專利名稱：作為遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的陽離子病毒體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，并且涉及用于有效地向靶位置轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的新的病毒體，即膜中包含病毒糖蛋白的正電荷脂小泡，涉及其制備方法和有用的應(yīng)用。本發(fā)明陽離子病毒體特別適合體外和體內(nèi)向靶細(xì)胞特異性的和非特異性的，非感染性的基因運(yùn)送。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體被廣泛用作藥物運(yùn)送的載體和用作有效期短的藥物或者抗體液(生物)化學(xué)侵害的保護(hù)性掩蔽劑。包含來自病毒被膜的重組膜蛋白或其部分的脂質(zhì)體通常稱之為“病毒體”(Sizer等，生物化學(xué)(Biochemistry)26:5106-5113,1987)。其已經(jīng)被用來非特異性運(yùn)送各種藥物和DNA分子(Vainstein等，酶方法(MethodsEnzymol.)101:492-512,1983)。其主要缺點(diǎn)在于這些病毒體與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，導(dǎo)致運(yùn)送的物質(zhì)沒有控制地釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在那里沒有保護(hù)的物質(zhì)容易被細(xì)胞內(nèi)降解過程破壞。
WO92/13525，其全文在此引入作為參考，報道了來自流感病毒的病毒刺突蛋白所指向的，并且有細(xì)胞特異性標(biāo)記例如單克隆抗體的磷脂雙分子層膜制備的病毒體，根據(jù)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的類病毒穿入機(jī)理，非常有效地與膜模型和動物細(xì)胞融合。在這些病毒體成功地應(yīng)用于將化學(xué)物質(zhì)和期望的藥物運(yùn)送到靶位置的同時，關(guān)于穩(wěn)定摻入和轉(zhuǎn)移帶電荷分子，例如負(fù)電荷核酸，其仍有一些缺點(diǎn)。
在過去的幾年里，脂質(zhì)體中摻入的遺傳物質(zhì)的運(yùn)送，特別是細(xì)胞特異性運(yùn)送越來越引起關(guān)注且越來越重要，特別是關(guān)于在抗癌和基因治療中的應(yīng)用。目前有幾種方法適合向細(xì)胞運(yùn)送DNA或RNA病毒介導(dǎo)的方法，脂質(zhì)介導(dǎo)的方法，和其它方法，象微注射和電穿孔。目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)可以總結(jié)如下8)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移基因可以通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而被穩(wěn)定且有效地導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞。但是基因向非復(fù)制型細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的效率非常低，因為逆轉(zhuǎn)錄病毒只感染分裂的細(xì)胞。而且，一般所關(guān)心的安全問題和與例如癌基因可能的激活有關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用有關(guān)。復(fù)制缺陷腺病毒成為大多數(shù)研究人員的基因轉(zhuǎn)移載體的選擇。腺病毒載體介導(dǎo)的基因運(yùn)送包括期望的基因向缺陷腺病毒粒子的插入或者要插入的DNA和腺病毒外被之間通過運(yùn)鐵蛋白-聚賴氨酸橋的復(fù)合物的生成。該體內(nèi)非常有效的系統(tǒng)的缺點(diǎn)是有感染或炎癥的危險盡管有使病毒對于復(fù)制是有缺陷的之E1基因缺失，但是剩余的病毒基因組仍包含數(shù)個編碼病毒蛋白質(zhì)的可讀框(Yang等，1994；美國國家科學(xué)院學(xué)報91,4407-4411)。病毒蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)引起動物和人體內(nèi)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此可以引起炎癥和增生。
在HVJ(仙臺病毒)介導(dǎo)的方法中，外來DNA與脂質(zhì)體相復(fù)合。然后脂質(zhì)體負(fù)載了滅活的仙臺病毒(日本的血凝病毒；HVJ)。該方法已經(jīng)用于體內(nèi)對各種組織的基因移植。另外，業(yè)已報道了細(xì)胞通過HVJ-脂質(zhì)體攝入反義寡核苷酸(Morishita等，1993；細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)17E,239)。但是一個特別的缺點(diǎn)是HVJ-脂質(zhì)體有非特異性結(jié)合紅細(xì)胞的傾向。b)脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移由陽離子脂類制備的帶正電荷脂質(zhì)體表現(xiàn)出使用安全方便，并且對于體外轉(zhuǎn)移DNA和反義寡核苷酸是有效的。高負(fù)電荷核酸自發(fā)與陽離子脂質(zhì)體相互作用。通過簡單地混合聚核苷酸和預(yù)先生成的陽離子脂質(zhì)體，已經(jīng)實現(xiàn)了DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的完全生成。但是，由于脂質(zhì)體膜上缺少融合蛋白和細(xì)胞特異性標(biāo)記，所以體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效率非常低，并且培育時間長，為了達(dá)到期望的效果不得不高劑量給藥。結(jié)果是，可以發(fā)生不期望的副作用，因為有證據(jù)證明大量的陽離子脂質(zhì)在體內(nèi)可以表現(xiàn)出毒副作用。
目前正在試驗小的寡核苷酸作為治療癌癥的治療藥物和作為抗病毒藥物。只有兩個DNA鏈中的一股被轉(zhuǎn)錄來合成信使RNA(mRNA)。被轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA鏈稱之為編碼鏈或正義鏈。互補(bǔ)，非編碼或反義鏈具有和mRNA相同的序列。當(dāng)轉(zhuǎn)錄非編碼鏈時，其產(chǎn)生能結(jié)合目的(正義)mRNA的反義RNA分子。一旦反義RNA結(jié)合正義RNA，則得到的RNA雙鏈分子不能被翻譯，并且蛋白質(zhì)的產(chǎn)生被阻斷。通常情況下，18-22個堿基的短的合成的反義寡核苷酸有效結(jié)合mRNA并抑制mRNA翻譯。通過這種機(jī)理，反義寡核苷酸能終止人癌細(xì)胞的增殖。癌所涉及的基因表現(xiàn)出其通過其正常結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的超表達(dá)的作用。基因例如c-fos,c-myc,L-myc,N-myc,c-myb,abl,bcr-abl,c-raf,c-erb-2,K-ras可能是反義癌癥治療的潛在的靶物。反義寡核苷酸也是常規(guī)藥物的令人注意的潛在的替代物，所述常規(guī)藥物是例如抗病毒劑，例如人免疫缺陷病毒(HIV)tat和gag基因反義寡核苷酸。
如文獻(xiàn)所述(Stegmann等；EMBO J.6:2651-2659,1987)包含重組病毒被膜的脂質(zhì)體膜可以稱為病毒體。其通常包括包含磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂雙分子層和病毒被膜，例如包埋在膜中的刺突蛋白質(zhì)。將遺傳物質(zhì)插入到PC,PE-病毒體中的常規(guī)方法缺點(diǎn)在于核酸摻入的極低的效率。
發(fā)明概述因此本發(fā)明涉及新的陽離子病毒體，由于其特異的膜組成而可以非常有效地負(fù)載任何期望的遺傳物質(zhì)，包括長鏈和短鏈DNA或RNA，寡脫氧核苷酸，核糖核苷酸，肽核酸(PNA)，核糖酶(有酶活性的RNA分子)，基因，質(zhì)粒和載體，因此令人信服地克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及流感病毒A特別是A/Singapore株的血凝素有效重組為大量單層陽離子脂小泡，導(dǎo)致生成平均直徑大約是120-180nm的陽離子病毒體和連接的脂質(zhì)雙分子層的方法，其基本上沒有了很多常規(guī)病毒體制劑所見的滲漏的缺點(diǎn)。-優(yōu)選單層的-陽離子雙分子層膜的結(jié)構(gòu)向含水相取向，而疏水脂肪酸尾部向雙分子層中心取向。電子顯微鏡顯示重組病毒刺突蛋白質(zhì)(血凝素)在脂質(zhì)雙分子層中整合，并且從陽離子小泡表面伸展(

圖1)。
小泡膜脂質(zhì)組成包括陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和任選地磷脂，例如磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。最多的情況下，證明選擇包含-以總的脂質(zhì)為基礎(chǔ)-下面組成之一的膜的脂質(zhì)組成是有利的(ⅰ)100％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)；或(ⅱ)90-95％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰膽堿。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明也涉及細(xì)胞特異性標(biāo)記與陽離子病毒體不可逆的共價鍵合，所述陽離子病毒體包括但不限于用于選擇性探測和結(jié)合靶細(xì)胞的單克隆抗體，抗體片段，例如F(ab’)2和Fab’片段，細(xì)胞因子，和/或生長因子。其與小泡膜連接從而提供關(guān)于受體檢測和結(jié)合的外部的和外露的基本上全功能活性。
例如Marting等(生物化學(xué)雜志，257:286-288,1982)描述的細(xì)胞特異性標(biāo)記例如抗體片段與先成的小泡的偶聯(lián)經(jīng)常導(dǎo)致低的且常常不可重復(fù)的偶聯(lián)率-對目的策略施與顯著限制性的復(fù)雜的情況。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，標(biāo)記物在去污劑存在下偶聯(lián)先成的磷脂酰乙醇胺-交聯(lián)劑分子，例如N-[4-(對-馬來酰亞胺-苯基丁?；鵠-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)。
為了實現(xiàn)最好的可能的結(jié)果，證明為了避免蛋白水解消化或者分子內(nèi)S-S鍵的減少引起的滅活而在重組之前小心分離和純化病毒糖蛋白是有利的。因此，優(yōu)選用活化的瓊脂糖基質(zhì)，優(yōu)選用還原的硫丙基Sepharose 6B，通過親和層析從未接合的磷脂酰乙醇胺-交聯(lián)劑分子(例如MPB.PE)分離接合的標(biāo)記物，例如標(biāo)記-MPB.PE。然后在陽離子病毒體生成之前將純化的接合的標(biāo)記物(磷脂酰乙醇胺-交聯(lián)劑-標(biāo)記物分子復(fù)合物)等份加入到含有溶解的膜脂質(zhì)，融合肽和其它期望的成分的混合物的去污劑溶液中。
證明在制備病毒體之前在分開的過程中進(jìn)行雙功能交聯(lián)劑與磷脂和細(xì)胞特異性標(biāo)記的偶聯(lián)程序是有利的。該方法使更好地控制和優(yōu)化病毒體膜的表面密度，特別是關(guān)于連接的細(xì)胞特異性標(biāo)記的數(shù)目。包埋在膜中或者與膜連接的蛋白質(zhì)分子濃度的改進(jìn)的控制是重要的，病毒體上融合蛋白(例如血凝素)和細(xì)胞特異性標(biāo)記(例如抗體Fab’片段)不平衡的比例可以降低甚至破壞其選擇性性質(zhì)，和-極限下-可以導(dǎo)致小泡的凝塊和沉淀。
用抗體片段F(ab’)2和Fab’代替全抗體分子作為細(xì)胞特異性標(biāo)記是特別有利的，因為它們與全抗體相比有小得多的免疫原性。不存在Fc區(qū)減小了所不期望的Fc介導(dǎo)的生物和免疫活性的范圍，例如通過經(jīng)典途經(jīng)的補(bǔ)體活化，和最終導(dǎo)致-通過抗體和其Fc-受體在靶細(xì)胞上的相互作用而從靶細(xì)胞表面清除附著病毒體的急性體液應(yīng)答。
與運(yùn)送核酸的已知的脂質(zhì)體組成不同，本發(fā)明陽離子病毒體通常不需要與原生質(zhì)細(xì)胞膜融合或者使原生質(zhì)細(xì)胞膜不穩(wěn)定而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。它們能通過兩步機(jī)理進(jìn)入宿主細(xì)胞1．附著和2．穿入。在第一步中，其通過融合肽(例如血凝素)和/或細(xì)胞特異性標(biāo)記結(jié)合細(xì)胞受體，特別是結(jié)合膜糖蛋白或帶有末端唾液酸的糖脂質(zhì)，然后通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用非常有效地?fù)饺?。在帶有?xì)胞特異性標(biāo)記例如抗體片段的病毒體情況下，這些標(biāo)記會另外識別靶細(xì)胞表面上的抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通過兩種不同的結(jié)合機(jī)理附著。因此，本發(fā)明細(xì)胞特異性病毒體因為其在膜上有細(xì)胞特異性標(biāo)記而具有對于各種細(xì)胞類型的選擇性，同時，由于病毒融合肽例如血凝素而具有通過內(nèi)吞作用而細(xì)胞穿入的高的能力。帶有識別腫瘤相關(guān)抗原例如TAG72,CEA,17-1A,CA19-9或白血病相關(guān)的抗原例如CD10(CALLA=常見的急性淋巴細(xì)胞白血病抗原)和CD20的Fab’片段的病毒體將選擇性結(jié)合其細(xì)胞表面帶有提到的抗原的腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞。
在第二步中，當(dāng)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞時，病毒體在核內(nèi)體截留。隨后，核內(nèi)體中的pH減小到大約pH5-6，其激活血凝素融合肽，并觸發(fā)核內(nèi)體膜和病毒體膜的融合。膜融合反應(yīng)打開病毒體的被膜并將截留的遺傳物質(zhì)釋放到胞質(zhì)中。該機(jī)理值得重視地增加了轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)在通過消化降解和/或胞吐作用而遭破壞之前達(dá)到核的機(jī)會。發(fā)明的描述本發(fā)明主要目的是提供包含陽離子或聚陽離子脂質(zhì)和內(nèi)部-通常含水-空間，并且進(jìn)一步包含至少一種包埋在小泡膜中或者在小泡膜中整合或者與小泡膜共價連接的病毒融合肽的正電荷脂小泡。小泡還優(yōu)選在膜上包含至少一種細(xì)胞特異性標(biāo)記。本發(fā)明又一個目的是提供具有全生物融合活性的小泡，即具有基本上與完整流感病毒一樣的融合活性。融合肽是病毒糖蛋白，例如血凝素或其衍生物，或者能誘導(dǎo)所述小泡在內(nèi)吞作用之后與靶細(xì)胞核內(nèi)體膜的快速融合的合成的融合肽。
新的小泡或病毒體對于將任何期望的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移給靶位置，特別是體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移給動物和人細(xì)胞和組織是特別有用的。強(qiáng)調(diào)的是新的病毒體不只是能穿入增殖的即復(fù)制的細(xì)胞，而且能穿入非增殖的即靜止細(xì)胞，其特性使其廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)，藥學(xué)和藥物領(lǐng)域，作為研究和/或診斷工具和作為藥物。對于作為藥物的應(yīng)用，本發(fā)明病毒體可以是進(jìn)一步含有常規(guī)添加劑和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物的一部分。優(yōu)選藥物組合物制備成注射液，但是，其它制劑形式，例如用于表面或系統(tǒng)給藥的乳液，乳脂，凝膠，軟膏，對于某些應(yīng)用是有利的。
因此本發(fā)明又一個目的是使用本發(fā)明病毒體制備適合預(yù)防性和/或治療性治療動物或人個體的藥物組合物，動物或人個體從這樣的治療中得到了好處。本發(fā)明另一個目的是用本發(fā)明病毒體制備用于體外和體內(nèi)應(yīng)用的診斷藥盒。
在一個實施方案中，本發(fā)明小泡通過包括有效重組流感病毒A的血凝素(HA)的方法獲得。因此本發(fā)明又一個目的是公開制備陽離子病毒體的方法。在優(yōu)選的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括向陽離子脂小泡中摻入遺傳物質(zhì)的步驟?；镜?，制備方法包括下面的步驟1)將陽離子脂質(zhì)與-優(yōu)選純化的-病毒刺突糖蛋白，期望運(yùn)送的遺傳物質(zhì)和任選地先成的由磷脂酰乙醇胺，交聯(lián)劑和細(xì)胞特異性標(biāo)記制備的復(fù)合物分子一起溶解于非離子去污劑優(yōu)選八乙二醇單正十二烷基醚(OEG,C12E8)中；和2)通過用去污劑吸附微載體珠，優(yōu)選具有優(yōu)選孔度(濕)20-50(0.84-O.30mm)SM-2 Biobeads型聚苯乙烯小球-優(yōu)選反復(fù)地-去除去污劑，生成小泡。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，合適的雙功能交聯(lián)劑被用來不可逆連接細(xì)胞特異性標(biāo)記和小泡膜。指向決定著病毒體與細(xì)胞特異性結(jié)合的細(xì)胞受體的細(xì)胞特異性標(biāo)記以其仍然是全生物活性的方式與交聯(lián)劑結(jié)合。優(yōu)選交聯(lián)劑以先成的分子-復(fù)合物的形式使用，其中交聯(lián)劑與磷脂酰乙醇胺共價連接或者與磷脂酰乙醇胺和細(xì)胞特異性標(biāo)記共價連接。
由于本發(fā)明病毒體功能活性融合肽，被囊化物質(zhì)主要隨著核內(nèi)體pH的降低而被釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中(上文略述)。這種釋放一方面延長了運(yùn)送物質(zhì)在靶細(xì)胞中的停留時間，另一方面避免病毒體在核內(nèi)體中不期望的長期停留，從而減少了病毒體運(yùn)送的有價值的物質(zhì)非特異性降解的危險。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及其中膜脂質(zhì)另外包含磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的小泡，其進(jìn)一步提高特異性病毒體設(shè)計和/或促進(jìn)融合肽和/或細(xì)胞特異性標(biāo)記瞄定膜的能力。
術(shù)語“融合肽”指能誘導(dǎo)和/或促進(jìn)病毒體膜和靶細(xì)胞脂質(zhì)膜之間融合反應(yīng)的肽或蛋白質(zhì)。在最優(yōu)選的實施方案中，其指包含融合肽的病毒刺突糖蛋白，特別是指其單體，病毒表面刺突的完全的血凝素三聚體，或者指一個或兩個包含功能融合肽的裂解亞單位，糖肽HA1和HA2。在本發(fā)明另一個實施方案中，該術(shù)語指純化融合肽本身，或者是從天然來源分離的或者是合成制備的。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，這些包含融合肽的多肽指流感血凝素，特別是A-H1N1亞型的一種。合成的融合肽優(yōu)選從下面的表1所列的氨基酸序列選擇，其中氨基酸通過其相應(yīng)的單字母碼表示(也參見WO92/13525實施例6和圖2)。
術(shù)語“交聯(lián)劑”指能連接根據(jù)本發(fā)明制備的小泡的表面和能結(jié)合多肽的有機(jī)異雙功能分子。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，該分子包含一個偶聯(lián)磷脂酰乙醇胺的氨基的N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)和接合單克隆抗體片段的馬來酰亞胺基團(tuán)，例如4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯，間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯，間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯，4-(對-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸琥珀酰亞胺酯，4-(對-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸磺基琥珀酰亞胺酯；或者其包含偶聯(lián)細(xì)胞因子的N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)和光反應(yīng)性疊氮基，例如N-羥基琥珀酰亞胺辛二酸酯(NHSSA),N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯(HASAB),N-琥珀酰亞胺基-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH),N-磺基琥珀酰亞胺基-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯。
表1
優(yōu)選交聯(lián)劑以交聯(lián)劑和脂質(zhì)的先成分子復(fù)合物的形式使用，特別是交聯(lián)劑和磷脂酰乙醇胺，或者脂質(zhì)加交聯(lián)劑加細(xì)胞特異性標(biāo)記的復(fù)合物。
術(shù)語“細(xì)胞特異性”蛋白質(zhì)或標(biāo)記物指能分別連接交聯(lián)劑或交聯(lián)劑-脂質(zhì)復(fù)合物，并且進(jìn)一步能結(jié)合靶細(xì)胞受體的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，該分子指細(xì)胞受體特異性化合物，例如單克隆抗體，抗體片段，細(xì)胞因子或生長因子。細(xì)胞特異性標(biāo)記提供選擇性探測并且結(jié)合靶細(xì)胞，因此提高病毒體膜中伴隨存在的融合肽的作用。優(yōu)選的抗體片段包括F(ab’)2和Fab’片段，同時細(xì)胞特異性標(biāo)記還包括白細(xì)胞介素和其它細(xì)胞因子，特別是下面表2中所列出的。表2
這里所使用的術(shù)語“陽離子脂質(zhì)”指包含陽離子成分和非極性尾部的有機(jī)分子，稱之為頭-尾兩親物，例如氯化N-[(1,2,3-二油?；趸?丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)(Felgner等；美國國家科學(xué)院學(xué)報84:7413-7417,1987),N-[(1,2,3-二油?；趸?丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酰酯(DOTAP)；或N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒(Ruysschaert等；生物化學(xué)生物物理研究通訊203:1622-1628,1994)。除非另有說明，該術(shù)語也包括下面定義的聚陽離子脂質(zhì)。
術(shù)語“聚陽離子脂質(zhì)”指包含聚陽離子成分和非極性尾部的有機(jī)分子例如脂精胺1,3-二棕櫚酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)和二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)(Behr等；美國國家科學(xué)院學(xué)報86:6982-6986,1989)；三氟乙酸2,3-二油?；趸?N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油?；趸?1,4-丁二銨(THDOB)。
這里所使用的術(shù)語“核酸”或“遺傳物質(zhì)”包括短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，磺酸寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸(OPTs)硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸(PNAs)，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶(具有酶活性的RNA分子)，基因，質(zhì)粒和載體(克隆載體)。
這里所使用的術(shù)語“病毒體”指-以其最簡單的形式-具有包含陽離子脂質(zhì)和內(nèi)部-優(yōu)選含水的-空間的雙分子層膜的脂小泡，其中膜進(jìn)一步包含病毒蛋白質(zhì)，特別是病毒糖蛋白。在優(yōu)選實施方案中，病毒蛋白質(zhì)包括至少一種具有全生物融合活性的融合肽或蛋白，特別是刺突糖蛋白血凝素和/或流感A病毒(例如A/Singapore)的神經(jīng)氨酸酶。應(yīng)該明白病毒蛋白質(zhì)也包括合成制備的相應(yīng)于或等于這里所描述的流感病毒融合肽的氨基酸序列。膜脂質(zhì)包含上面定義的陽離子脂質(zhì)但是可以任選地進(jìn)一步包含其它天然的和/或合成的脂質(zhì)，優(yōu)選磷脂，例如磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。
雖然本發(fā)明陽離子病毒體在很多情況下-特另是在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗中-膜上沒有細(xì)胞特異性標(biāo)記就可以成功地應(yīng)用，但是對于體內(nèi)應(yīng)用特別優(yōu)選其膜上進(jìn)一步包含至少一種上文所定義的細(xì)胞特異性標(biāo)記。根據(jù)電子顯微鏡和動態(tài)光散射測定，小泡的平均直徑在120-180nm范圍內(nèi)。
這里所使用的術(shù)語“全(生物)融合活性”應(yīng)該表達(dá)為在小泡膜中包含重組病毒蛋白的本發(fā)明病毒體基本上具有與通常它們所從中重組的完整的病毒對于靶細(xì)胞的相同的融合活性。優(yōu)選地，陽離子病毒體融合性的比較與完整的流感病毒A不相上下。根據(jù)已知的方法測定融合活性，特別是根據(jù)Hoekstra等的報道(生物化學(xué)23:5675-5681,1984)，或Luscher等的報道(Arch.Virol.130:317-326,1993)。
在反義技術(shù)可以在治療或預(yù)防上應(yīng)用于需要的患者之前，大量的技術(shù)問題，特別是涉及開發(fā)合適的載體系統(tǒng)，需要在操作之前解決。舉例來說，遺傳物質(zhì)，例如反義寡核苷酸，是不穩(wěn)定的，并且在其到達(dá)靶細(xì)胞之前就裂解或者或多或少滅活，因此必須使用大量截留在常規(guī)陽離子脂質(zhì)中的這樣的物質(zhì)。由于使用量大，人或動物體內(nèi)產(chǎn)生潛在的毒性問題。
通過使用本發(fā)明陽離子病毒體作為遺傳物質(zhì)的載體，這些問題可以成功地解決，并且可以防止由于毒性產(chǎn)生的不期望的副作用，或者至少大大減少。實現(xiàn)這些有益的效果是因為本發(fā)明陽離子病毒體-與迄今為止已知的脂質(zhì)體或病毒體相比-具有高得多的活性和效率，最多1000-20000個運(yùn)送截留遺傳物質(zhì)的因子例如反義寡核苷酸進(jìn)入靶細(xì)胞。結(jié)論是，比較常規(guī)病毒體或陽離子脂質(zhì)體的功效與本發(fā)明陽離子病毒體的功效實際上是不可能的。
附圖的簡要說明圖1給出帶有病毒刺突蛋白的D0TAP病毒體的顯微照相。
圖2給出帶有模型脂質(zhì)體的十八烷基若丹明B標(biāo)記的DOTAP-病毒體的pH誘發(fā)的融合活性。
圖3圖示帶有被囊化的反義FITC-OPT的DOTAP-病毒體摻入人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
圖4和圖5圖示反義-L-myc-DOTAP-病毒體進(jìn)入人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的超常的攝入和轉(zhuǎn)染效率。
圖6圖示不同的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞與反義-L-myc病毒體的培育。
圖7a,7b圖示對于Jurkat細(xì)胞pRSVcat-DOTAP病毒體的轉(zhuǎn)染效率。
圖8DOTAP-病毒體與磷脂-脂質(zhì)體的融合。用37℃下R18測試測定融合。
圖9胸腺嘧啶核苷摻入到病毒體處理過的NCI-H209細(xì)胞。向每孔5×104細(xì)胞/ml加入75μl含有200皮摩爾或者反義，正義，或者mscFITC-OPT的病毒體和625μl含有0.5μCi14C-胸腺嘧啶核苷的新鮮培養(yǎng)基。
圖10通過加入含有反義-L-myc-OPT病毒體胸腺嘧啶核苷摻入NCI-H209細(xì)胞的劑量依賴性抑制。NCI-H209細(xì)胞以每孔每ml1×105的初始細(xì)胞濃度培育。取三次試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖11不同的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系與反義-L-myc病毒體與75μl反義-L-myc病毒體的培育。如所指出的該細(xì)胞系中癌基因表達(dá)減少H82＜H510A＜H209。第-批病毒體比第二批含有更少量的反義-L-myc。
圖12兩種不同制備的病毒體制劑對Sp2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
圖13兩種不同制備的病毒體制劑對P3/NS1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
圖14兩種不同制備的病毒體制劑對NIH/3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
圖15,16,17用正義和反義c-myb-DOTAP病毒體處理的KG1細(xì)胞的細(xì)胞生長。分別加入25,50或100μl含有18,36，或72pmol OPT的病毒體溶液。取三次試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖18用DOTAP病毒體加入50μl正義和反義c-myb病毒體溶液處理的CEM-C3細(xì)胞的細(xì)胞生長。取三次試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
為了使更全面理解這里所描述的本發(fā)明，提出下面的實施例。這些實施例只是為了詳細(xì)說明的目的而不認(rèn)為是在任何方面限制本發(fā)明。實施例1從含有被囊化的反義L-myc-FITC(=熒光素標(biāo)記的)-寡脫氧核苷酸的流感病毒制備帶有全融合活性病毒體血凝素三聚體的陽離子脂小泡。制備DOTAP病毒體和DOTAP-磷脂酰膽堿(PC)-病毒體根據(jù)Skehel和Schild(1971)，美國國家科學(xué)院學(xué)報79:968-972所述從流感病毒株A/Singapore/6/86分離血凝素(HA)。簡要地說，病毒在母雞卵的尿囊腔中生長，并且通過在蔗糖梯度中超離心純化兩次。純化的病毒在含有7.9mg/ml氯化鈉，4.4g/ml檸檬酸三鈉·2H2O，2.1mg/ml 2-嗎啉乙烷磺酸，和1.2mg/mlN-羥基乙基-哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，pH7.3的緩沖液中是穩(wěn)定的。53ml含有345μgHA/ml的病毒懸浮液通過以100000×g超離心10分鐘沉淀。向流感病毒丸粒中加入含有145mM氯化鈉，2.5mM HEPES和54mg/ml非離子去污劑八乙二醇單十二烷基醚(OEG=C12E8),pH7.4的7.7ml緩沖的去污劑。通過在室溫下超聲2分鐘使沉淀完全溶解。溶液以100000×g超離心1小時。得到的上清含有溶解的HA三聚體(1.635mg HA/ml)和痕量的神經(jīng)氨酸酶。6mg DOTAP加入到3.7ml上清(6mg HA)中并溶解。溶液通過過0.2μm過濾器滅菌，然后轉(zhuǎn)移到含有1.15g滅菌微載體珠優(yōu)選Biobeads SM-2的玻璃容器中。通過使用購自Heidolph(Kelheim，德國)的搖動器REA×2將容器搖蕩1小時。如果必要，用0.58mgBiobeads重復(fù)最多3次。操作后得到稍透明的DOTAP病毒體溶液。
為了制備DOTAP-PC病毒體，將3mg DOTAP和3mgPC加入到含有6mgHA的上清中，并且溶解。接下來的步驟與對于DOTAP病毒體的描述相同。制備帶有合成的融合肽的病毒體制備膜中帶有合成的融合肽的陽離子病毒體的一種可能性包括下面的步驟1．根據(jù)Martin等，免疫球蛋白片段與先成小泡不可逆偶聯(lián)；生物化學(xué)雜志257:286-288(1982)的描述，在下面的反應(yīng)中通過交聯(lián)劑N-[γ-馬來酰亞胺丁?；趸鵠琥珀酰亞胺酯(GMBS)活化磷脂酰乙醇胺(PE)PE+GMBS→MBS-PE+N-羥基琥珀酰亞胺。
2．制備帶有活化PE(GMB-PE)脂小泡，其中根據(jù)上文對于含有DOTAP病毒體的HA的描述，將20％磷脂酰膽堿，70％DOTAP和10％GMB-PE溶解于緩沖的去污劑溶液中。接下來的制備脂小泡的步驟與對于DOTAP病毒體的描述相同。
3．偶聯(lián)合成的融合肽和脂小泡，其中使用包含20個氨基酸，具有氨基酸序列G-L-F-E-A-I-A-G-F-I-E-N-G-W-E-G-M-I-D-C的肽，其在N-末端包含一個游離氨基并且在C-末端包含一個酰胺基團(tuán)。因為C-末端的氨基酸是半胱氨酸，有一個游離硫醇基適于偶聯(lián)肽和脂小泡膜中的GMP-PE。
為了進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)PE-GMB膜+HS-Cys-肽→PE-GMB膜-S-Cys-肽在緩沖液(40mM檸檬酸，35mM磷酸二鈉，100mM氯化鈉，和2mM EDTA,pH5.5)中的新鮮制備的脂小泡溶液與相同緩沖液中的肽溶液混合?；旌衔镌?℃下在氮?dú)庵袦睾蛿嚢柽^夜。通過在High Load Superdex×200柱上凝膠過濾從未接合的肽中分離脂小泡。
作為可選擇的方法，融合肽也可以利用先成的PE-交聯(lián)劑-肽復(fù)合物與脂小泡偶聯(lián)，如下文對于Fab’片段的實施例所述。硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸結(jié)合到DOTAP病毒體中L-myc基因的反義和正義寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽(OPTs)被用作證明陽離子病毒體在轉(zhuǎn)染中的高效率的實施例。通過亞磷酰胺化合物合成5’-FITC-OPTs(Microsynth GmbH,Balgach,Switzerland)。分別使用十五體(5’-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3’)和十五聚體(5’-FITC-GCGGACATGGACTAC-3’)作為反義OPT和正義OPT?；旌系男蛄袑φ?msc)OPT由和合成的反義和正義OPTs一樣的相同長度核苷酸組成。
向下面各項加入1ml DOTAP病毒體或DOTAP-PC病毒體a)2mg反義FITC-OPT(1.3μmol),b)3.4mg正義FITC-OPT(1.3μmol)，和c)3.1mg msc FITC-OPT(1.3μmol)。
溶解FITC-OPTs，然后通過在26℃下超聲處理溶液2分鐘。通過在High Load Superdex×200柱(Pharmacia,Sweden)上凝膠過濾從病毒體中分離沒有被囊化的FITC-OPTs。用無菌PBS平衡柱子。含有帶有被囊化的FITC-OPT的DOTAP病毒體的外水體積級分用PBS洗脫并收集。
病毒體完全溶解于含有0.1％(v/v)Triton X-100的0.1M氫氧化鈉中后，熒光測定法測定病毒體-截留的FITC-OPT的濃度。為了校正熒光尺度，將溶解于上述去污劑溶液中的空DOTAP-病毒體的熒光設(shè)為0。利用先成磷脂酰乙醇胺-雙功能交聯(lián)劑分子復(fù)合物偶聯(lián)Fab’-片段和病毒體溶解于2.8ml檸檬酸緩沖液(100mM氯化鈉，40mM檸檬酸，35mMNa2HPO4·2H2O,2mM EDTA,pH5.5)中的3mg新鮮還原的來自鼠單抗抗-CD10-(抗CALLA)抗體的Fab’加入到含有0.5％正辛基-低聚-氧基乙烯的215μl檸檬酸緩沖液中的0.524mg N-[4-(對-馬來酰亞胺-苯基)-丁?；鵠磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)的溶液中。然后混合物在4℃在氮?dú)庀略跍睾蛿嚢柘屡嘤?。培育后通過一批400μl新鮮還原的濕硫丙基Sepharose 6B(Pharmacia,Sweden)去除沒有偶聯(lián)的MPB-PE。混合物在室溫下培育4小時。通過離心去除硫丙基Sepharose 6B，并將得到的溶液中和到pH 7.0。中和的溶液補(bǔ)加OEG(54mg/ml)。
根據(jù)上述制備的溶液加入到用于制備DOTAP病毒體的溶液中。在生成病毒體期間Fab’-MPB.PE分子被插入到脂質(zhì)雙分子層中。電子顯微鏡觀察DOTAP的電子照相證實了根據(jù)激光散射測定的具有平均直徑大約120-180nm的小泡的優(yōu)選的單層結(jié)構(gòu)。流感病毒的HA蛋白刺突清淅可見(圖1)。測定DOTAP病毒體的融合活性以通過Hoekstra等(1984)，生物化學(xué)23:5675-5681和Luscher等(1993),Arch.Virol.130:317-326描述的熒光去猝滅(dequencing)為基礎(chǔ)，通過定量測試測定本發(fā)明DOTAP病毒體的融合活性。通過向熒光探針的薄層干膜加入含有DOTAP和HA的緩沖的OEG(C12E8)溶液，接著振蕩5-10分鐘以溶解探針，然后按照上述“制備陽離子脂小泡…”的描述繼續(xù)，來將熒光探針氯化十八烷基羅丹明B(R18)(從Molecular Probes Inc.,Eugene，美國購得)以高密度插入到DOTAP病毒體的膜中。通過培育羅丹明標(biāo)記的DOTAP病毒體和脂質(zhì)體模型(DOTAP∶脂質(zhì)體磷脂=1∶20)，發(fā)現(xiàn)猝滅羅丹明的稀釋度。通過PERKIN-Elmer1000熒光分光光度計，分別在560和590nm激發(fā)波長和發(fā)射波長測定熒光。圖2給出了以熒光去猝滅百分比(％FDQ)表示的DOTAP病毒體的pH誘導(dǎo)的融合反應(yīng)。被囊化的反義-L-myc-FITC-OPT的細(xì)胞攝入證明用熒光素標(biāo)記OPT在研究DOTAP病毒體細(xì)胞攝入機(jī)理中非常有用。表達(dá)高水平L-myc基因(Nau等，1985；自然318,69-73)的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(ATCC-NCI-H209)在2-孔組織培養(yǎng)分室載玻片中生長(Nunc,Naperville,IL 60566,USA)。向細(xì)胞加入50μl FITC-OPT-病毒體。其在37℃培育5,15和30分鐘，用PBS沖洗兩次后用熒光顯微鏡檢查。如圖3所示，帶有被囊化的反義FITC-O PT的DOTAP病毒體快速結(jié)合到細(xì)胞中。通過胸苷結(jié)合方法測定反義-L-myc-FITC-OPT-DOTAP病毒體的生物作用的實驗以每孔每毫升1×105的初始濃度在24-孔Costar平板中培養(yǎng)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(ATCC-NCI-H209，美國典型培養(yǎng)物中心，Rockville，美國)。培育24小時后，去除培養(yǎng)基，并且加入含有0.5μCi14C-胸苷(由[2-14C]胸苷制備，52.0mCi/mmol；Ametsham，英國)的625μl新鮮培養(yǎng)基和含有0.2nmol或者反義，正義，或者msc FITC-OPTs的75μl DOTAP病毒體。培養(yǎng)物在37℃下在非常慢的攪拌下小心振蕩，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)器中。48小時后去除細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到離心管中離心。將得到的細(xì)胞沉淀沖洗兩次。當(dāng)細(xì)胞不能充分地分散到單一的細(xì)胞懸浮液中時，其主要顯露給胰蛋白酶/EDTA溶液。細(xì)胞沉淀溶解于1.5ml 0.1M氫氧化鈉/Triton-X-100(0.1％)溶液中。向1ml溶液中加入3ml液體閃爍混合物(ReadyProtein+,Beckman,Fullerton,CA,USA)。在液體閃爍計數(shù)器(Beckman,Fullerton,CA,USA)中計數(shù)14C-放射性。
圖4和5清楚地證明反義-L-myc-DOTAP病毒體超常的攝入和轉(zhuǎn)染效率。
圖6證明不表達(dá)L-myc的細(xì)胞不受反義-L-myc病毒體的影響或抑制。并且空病毒體沒有表現(xiàn)出對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的任何作用。因此表明用被囊化在本發(fā)明病毒體中的反義OPT的抗癌治療具有極大的潛力，特別是因為其沒有上文所提到的常規(guī)陽離子脂質(zhì)體的缺點(diǎn)。實施例2從含有被囊化的載體pcDNA3的流感病毒，將人IL-6基因克隆到多接頭位點(diǎn)(=pcDNA3-IL-6)，制備帶有全融合活性病毒血凝素三聚體的陽離子脂小泡制備DOTAP病毒體和摻入pcDNA3-IL-6
pcDNA3(Invitrogen Corporation,San Diego,USA)是5.4kb載體，為在真核宿主中高水平穩(wěn)定地和瞬時表達(dá)而設(shè)計。根據(jù)實施例1所述分離和純化HA。4mg DOTAP溶解于含有145mM氯化鈉，2.5mMHEPES和54mg/ml OEG(=C12E8),pH7.4的緩沖去污劑溶液中，并加入到含有4mg HA的2ml上清液中。向得到的混合物中加入100μgpcDNA3-IL-6并溶解。使溶液超聲30秒。如實施例1所述用Biobeads去除OEG。載有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒體轉(zhuǎn)染到鼠骨髓瘤細(xì)胞中得到的含有載有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒體的溶液用PBS稀釋1∶1000倍。分別將20μl和50μl含有1ng和2.5ng pcDNA-IL-6的該溶液加入到2×106骨髓瘤細(xì)胞(P3/SN1/1-Ag4-1；美國典型培養(yǎng)物中心，Rockville,USA)中。培育48小時后通過ELISA測試對細(xì)胞培養(yǎng)上清檢查人IL-6。測得每毫升含量為20-45 pg IL-6。比較載有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒體和載有pcDNA-IL-6的DOTAP脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率在用含有與DOTAP病毒體相同量的pcDNA-IL-6的常規(guī)DOTAP脂質(zhì)體(其沒有病毒融合肽)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)IL-6。為了得到和用載有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒體一樣的轉(zhuǎn)染結(jié)果，必須將載有pcDNA-IL-6的DOTAP脂質(zhì)體的量提高一千個單位(1000)!!實施例3從包含被囊化的載體pRSVcat的流感病毒制備帶有全融合活性病毒血凝素三聚體的陽離子脂小泡制備DOTAP和摻入pRSVcat表達(dá)載體pRSVcat(購自ATCC,Rockville,USA)包含編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的CAT基因。該酶催化乙?；月让顾氐囊阴；?CoA向3’-羥基位置轉(zhuǎn)移。CAT載體用來監(jiān)測一般情況下的轉(zhuǎn)染效率。
pRSVca在實施例2所述的條件下被被囊化到DOTAP病毒體中。載有pRSVcat的DOTAP病毒體轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞中
Jurkat細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)與不同量的載有pRSVcat的DOTAP病毒體(0.0001μl-25μl)培育。在37℃下培育48小時后，通過CAT-ELISA測試(Boehringer Mannheim，德國)測定Jurkat細(xì)胞中的CAT活性。
圖7a和7b證明通過加入0.01μl DOTAP病毒體可實現(xiàn)最大轉(zhuǎn)染。與上述相反，在相同培育條件下向Jurkat細(xì)胞加入0.01μl載有pRSVcat的DOTAP脂質(zhì)體沒有產(chǎn)生任何可檢測的CAT活性。實施例4細(xì)胞攝入病毒體病毒體進(jìn)入靶細(xì)胞可以分為兩個性質(zhì)不同的步驟1．附著2．穿入附著包括病毒體通過HA與細(xì)胞受體結(jié)合，細(xì)胞受體是帶有末端唾液酸的膜糖蛋白或糖脂質(zhì)。在特異病毒體情況下，F(xiàn)ab’片段將另外識別靶細(xì)胞表面上的抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通過兩個不同的結(jié)合機(jī)理附著靶細(xì)胞。因此特異病毒體對特異細(xì)胞類型具有選擇性。帶有識別腫瘤相關(guān)抗原例如TAG72,CEA,17-1A,CA19-9或白血病相關(guān)抗原例如CD10(CALLA)和CD20的病毒體將選擇性結(jié)合其細(xì)胞表面上帶有所述抗原的腫瘤或白血病細(xì)胞。小心分離和純化血凝素糖蛋白。沒有通過蛋白水解消化或者通過還原其分子內(nèi)二硫鍵(-S-S-)的滅活。
穿入包括病毒體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。病毒體誘捕到核內(nèi)體中。核內(nèi)體中的酸性pH(5-6)觸發(fā)病毒體膜與核內(nèi)體膜融合。融合通過病毒刺突糖蛋白血凝素(HA)介導(dǎo)。核內(nèi)體中的融合反應(yīng)將病毒體從其脂質(zhì)被膜釋放出來，并提供被囊化的藥物進(jìn)入胞質(zhì)溶膠的機(jī)會。通過熒光去猝滅方法測試這些病毒體制劑的融合活性。病毒體用熒光探針十八烷基若丹明B(R18)標(biāo)記，并且根據(jù)熒光去猝滅監(jiān)測HA的融合活性，歸因于來自病毒體的探針的稀釋物進(jìn)入脂質(zhì)體靶細(xì)胞膜。圖8給出向磷脂-脂質(zhì)體加入用R18標(biāo)記的DOTAP病毒體所發(fā)現(xiàn)的熒光。熒光度開始快速增加表明完整HA介導(dǎo)的融合。細(xì)胞的時間依賴性攝入通過培育細(xì)胞和14C-標(biāo)記的病毒體來測定病毒體的攝入。濃度為1×105/ml的P3/NSl細(xì)胞與40μl病毒體在37℃培育5,10,15,20和30分鐘。清洗后裂解細(xì)胞，并測定14C-標(biāo)記的病毒體的量。如表3所示，細(xì)胞攝入非?？煸诘谝粋€5分鐘，結(jié)合10％病毒體。更長培育時間不再提高攝入量。1ml病毒體溶液含有大約1011-1012病毒體，因此在5分鐘內(nèi)每個細(xì)胞結(jié)合4000-40000病毒體。表3
實施例5癌癥治療中的反義策略稱之為“反義”的寡脫氧核苷酸(ODN)是根據(jù)期望的mDNA目的核苷酸序列的可逆互補(bǔ)制備的DNA短的核苷酸序列。通過形成RNA-DNA雙鏈，信息的翻譯被阻止，而且促進(jìn)了RNaseH對分子的破壞。將ODN指向的癌基因編碼的mRNA運(yùn)送給癌細(xì)胞可能與細(xì)胞增殖的抑制有關(guān)，而且，在某些條件下與細(xì)胞死亡有關(guān)。
反義ODN具有作為治療劑的極大潛力。很多臨床前動物研究以及Ⅰ-Ⅲ期臨床試驗表明針對癌基因和病毒基因的反義ODN是有治療活性的。
功能DNA分子通過載有DNA脂質(zhì)體或常規(guī)病毒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中不是非常有效的。因此研究出帶有正電荷脂質(zhì)雙分子層(陽離子)的病毒體用于轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。帶正電荷脂質(zhì)雙分子層與核酸相互作用，并引起其集中在生成的小泡中。反義-L-mvc-病毒體最先在小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的L-myc基因常常在SCLC中擴(kuò)增和超表達(dá)。5’-FITC-硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸(OPT)通過亞磷酰胺化合物(Microsynth GmbH,Balgach,Switzerland)合成。分別使用十五體(5’-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3’)和十五聚體(5’-FITC-GCGGACATGGACTAC-3’)作為反義OPT和正義OPT?；旌系男蛄袑φ?msc)OPT由和合成的反義和正義OPT一樣的相同長度核苷酸組成。覆蓋翻譯起始位點(diǎn)的反義OPT通過抑制靶mRNA的核糖體翻譯而作用。反義-L-myc-硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸被被囊化到病毒體中。評價病毒體被囊化的-L-myc反義DNA在SCLC細(xì)胞系H209,H510和H82中的抗增殖效果。反義-L-myc病毒體加入到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞中。正義-L-myc病毒體和msc(混合的序列對照物)-病毒體用作對照(圖9)。
反義-L-myc病毒體比沒有被囊化的反義OPT活性大20000倍。為了誘導(dǎo)相同的效果，如圖10所示，不得不向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入微摩爾范圍內(nèi)濃度的沒有被囊化的-L-myc反義OPT。因此陽離子病毒體在運(yùn)送ODN中比沒有被囊化的ODN的細(xì)胞攝入有效得多，并且也比陽離子脂質(zhì)體更有效。
反義-L-myc病毒體的生長抑制效果用在三種SCLC細(xì)胞系，H209,H510和H82中L-myc表達(dá)的水平校正。從圖11得出結(jié)論，不表達(dá)L-myc基因的細(xì)胞不受反義-L-myc病毒體的影響?？贞栯x子病毒體對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞沒有顯示出任何作用或者只是極小的作用。因為L-myc基因經(jīng)常在SCLC中擴(kuò)增和超表達(dá)，并且在成人組織中非常限制地低水平地表達(dá)，L-myc可能是反義病毒體治療的好的靶物。實施例6用于基因治療的以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體的非傳染性轉(zhuǎn)移通過陽離子病毒體用于哺乳動物表達(dá)的載體的轉(zhuǎn)染現(xiàn)行癌基因治療方法使用以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體在來自體內(nèi)或體內(nèi)在人癌細(xì)胞中表達(dá)合適的靶基因。評價下面的治療性基因靶物敏感性基因，例如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(Moolten FL；癌癥研究46:5276-5281,1986)；指向免疫系統(tǒng)以減少癌細(xì)胞的基因，例如細(xì)胞因子基因(Tepper RI等；細(xì)胞57:503-512,1989)，共同刺激分子編碼基因(Townsend SE等；科學(xué)259:368-370,1993)，外來組織相容性基因(Plautz GE等；美國國家科學(xué)院學(xué)報90:4645-4649,1993)；和野生型腫瘤抑制基因的替代，例如p53(Chen PL等；科學(xué)250:1576-1580,1990)。
由于現(xiàn)今使用的用于基因治療的以病毒為基礎(chǔ)的載體的某些選擇性，例如基因轉(zhuǎn)移在指向目的腫瘤細(xì)胞中沒有特異性，而且因為，考慮到可能誘發(fā)第二惡性腫瘤，和重組生成復(fù)制的活性病毒，沒有安全性，所以需要開發(fā)以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的表達(dá)載體的體內(nèi)基因運(yùn)送的非傳染性基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。本文所公開的陽離子病毒體的應(yīng)用是許可替代的非傳染性，受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。
使用商購脂質(zhì)的一般的轉(zhuǎn)染效率在5-50％之間。不只是提供了比商購脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染率高的病毒體，而且還將DNA截留在病毒體中，也導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化作用。
人白介素6(IL-6)基因克隆到pcDNA3多接頭位點(diǎn)，設(shè)計在真核宿主中高度穩(wěn)定和瞬時表達(dá)的5.4kb載體。該載體包含新霉素抗性標(biāo)記，從SV40早期啟動子表達(dá)，以在G418存在下選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化物。
載體的被囊化作用通過3種不同方法進(jìn)行1．透析在生成病毒體的過程中被囊化質(zhì)粒。通過透析去除去污劑辛基-POE(購自Alexis Corp.,Laeufelfingen,Switzerland)。2．Biobeads在生成病毒體的過程中被囊化質(zhì)粒。通過Biobeads去除去污劑OEG。3．超聲通過DOTAP被囊化質(zhì)粒，并且得到的DOTAP-脂質(zhì)體通過超聲與DOTAP-病毒體融合。
制備14C-胸苷-標(biāo)記的pcDNA3-cIL-6-DNA來測定被囊化質(zhì)粒的量。被囊化方法 被囊化質(zhì)粒的量透析(1) 每μl病毒體0.02μgDNABiobeads(2) 每μl病毒體0.009μgDNA超聲(3) 每μl病毒體0.04μgDNASp2/0-Ag14細(xì)胞(雜交，非分泌型，鼠；ID-No:ATCC CRL-1581；本文命名為Sp2),P3/NSl/1-Ag4-1細(xì)胞(非分泌型骨髓瘤，鼠；ID-No:ATCC TIB-18；本文命名為P3/NSl)和NIH/3T3細(xì)胞(胚胎，接觸抑制型，NIH Swiss鼠ID-No:ATCC CRL-1658)，以1ml培養(yǎng)基中1×105的細(xì)胞濃度，通過病毒體制劑(1)-(3)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后10天，通過ELISA測定表達(dá)的IL-6的量(圖12，圖13，圖14)。所有的細(xì)胞系得自ATCC,1230lParklawn Drive,RockVille,Maryland,USA。
用G418兩次選擇轉(zhuǎn)染的Sp2和P3/NS1細(xì)胞。培養(yǎng)兩個月后再次測定IL-6的產(chǎn)生。在表4中列出了數(shù)據(jù)。表4通過用G418再選擇后的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的IL-6的產(chǎn)生
調(diào)節(jié)加入到細(xì)胞沉淀中的裂解緩沖液的體積，使每毫升得到大約2×106細(xì)胞數(shù)。實施例7白血病治療中的反義策略人白血病中最常見的遺傳不正常性是費(fèi)城染色體(Ph1)易位。原癌基因abl從染色體9易位到染色體22上的斷點(diǎn)聚簇區(qū)(bcr)，導(dǎo)致形成bcr-abl雜交基因。abl原癌基因正常編碼具有酪氨酸激酶活性的蛋白，所述酶促進(jìn)細(xì)胞攜帶bcr-abl雜交基因。在大部分慢性骨髓性白血病(CML)患者和在Ph1急性淋巴細(xì)胞白血病患者中發(fā)現(xiàn)bcr-abl轉(zhuǎn)錄物。指向CML中的bcr-abl基因很清楚是最合理的治療方法。與從bcr基因的第二或第三外顯子與c-abl的第二外顯子拼接產(chǎn)生的bcr-abl轉(zhuǎn)錄物的接頭互補(bǔ)的合成的ODN表現(xiàn)出體外抑制費(fèi)城1白血病細(xì)胞增殖，并且稀蔬正常骨髓先祖的生長(SzczylikC等；科學(xué)253:562-565,1991)。但是bcr-abl反義治療限于CML患者。
用于反義治療的另一種分子靶物是是myb基因。Myb，原癌基因c-myb的編碼產(chǎn)物，作為DNA結(jié)合特異性轉(zhuǎn)錄因子而起作用。其優(yōu)先在造血細(xì)胞中表達(dá)，并且是造血細(xì)胞增殖所必需的。指向c-myb的密碼子2-7的18-單體反義ODN強(qiáng)烈抑制或完全破壞白血病T-細(xì)胞系(CCRF-CEM)的克隆基因生長，以及所檢查的初期急性骨髓性白血病病例的78％，和5例初期慢性骨髓性白血病(CML)中的4例處于胚細(xì)胞危象中(Calabretta B等；美國國家科學(xué)院學(xué)報88:2351-2355,1991)。
凈化骨髓被作為治療幾種瘤中的組成部分，包括治療急性和慢性白血病。現(xiàn)在，通過各種各樣的試劑，例如免疫劑和化學(xué)治療劑從骨髓中清除白血病細(xì)胞。定向抗對白血病細(xì)胞生長有利的一種癌基因的病毒體被囊化的ODN被證明是有治療用途的，而且最重要的是，在減少白血病細(xì)胞的同時稀蔬正常先祖細(xì)胞方面，比常規(guī)化學(xué)治療劑更具選擇性。反義-c-myb病毒體制備相應(yīng)于c-myb密碼子2-9的正義和反義OPT。正義和反義c-myb分別是5’-GCCCGAAGACCCCGGC-3’和5’-TGTCCGGGGTCTTCGGGC-3’。通過用于L-myc DOTAP病毒體的相同的方法將OPT被囊化到DOTAP-病毒體中。人骨髓白血病細(xì)胞系KG-1和人急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系CEM-C3顯露給正義和反義c-myb病毒體。KG-1細(xì)胞的增殖取決于原癌基因myb基因的產(chǎn)生，而CEM-C3細(xì)胞不取決于myb基因的產(chǎn)生。KG-1細(xì)胞分別與含有18,36，和72pmol正義和反義OPT的25,50和100μl正義和反義c-myb病毒體培育。在第2,3和4天測定細(xì)胞數(shù)。
加入25μl正義和反義c-myb病毒體只是邊緣影響細(xì)胞生長(圖15)。但是加入50μl(圖16)和100μl(圖17)強(qiáng)烈抑制細(xì)胞的生長。較高劑量的正義c-myb病毒體也顯示出抑制作用。認(rèn)為這些作用不是由病毒體膜產(chǎn)生的，因為CEM-C3細(xì)胞不受相同病毒體制劑影響(圖18)。說明書中使用的縮寫2’-Ome2’-O甲基CALLA 常見急性成淋巴細(xì)胞白血病抗原CAT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶DOTAP N-[(1,2,3-二油?；趸?-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯DOTMA 氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基銨FITC-OPT 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽G418 Geneticin二硫化物(抗生素G418)HA 血凝素IL-6 白細(xì)胞介素6MPB.PE N-[4-(對-馬來酰亞胺)-苯基丁?；鵠-磷脂酰乙醇胺(=交聯(lián)劑-磷脂復(fù)合物)msc混合的序列對照物NA 神經(jīng)氨酸酶Octyl-POE 正辛基-低聚-氧基乙烯ODN寡脫氧核苷酸OEG八乙二醇單十二烷基醚(C12E8)OPT寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽(類)PC 磷脂酰膽堿PE 磷脂酰乙醇胺PNA肽核酸SCLC 小細(xì)胞肺癌SV40 猿病毒40
權(quán)利要求書1．帶有包含陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)正電荷脂雙分子層膜的脂小泡，其中脂小泡進(jìn)一步包含至少一種功能活性病毒融合肽和至少一種與膜連接的細(xì)胞特異性標(biāo)記，和優(yōu)選地期望的用于向靶細(xì)胞運(yùn)送的物質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的小泡，其中膜包含-以總的脂質(zhì)為基礎(chǔ)的--90-95％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或-45-90％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰膽堿。
3．權(quán)利要求1或2的小泡，其中(ⅰ)陽離子脂質(zhì)包括至少-種選自下面的脂質(zhì)氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA),N-[(1,2,3-二油?；趸?-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)1,3-二棕櫚酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油?；趸?1,4-丁二銨(THDOB)。
4．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其中融合肽選自血凝素三聚體或單體，其一種或兩種裂解的亞單位，糖肽HA1和HA2，從天然來源分離的融合肽，和合成的融合肽。
5．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其中膜進(jìn)一步包含至少一種雙功能交聯(lián)劑，并且其中至少一種融合肽和/或至少一種細(xì)胞特異性標(biāo)記通過所述交聯(lián)劑與膜連接。
6．權(quán)利要求5的小泡，其中膜進(jìn)一步包含磷脂酰乙醇胺，并且交聯(lián)劑通過與磷脂酰乙醇胺共價鍵合與膜連接，并且其中交聯(lián)劑進(jìn)一步分別鍵合融合肽的游離的硫醇基或細(xì)胞特異性標(biāo)記。
7．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記選自單克隆抗體，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)ab’片段，細(xì)胞因子和生長因子。
8．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，進(jìn)一步包含截留在所述小泡中的所需的遺傳物質(zhì)，優(yōu)選選自短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶，基因，質(zhì)粒和載體。
9．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其直徑為120-180nm。
10．權(quán)利要求1定義的小泡的制備方法，包括步驟a)將至少一種天然的或合成的病毒融合肽溶解于含有非離子去污劑的合適的緩沖液中；b)加入到來自步驟a)的溶液中并將陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)溶解于其中；c)進(jìn)一步加入磷脂酰乙醇胺(PE)，交聯(lián)劑，和至少一種能結(jié)合交聯(lián)劑的細(xì)胞特異性標(biāo)記，優(yōu)選包括選自交聯(lián)劑活化的磷脂酰乙醇胺(PE/交聯(lián)劑)和PE/交聯(lián)劑/標(biāo)記復(fù)合物的先成分子復(fù)合物；d)任選地進(jìn)一步加入磷脂酰膽堿；e)通過用微載體珠，優(yōu)選聚苯乙烯Biobeads SM-2，處理溶液來去除去污劑，結(jié)果生成正電荷脂雙分子層小泡；和f)優(yōu)選向步驟e)得到的小泡加定量的向靶細(xì)胞運(yùn)送的期望的物質(zhì)，超聲混合物，將物質(zhì)整合到小泡中，并通過凝膠過濾去除沒有整合的物質(zhì)。
11．制備權(quán)利要求1定義的小泡的方法，包括步驟a)將陽離子脂質(zhì)和/或聚陽離子脂質(zhì)溶解于含有非離子去污劑的合適的緩沖液中；b)將磷脂酰乙醇胺(PE)和雙功能交聯(lián)劑，優(yōu)選包括先成的PE/交聯(lián)劑復(fù)合物加入到來自步驟a)的溶液中；或者可選擇地b’)將磷脂酰乙醇胺(PE)，雙功能交聯(lián)劑，至少一種融合肽和至少一種細(xì)胞特異性標(biāo)記，優(yōu)選包括選自PE/交聯(lián)劑，PE/交聯(lián)劑/融合肽，和PE/交聯(lián)劑/標(biāo)記物的先成的分子復(fù)合物加入到來自步驟a)的溶液中，并且刪除步驟e)；c)任選地進(jìn)一步加入磷脂酰膽堿；
d)通過用微載體珠，優(yōu)選聚苯乙烯Biobeads SM-2，處理溶液來去除去污劑，結(jié)果生成正電荷脂雙分子層小泡；e)向小泡加至少一種病毒融合肽和至少一種能結(jié)合交聯(lián)劑的細(xì)胞特異性標(biāo)記；和f)優(yōu)選向步驟e)得到的小泡加定量的向靶細(xì)胞運(yùn)送的期望的物質(zhì)，超聲混合物，將物質(zhì)整合到小泡中，并通過凝膠過濾去除沒有整合的物質(zhì)。
12．權(quán)利要求10或11的方法，其中(ⅰ)陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)氯化N-[(1,2,3-二油?；趸?丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)1,3-二棕櫚酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酸氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油?；趸?N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨(DOSPA)；1,3-二油?；趸?2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N'-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二銨(THDOB)。
13．權(quán)利要求10-12一項或幾項的方法，其中所述緩沖液是HEPES緩沖液，并且每毫升進(jìn)一步含有10-250μmol所述的非離子去污劑，優(yōu)選選自八乙二醇單十二烷基醚和正辛基-低聚-氧基乙烯。
14．權(quán)利要求10-13一項或幾項的方法，其中所述病毒融合肽選自血凝素三聚體或單體，其一種或兩種裂解的亞單位，糖肽HA1和HA2，從天然來源分離的融合肽，和合成的融合肽。
15．權(quán)利要求10-14一項或幾項的方法，其中脂質(zhì)包含-以總的脂質(zhì)量為基礎(chǔ)的-或者-90-95％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或-45-90％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰膽堿。
16．權(quán)利要求10-15一項或幾項的方法，其中所述微載體珠具有濕篩目20-50(0.84-0.30mm)，而且用所述微載體珠處理步驟(c)中的溶液最多4次。
17．權(quán)利要求10-16一項或幾項的方法，其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記選自單克隆抗體，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)ab’片段，細(xì)胞因子和生長因子。
18．權(quán)利要求10-17一項或幾項的方法，其中所述交聯(lián)劑是異雙功能琥珀酰亞胺基衍生物，優(yōu)選選自雙-N-琥珀酰亞胺基衍生物和光反應(yīng)性琥珀酰亞胺基衍生物。
19．權(quán)利要求10-18一項或幾項的方法，其中所述先成分子復(fù)合物PE/交聯(lián)劑/融合肽或PE/交聯(lián)劑/細(xì)胞特異性標(biāo)記通過一個反應(yīng)而獲得，其中融合肽或細(xì)胞特異性標(biāo)記通過硫醇基鍵合共價連接的交聯(lián)劑/PE分子的交聯(lián)部分，優(yōu)選選自N-[4-(對-馬來酰亞胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-磷脂酰乙醇胺(MCC.PE)。
20．權(quán)利要求19的方法，其中沒有反應(yīng)的交聯(lián)劑-磷脂酰乙醇胺分子，特別是沒有反應(yīng)的MPB.PE或MCC.PE通過凝膠層析，優(yōu)選通過用瓊脂糖基質(zhì)的親和層析，最優(yōu)選通過還原的硫代丙基瓊脂糖6B，從反應(yīng)產(chǎn)物中去除。
21．權(quán)利要求10-20一項或幾項的方法，其中所述所需的運(yùn)送物質(zhì)是遺傳物質(zhì)，選自短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶，基因，質(zhì)粒和載體。
22．權(quán)利要求1-9一項或幾項定義的和/或通過權(quán)利要求10-21一項或幾項定義的方法可得到正電荷脂小泡，作為藥物運(yùn)送，特別是用于向靶細(xì)胞或組織，特別是向靜止或增殖哺乳動物細(xì)胞特異性且非傳染性運(yùn)送期望的遺傳物質(zhì)的載體系統(tǒng)。
23．權(quán)利要求22的正電荷脂小泡，用于診斷或藥物應(yīng)用，特別是用于人或動物預(yù)防性和/或治療性處理。
24．權(quán)利要求22或23的正電荷脂小泡，優(yōu)選包含至少一種適于反義治療的反義寡核苷酸用于治療選自癌癥，白血病，和病毒感染的疾病。
25．權(quán)利要求24的正電荷脂小泡，其中反義寡核苷酸靶向原癌基因或癌基因編碼的mRNA。
權(quán)利要求
1．帶有正電荷脂雙分子層膜的脂小泡，包括陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和至少一種在膜中整合的或者與膜共價連接的天然的或合成的病毒融合肽。
2．權(quán)利要求1的小泡，其中膜包含-以總的脂質(zhì)為基礎(chǔ)的-(ⅰ)100％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)；或(ⅱ)90-95％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰膽堿。
3．權(quán)利要求1或2的小泡，其中(ⅰ)陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自如下的脂質(zhì)氯化N-[(1,2,3-二油?；趸?丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’-十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)1,3-二棕櫚酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油?；趸?N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨(DOSPA)；1,3-二油?；趸?2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N'-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二銨(THDOB)。
4．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其中融合肽選自血凝素三聚體或單體，其一種或兩種裂解的亞單位，糖肽HA1和HA2，從天然來源分離的融合肽，和合成的融合肽。
5．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其中膜進(jìn)一步包含至少一個細(xì)胞特異性標(biāo)記和至少一種雙功能交聯(lián)劑，并且其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記與所述膜通過所述交聯(lián)劑連接。
6．權(quán)利要求5的小泡，其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記選自單克隆抗體，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)ab’片段，細(xì)胞因子和生長因子。
7．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，進(jìn)一步包含截留在所述小泡中的所需的遺傳物質(zhì)，優(yōu)選選自短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-0Me-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶，基因，質(zhì)粒和載體。
8．前面一項或幾項權(quán)利要求的小泡，其直徑為120-180nm。
9．制備帶有正電荷脂雙分子層膜和至少一種病毒融合肽的小泡的方法，其中a)將至少一種天然的或合成的病毒融合肽溶解于含有非離子去污劑的合適的緩沖液中；b)將陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)加入到溶液中并溶解；和c)通過用聚苯乙烯微載體珠，優(yōu)選Biobeads SM-2處理溶液而去除去污劑，導(dǎo)致生成含有所述正電荷脂雙分子層小泡的懸浮液。
10．權(quán)利要求9的方法，其中(ⅰ)陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA),N-[(1,2,3-二油?；趸?-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’-十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚陽離子脂質(zhì)包括至少一種選自下面的脂質(zhì)1,3-二棕櫚酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基酰氨基-甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-雙(2-羥基乙基)-2,3-二油?；趸?1,4-丁二銨(THDOB)。
11．權(quán)利要求9或10的方法，其中所述緩沖液是HEPES緩沖液，并且每毫升進(jìn)一步含有10-250μmol所述的非離子去污劑，優(yōu)選選自八乙二醇單十二烷基醚和正辛基-寡-氧基乙烯。
12．一項或幾項權(quán)利要求9-11的方法，其中所述病毒融合肽選自血凝素三聚體或單體，其一種或兩種裂解的亞單位，糖肽HA1和HA2，從天然來源分離的融合肽，和合成的融合肽。
13．一項或幾項權(quán)利要求9-12的方法，其中磷脂酰膽堿和/或磷脂酰乙醇胺與步驟(b)的溶液混合。
14．權(quán)利要求9-13一項或幾項的方法，其中向步驟(b)的溶液中進(jìn)一步加入至少一種細(xì)胞特異性標(biāo)記和雙功能交聯(lián)劑，優(yōu)選由磷脂酰乙醇胺，雙功能交聯(lián)劑和細(xì)胞特異性標(biāo)記組成的先成分子復(fù)合物形式。
15．權(quán)利要求9-14一項或幾項的方法，其中步驟(b)包括加入-以總的脂質(zhì)量為基礎(chǔ)的-或者(ⅰ)100％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)；或(ⅱ)90-95％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰膽堿。
16．權(quán)利要求9-15一項或幾項的方法，其中所述微載體珠具有濕篩目20-50(0.84-0.30mm)，而且用所述微載體珠處理步驟(c)中的溶液最多4次。
17．權(quán)利要求9-16一項或幾項的方法，其中期望的遺傳物質(zhì)被加入到步驟(b)的溶液中。
18．權(quán)利要求9-16一項或幾項的方法，其中期望的遺傳物質(zhì)被加入到步驟(c)的小泡懸浮液中，其后對得到的混合物超聲以將所述期望的遺傳物質(zhì)摻入到所述小泡中，并且從小泡中分離沒有結(jié)合的物質(zhì)，優(yōu)選通過凝膠過濾。
19．權(quán)利要求14-18一項或幾項的方法，其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記選自單克隆抗體，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)ab’片段，細(xì)胞因子和生長因子。
20．權(quán)利要求14-19一項或幾項的方法，其中所述交聯(lián)劑是異雙功能琥珀酰亞胺基衍生物，優(yōu)選選自雙-N-琥珀酰亞胺基衍生物和光反應(yīng)性異雙功能交聯(lián)劑。
21．權(quán)利要求14-20一項或幾項的方法，其中所述先成分子復(fù)合物從反應(yīng)混合物中獲得，其中所述細(xì)胞特異性標(biāo)記通過硫醇基鍵合共價連接的交聯(lián)劑-磷脂酰乙醇胺分子的交聯(lián)部分，優(yōu)選選自N-[4-(對-馬來酰亞胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-磷脂酰乙醇胺(MCC.PE)。
22．權(quán)利要求21的方法，其中沒有反應(yīng)的交聯(lián)劑-磷脂酰乙醇胺分子，特別是沒有反應(yīng)的MPB.PE或MCC.PE通過凝膠色譜，優(yōu)選通過用瓊脂糖基質(zhì)的親和層析，最優(yōu)選通過還原的硫代丙基瓊脂糖6B，從反應(yīng)混合物中去除。
23．權(quán)利要求9-22一項或幾項的方法，其中所述所需的遺傳物質(zhì)選自短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶，基因，質(zhì)粒和載體。
24．權(quán)利要求1-8任一項定義的和/或通過權(quán)利要求9-23任一項定義的方法可得到的用于向靶細(xì)胞或組織特異性或非特異性運(yùn)送遺傳物質(zhì)的正電荷脂小泡。
25．權(quán)利要求1-8任一項定義的和/或通過權(quán)利要求9-23任一項定義的方法可得到的用作藥物，優(yōu)選用于人和/或動物預(yù)防性和/或治療性處理的正電荷脂小泡。
26．帶有正電荷脂雙分子層膜的脂小泡作為藥物運(yùn)送的載體系統(tǒng)的用途，該小泡包含陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，至少一種在膜中整合的或者與膜共價連接的天然的或合成的病毒融合肽，和優(yōu)選地至少一種與膜連接的細(xì)胞特異性標(biāo)記。
27．權(quán)利要求26的用途，用于向靜止或增殖的哺乳動物細(xì)胞非傳染性轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。
28．帶有正電荷脂雙分子層膜的脂小泡制備用于治療癌癥的藥物組合物的用途，該小泡包含陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì)，至少一種在膜中整合的或者與膜共價連接的天然的或合成的病毒融合肽，和優(yōu)選地至少一種與膜連接的細(xì)胞特異性標(biāo)記。
29．權(quán)利要求26-28任一項的用途，其中融合肽選自血凝素三聚體或單體，其一種或兩種裂解的亞單位，糖肽HA1和HA2，從天然來源分離的融合肽，和合成的融合肽。
30．權(quán)利要求26-29任一項的用途，其中細(xì)胞特異性標(biāo)記選自單克隆抗體，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)ab’片段，細(xì)胞因子和生長因子。
31．權(quán)利要求26-30任一項的用途，其中小泡進(jìn)一步包含所需的遺傳物質(zhì)，優(yōu)選選自短鏈DNA或RNA，脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸硒酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸硫代磷酸鹽，寡脫氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脫氧核糖核苷酸甲基膦酸鹽，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸鹽，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸鹽，核酶，基因，質(zhì)粒和載體。
32．權(quán)利要求26-31任一項的用途，其中小泡包含至少一種適于反義治療癌癥，白血病，和病毒感染的反義寡核苷酸。
33．權(quán)利要求32的用途，其中反義寡核苷酸靶向原癌基因或癌基因編碼的mRNA。
34．權(quán)利要求1-8任一項定義的和/或通過權(quán)利要求9-23任一項定義的方法可得到的正電荷脂小泡用于制備用于診斷應(yīng)用和/或用于人或動物預(yù)防性和/或治療性處理的藥物組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及體外和體內(nèi)向靜止或增殖哺乳動物細(xì)胞有效運(yùn)送遺傳物質(zhì)的正電荷病毒體。該病毒體膜包含陽離子和/或聚陽離子脂質(zhì),至少一種病毒融合肽和優(yōu)選地至少一種細(xì)胞特異性標(biāo)記,該細(xì)胞特異性標(biāo)記有利地選自單克隆抗體,抗體片段F(ab’)
文檔編號A61K31/00GK1225007SQ97196232
公開日1999年8月4日 申請日期1997年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月8日
發(fā)明者E·R·維爾蒂, R·格呂克, P·克萊恩 申請人:尼卡健康產(chǎn)品有限公司