專利名稱：能選擇性檢測朊病毒PrP的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對朊病毒PrPSc同型異構(gòu)體(PrPscisoform)C末端部分的新型抗體。具體來說，本發(fā)明涉及該類抗體在診斷牛海綿樣腦病(BSE)、克雅病新變異形式(vCJD)、散發(fā)性CJD及瘙癢癥中的應(yīng)用。
從1986年開始，在英國診斷發(fā)現(xiàn)一種慢性變性疾病。感染該病的牛的神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)進(jìn)行性變性，其癥狀為性情發(fā)生改變，如神經(jīng)質(zhì)、具有攻擊性、姿勢異常，官能共濟(jì)喪失及起立困難、產(chǎn)奶量減少或盡管食欲不變但體重減輕。感染該病的牛最終死亡。
該疾病被定名為牛海綿樣腦病(BSE)，現(xiàn)廣泛稱作“瘋牛病”。接下來的十年里，英國確診了約160000例該新識別的牛類疾病，同時在其他歐洲國家甚至歐洲以外的國家如加拿大、?？颂m(Falkland)群島和阿曼蘇丹王國亦有動物感染該病的報導(dǎo)。
BSE與一種可傳染性因子相關(guān)，該因子的性質(zhì)至今仍未完全清楚。該因子感染牛的腦部及脊髓，病損特征為通過顯微鏡可見的海綿樣改變。該因子極為穩(wěn)定，可耐受正常蒸煮溫度甚至巴斯德滅菌用高溫、常規(guī)溫度和時間的消毒及冷凍與干燥。
在自然感染BSE的牛中，僅發(fā)現(xiàn)其腦部組織、脊髓及視網(wǎng)膜中存有BSE因子。進(jìn)一步的研究確認(rèn)，喂食BSE感染動物腦組織的牛的遠(yuǎn)端回腸、骨髓、脊神經(jīng)節(jié)與三叉神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)BSE感染。
在人類中，已知有一種類似的變性性綜合癥，稱為克雅病(CJD)。CJD為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性變性性人類疾病，伴隨有明顯的功能障礙、進(jìn)行性癡呆及腦部空泡變性。CJD每年以百萬分之一的比率在世界范圍內(nèi)散發(fā)性地發(fā)生。Gerstmann-Straussler綜合征、庫魯病及致命性家族性失眠癥的相關(guān)TSE(可傳播性海綿樣腦病)病癥更為少見。
1996年，英國海綿樣腦病咨詢委員會(SEAC)宣布已確診10例CJD新變異形式(vCJD)病例。所有的患者均在1994或1995年發(fā)病。然而，報導(dǎo)的10個病例與CJD的散發(fā)形式極為不同。被感染者比典型CJD患者要年輕得多。通常，CJD患者的年齡均超過63歲。與此相反，變異CJD患者發(fā)病的平均年齡約為28歲。vCJD的病程平均為13個月，而典型CJD病的病程平均僅為6個月。在變異病例中，腦部的腦電波(EEG)電活性與典型的散發(fā)型CJD不同。盡管腦病理學(xué)可認(rèn)定為CJD，但其模式為朊病毒蛋白斑片大量聚集，與散發(fā)型CJD不同。
SEAC的報告顯示，所有罹病者在過去的十年里均吃過牛肉或牛肉制品，這表明vCJD與BSE之間存在因果關(guān)系。1997年發(fā)表的兩項研究結(jié)果確認(rèn)了vCJD極有可能起因于BSE因子這一假設(shè)。為此，一組研究者分別用BSE、vCJD及散發(fā)型CJD感染了三組近交系小鼠和一組雜交小鼠。當(dāng)前結(jié)果表明，接種了BSE的小鼠與接種了vCJD患者組織的小鼠在培養(yǎng)時間、臨床體征及腦損傷模式方面相同，由此得出如下結(jié)論，即BSE與vCJD具有相同特征(signature)或為同一“菌株”。此外，散發(fā)型CJD及已知的瘙癢癥菌株與vCJD或BSE無相似性。其他研究者已證實(shí)了上述結(jié)果，因此目前人們相信BSE可以傳播給人類，引發(fā)vCJD。
由于公眾和科學(xué)界對食用感染BSE牛的肉制品會將BSE傳播給人類的擔(dān)心日盛，人們建議將患有BSE的牛殺掉并且其尸體不得進(jìn)入人類的食物鏈。然而，鑒于BSE通常需五年或更長的時間方能通過染病動物的舉止表現(xiàn)出來和目前除檢查已屠宰動物的腦部外尚無快速確定牛是否感染BSE的方法這一事實(shí)，人們建議可采用的唯一安全并亦能平息公眾對食用牛肉制品恐懼的方法是大范圍屠宰。不可避免的是，該政策會導(dǎo)致成千上萬頭未感染BSE的牛遭到屠殺。因此，在技術(shù)上需要一種快速測定BSE的方法。
目前使用的一種測定組織中是否存有BSE因子的方法是用相信已感染BSE的材料接種動物——通常為小鼠。然而，小鼠接種研究需要的時間長達(dá)700天，并且在組織中未測出BSE既可能表明該因子確實(shí)不存在亦可能只表明該方法的靈敏度有限。
BSE和其他TSE如vCJD的發(fā)病因子比已知的最小病毒還要小，其性質(zhì)仍未完全確定。有關(guān)該因子的性質(zhì)，目前有三種主要理論(1)該因子為一種性質(zhì)特殊的病毒，(2)該因子為一種感染后變成一種部分抗蛋白酶形式的獨(dú)特的宿主編碼蛋白(“朊病毒”)，(3)該因子為一種被宿主衍生保護(hù)性蛋白包被的非編碼調(diào)節(jié)小核酸。該BSE因子對熱及正常的消毒方法具有極強(qiáng)的抵抗性。它亦不在宿主動物中引發(fā)任何可檢測性免疫反應(yīng)或炎性反應(yīng)。
前不久，人們發(fā)現(xiàn)該發(fā)病因子與病毒不同該因子能以多分子形式存在，而病毒只以單一形式存在，并具有不同的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)；其次，該因子為非免疫原性，與此相反，病毒總引起免疫反應(yīng)；再次，沒有該傳染性顆粒內(nèi)有基本核酸的證據(jù)，而病毒有在子代病毒合成中作為模板的核酸基因組。因此，最終得出這樣的結(jié)論朊病毒為變性性疾病的原因，其唯一已知成分為朊病毒，它由個體自身的染色體基因編碼。
傳染性朊病毒主要由一種名為朊病毒蛋白的“瘙癢癥同型異構(gòu)體”的蛋白構(gòu)成，縮寫為PrPSc。很明顯，一種尚未定義的翻譯后過程從遍在細(xì)胞朊病毒蛋白PrPC生成PrPSc。PrPC與PrPSc均由一單復(fù)制染色體基因編碼，并且已發(fā)現(xiàn)，接種朊病毒會引發(fā)正常宿主PrPC多肽生成PrPSc。與主要位于細(xì)胞表面的正常形式相反，同型異構(gòu)體以泡囊形式聚集在細(xì)胞內(nèi)。同型異構(gòu)體在構(gòu)象結(jié)構(gòu)上亦不同，表現(xiàn)為β折疊含量增加，這可能是PrPSc同型異構(gòu)體與正常形式PrPC相比蛋白酶抗性增強(qiáng)的原因之一。
目前，尚沒有該病的治療方法或任何預(yù)防疫苗。這主要是因為PrPSc同型異構(gòu)體的免疫原性明顯較低，從而阻礙了能專門識別PrPSc同型異構(gòu)體，同時又避免與“正?！蓖彤悩?gòu)體PrPC交叉反應(yīng)的抗體的制造。
此外，亦無在活動物內(nèi)檢測該病的適當(dāng)檢驗方法。獸醫(yī)病理學(xué)家可以通過腦組織死后顯微鏡檢查確認(rèn)BSE。然而，當(dāng)檢測組織中的BSE時，則采用給動物—通常為小鼠接種相信已感染BSE的組織的方法。因此，在技術(shù)上需要提供一種能夠測定神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病如BSE、CJD、vCJD或TES相關(guān)疾病如瘙癢癥及其他疾病發(fā)病因子的方法。
因此本發(fā)明要解決的問題是提供能讓獸醫(yī)或醫(yī)師專門檢測BSE、CJD、vCJD和/或TSE相關(guān)疾病發(fā)病因子的方法。
在導(dǎo)致本發(fā)明的廣泛研究過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PrPC在向PrPSc轉(zhuǎn)變中經(jīng)歷的構(gòu)象變化之一是PrPCC末端區(qū)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
附圖中，

圖1為用抗體CNCM I-2476治療過的散發(fā)型CJD患者的人腦組織試樣圖片(放大10倍)。
圖2為用抗體CNCM I-2476治療過的散發(fā)型CJD患者的人腦組織試樣圖片(放大60倍)。
圖3為用抗體CNCM I-2476治療過的新變異CJD患者的人腦組織試樣圖片(放大60倍)。
圖4為用抗體CNCM I-2476治療過的新變異CJD患者的人腦組織試樣圖片(放大20倍)。
圖5為用抗體CNCM I-2476治療過的呈現(xiàn)BSE體征的動物牛腦組織試樣圖片(放大20倍)。
圖6為用抗體CNCM I-2476治療過的患瘙癢癥山羊的腦組織試樣圖片(放大10倍)。
圖7為一斑點(diǎn)印跡實(shí)驗結(jié)果，其中各種正常腦組織試樣暴露于抗體CNCM I-2476。作為對照，使用了Seq.ID No.2的肽和該肽和KLH的綴合物。
因此，本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案提供了一種針對PrPSc同型異構(gòu)體C末端部分或其一部分的抗體，即針對表現(xiàn)為“錯折疊”形式的朊病毒多肽的所述部分的三維構(gòu)象。由于PrPC形式在朊病毒多肽的該部分展現(xiàn)出與PrPSc明顯不同的三維構(gòu)象，該抗體能選擇性地結(jié)合在PrPSc同型異構(gòu)體上而不結(jié)合在PrPC同型異構(gòu)體上。因此，它們能區(qū)分這兩種同型異構(gòu)體。這些抗體優(yōu)選針對由PrPSc的氨基酸190至214構(gòu)成的區(qū)域或其一部分，更優(yōu)選針對PrPSc的約202至約214的序列或其一部分，或針對在基本保留PrPSc同型異構(gòu)體展示的所述區(qū)域的構(gòu)象特征的前提下通過取代或缺失一個或更多氨基酸獲得的變體。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的氨基酸序列為-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-或-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Seq.ID.No.1為本發(fā)明識別的牛朊病毒多肽氨基酸序列的C末端區(qū)域的一部分，其為氨基酸180至219。Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn-Phe-Thr-Glu-Thr-Asp-Ile-Lys-Met-Met-Glu-180 185 190 195Arg-Val-Val-Glu-Gln-Met-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-200 205 210Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-Ser215本發(fā)明中定義的抗體將能通過選擇性地結(jié)合在PrPSc同型異構(gòu)體的C末端部分提供的三維構(gòu)象(PrPC形式中不存在該構(gòu)象)上來區(qū)分PrPSc與PrPC。
該抗體可為多克隆或單克隆，而由于交叉反應(yīng)的原因，優(yōu)選為單克隆抗體。此外，抗體的片段亦在本發(fā)明抗體的含義內(nèi)，尤其是那些結(jié)合在靶上的片段，如Fab區(qū)或其部分。依據(jù)各自的需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能設(shè)計相應(yīng)的片段。
術(shù)語抗體亦包含嵌合抗體，如人源化抗體，其中不變區(qū)來自人源，可變區(qū)來自動物源如小鼠，以便降低被治療個體對該因子的反應(yīng)。本發(fā)明中亦考慮了雙特異性抗體。雙特異性抗體為免疫球蛋白或其片段，其中兩個Fab片段分別針對不同的靶。因此，一個Fab片段將針對PrPSc的C末端部分，而另一個Fab片段可以針對任何靶，如在一種測定中使用的靶。
該抗體可以與在靶的檢測中常用的標(biāo)記相連，如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或染劑。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，抗體為由雜交瘤細(xì)胞系CNCM I-2476生成的抗體，按照布達(dá)佩斯條約，于2000年5月10日保藏于法國巴黎巴斯德研究所。
上述抗體可用于診斷和/或治療牛海綿樣腦病或克雅病或其變異形式或哺乳動物，如有蹄類或人類中與TSE相關(guān)的疾病，因為該抗體選擇性地結(jié)合在PrPSc同形異構(gòu)體上。本抗體能用于不同的種群如人類、牛、羊等是本抗體的一個新潁和具有誘惑力的特點(diǎn)，它簡化了檢測方法，使研究各種個體只需一種抗體。
為確定個體是否感染了相應(yīng)的疾病，從要檢查的個體中采集一份試樣如組織(勻漿或切片)或體液例如血液、唾液、尿液或腦脊液，爾后在合適的條件下使試樣與抗體接觸，檢查是否存在PrPSc同形異構(gòu)體。
試樣與抗體接觸的方法不受任何特別的限制，只取決于可利用的手段及試樣本身。因此，本抗體可在以下方法中使用，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)方法及其他方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員對這些方法都非常了解。
為了快速檢測個體是否感染了與朊病毒有關(guān)的疾病，本發(fā)明亦提供了一種試劑盒，其中至少包含一種本發(fā)明的抗體。另外，該試劑盒亦包含適用于進(jìn)行相應(yīng)測定的緩沖劑、支持材料與標(biāo)記試劑。
此外，通過將有效量的本發(fā)明抗體，任選地與適當(dāng)?shù)馁x形劑及載體一起給予受感染個體，本發(fā)明還可用于治療與朊病毒有關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明亦包含一種至少含有一種本發(fā)明抗體的藥物組合物。
并且，本發(fā)明亦提供了一種使個體對PrPSc同形異構(gòu)體免疫的方法。在這一方面，與正常形式(PrPC)不同的C末端部分的肽可用于引發(fā)個體中的免疫反應(yīng)，該肽優(yōu)選從朊病毒序列氨基酸190至215或其一部分衍生，更優(yōu)選從多肽的約202至約214的序列或其一部分或在基本保留PrPSc同形異構(gòu)體表現(xiàn)出的所述區(qū)域構(gòu)象特征的前提下通過取代或缺失一個或多個氨基酸獲得的變體衍生。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方案，氨基酸序列為-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-或-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr另外，該抗體本身亦可用來生成抗獨(dú)特型抗體，用于免疫接種。應(yīng)了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員將選擇合適的加強(qiáng)免疫步驟時間間隔，如有必要，還將選擇恰當(dāng)?shù)淖魟﹣磉M(jìn)行免疫接種。
本抗體還可用于生成抗獨(dú)特型抗體，即針對本發(fā)明抗體的結(jié)合區(qū)的抗體。該抗獨(dú)特型抗體代表本發(fā)明抗體的鏡像，可用來預(yù)防和治療上述疾病。因此，抗獨(dú)特型抗體亦在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，可按照本領(lǐng)域中熟知的方法制成，即用例如本發(fā)明抗體的高變區(qū)對動物進(jìn)行免疫接種，生成抵抗它的多克隆或單克隆抗體。下一步，將根據(jù)本抗體與所述抗獨(dú)特型抗體的結(jié)合對獲得的抗體進(jìn)行選擇。
獲得本發(fā)明抗體的方法包含的步驟為用免疫量的含有朊病毒多肽C末端部分氨基酸的肽對動物如小鼠或兔進(jìn)行免疫接種，優(yōu)選用具有下列序列的肽-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-更優(yōu)選地，將通過用Glu替代朊病毒多肽的位置207的Gln殘基而從上述序列衍生出的具有下列氨基酸序列的肽用于免疫接種步驟中-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-已驚奇地證明，該序列能引發(fā)免疫反應(yīng)，其強(qiáng)度足以能夠容易地產(chǎn)生抗PrPSc的特異性抗體。在不依附于任何理論的情況下，從該肽得出的這一驚人結(jié)果的道理可能在于天然Gln殘基可以形成氫鍵，由此造成肽的不溶性；這種情況在作為抗原表位的一部分時是不希望有的。另一方面，人PrP序列中的Glu(Gln位于牛PrP一級結(jié)構(gòu)中的相同位置)似乎不形成這樣的鍵。
在免疫接種步驟中使用上述任意一種肽具有無需像使用整個朊病毒多肽時事先準(zhǔn)備擊昏(knock out)小鼠的優(yōu)勢。免疫接種時優(yōu)選使用該肽和載體的綴合物，其中該肽通過其N末端連接于載體?？煽闯?，與通過C末端將該肽與載體結(jié)合相比，該方法提供明顯更好的免疫反應(yīng)。
用抗原接種動物后，采用本領(lǐng)域熟知的方法和技術(shù)將脾細(xì)胞分離并與骨髓瘤細(xì)胞融合。使用合適的培養(yǎng)基選擇融合細(xì)胞，該培養(yǎng)基不支持未融合細(xì)胞的生長，如HAT培養(yǎng)基。對選擇培養(yǎng)基中生長的融合雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，用于生成能與免疫接種步驟中使用的肽相結(jié)合的抗體。
本發(fā)明亦涉及能生成本發(fā)明抗體并且按上述方法可以獲得的雜交瘤細(xì)胞系。我們發(fā)現(xiàn)獲得的細(xì)胞系生長非常迅速，倍增時間周期約為8小時。另外還發(fā)現(xiàn)，抗體的分泌與正常雜交瘤抗體分泌相比也非常高。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，該雜交瘤為CNCM I-2476，并已按照布達(dá)佩斯條約于2000年5月10日保藏于法國巴黎巴斯德研究院。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及如下列氨基酸序列所示的肽序列Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-GLn-Ala-Tyr-Tyr或Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr或在基本保留三維結(jié)構(gòu)的前提下通過取代或缺失一個或多個氨基酸而從上述序列中衍生出的肽。
這些肽明顯地提供了一種PrPSc而非PrPC同形異構(gòu)體獨(dú)有的三維構(gòu)象。因此，如上所述，該肽也可以用于人或動物的免疫接種，使接種個體能產(chǎn)生對朊病毒多肽“錯折疊形式”的免疫反應(yīng)并以自然的方式將其從體內(nèi)消除。另外，所述多肽亦可以用于生產(chǎn)治療上述朊病毒相關(guān)疾病的藥物。
下列實(shí)施例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1一種合成肽的制備人PrP(人朊病毒蛋白)一級結(jié)構(gòu)的13-氨基酸長的肽被選擇用于免疫接種。該肽的位置靠近朊病毒蛋白的C末端部分，從氨基酸202至214。通過用Glu殘基取代位置207上的Gln殘基來修飾該肽，得出下列氨基酸序列H-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-OH該肽通過其N末端部分結(jié)合在載體蛋白KLH-鑰孔血藍(lán)蛋白上，這體現(xiàn)了一種將潛在免疫原性肽與載體連接的新特征，因為肽通常通過C末端連接于載體。實(shí)施例2動物免疫接種用KLH-肽綴合物(按照實(shí)施例1制備)對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種，劑量為每只小鼠0.2mg，采用弗氏完全佐劑(CFA)(200μl/小鼠)皮下用藥。14天后，用弗氏不完全佐劑(IFA)再次小鼠接種KLH-肽，劑量為每只小鼠0.1mg，腹膜內(nèi)給藥(200μl/小鼠)。兩周后，再一次用Freund氏不完全佐劑以腹膜內(nèi)給藥的方式給小鼠接種KLH-肽，劑量為每只小鼠0.2mg。最后一次接種10天后，從小鼠尾靜脈中取血，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定是否存在抗綴合物抗體。平板被KLH、KLH-肽及游離肽所覆蓋。用與HPR綴合的山羊抗小鼠抗體檢測小鼠抗體的結(jié)合。令人吃驚的是，所有小鼠的免疫反應(yīng)均非常強(qiáng)。
用生理溶液進(jìn)行最后一次靜脈加強(qiáng)注射(100μl中0.1mg/小鼠)實(shí)施例3雜交瘤生成加強(qiáng)注射后第4天，將小鼠殺死并取出它們的脾。分離出脾細(xì)胞并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Liddel，J.E.，Cryer，A.，《單克隆抗體實(shí)用指南》″Apractical guide to monoclonal antibodies″.John Wiley & Sonis，NewYork，1991)使用50％的PEG將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS1融合(比率為10∶4)，時間為3分鐘。洗滌細(xì)胞，然后將其重新懸浮在96-孔微量滴定板的DMEM(Flow，UK)中，補(bǔ)充加入13％FCS(HyClone，USA)(下文中僅稱作DMEM)和小鼠胸腺細(xì)胞飼養(yǎng)層。第二天，將HAT DMEM加入所有孔中。10-14天后，用間接ELISA法檢驗上清液中是否存在特異性抗體。為此，在4℃下，微量滴定板在50mMpH值為9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖劑中被5μg/ml的肽或KLH-肽綴合物或單獨(dú)的KLH(Bachem，Switzerland)覆蓋一夜。用PBS/吐溫20(Sigma，USA)將平板洗滌三次，用1％的BSA(Sigma，USA)將其封閉30分鐘。上清液用PBS/吐溫20洗滌后加入孔中，在37℃下培育2小時。將平板用PBS/吐溫20洗滌三次，將與HRP(Sigma，USA)的山羊抗小鼠免疫球蛋白加入孔中，用1％的BSA稀釋成15000。將平板在37℃下培育2小時后，用PBS/吐溫20洗滌，將底物加入孔中(ABTS/H2O2；Sigma，USA)。在410nm對平板進(jìn)行讀數(shù)。所有的容積均為50μl。
將雜交瘤從陽性孔移至裝有HT DMEM培養(yǎng)基的更大容器(24-孔板)中。用間接ELISA法再次檢測是否存在特異性抗體，將選定的細(xì)胞系移至裝有DMEM的組織培養(yǎng)瓶中。最后，用極限稀釋法將選定的雜交瘤克隆兩次并在液氮中冷凍。
選定的細(xì)胞系在DMEM中生長極為迅速，即，在無需HT的情況下，其倍增時間周期約為8小時。還發(fā)現(xiàn)抗體的分泌亦極高。獲得的克隆之一被交與巴斯德研究院保藏，保藏號為CNCM I-2476。實(shí)施例4抗體檢驗用保存的克隆的上清液檢驗單克隆抗體與PrP的反應(yīng)性。通過免疫組織化學(xué)對CJD患者、vCJD患者的腦組織及BSE陽性牛腦和感染瘙癢癥的羊腦進(jìn)行單克隆抗體檢驗。作為對照，使用正常人、牛與羊腦。亦用蛋白質(zhì)印跡與斑點(diǎn)印跡進(jìn)行了篩選。免疫組織化學(xué)試樣制備按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(機(jī)器Ventana)制備來自不同來源(人、牛與羊)的腦組織石蠟切片，獲得的切片厚度為6-8μm。用HCOOH對試樣進(jìn)行處理(圖1、5、6)或根本不作預(yù)處理(圖2-4)。隨后，用美國Ventata提供的試劑盒封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加入濃度為4μg/ml的抗體，用Dako S2022(Dako，USA)稀釋，然后在42℃下培育20分鐘。
隨后，加入生物素化的山羊抗-小鼠+兔(Ventana，USA)，并在42℃下培育20分鐘，接下來和鏈霉抗生物素HRP(Ventana)一起在42℃下培育20分鐘，和含有Cu的DAB(二氨基聯(lián)苯胺)一起培育4分鐘。結(jié)果免疫組織化學(xué)反應(yīng)模式表明，mAb CNCM I-2476與不同物種(人、牛、羊)的所有已知TSE形式反應(yīng)，且只與病態(tài)蛋白反應(yīng)。對健康個體和阿爾茨海默病患者的腦組織無反應(yīng)。腦勻漿制備在pH值為7.5的10％的蔗糖、20mM HEPES及2％的十二烷基肌氨酸鈉和5mMEDTA中用勻漿儀(Potter)將腦組織勻化(丘腦或髓質(zhì)或脊髓)(5倍，1ml中0.1g)。在+4℃下以14000rpm轉(zhuǎn)速將勻漿離心45分鐘。將上清液在-20℃下冷凍，而將小顆粒溶解在1 M NaOH中。通過測量280和260mm的吸光率來測定試樣中的蛋白濃度。斑點(diǎn)印跡將稀釋10倍的上清液或小顆粒作為試樣。它們或直接使用或用蛋白酶K(10μg/ml和100μg/ml)消化。用25mM Tris、0.32 M甘氨酸、0.16％的SDS(w/v)(pH為8.3)在Bio Rad池中進(jìn)行電泳。用25mM Tris、192mM甘氨酸、20％的甲醇(v/v)(pH為8.3)在0.2mm PVDF膜上進(jìn)行遷移。在100V條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)移，時間為50分鐘。然后，用5％的乳狀液對膜進(jìn)行封閉，并在1％的乳狀液中和單克隆抗體(對于CNCM I-2476，用量為40μg/ml)一起培育1-2小時(輕輕振搖)。對膜進(jìn)行洗滌后，將膜和與HRP(山羊抗-小鼠，Sigma，USA)綴合并在1％的乳狀液中稀釋為1∶5000的二次抗體一起培育(1-2小時，輕輕振搖)。對膜進(jìn)行洗滌，用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL，Amersham，USA)檢測免疫反應(yīng)。結(jié)果正常腦試樣未與抗體V5B2(CNCM I-2476)發(fā)生反應(yīng)。作為陽性對照，使用了KLH-肽。
本發(fā)明提供的單克隆抗體對PrPSc具有高特異性。為了進(jìn)行識別，在篩選方法之前無需使用蛋白酶K對PrPC進(jìn)行消化。在相同條件下，正常腦組織與mAb間不發(fā)生反應(yīng)，這表明產(chǎn)生的抗體的特異性極強(qiáng)，唯一識別PrPSc。
序列表<110>斯洛文尼亞輸血中心<120>能選擇性檢測朊病毒PrPsc同型異構(gòu)體的抗體<130>80242<140><141><160>3<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>40<212>PRT<213>Bos taurus<400>1Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu1 5 10 15Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln20 25 30Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser35 40<210>2<211>13<212>PRT<213>Bos taurus<400>2Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>Bos taurus<400>3Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr1 5 10
權(quán)利要求
1.一種能選擇性地與朊病毒蛋白PrPSc同形異構(gòu)體C末端部分或其一部分的三維構(gòu)象結(jié)合而不與PrPC形式結(jié)合的抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中C-末端部分包括從約氨基酸190至氨基酸214的朊病毒多肽區(qū)域，該區(qū)域優(yōu)選為朊病毒多肽的氨基酸202至214，或在不改變其三維構(gòu)象的前提下通過取代或缺失或添加一個或多個氨基酸而獲得的其變體。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體，其中被抗體識別的蛋白序列為-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-或其一部分。
4.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的抗體，該抗體為多克隆或單克隆抗體或其片段。
5.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的抗體，該抗體與標(biāo)記連接。
6.如權(quán)利要求1或2任何一項所述的抗體，該抗體來自雜交瘤細(xì)胞系CNCM-2476。
7.權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體或其功能部分用于診斷和/或治療牛海綿樣腦病或克雅病或克雅病變異形式或TSE相關(guān)疾病的用途。
8.權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體用于生產(chǎn)治療BSE和/或CJD和/或vCJD或TSE相關(guān)疾病的藥物的用途。
9.權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體用于生產(chǎn)抗BSE、CJD、vCJD或TSE相關(guān)疾病的活性和/或滅活疫苗的用途。
10.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至6中任何一項所述抗體的方法，其包含用足以引發(fā)免疫反應(yīng)的量的具有下列氨基酸序列的肽或其變體對動物進(jìn)行免疫接種，-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-或-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-所述變體是在基本保留三維構(gòu)象的前提下通過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸的方法獲得的。
11.用于診斷和/或治療BSE和/或CJD和/或vCJD或TSE相關(guān)疾病的試劑盒，其包含權(quán)利要求1至6中任何一項所述的抗體。
12.包含權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體的藥物組合物。
13.能生成權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
14.如權(quán)利要求13所述的雜交瘤細(xì)胞系，其為CNCMI-2476。
15.針對權(quán)利要求1至6任何一項所述抗體的獨(dú)特型的抗體。
16.將權(quán)利要求15所述抗體用于生產(chǎn)藥物或疫苗的用途。
17.一種肽，其具有下列氨基酸序列Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr或在基本保留所述肽的三維構(gòu)象特征的前提下通過取代一個或多個氨基酸而從其衍生的序列的肽。
18.如權(quán)利要求17所述的肽，其中該肽為Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr。
19.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述氨基酸序列用于制備抗BSE、CJD、vCJD或TSE相關(guān)疾病的藥物或疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對朊病毒PrP
文檔編號A61P25/00GK1441811SQ01809936
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月23日
發(fā)明者弗拉德卡·丘林－塞爾貝克 申請人:斯洛文尼亞輸血中心