一種倍半萜類(lèi)化合物、其制備方法及其在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種倍半萜類(lèi)化合物，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)：該化合物的命名為：2-羥基-4-異丙基-7-甲氧基-6-甲基-1-萘甲酸甲酯。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的倍半萜類(lèi)化合物的制備方法及在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種倍半萜類(lèi)化合物、其制備方法及其在制備抗煙草花葉病 毒藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于煙草化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的倍半萜類(lèi) 化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法和在抗煙草花葉病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，經(jīng)過(guò)幾十年的 研究，人們目前從煙草中鑒定出來(lái)的單體化學(xué)物質(zhì)就超過(guò)3000多種，而且還有許多成分尚 未鑒定出來(lái)。雖然吸煙有害健康已得到廣泛認(rèn)可，但煙草仍然對(duì)成千上萬(wàn)的消費(fèi)者有著強(qiáng) 大的吸引力，除尼古丁的成癮性外，煙草中豐富的香味物質(zhì)也發(fā)揮著重要作用。倍半萜 (sesquiterpenes)是指分子中含15個(gè)碳原子的天然萜類(lèi)化合物。倍半萜類(lèi)化合物分布較 廣，在植物體內(nèi)常以醇、酮、內(nèi)酯等等形式存在于揮發(fā)油中，是揮發(fā)油中高沸點(diǎn)部分的主要 組成部分。多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，是醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)的重要原料。為了研究 這類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系，可進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)更多的倍半萜類(lèi)化合物，從中尋找有效的先 導(dǎo)化合物和活性基團(tuán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明第一方面涉及一種倍半萜類(lèi)化合物，其具有如下結(jié)構(gòu)：
[0005] 該化合物的命名為：2_羥基-4-異丙基-7-甲氧基-6-甲基-1-萘甲酸甲酯，英文名 為：methyl 2-hydroxy-4-isopropyl-7-methoxy-6-methyl-l_naphthoate;其分子式為 C17H20O40
[0006] 本發(fā)明第二方面涉及所述的倍半萜類(lèi)化合物的制備方法，其特征在于，該方法包 括以下步驟：
[0007] (1)浸膏提?。阂詿熑~為原料，將煙葉粉碎或切成小段，用重量百分濃度80%~ 100 %的甲醇或乙醇、或重量百分濃度60 %~90 %的丙酮為提取溶劑，提取溶劑與煙葉的重 量比為2~4:1，浸泡24h~72h，提取3~5次，合并提取液、過(guò)濾濃縮成浸膏；
[0008] (2)硅膠柱層析:將步驟（1)得到的浸膏用其重量比2~4倍量的160~300目硅膠干 法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-丙酮體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的 溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮；
[0009] (3)高壓液相色譜分離:收集步驟(2)氯仿-丙酮體積配比為8:2部分的洗脫液，進(jìn) 一步用高壓液相色譜分離即得所述的倍半萜化合物；
[0010] (4)分離純化:將步驟(3)得到的倍半萜化合物用甲醇溶解，再以甲醇為流動(dòng)相，用 凝膠柱層析分離，以進(jìn)一步分離純化得到所述的倍半萜化合物。
[0011]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述的高壓液相色譜分離純化是采用21.2mmX250mm，5ym的 C18色譜柱，流速為20mL/min，流動(dòng)相為48 %的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣 200yL，收集32.6min的色譜峰，多次累加后蒸干。
[0012] 優(yōu)選地，步驟(2)中所述的浸膏在經(jīng)硅膠柱層析粗分前，用重量比1.5~3倍量的純 甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后，用重量比0.8~1.2倍的80~100目硅膠拌樣。
[0013] 本發(fā)明第三方面涉及所述的倍半萜化合物在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。
[0014] 表1.化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(溶劑為C5D5N)
[0015]
[0016] 以上述方法制備得到的倍半萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明化 合物為淺黃色膠狀物；紫外光譜（溶劑為甲醇），λ ΜΧ( logs )210(4.22)、232(3.87)、335 (3.65)_;紅外光譜（溴化鉀壓片>_3426、3055、2934、1715、1648、1610、1546、1460、1354、 1257、1203、1136、960、884cm-S高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 311·1252[Μ+ 似]+ (計(jì)算值311.1259)。結(jié)合1!1和130匪1?譜給出一個(gè)分子式(：1711 2()〇4，不飽和度為8。紅外光 譜數(shù)據(jù)證實(shí)化合物中存在羥基（3426CHT1)、羰基（1715,1648^^ 1)和芳環(huán)（1610,1546， 1460CHT1)功能團(tuán)，紫外光譜在335和232nm處有強(qiáng)吸收也證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從 1Η 和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表-1)信號(hào)可以看出化合物中有一個(gè)1，2,4,6,7-五取代的萘環(huán)(01 ~C-10;H-3，H-6 和 H-8)、一個(gè)異丙基（C-11 ~C-13;H-ll，H6-12，13)、一個(gè)甲酸酯基（C-14、-0Me-14)、l個(gè)甲基(C-15，H 3-15)、l個(gè)甲氧基(-0Me-7)，以及l(fā)個(gè)酚羥基(Ar-OH-2);這些信號(hào) 表明化合物為芳構(gòu)化的倍半砲（Journal of Natural Products. ,2013,76(6) :1058-1063)?；衔锏哪负说玫酱_認(rèn)后，剩余的甲基、異丙基、甲氧基和酚羥基為母核上的取代 基。根據(jù)Η-ll和(：-3、(：-4、(：-10，!1-12，13和(：-4，以及!1-3和(：-11的腿8(：(圖-3)相關(guān)可證實(shí)異 丙基取代在萘環(huán)的C-4位;根據(jù)H 3-l 5和C-5、C-6、C-10的HMBC相關(guān)，可證實(shí)該甲基取代在母 核的C-6位;根據(jù)甲氧基氫(δΗ3.84?〇和C-7有HMBC相關(guān)，可證實(shí)甲氧基分別取代在母核的C- 7位;根據(jù)酚羥基氫（δΗ11.93)和C-l、C-2、C-3的HMBC相關(guān)，可證實(shí)酚羥基取代在母核的C-2 位;根據(jù)H-8和C-1有HMBC相關(guān)，以及H-3和酯羰基(C-14)沒(méi)有HMBC相關(guān)，可推測(cè)酯羰基取代 在母核的C-1位。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定，該化合物命名為:2-羥基-4-異丙基-7-甲 氧基-6-甲基-1-萘甲酸甲酯。
[0017] 采用半葉法進(jìn)行了本發(fā)明化合物的抗煙草花葉病毒活性測(cè)試，結(jié)果明本化合物的 相對(duì)抑制率為45.7%，超過(guò)對(duì)照寧南霉素的相對(duì)抑制率31.5%，說(shuō)明化合物有很好的抗煙 草花葉病毒活性。
[0018] 本發(fā)明的有益效果
[0019] 1、本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物是首次被分離，結(jié)構(gòu)新穎。至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。
[0020] 2、本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物原料易得，提取方法簡(jiǎn)單;所獲得的本發(fā)明化合物純 度高，后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)容易實(shí)現(xiàn)。
[0021] 3、本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物具有很好的抗煙草花葉病毒活性，可作為抗花葉病毒 藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化合物用于抗花葉病毒藥物制劑研發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物的核磁共振碳譜；
[0023] 圖2為本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物的核磁共振氫譜；
[0024] 圖3為本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物的主要HMBC相關(guān)。
[0025]圖4為本發(fā)明的倍半萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明 加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]制備倍半萜類(lèi)化合物C17H2Q04,包括浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離，具 體采用以下步驟：
[0028] (1)浸膏提取:取煙葉粉碎，用高濃度甲醇(w% :95%)或高濃度乙醇(w% :95%)或 高濃度丙酮(w% : 70 % )為提取溶劑，提取溶劑:煙草(重量比）=3: 5，浸泡54h，提取4次，合 并提取液、過(guò)濾濃縮成浸膏。
[0029] (2)硅膠柱層析:浸膏用重量比2.5倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后用重量 比1.2倍的80~100目硅膠拌樣，用重量比3倍量的250目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以 體積配比為（1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并 相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮。
[0030] (3)高壓液相色譜分離:柱層析洗脫液的8:2部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化 即得所述的倍半砲類(lèi)化合物，高壓液相色譜分離純化是采用21.2_X 250mm，5μηι的Cis色譜 柱，流速為20mL/min，流動(dòng)相為48 %的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣200yL， 收集32.6min的色譜峰，多次累加后蒸干。
[0031] 高壓液相色譜法分離純化后的物質(zhì)，一個(gè)優(yōu)選的后處理方案為，所得化合物再次 用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用凝膠柱層析分離，以進(jìn)一步分離純化。
[0032] 本發(fā)明所用煙葉原料不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下面以來(lái)源于云 南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司不同產(chǎn)地的煙葉原料，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 煙草樣品來(lái)源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2.0kg粉碎以95%的甲醇 提取5次，每次提取24h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0 倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0.6kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析， 用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相 同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高 效液相色譜分離，以48%的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18(21 · 2 X 250mm，5μπι)制備柱為固 定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣200yL，收集32.6min的色譜 峰，多次累加后蒸干;所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 煙草樣品來(lái)源于云南大理，品種為云煙200,將煙草取樣3.5kg切碎，以95%的乙醇 提取4次，每次提取48h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0 倍量的純甲醇溶解后用250g的80目粗硅膠拌樣，1.2kg的200目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析， 用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相 同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高 效液相色譜分離，以48%的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18(21 · 2 X 250mm，5μπι)制備柱為固 定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣200yL，收集32.6min的色譜 峰，多次累加后蒸干;所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] 煙草樣品來(lái)源于云南昆明，品種為紅花大金元，將煙草取樣5kg粉碎，以75%的丙 酮用超聲提取3次，每次提取72h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏380g。浸膏用 重量比1.6倍量的純甲醇溶解后用400g的90目粗硅膠拌樣，2.4kg的180目硅膠裝柱進(jìn)行硅 膠柱層析，用體積配比為1 :〇、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1: 2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC 監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖 1100半制備高效液相色譜分離，以48 %的甲醇為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18( 21.2 X 250mm，5μ m)制備柱為固定相，流速為20ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣200yL，收集 32.6min的色譜峰，多次累加后蒸干;所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用 Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0039] 實(shí)施例4
[0040]------化合物結(jié)構(gòu)的鑒定
[0041]以上述方法制備得到的倍半萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明化 合物為淺黃色膠狀物；紫外光譜（溶劑為甲醇），λΜΧ( logs )210(4.22)、232(3.87)、335 (3.65)_;紅外光譜（溴化鉀壓片>_3426、3055、2934、1715、1648、1610、1546、1460、1354、 1257、1203、1136、960、884cm-S高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 311·1252[Μ+ 似]+ (計(jì)算值311.1259)。結(jié)合1!1和130匪1?譜給出一個(gè)分子式(：1711 2()〇4，不飽和度為8。紅外光 譜數(shù)據(jù)證實(shí)化合物中存在羥基（3426CHT1)、羰基（1715,1648^^ 1)和芳環(huán)（1610,1546， 1460CHT1)功能團(tuán)，紫外光譜在335和232nm處有強(qiáng)吸收也證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從1Η 和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1)信號(hào)可以看出化合物中有一個(gè)1，2,4,6,7-五取代的萘環(huán)(01 ~C-10;H-3，H-6 和 H-8)、一個(gè)異丙基（C-11 ~C-13;H-ll，H6-12，13)、一個(gè)甲酸酯基（C-14、-OMe-14)、l個(gè)甲基(C-15，H 3-15)、l個(gè)甲氧基(-OMe-7)，以及l(fā)個(gè)酚羥基(Ar-OH-2);這些信號(hào) 表明化合物為芳構(gòu)化的倍半砲（Journal of Natural Products. ,2013,76(6) :1058-1063)。化合物的母核得到確認(rèn)后，剩余的甲基、異丙基、甲氧基和酚羥基為母核上的取代 基。根據(jù)Η-ll和(：-3、(：-4、(：-10，!1-12，13和(：-4，以及!1-3和(：-11的腿8(：(圖-3)相關(guān)可證實(shí)異 丙基取代在萘環(huán)的C-4位;根據(jù)H 3-l 5和C-5、C-6、C-10的HMBC相關(guān)，可證實(shí)該甲基取代在母 核的C-6位;根據(jù)甲氧基氫(δΗ3.84?〇和C-7有HMBC相關(guān)，可證實(shí)甲氧基分別取代在母核的C-7位;根據(jù)酚羥基氫（δ Η11.93)和C-l、C-2、C-3的HMBC相關(guān)，可證實(shí)酚羥基取代在母核的C-2 位;根據(jù)H-8和C-1有HMBC相關(guān)，以及H-3和酯羰基(C-14)沒(méi)有HMBC相關(guān)，可推測(cè)酯羰基取代 在母核的C-1位。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定，該化合物命名為:2-羥基-4-異丙基-7-甲 氧基-6-甲基-1-萘甲酸甲酯。
[0042] 實(shí)施例5
[0043] 取實(shí)施例2制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例4相同，確認(rèn)實(shí)施例4 制備的化合物為所述的倍半萜類(lèi)化合物一一2-羥基-4-異丙基-7-甲氧基-6-甲基-1-萘甲 酸甲酯。
[0044] 實(shí)施例6
[0045] 取實(shí)施例3制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例4相同，確認(rèn)實(shí)施例3 制備的化合物為所述的2-羥基-4-異丙基-7-甲氧基-6-甲基-1-萘甲酸甲酯。
[0046] 實(shí)施例7
[0047] 取實(shí)施例2-3制備的任倍半萜類(lèi)化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒活性試驗(yàn)，試驗(yàn)情況 如下：
[0048]采用半葉法，在藥劑的質(zhì)量濃度均為50mg/L時(shí)對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行抗煙草花葉病 毒活性測(cè)定。在5~6齡烤煙的植株上，選取適用于測(cè)試的葉片（葉行正常，無(wú)病無(wú)蟲(chóng)），先將 葉片均勻撒上細(xì)金剛砂，用毛筆將備用的煙草花葉病毒源(3.0ΧΚΓ 3)均勻抹在撒有金剛砂 的葉片上，待所有中選的葉片接毒結(jié)束后，立即放在盛有藥液的培養(yǎng)皿中處理20min，取出， 擦去葉片上水珠和藥液，將兩個(gè)半葉復(fù)原排放在鋪有衛(wèi)生紙保濕的玻璃缸中，并蓋上玻璃 蓋，控溫(23±2)°C，放在溫室自然光照射，2~3d即可見(jiàn)枯斑.每個(gè)處理都設(shè)另一半葉為對(duì) 照，另外設(shè)有1組為商品寧南霉素的處理作為對(duì)比，按下公式計(jì)算相對(duì)抑制率。
[0049] XI% = (CK-T)/CKX100%
[0050] X:相對(duì)抑制率（％ )，CK:浸泡于清水中半片接毒葉的枯斑數(shù)(個(gè)），T浸泡于藥液中 半片接毒葉的枯斑數(shù)(個(gè)）。
[0051 ]結(jié)果明本化合物的相對(duì)抑制率為45.7%，超過(guò)對(duì)照寧南霉素的相對(duì)抑制率 31.5%，說(shuō)明化合物有很好的抗煙草花葉病毒活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種倍半萜類(lèi)化合物，其特征亦干，縣有加下結(jié)核I;該化合物的命名為：2-枉整-4-開(kāi)IAJ整-，-Ψ羊ψ整-1 -衆(zhòng)ψ EK甲酯。2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的倍半萜類(lèi)化合物的制備方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟： (1) 浸膏提?。阂詿熑~為原料，將煙葉粉碎或切成小段，用重量百分濃度80%~100%的 甲醇或乙醇、或重量百分濃度60%~90%的丙酮為提取溶劑，提取溶劑與煙葉的重量比為2 ~4:1，浸泡24h~72h，提取3~5次，合并提取液、過(guò)濾濃縮成浸膏； (2) 硅膠柱層析:將步驟（1)得到的浸膏用其重量比2~4倍量的160~300目硅膠干法裝 柱進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-丙酮體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的溶液 進(jìn)行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮； (3) 高壓液相色譜分離：收集步驟(2)氯仿-丙酮體積配比為8:2部分的洗脫液，進(jìn)一步 用高壓液相色譜分離即得所述的倍半萜化合物； (4) 分離純化:將步驟(3)得到的倍半萜化合物用甲醇溶解，再以甲醇為流動(dòng)相，用凝膠 柱層析分離，以進(jìn)一步分離純化得到所述的倍半萜化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的高壓液相色譜分離 純化是采用21.2mm X 250mm，5μηι的Ci8色譜柱，流速為20mL/min，流動(dòng)相為48 %的甲醇，紫外 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，每次進(jìn)樣200yL，收集32.6min的色譜峰，多次累加后蒸干。4. 根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的浸膏在經(jīng)硅膠柱層析粗 分前，用重量比1.5~3倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后，用重量比0.8~1.2倍的80 ~100目硅膠拌樣。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的倍半萜化合物在制備抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07C69/94GK105949065SQ201610339968
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】陳永寬, 尚善齋, 趙偉, 李忠, 劉志華, 楊光宇, 劉春波, 申欽鵬, 繆明明
【申請(qǐng)人】云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司