專利名稱：合成和標準化的朊病毒感染性材料，及其作為感染性接種物的應(yīng)用的制作方法
專利說明合成和標準化的朊病毒感染性材料，及其作為感染性接種物的應(yīng)用 本發(fā)明涉及合成的、標準化的朊病毒類材料及其作為感染性接種物的應(yīng)用。
發(fā)明領(lǐng)域 術(shù)語傳染性海綿狀腦炎(TSE)描述了一組遺傳性或獲得性疾病，其特征在于已知在人類中可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(SNC)退化，如同在其它克雅病(creutzfeld-Jacob disease，CJD)中那樣，但是也可以影響其它哺乳動物例如綿羊(羊瘙癢癥)和牛(牛海綿狀腦炎)。這些疾病的病原因素的性質(zhì)使得它們被歸為一組，稱為“非常規(guī)傳染因子”(NCTAs)。盡管病因因素尚不了解，但是這些疾病的特征是存在被稱為朊病毒蛋白(PrP)的細胞外蛋白。PrP在疾病進程中變成不可溶的形式，這樣至少部分對抗蛋白酶例如蛋白酶K，并且在細胞中積累，致其死亡。PrP的這種異常和病原形式，被稱為PrPsc，是朊病毒蛋白PrP的構(gòu)象變化的結(jié)果。已經(jīng)證明編碼PrP的基因表達或其翻譯中的修飾沒有變化(P.Brown，Transfusion，41，4333-436，2001和D.Vlkel等，Transfusion，41，441-448，2001)。
我們對于TSE的了解主要來自體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的研究。因此，編碼PrPsc的基因已經(jīng)失活的小鼠，變得對實驗誘導的疾病有高度抗性。相反，表達(或過量表達)從患有家族性TSE的患者的PrP基因或外來基因克隆到的病理性轉(zhuǎn)入基因的小鼠和細胞培養(yǎng)物，模擬了相應(yīng)的疾病，或者對從感染患者獲得的、屬于轉(zhuǎn)基因同一物種的接種物敏感。轉(zhuǎn)基因細胞系也被用作體外模型，以測試與PrP到PrPsc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變相互作用的分子。
在目前獲得的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，不可能證實引起TSE的感染性因素在血液或血液制品中以傳染性形式存在(參見前面P.Brown)。但是，也不可能證明它不存在，一方面由于血液中的水平可能非常低的可能性，另一方面由于對象感染患者后，疾病的潛伏期非常長。
已知某些醫(yī)藥產(chǎn)品的來源，例如，涉及人類或動物來源的生物起始材料，有可能被NCTA污染(血液、器官、骨、皮膚、血漿、胎盤或細胞培養(yǎng)物)，或者是通過用可能污染起始材料(培養(yǎng)基，生長因子)的工藝獲得的，因此制藥工業(yè)目前正在評估用于獲得或處理生物醫(yī)藥制品的工藝的效能、用于消除NCTAs的設(shè)備去污染步驟的效能、以及最后密閉(confinement)步驟的效能。
由于對于所有NCTAs來說，共同的唯一已知傳染性因素(即能夠傳播疾病的因素)是病原形式的朊病毒蛋白PrPsc，因此，評估的是這些方法在消除或密閉PrPsc方面的效能。
PrPsc的令人吃驚的抗性，事實上預先就排除了使用現(xiàn)有的能夠減少例如可低溫沉淀的血漿蛋白(因子VIII，von Willebrand因子等)這樣的血液制品中的病毒含量的經(jīng)典的失活方法(例如用TWEEN-TNBP溶劑/去污劑處理)。
現(xiàn)有技術(shù) 這些用于評估和/或控制獲得或處理生物醫(yī)藥制品的程序的效能、消除PrPsc的設(shè)備去污染的效能和密閉步驟的效能的方法，必須包括 -在生物物質(zhì)被獲得、或處理或去污染之前、期間或之后，對其中PrPsc的滴定方法 -以及感染性接種物，即允許生物制品或設(shè)備的污染用已知的感染性PrPsc滴度去污染的感染性材料，其中的變化可以監(jiān)測。
作為PrPsc的滴定方法，下列的方法是已知的。
總的來說，朊病毒感染性滴定通過用不同稀釋度的添加PrPsc的待測制品，腦內(nèi)接種實驗室動物來進行，例如已經(jīng)適應(yīng)了來自其它動物、特別是金色倉鼠的感染性TSE株的嚙齒動物，或表達與感染源PrPsc相同物種的PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠。根據(jù)在對應(yīng)于所用稀釋度的不同組中感染的動物的數(shù)量，可以計算感染滴度。然而，該方法耗時、耗費，并且難以在工業(yè)規(guī)模上發(fā)展。對于綿羊瘙癢癥來說，在腦內(nèi)注射后在金色倉鼠中的潛伏期是75天。
此外，已有滴定方法可用于TSE感染性因素的體外滴定。它們用于以Western印跡(Ironside J.W.等，J.of Thrombosis and Haemostasis，1，1479-1486，2003)或ELISA的PrPsc檢測中。這些方法或者包括使用蛋白酶K對待分析的樣品進行初步消化，或者包括使用離液序列高的試劑進行變性以從正常蛋白(PrP)中鑒別病原性蛋白(PrPsc)。事實上，抗體檢測的是對蛋白酶K有抗性的朊病毒蛋白片段，被稱為PrPres。最近，在使用不識別PrP的特異性PrPsc抗體的基礎(chǔ)上開發(fā)了另一種滴定方法。
同樣地，在專利申請WO 04/02179中，申請人描述了用于NCTA的體外滴定方法，使用了支持對應(yīng)于前述NCTA的PrPsc的復制、并導致存在于待測生物物質(zhì)中的PrPsc量增加的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞株，以及使用這種滴定方法作為用于獲得或處理可能被NCTA污染的生物制品的工藝方法的體外評估和/或控制方法的一部分、或作為用于設(shè)備去污染的工藝方法的體外評估和/或控制方法的一部分。該滴定方法能夠計算可能被NCTA污染的生物制品的PrPsc的感染滴度。
本申請中的實施例A和B是參考實施例，回憶了專利申請WO04/02179中描述的滴定方法的可行性、及其用于評估納濾步驟對PrPsc消除的效能。
至于適合于這些方法的感染性接種物的選擇，選擇極為有限。
迄今為止，使用的都是一個感染源含有感染的腦勻漿的感染性接種物。
在大多數(shù)情況下，這些勻漿從通過腦內(nèi)接種感染物質(zhì)而被感染的實驗室動物、特別是嚙齒動物中獲得。
Miekka等公開了使用從用倉鼠263K瘙癢癥蛋白作為25％白蛋白溶液的感染性接種物感染的倉鼠中獲得的腦勻漿，來評估γ輻射關(guān)于倉鼠PrPsc失活同時保留人類白蛋白的完整性方面的效能。
使用從感染了新變種克雅病(vCJD)的對象獲得的以及可從國立生物標準和控制研究所(National Institute for Biological Standard andControls，NIBSC)獲得的標準腦和脾制品，也是可能的。它們含有10％的組織勻漿，被分成等量小份并保存。它們體現(xiàn)出作為人類來源的感染性物質(zhì)的優(yōu)勢。
Stenland等(“在從人類血漿中純化治療性蛋白的過程中人類和綿羊形式的病原性朊病毒蛋白的分配”(″Partitioning of human andsheep forms of the pathogenic prion protein during the purification oftherapeutic proteins from human plasma″)，TRANSFUSION，Vol 42，2002年11月)通過多種人類血漿蛋白純化步驟，在消除疾病方面，比較了從幾個物種獲得的、并且感染了不同疾病的多種腦勻漿。他們使用了下面的腦勻漿作為感染性接種物 -人類，感染了新變種克雅病(National CJD Surveillace Unit，愛丁堡，蘇格蘭) -人類，感染了散發(fā)性克雅病(NIH Laboratory of CNS Studies，Bethesda，MD) -人類，感染了GSS綜合癥(Gertsmann-Strussler-Scheinker)(New York State Institute for Basic Research in DevelopmentalDisabilities，Staten Island，NY) -綿羊，感染了羊瘙癢癥(CaineVeterinary Teaching Center，University of Idaho，Moscow，ID) -倉鼠，感染了適應(yīng)倉鼠的263K瘙癢癥株 勻漿通過將1g組織分散在9倍體積冷TBS(Tris緩沖鹽水)中然后進行勻漿來制備。
他們的結(jié)論是，感染了適應(yīng)倉鼠的263K瘙癢癥的倉鼠的腦勻漿，是感染了上述不同NCTAs的人類腦勻漿的合適替代品。
Vey等(“摻料試劑的純度影響血漿蛋白純化中朊病毒的分配”“Purity of Spiking Agent Affects Partitioning of Prions in Plasma ProteinPurification”，Biologicals，2002，30，187-196)通過不同的血漿蛋白純化工藝，以PrPsc滴度量度，在消除感染性接種物方面，比較了純度不同的不同形式的感染性接種物，即腦勻漿、微粒體膜級份、“細胞膜穴樣內(nèi)陷(caveolae)樣”功能域(特化的膜區(qū)室)、純化的PrPsc(Bolton等，完整的瘙癢癥因素蛋白的分離和結(jié)構(gòu)研究，Isolation and structuralstudies of the intact scrapie agent protein，Arch Biochem Biophys.1987Nov 1；258(2)579-90)。腦勻漿被制備成冷TBS中10％的分散液，然后在Ultra Turrax上勻漿。他們的結(jié)論是，為了最佳刺激從血液中消除理論上的朊病毒污染物，應(yīng)該優(yōu)選使用具有不同性質(zhì)的不同感染性接種物。
美國專利6,020,537公開了使用表達與感染源同一物種的PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠，來生產(chǎn)用于檢測朊病毒的參比樣品。
Haemosan LSS GmbH公司(Herwig Reichl教授)使用了添加瘙癢癥139A株作為實驗添加物的SMB淋巴細胞系，來評估獲得易于被NCTA污染的生物制品的步驟，以及它們消除NCTA的能力。該細胞系不是轉(zhuǎn)基因的，產(chǎn)生極低的感染性水平，這成為評估獲得生物源制品的生產(chǎn)工藝中步驟的主要障礙。
技術(shù)難題 使用腦勻漿作為感染性接種物，引起了與待測制品或與消除/失活方法不相容的技術(shù)難題。
事實上，腦提取液中的高脂類含量可以誘導進入腦聚集物的生物產(chǎn)品的吸附；同樣地，產(chǎn)生的不溶性可以人為增加PrPsc作為感染物質(zhì)的折減系數(shù)，其行為與可溶性物質(zhì)不同，例如它可以堵塞濾膜，或者在要去污染的設(shè)備表面干燥。
當然，可以使用稀釋的腦勻漿。但是，這與高感染性滴度不相符合，特別是因為勻漿已經(jīng)被稀釋到10％腦重量/稀釋液體積。
使用腦勻漿作為感染性接種物，也產(chǎn)生如下的問題 -PrPsc復制所需的潛伏期 -實驗動物的花費 -需要合格的工作人員操作實驗室動物 -工業(yè)規(guī)模的放大 -樣品與樣品的可重復性 -以及同時，與動物的使用和故意感染有關(guān)的明顯的倫理考慮。
此外，感染的腦質(zhì)難以標準化。事實上，很難重復在來自用感染性物質(zhì)腦內(nèi)接種的動物腦中的感染劑量。特別是在所用的感染物質(zhì)本身就是具有未知的感染性載量的腦勻漿的情況下。
最后，腦勻漿模型本身表現(xiàn)得難以適合血液中的潛在感染形式，并且難以適合在完全不同的環(huán)境中存在。
因此，鑒定出新的、與感染的腦勻漿表現(xiàn)出的PrPsc感染滴度相當甚至更高的感染滴度的感染源，顯得是必需的。這種新感染源也應(yīng)該表現(xiàn)出優(yōu)點，即既能夠免除上面提到的與使用腦勻漿有關(guān)的問題(溶解性、標準化、儲存、可重復性、簡化培養(yǎng)條件)，又能夠允許它用做感染性接種物，用于獲得或處理生物制品的步驟所用的評估和/或控制方法，以及用于設(shè)備去污染步驟。
發(fā)明簡述 本申請人以一種不尋常的方式正好鑒定到了這樣一種合成的、標準化的、可溶的、可重復的并易于操作的新感染源，由來自表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液組成，其PrPsc的感染性滴度大于用PrPsc感染的動物腦勻漿的感染性滴度的50％、特別是75％，在優(yōu)選實施方案中為100％。
在本發(fā)明中描述的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，可以通過本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員已知的方法標準化和穩(wěn)定化。
該細胞裂解液或培養(yǎng)上清液可以用做感染性接種物 -作為用于獲得或處理易于被NCTA污染的生物制品的步驟、特別是用于純化血液血漿制品衍生物的步驟、特別是層析方法或納濾方法的評估和/或控制方法的一部分。
-用于評估和/或控制易于被NCTA污染的設(shè)備的去污染過程的方法。
-用于評估化合物抑制NCTA感染性的方法。
無論被NCTA感染的物種是什么，獲得無限量的這種具有高感染滴度的感染性接種物是可能的，特別是人類，因為所用的細胞株允許感染性材料在體外擴增。
本申請人鑒定到了唯一一種可以不依靠使用病人腦質(zhì)就獲得感染性人類材料的方法。
同樣地，本發(fā)明的感染性材料免去了對使用羊瘙癢癥或牛海綿狀腦炎感染的羊或牛腦組織收集物的需要。
發(fā)明詳述 因此，本發(fā)明涉及從表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc的復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞獲得的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其PrPsc的感染性滴度大于用所述PrPsc感染的10％動物腦勻漿的感染性滴度的50％、特別是75％、優(yōu)選100％。
使用本發(fā)明的這種穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細胞表現(xiàn)出許多優(yōu)點，尤其是材料的無限生產(chǎn)和立即可用的可能性，因為它被分泌到培養(yǎng)上清液中。
Vilette等(PNAS，Mars 2001，98(7)，4055-4059)證明了表達羊PrP(轉(zhuǎn)基因)的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因兔上皮細胞，在用含有羊PrPsc的提取液感染后，能夠復制羊PrPsc。他們設(shè)計的細胞模型Rov9株，誘導表達外源性PrP，保證了它在暴露于感染性物質(zhì)的細胞中，積累PrPsc所必需的潛伏期內(nèi)得到維持。這種支持PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞，適合用于本發(fā)明的感染性材料的生產(chǎn)中。
Archer等(Journal of Virology，Jan.2004，p.482-490)創(chuàng)建了另一種類型的支持PrPsc復制的穩(wěn)定細胞株。他們的模型包含表達羊PrP并支持羊PrPsc復制的鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞，MovS細胞。這些細胞表現(xiàn)出它們本身特別適合生產(chǎn)本發(fā)明的感染性材料。
用PrPsc感染的10％動物腦勻漿，其感染性滴度用作本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液中同樣PrPsc的感染性滴度的參照，在例如等滲緩沖液，如TBS或PBS中，稀釋到10％。然后將它在這種稀釋液中使用例如Ultra turrax進行勻漿。
當PrPsc感染被組織病理學分析所證實時，和/或通過免疫組織化學染色檢測到PrPsc后，以及當動物已經(jīng)發(fā)展出與所述PrPsc相應(yīng)的NCTA綜合癥時，該動物腦被說成是“被PrPsc感染”。具體來說，“被PrPsc感染的動物腦”可以從死于NCTA相關(guān)疾病的動物、以及被安樂死的瀕死動物獲得，如果PrPsc引起的腦感染已經(jīng)通過組織病理學和/或免疫化學染色證實了的話。
感染滴度也可以用本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知的方法來測定。例如，將要滴定的材料的一系列稀釋液腦內(nèi)注射到可能被要滴定的PrPsc感染的動物中，在這種情況下按照一組動物一個稀釋度的比率。根據(jù)每組動物中疾病的潛伏期以及受感染動物的數(shù)量，可以使用專業(yè)技術(shù)人員已知的統(tǒng)計學方法例如Spearman-Krber法，推算出感染滴度。
有利的是，本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液可以被標準化成每劑的感染單位數(shù)。此外，它可以通過冷凍、干燥、冷凍干燥和霧化而被穩(wěn)定化，這可能需要本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知的物質(zhì)的存在，其目的是防止與所用的穩(wěn)定化方法有關(guān)的感染滴度的損失。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“NCTA”是指所有的NCTAs，包括在動物中引起家族性和散發(fā)性CJD、Kuru病、在幼年對象中明顯的CJD變體的NCTAs，以及引起羊瘙癢癥或?；蜇埡＞d狀腦炎的NCTAs。
術(shù)語“朊病毒蛋白”描述了NCTA的特征蛋白，在易于被所討論的NCTA感染的給定物種的個體中表達為正常形式PrP，并在已經(jīng)被NCTA感染的同樣物種的個體中表達為病原形式PrPsc。該蛋白是在所有NCTA感染、特別是腦部感染病例中存在的感染載體元件，即在腦內(nèi)注射到健康對象中之后，它能夠誘導NCTA的癥狀。
本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液的感染滴度≥4、優(yōu)選≥5、更優(yōu)選≥6、在特別優(yōu)選實施方案中≥71og TCID50/ml。
具體來說，本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液中存在的感染性PrPsc是羊、?；蛉祟悂碓础?yōu)選，它代表羊瘙癢癥中的羊朊病毒蛋白或克雅病新變種中的人類朊病毒蛋白。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，包括了將本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液的感染滴度、與從給定物種獲得的并被同一物種PrPsc感染的動物腦勻漿進行比較，例如來自瘙癢癥的羊PrPsc感染的動物的羊腦勻漿、來自倉鼠適應(yīng)株263K的PrPsc感染的動物的倉鼠腦勻漿、來自牛海綿狀腦炎(BSE)的牛PrPsc感染的動物的牛腦勻漿、或從克雅病新變種(vCJD)的人類PrPsc感染的病人獲得的人腦勻漿。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液的感染滴度，與從轉(zhuǎn)基因表達給定物種的PrP并被同一物種的PrPsc感染的轉(zhuǎn)基因動物獲得的腦勻漿進行了比較，例如表達羊PrP并被羊PrPsc感染的轉(zhuǎn)基因小鼠腦勻漿。這些轉(zhuǎn)基因動物可以被“敲除”(兩個等位基因缺失)它們自身物種的PrP基因。
一種有優(yōu)勢的方式是，本發(fā)明的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，從兔上皮細胞、特別是來自細胞系Rov9(Vilette等)的兔上皮細胞或從鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞、特別是來自細胞系MovS6(Archer等)的鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞獲得。
本發(fā)明也考慮到了本發(fā)明感染性材料的用途，在獲得或處理易于被非常規(guī)傳染因素(NCTA)感染的生物制品的體外步驟的評估和/或控制方法中，作為感染性接種物。該評估和/或控制方法具有下列特征 -本發(fā)明的感染性材料被接種到生物制品中以刺激感染； -用本發(fā)明的感染性材料人為感染的生物制品在所述步驟之前和之后都進行滴定。
-以及，比較獲得的兩個PrPsc感染滴度。
通過對兩個測量值進行比較，獲得了PrPsc消除程度或折減系數(shù)。
因此，本方法的實施可以在用于獲得生物制品的步驟過程中進行，或在一旦獲得生物制品后消除NCTA的工藝范圍內(nèi)進行。
具體來說，用于獲得或處理生物制品的步驟是獲得或純化生物制品例如血漿衍生物的過程，其中獲得或純化使用例如層析方法或納濾方法，特別是在專利EP 0 359 593和專利申請WO 02092632中描述的層析方法。
本發(fā)明也考慮到了使用本發(fā)明的感染性材料在設(shè)備去污染步驟的體外評估和/或控制方法中作為感染性接種物。在這種情況下，被待測的去污染方法去污染的設(shè)備被人為地感染。為此，其感染滴度已知的本發(fā)明感染性材料，與將要進行去污染的設(shè)備相接觸，然后所述設(shè)備進行去污染步驟。最后，在去污染循環(huán)后，測定從已去污染的設(shè)備取回的樣品的滴度。該滴度與本發(fā)明的感染性材料的起始感染滴度相比較，以評估去污染步驟的效能。
設(shè)備可以包括例如純化系統(tǒng)，更具體來說是層析柱。
去污染步驟可以是例如使用氫氧化鈉清洗層析柱。
本發(fā)明也考慮到了使用本發(fā)明的感染性材料作為感染性接種物，用于評估抑制NCTA感染性的化合物的方法。在這種情況下，本發(fā)明的感染性材料的NCTA感染能力，在有或沒有傾向于抑制所述NCTA感染性的化合物的情況下測試。
本發(fā)明也考慮到了使用本發(fā)明的感染性材料作為感染性接種物，用于感染性材料密閉步驟、特別是P3類型的步驟和設(shè)備的評估和/或控制方法。
參比實施例A通過對Mov S6細胞進行體外滴定來滴定PrPscPG127的感染性 為了研究用于滴定與NCTAs相關(guān)的感染性的體外系統(tǒng)的可行性，MovS6細胞(Archer F.等2004)被選作支持NCTA復制的細胞，適應(yīng)Tg301轉(zhuǎn)基因小鼠的PG127瘙癢癥株，被用作感染源(Vilotte JL 等，Journal of Virology，Vol.75，n°13，p.5977-5984，2001)。接種物含有10％(重量/體積)以100mg/ml量用PG127瘙癢癥株、即用10％(重量/體積)的PG127/98羊腦勻漿(Veterinary Laboratory Agency，Addelstone，UK)感染的小鼠腦勻漿(參見Vilotte JL 等，Journal of Virology，Vol.75，n°13，p.5977-5984，2001，Material and Methods)。將Mov S6細胞培養(yǎng)在添加了谷氨酰胺和胎牛血清的DMEM+HamF-12培養(yǎng)基中。在接種前24小時準備滴定板。細胞以每孔40.000個細胞的量接種在96孔板上(試驗1)，以100.000個細胞接種在24孔板上(試驗2和3)。用培養(yǎng)基制備10倍(試驗1和2)和5倍(試驗3)小鼠腦勻漿的系列稀釋度。每個培養(yǎng)板中用各接種物稀釋度接種5個孔。細胞被暴露在給定體積的接種物中(50到150μl)，時間范圍從12小時到4天。表1概述了每個試驗特定的實驗接種和細胞擴展條件。棄去接種物并用新鮮培養(yǎng)基替換，然后將細胞在培養(yǎng)基中保持72小時，直到第一次傳代，在此期間培養(yǎng)板格式改為保持一半(試驗1)或所有的感染細胞(試驗2和3)。隨后在試驗過程中每周換培養(yǎng)基一次，以1比10的比例重新接種細胞，使得在每次傳代中分析90％的細胞。在每次傳代收獲的細胞作為細胞團進行冷凍，保存在-80℃下，直到使用Western印跡方法分析，以檢測PrPsc。各細胞團用Benzonase(250單位)在50μl體積中在37℃下處理2小時。然后用蛋白酶K處理細胞裂解液，變性，然后在變性條件下使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。然后將凝膠中遷移的蛋白通過電轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在與6H4抗體(Prionics)、然后與標記的第二抗體(針對小鼠抗體的山羊抗體)溫育后，檢測膜上存在的PrPsc。標記的膜通過化學發(fā)光進行顯示。當在放射自顯影圖上可以看到三種形式的糖基化PrPsc的電泳圖譜時，樣品被視為陽性。對于每個Western印跡分析來說，陰性對照(未感染的MovS6細胞)與樣品平行處理。在每次細胞傳代中，培養(yǎng)板上的所有孔都被測試。當用給定的接種物稀釋度接種的所有細胞培養(yǎng)平行樣，在連續(xù)兩次傳代中都被發(fā)現(xiàn)是PrPsc陽性的情況下，這些培養(yǎng)物不再在后面的傳代中試驗。在細胞培養(yǎng)結(jié)束后使用SpearmanKrber方法(Schmidt NJ和Emmons RW，病毒、立克次氏體和衣原體感染診斷方法(第六版)，Diagnostic Procedures for Viral，Rickettsial andChlamydial Infection 1989，6th Edition)計算樣品滴度。
表1、用于NCTA相關(guān)感染性體外滴定分析的實驗條件 結(jié)果 試驗1 試驗了10-1到10-6稀釋度的用PG127羊瘙癢癥株感染的小鼠腦勻漿。在第三次傳代中，沒有細胞孔呈現(xiàn)PrPsc。在第四次傳代中，100％的已經(jīng)用稀釋度為10-1到10-3的接種物接種的孔對PrPsc陽性，75％的用10-4稀釋度感染的培養(yǎng)物為陽性。在第五次傳代中，25％的用10-5稀釋度接種的孔是陽性，使用Spearman Karber方法，得出50％感染劑量(TCID50)滴度為6.05log/ml。在隨后的細胞傳代中，儲存物的滴度沒有增加。
試驗2 表2總結(jié)了在試驗2過程中獲得的結(jié)果，再次顯示了用每種試驗的接種物稀釋度(從10-3到10-7)感染的每種培養(yǎng)平行樣中陽性結(jié)果的百分率變化?？梢杂^察到培養(yǎng)物中出現(xiàn)PrPsc的時間與培養(yǎng)物被接種的感染劑量成反比。因此，接受10-3稀釋度接種物的培養(yǎng)物在第二次傳代中表現(xiàn)出PrPsc，而用10-4接種的培養(yǎng)物100％表現(xiàn)出陽性則需要多一次傳代。該實驗計算出的接種物滴度是5.5 TCID50/ml。
表2、滴定試驗2的結(jié)果 NT沒有試驗，因為100％的孔被接種了 NTa沒有試驗，因為在前面兩次傳代中100％陽性。
試驗3 表3總結(jié)了在試驗3中獲得的結(jié)果。出于本試驗的目的，接種物稀釋比率減少到1/5，試驗的稀釋度是10-4到10-6.8。在第六次傳代時獲得了最大的滴度，計算出的滴度是6.43 TCID50/ml。
表3試驗3的結(jié)果 NT沒有試驗，因為100％的孔被接種了 NTa沒有試驗，因為在前面兩次傳代中100％陽性。
進行的三組試驗的結(jié)果證實了對NCTA相關(guān)感染性的TCID50進行體外滴定的可行性。
參比實施例B與用于可能被NCTA感染的生物醫(yī)藥產(chǎn)品的純化步驟有關(guān)的折減系數(shù)的計算 在本試驗中，納濾步驟被選為可以獲得生物制品的生產(chǎn)工藝的步驟之一的例子。選用的是PLANOVA 15 N(ASAHI KASEI)濾膜，孔徑為15nm，表面積為0.01m2。要過濾的物質(zhì)是在0.01M二水檸檬酸三鈉緩沖液、0.12M甘氨酸、0.016M L-賴氨酸(一氯化物)、0.001M二水氯化鈣、0.17M氯化鈉中的0.2g/l人白蛋白，滲透壓為490-510mosmol/kg，pH為6.90-7.10。納濾在25℃于500±100 mbar的壓力下進行。在對制品進行納濾之前，用40ml用于稀釋人白蛋白的緩沖溶液平衡濾膜。要過濾的30ml制品，添加4％的感染了PG127瘙癢癥株的10％小鼠腦勻漿(重量/體積)，進行過濾，然后過濾10ml用于平衡濾膜的緩沖液，以將制品沖洗過濾膜。為了保證該步驟的可重復性，進行了兩次納濾試驗。要過濾的試驗摻料制品的制備量足夠分出等份的級份，用于對納濾前制品中存在的感染性進行量化。在納濾后，回收到總體積為40ml的濾液，進行滴定以測定納濾后制品中感染性的量。在儲存于-80℃等待滴定之前，起始添加材料和過濾過的制品用培養(yǎng)基1/3稀釋。樣品按照第一個實施例中描述的試驗3的實驗條件進行滴定。由于過濾過的樣品其殘留的感染滴度預計將為零或非常低，無細胞毒性的樣品的最低稀釋度被接種到10個平行樣中，然后按照上面的描述稀釋到5個平行樣中。
表4總結(jié)了通過本納濾試驗產(chǎn)生的4個樣品的滴定結(jié)果。
對于試驗1和2來說，起始添加材料的滴度是4.67 log TCID50/ml。在過濾樣品中沒有檢測到殘留的感染性。使用泊松定律，從被接種樣品的最低稀釋度的體積，計算出這些樣品的感染載量是0.28 logTCID50/ml。樣品中存在的總載量通過用它們的載量乘以它們相應(yīng)的體積來計算，折減系數(shù)通過用過濾前起始材料或起始樣品中測定到的載量除以濾液中測定到的載量來計算。清除系數(shù)從計算出的加入到實驗添加物中的感染量來計算。清除系數(shù)和折減系數(shù)之間的差別，當超過一個log時，將允許在起始制品和檢測本制品中的感染性的滴定系統(tǒng)的能力之間鑒定可能的干擾。表5總結(jié)了這些計算。對于試驗1和2來說，與消除用于添加起始材料的腦勻漿中存在的感染有關(guān)的折減系數(shù)，分別是≥4.24 和≥4.22log。清除系數(shù)的計算沒有顯示出起始材料的任何干擾。
表4、在納濾步驟的評估過程中產(chǎn)生的樣品滴定結(jié)果 *沒有檢測到感染根據(jù)泊松定律計算的檢測限 表5、與體外滴定評估的15nm納濾步驟相關(guān)的折減系數(shù)的計算 1從試驗添加物中的總載量計算。
2從起始材料中測定的起始載量計算。
3把用于滴定起始樣品取出的等份試樣級份考慮在內(nèi)的體積。
4沒有可檢測的感染根據(jù)泊松定律計算的檢測限。
實施例1使用實施例1中描述的滴定方法對PG127株感染的MovS6細胞裂解液的滴定 使用實施例1中描述的滴定方法，用試驗3的實驗條件，唯一的區(qū)別是感染性接種物。
使用的感染性接種物是實施例1中描述的用10％小鼠腦勻漿(重量體積比)感染的Mov S6細胞裂解液，該小鼠的腦用PG127瘙癢癥株以100mg/ml的量感染。
連續(xù)的10倍稀釋度，范圍從10-4到10-8，用于每種稀釋度每個培養(yǎng)板感染5個孔。
結(jié)果顯示在表6中。
表6用PG127株感染的MovS6細胞裂解液的滴定 ND由于技術(shù)問題沒有測定 NTa沒有試驗，因為前兩次傳代中100％陽性 NT沒有試驗，因為100％的細胞被重新接種 實施例2使用實施例1中描述的滴定方法對PG127株感染的MovS6細胞的培養(yǎng)上清液的滴定 使用實施例1中描述的滴定方法，使用試驗3的實驗條件，唯一的區(qū)別是感染性接種物。
使用的感染性接種物是實施例1中描述的用10％小鼠腦勻漿(重量體積比)感染的Mov S6細胞的培養(yǎng)上清液，所述小鼠的腦勻漿用PG127瘙癢癥株以100mg/ml的量感染。
連續(xù)的3倍稀釋度，范圍從1/3到1/2187，用于每種稀釋度每個培養(yǎng)板感染5個孔。
結(jié)果顯示在表7中。
表7用PG127株感染的MovS6細胞培養(yǎng)上清液的滴定 1在第三次傳代中，稀釋度1/3、1/9和1/27的所有平行樣都是陽性的。前一次傳代沒有被試驗。
NT沒有試驗，因為前兩次傳代中100％陽性。
實施例3PrPsc和感染滴度的比較 從表3、6和7中得到的感染性滴度被總結(jié)在表8中。
此外，實施例1中的Western印跡方法被用來定量起始接種物中的PrPsc用100mg/ml PG127瘙癢癥株感染的10％(重量/體積)小鼠腦勻漿，實施例1中描述的用10％(重量/體積)小鼠腦勻漿感染的Mov S6細胞的細胞裂解液，所述小鼠腦勻漿用100mg/ml PG127瘙癢癥株感染，以及實施例1中描述的用10％(重量/體積)小鼠腦勻漿感染的Mov S6細胞的細胞培養(yǎng)上清液，所述小鼠腦勻漿用100mg/mlPG127瘙癢癥株感染。對于后者來說，在其可以被檢測到之前，必須通過超速離心濃縮PrPsc。
每個接種物在SDS-PAGE上樣緩沖液中連續(xù)稀釋。第一個不再顯示出對PrPsc的特異信號的接種物稀釋度，被當作含有一個Western印跡單位。在考慮了凝膠中上樣的每個稀釋度的每個樣品的體積之后，PrPsc中的接種物滴度被計算為極限稀釋度的倒數(shù)。
表8
權(quán)利要求
1.從表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞獲得的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其中PrPsc感染滴度大于用所述PrPsc感染的10％動物腦勻漿的感染滴度的50％。
2.從表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞獲得的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其中PrPsc感染滴度大于用所述PrPsc感染的10％動物腦勻漿的感染滴度的75％。
3.從表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞獲得的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其中PrPsc感染滴度大于用所述PrPsc感染的10％動物腦勻漿的感染滴度。
4.權(quán)利要求1到3任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染滴度≥4log TCID50/ml。
5.權(quán)利要求1到3任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染滴度≥5log TCID50/ml。
6.權(quán)利要求1到3任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染滴度≥6log TCID50/ml。
7.權(quán)利要求1到3任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染滴度≥7log TCID50/ml。
8.權(quán)利要求1到7任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為支持病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞表達的朊病毒蛋白PrP是羊、?；蛉祟悂碓吹?。
9.權(quán)利要求8中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為朊病毒蛋白PrP是羊瘙癢癥的羊朊病毒蛋白。
10.權(quán)利要求8中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為朊病毒蛋白PrP是克雅病新變種的人類朊病毒蛋白。
11.權(quán)利要求1到10任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從用給定物種的PrPsc感染的同樣物種的動物腦獲得的。
12.權(quán)利要求11中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從用羊瘙癢癥的羊PrPsc感染的羊腦獲得的。
13.權(quán)利要求11中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從用倉鼠適應(yīng)的PrPsc株263K感染的倉鼠腦獲得的。
14.權(quán)利要求11中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從用牛海綿狀腦炎(BSE)的牛PrPsc感染的牛腦獲得的。
15.權(quán)利要求11中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從用克雅病新變種(vCJD)的人類PrPsc感染的人類病人腦獲得的。
16.權(quán)利要求1到10任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從作為轉(zhuǎn)基因表達給定物種的PrP、并被同樣物種的PrPsc感染的轉(zhuǎn)基因動物的腦獲得的。
17.權(quán)利要求16中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，其特征為感染的動物腦勻漿是從表達羊PrP、并被羊PrPsc感染的轉(zhuǎn)基因小鼠的腦獲得的。
18.權(quán)利要求1到17任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，從穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因兔上皮細胞獲得。
19.權(quán)利要求18中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，從穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因兔上皮細胞系Rov9獲得。
20.權(quán)利要求1到17任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，從穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞獲得。
21.權(quán)利要求20中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，從穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞系MovS6獲得。
22.權(quán)利要求1到21任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液作為評估和/或控制方法的感染性接種物的應(yīng)用，所述評估和/或控制方法適用于用來獲得或處理可能被NCTA污染的生物制品的步驟。
23.權(quán)利要求22中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液作為評估和/或控制方法的感染性接種物的應(yīng)用，所述評估和/或控制方法適用于用來純化血漿衍生產(chǎn)品的步驟。
24.權(quán)利要求23中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液的應(yīng)用，其特征為純化工藝意味著層析或納濾。
25.權(quán)利要求1到21任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液作為評估和/或控制方法的感染性接種物的應(yīng)用，所述評估和/或控制方法適用于用來對可能被NCTA污染的設(shè)備去污染的步驟。
26.權(quán)利要求1到21任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液作為感染性接種物用于抑制NCTA感染性的化合物的評估方法的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求1到21任何一個中的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液，作為感染性接種物用于感染性材料密閉步驟的評估和/或控制方法的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的、合成的、標準化的、可溶的、可重復的和易于操作的朊病毒類型的感染性材料，其組成為從表達朊病毒蛋白PrP并支持所述PrP的病原形式PrPsc復制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細胞獲得的細胞裂解液或培養(yǎng)上清液。
文檔編號G01N33/68GK101171516SQ200680015422
公開日2008年4月30日 申請日期2006年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日
發(fā)明者讓-蒂埃里·奧賓, 布魯諾·尤, 貝諾伊特·弗蘭 申請人:分餾及生物技術(shù)法國實驗室