專利名稱：破壞感染性朊病毒蛋白的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及破壞與可傳染的海綿狀腦病(TSE)例如牛海綿狀腦病(BSE)和羊瘙癢病有關(guān)的感染性朊病毒蛋白的組合物及方法。更具體地說，本發(fā)明涉及破壞動(dòng)物組織中感染性朊病毒蛋白的蛋白酶的應(yīng)用，和/或?qū)⒃摰鞍酌笐?yīng)用于被這種感染性朊病毒蛋白污染的衛(wèi)生器材以及類似物品的消毒和殺菌。
背景技術(shù)：
朊病毒蛋白是構(gòu)象不規(guī)則蛋白，它與人類以及非人類哺乳動(dòng)物物種中的感染性神經(jīng)變性疾病有關(guān)。
在非人類哺乳動(dòng)物物種中的朊病毒疾病包括瘙癢病(羊)、可傳染的貂腦病(貂)、慢性消耗性疾病(麋、鹿)、牛海綿狀腦病(BSE)(牛)、貓海綿狀腦病(貓)以及猴海綿狀腦病(猴)。
病因上與朊病毒蛋白有關(guān)的人類的各種神經(jīng)變性疾病包括克雅氏病、格-施-沙綜合癥、嚴(yán)重失眠、庫魯病以及克雅氏病變種。人類朊病毒疾病的發(fā)病機(jī)理與食肉動(dòng)物(BSE感染的牛，引起新的克雅氏病變種)、人類生長(zhǎng)激素給藥(引起醫(yī)原性的克雅氏病)以及強(qiáng)迫性惡性細(xì)胞吞噬作用(引起庫魯病)有關(guān)。
自從1992年以來，在歐洲已經(jīng)報(bào)道了超過180,000個(gè)BSE病例以及100個(gè)人類克雅氏病病例，預(yù)計(jì)人類的克雅氏病病例將顯著增長(zhǎng)。由于這種疾病目前還沒有治療方法，而且病原性的朊病毒蛋白是頑固的并且是非免疫遺傳的，因此很難控制這種疾病的蔓延。病原性的和感染性的朊病毒蛋白質(zhì)的同型異構(gòu)體是很穩(wěn)定的，其具有豐富的β折疊結(jié)構(gòu)，并且耐熱及耐普通的蛋白水解酶(Prusiner，S.B.，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.，95，11363(1998)；Cohen，F(xiàn).E.和Prusiner，S.B.，Ann.Rev.Biochem.，67，793(1998)；以及Pan，K-M，Baldwin，M.，Nguyen，J.，Gasset，M.，Serban，A.，Groth，D.，Mehlhorn，I.，Huang，Z.，F(xiàn)letterick，R.J.，Cohen，F(xiàn).E.，和Prusiner，S.B.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，10962(1993)}。
目前研究主要集中于BSE、被朊病毒蛋白污染的源自牛的人類食品、以及牛物種身上的朊病毒蛋白疾病的生殖和繁衍。在牛群中的傳染與牛用包含骨粉和從感染的牛、羊以及其他反芻動(dòng)物中提煉的器官和組織的飼料飼養(yǎng)有關(guān)。
目前，在許多國家，對(duì)不是提供人類食品的畜產(chǎn)品以及不是提供用于動(dòng)物飼料的原材料和營養(yǎng)增補(bǔ)劑的活的來源的畜牧副產(chǎn)品進(jìn)行焚化并將其骨灰殘余物埋入地下，以防止從存在感染性朊病毒蛋白的動(dòng)物身上傳播朊病毒蛋白。
在歐洲，來自畜牧副產(chǎn)品的肉骨粉已經(jīng)禁止在飼料中使用。在美國，雖然還沒有爆發(fā)BSE的報(bào)告，然而畜牧業(yè)以及其提煉與加工工業(yè)已經(jīng)制定了嚴(yán)格的措施以防止該疾病的發(fā)生及蔓延(Franco，B.A.，F(xiàn)eedStuffs，2001年2月12日)。另外，美國已經(jīng)禁止肉以及肉類副產(chǎn)品的進(jìn)口。
目前已經(jīng)研究出在動(dòng)物組織中是否存在感染性朊病毒蛋白的各種檢驗(yàn)方法，包括蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)、三明治免疫分析試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光免疫分析試驗(yàn)、毛細(xì)管免疫電泳試驗(yàn)以及纖維蛋白溶酶原界限試驗(yàn)(Genetic Engineering News，Vol.21，No.6，2001年3月15日)，但是迄今為止，工業(yè)上合適的從感染的動(dòng)物組織中除去感染性朊病毒蛋白的相應(yīng)能力并無進(jìn)展。
用常規(guī)方法，變性而不是降解構(gòu)象規(guī)則的蛋白，所述方法包括例如高壓蒸氣處理(甚至溫度高達(dá)200，都不能有效地使感染性朊病毒蛋白失活)、煮沸、凍結(jié)、以及暴露于試劑例如甲醛、石碳酸以及氯仿中，難以破壞感染性朊病毒蛋白。通常，采用焚化或漂白處理的方法破壞朊病毒蛋白的病原性同型異構(gòu)體。
因此，提供一種破壞感染性朊病毒蛋白的組合物和方法將是本領(lǐng)域的一項(xiàng)重大的進(jìn)步，所述組合物和方法適用于處理生物材料，例如包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的動(dòng)物組織。
此外，由先前暴露于朊病毒感染的組織下的醫(yī)療器械的重復(fù)使用引起的交叉污染變得越來越危險(xiǎn)并且成為傳播感染的潛在因素。
為防止在衛(wèi)生保健期間通過醫(yī)療器械的交叉污染，對(duì)衛(wèi)生保健器件和工具使用抗菌劑、消毒劑進(jìn)行滅菌是非常關(guān)鍵的?？梢酝ㄟ^各種常規(guī)的方法，使用各種破壞感染的生物材料，例如細(xì)菌或病毒，的物理和化學(xué)方法，對(duì)衛(wèi)生器材或儀器進(jìn)行消毒和滅菌。例如，可以使用化學(xué)消毒劑如過乙酸、過氧化氫、氫氧化鈉、甲酸、漂白劑、醇、環(huán)氧乙烷、甲醛、福爾馬林、以及戊二醛對(duì)衛(wèi)生器材進(jìn)行消毒和殺菌。焚化、高壓蒸氣處理、凍結(jié)、干熱、煮沸、紫外線輻射以及微波輻射同樣可以用于破壞常見的傳染物例如細(xì)菌和病毒。
然而，如上文論述，眾所周知感染性朊病毒蛋難以用常規(guī)方法進(jìn)行破壞，因此用常規(guī)方法對(duì)朊病毒污染的衛(wèi)生器材或類似物品進(jìn)行消毒或殺菌是無效的。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種對(duì)朊病毒感染的衛(wèi)生器材例如手術(shù)器械或類似物品例如廚房用具以及實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行有效消毒或殺菌的組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了破壞感染性朊病毒蛋白的方法和組合物。
一方面，本發(fā)明涉及在被感染性朊病毒蛋白污染的位點(diǎn)上減少感染性朊病毒蛋白的處理方法，該方法包括步驟(a)加熱該位點(diǎn)至足夠高的溫度并保持該溫度足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高該位點(diǎn)上的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；和(b)將已加熱的位點(diǎn)暴露于蛋白水解酶中，所述酶在該位點(diǎn)至少能部分有效地減少感染性蛋白朊病毒。
所述的位點(diǎn)可以是包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織，或者可以是易被感染性朊病毒蛋白污染的物品。
步驟(a)的溫度不超過約150℃，優(yōu)選在約100℃至約150℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約125℃至約140℃的范圍內(nèi)。
步驟(b)的溫度要比步驟(a)的溫度低，例如(1)在約35℃至約100℃的范圍內(nèi)，(2)在約40℃至約75℃的范圍內(nèi)，(3)在約50℃至約60℃的范圍內(nèi)。步驟(b)優(yōu)選在高于約40℃的溫度，更優(yōu)選在高于約50℃的溫度下進(jìn)行。
用于步驟(b)中的蛋白水解酶包括，但不限于，角蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶類、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、極熱嗜菌蛋白酶、羰基水解酶、木瓜蛋白酶、胰酶、鏈激酶、鏈脫酶、無花果蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶以及菠蘿蛋白酶。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐，角蛋白酶和/或其活性片段是特別優(yōu)選的。角蛋白酶通常是一組已知的能夠分解角蛋白的蛋白水解酶，它們是羽毛、角、蹄以及毛發(fā)的主要成分。本申請(qǐng)的發(fā)明人意外并驚奇地發(fā)現(xiàn)角蛋白酶在破壞感染性朊病毒蛋白中同樣有效，特別是如果感染性朊病毒蛋白已經(jīng)進(jìn)行過加工，使其對(duì)蛋白水解變得更敏感。這種蛋白水解酶更優(yōu)選地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)PWD-1角蛋白酶和/或其活性片段?；蛘撸@種蛋白水解酶是一種野生型的淀粉液化芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(Bacillus amyloliquefaciens subtilisin)的變異體，包括一種或多種氨基酸置換、添加或刪除。
此外，上文中描述的方法還可以包括步驟(c)檢驗(yàn)位點(diǎn)以證實(shí)在那里感染性朊病毒蛋白已減少，該步驟包括將該位點(diǎn)用選自蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)、三明治免疫分析試驗(yàn)、ELISA、熒光免疫分析檢驗(yàn)、毛細(xì)管免疫電泳試驗(yàn)和纖維蛋白溶酶原界限試驗(yàn)的方法進(jìn)行測(cè)試。本發(fā)明優(yōu)選用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢驗(yàn)。
如上文描述，本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及在被感染性朊病毒蛋白污染的或懷疑被感染性朊病毒蛋白污染的位點(diǎn)上減少感染性朊病毒蛋白的處理方法，其中所述位點(diǎn)包括含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織。這些組織包括動(dòng)物組織，優(yōu)選包括哺乳動(dòng)物組織例如牛組織、羊組織等等。也可來自這些動(dòng)物身體的任何部分，例如腦、垂體、腸、肺、心臟、腎以及脾組織。動(dòng)物組織優(yōu)選包括神經(jīng)系統(tǒng)組織，更優(yōu)選包括BSE感染的或瘙癢病感染的組織。它可以從攜帶感染性朊病毒蛋白的動(dòng)物中獲得。
如上文描述，本發(fā)明的另一個(gè)具體方面涉及在被感染性朊病毒蛋白污染的或懷疑被感染性朊病毒蛋白污染的位點(diǎn)上減少感染性朊病毒蛋白的處理方法，其中所述位點(diǎn)包括易受感染性朊病毒蛋白污染的物品。這些物品可能包括外科器械例如鉗(clamps)、鑷子(forceps)、剪刀、刀、電纜、鉆孔器、鉗子(tweezers)、插管、卡鉗、雕刻器、刮匙、刮刀器、擴(kuò)張器、夾鉗涂藥器、收縮裝置、收縮器、挖器、針托、吸管、凝固電極、腦電圖儀的深度電極、肋骨和胸骨擴(kuò)張器、雙極探針以及肋骨剪。另外，這些物品可能包括刀具和廚房用具例如刀、叉、剪刀、去皮機(jī)、削皮刀、切片機(jī)、刮鏟以及切肉刀，或?qū)嶒?yàn)儀器例如容器、過濾裝置、離心機(jī)、分光光度計(jì)以及熒光計(jì)，或獸醫(yī)裝置例如鉗、鑷子、刀、鋸、探針以及電子擊昏設(shè)備。
當(dāng)被處理的位點(diǎn)中包含物品時(shí)，為了凈化和消毒這些物品，步驟(b)中使用的蛋白水解酶優(yōu)選以溶液的形成提供。當(dāng)角蛋白酶用作蛋白水解酶時(shí)，這種酶溶液以低有效濃度為特征，該濃度優(yōu)選在約0.2g/L至約1.0g/L的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一方面涉及通過蛋白水解酶促降解處理以提高感染性朊病毒蛋白的降解性的方法，包括(a)將朊病毒蛋白加熱至低于朊病毒蛋白的熱解破壞溫度，接著(b)進(jìn)行朊病毒蛋白的酶促降解處理。
本發(fā)明的更進(jìn)一步方面涉及從包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的牛組織中除去感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在約100℃至約150℃的溫度范圍內(nèi)蒸煮牛組織，接著(b)在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)將該牛組織暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，其中該蛋白水解酶有效地對(duì)感染性朊病毒蛋白進(jìn)行蛋白水解，至少部分破壞牛組織中的感染性朊病毒蛋白。蒸煮優(yōu)選進(jìn)行約5分鐘至約5小時(shí)，步驟(b)中使用的蛋白水解酶優(yōu)選包括地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶。
就本發(fā)明的實(shí)踐，熱穩(wěn)定的蛋白水解酶是特別有用的。因此，本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及通過下面步驟在包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織中至少部分降解感染性朊病毒蛋白的方法，所述步驟包括加熱該組織并同時(shí)使其在足夠高的溫度下，在熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中暴露足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使感染性朊病毒蛋白至少部分降解；本發(fā)明的另一具體方面涉及組織組合物，該組織組合物包括含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織以及在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定的蛋白水解酶。這種熱穩(wěn)定的蛋白水解酶優(yōu)選是耐熱的蛋白酶，其可用于在足夠高的溫度下和足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)處理動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品以破壞其中引起B(yǎng)SE的感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及減少感染性朊病毒蛋白的組織處理方法。該方法包括步驟(a)在足夠高的溫度下將組織加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高該組織中感染性朊病毒蛋白的蛋白水解降解性；和(b)將所述已加熱的組織暴露于蛋白水解酶中，使其至少部分有效地減少該組織中的感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的另一方面涉及消毒易被感染性朊病毒蛋白污染的物品的方法，該方法包括步驟(a)在足夠高的溫度下將所述的物品加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所述物品上的朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；和(b)將所述已加熱的物品暴露于蛋白水解酶中，以至少部分有效地減少所述物品上的感染性朊病毒蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及從被感染性朊病毒蛋白污染的外科器械中除去感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在約100℃至約150℃的溫度范圍內(nèi)將所述外科器械加熱例如約5分鐘至約5小時(shí)，接著(b)在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)，將所述已加熱的外科器械暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分有效地破壞污染該外科器械上的感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的更進(jìn)一步方面涉及用于消毒易被感染性朊病毒蛋白污染的物品的清洗組合物，所述的組合物包括(i)一種或多種蛋白水解酶，選自角蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶類、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、極熱嗜菌蛋白酶、羰基水解酶、木瓜蛋白酶、胰酶、鏈激酶、鏈脫酶、無花果蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶以及菠蘿蛋白酶；和(ii)溶劑。
本發(fā)明的清洗組合物優(yōu)選包括濃度在約0.2g/L至約1.0g/L范圍內(nèi)的角蛋白酶。本發(fā)明可以使用各種溶劑，例如蒸餾水、緩沖溶液、洗滌液、醇、或任何其它的用于酶洗滌劑的無機(jī)或有機(jī)溶劑，這些可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，無需經(jīng)過試驗(yàn)。清洗組合物更優(yōu)選進(jìn)一步包括一種或多種提高消毒/滅菌效果的化學(xué)添加劑，其包括但不局限于表面活性劑、助洗劑、助促進(jìn)劑、填料及其他助劑。
其它方面，本發(fā)明的特點(diǎn)和實(shí)施方案將隨下面的公開和后附的權(quán)利要求書變得更加清楚。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1和2表示在SDS-PAGE凝膠上的凝膠電泳/蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，證明本發(fā)明的方法對(duì)破壞感染性朊病毒蛋白的效力。
發(fā)明詳述和優(yōu)選實(shí)施方案下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明及其特征、各個(gè)方面和實(shí)施方案，在發(fā)明的背景技術(shù)中引用的公開技術(shù)文獻(xiàn)，以及下面的專利和技術(shù)文獻(xiàn)，他們各自完整地在此引入作為參考美國專利號(hào)4,908,220；4,959,311；5,063,161；5,171,682；5,186,961；以及5,712,147；Deslys，J.P.，＂Screening slaughtered cattle for BSE＂，Nature，Vol.409，pp.476-477，2001年1月25日；以及Cohen，F(xiàn).E.，＂Protein Misfolding and PrionDiseases＂，J.Mol.Biol.(1999)，Vol.293，pp.313-320。
本發(fā)明使用蛋白水解酶來降解組織中的感染性朊病毒蛋白，或者，使用蛋白水解酶來消毒或滅菌被朊病毒污染的物品例如外科器械、刀具和廚房用具、獸醫(yī)裝置以及實(shí)驗(yàn)儀器。
用本發(fā)明的方法降解感染性朊病毒蛋白的效力是出人意料的，因?yàn)閷⒏腥拘噪貌《镜鞍讍为?dú)暴露于高溫(例如在200℃)并沒有改變他們的病原性特性；另外，常規(guī)的蛋白水解酶例如蛋白酶K，其徹底消化非感染性PrPc，也沒有破壞相應(yīng)的感染性同型異構(gòu)體。因此，非常驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以使用低于焚化溫度(在此以前該溫度是破壞感染性PrPSc所需的溫度)的溫度進(jìn)行酶處理，以徹底從包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織中除去感染性PrPSc。
在此使用的術(shù)語高溫是指溫度至少35℃。術(shù)語蛋白水解的敏感性是指將感染性朊病毒蛋白酶降解至非感染性產(chǎn)品的能力。
可以用下文描述的各種技術(shù)處理位點(diǎn)，例如組織或物品，以減少其中的感染性朊病毒蛋白。
例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在足夠高的溫度下將組織或物品(其可能包含感染性朊病毒蛋白、或被感染性朊病毒蛋白污染、或被懷疑包含感染性朊病毒蛋白、或被懷疑被感染性朊病毒蛋白污染)加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高可能存在的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解的敏感性，同時(shí)將該組織或物品暴露于蛋白水解酶中，使其至少部分有效地破壞存在于其中的任何感染性朊病毒蛋白。
這種處理方法可以按兩步順序進(jìn)行，首先，在較高的高溫下加熱組織或物品，然后，在較低的高溫下將已加熱的組織或物品暴露于酶試劑中，以進(jìn)行感染性朊病毒蛋白的蛋白水解降解。
在這種兩步處理法中，該組織或物品可以首先在較高的高溫下熱處理，然后通過例如使所述組織或物品放熱、對(duì)流或其它合適的方式，將該組織或物品冷卻至較低的高溫，以便進(jìn)行第二步酶處理步驟，當(dāng)組織或物品用蛋白水解酶接種或暴露于蛋白水解酶中時(shí)，該組織或物品處于一個(gè)合適的溫度下。
在這種兩步處理法的第二步驟中，將該組織或物品暴露于蛋白水解酶中，以使至少部分有效地破壞組織或物品中的感染性朊病毒蛋白。
因此，該方法可以在不同的實(shí)施方案中進(jìn)行，其中，通過將該組織或物品加熱至高溫，提高該組織或物品中的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性，以進(jìn)行隨后的蛋白水解酶處理。加熱步驟中的高溫可以是任何合適的溫度，例如至少35℃、至少40℃、至少60℃、至少75℃和/或不超過150℃(或其它較低溫度，如果需要)，一個(gè)說明性的具體溫度范圍為約100℃至約150℃、更優(yōu)選約125℃至約140℃。
或者，本發(fā)明也可以用一步法處理破壞朊病毒蛋白，在這種情況下，在處理過程中的相應(yīng)溫度下，蛋白水解酶是穩(wěn)定的和有效的，因此不需要最初的加熱步驟。
在一步法中，動(dòng)物組織或物品和蛋白水解酶一起被加熱至合適的高溫，以進(jìn)行感染性朊病毒蛋白的酶促降解。
例如，可以通過加熱組織或物品并同時(shí)將其暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分降解包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織或物品中的感染性朊病毒蛋白。
不管本發(fā)明方法中使用的具體順序，將組織或物品暴露于蛋白水解酶(兩步法中的第二步，或一步法的酶促降解步驟)，以至少部分有效地破壞其中的感染性蛋白朊病毒。
本發(fā)明的酶促降解步驟可以在任何合適的溫度下進(jìn)行。例如在溫度高于約35℃、高于約40℃、或高于約50℃下進(jìn)行，這取決于使用的蛋白水解酶的熱穩(wěn)定特性。
作為說明性的例子，酶促降解步驟可以在約35℃至約100℃、約40℃至約100℃、約50℃至約100℃、約40℃至約75℃、約50℃至約60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，這取決于蛋白水解的穩(wěn)定性以及所使用的具體蛋白水解酶的酶活性。
在酶促降解步驟中，蛋白水解酶至少部分、優(yōu)選完全地破壞要處理的組織或物品中的感染性蛋白朊病毒。
可以理解的是，本發(fā)明可以使用任何各式各樣的蛋白酶，用于蛋白水解降解的特定蛋白水解酶的選擇將影響溫度的選擇，并影響在暴露于蛋白水解酶之前對(duì)組織或物品進(jìn)行的任何高溫處理的選擇。
酶處理的具體溫度條件，以及在酶處理之前的任何高溫初步處理步驟必要的或所需的合適溫度條件，可以容易地由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確定，而無需經(jīng)過試驗(yàn)。
在本發(fā)明中使用的有用的蛋白水解酶包括那些在使用條件下是活性的并且是有效的酶。對(duì)于高溫酶處理，適合的蛋白水解酶在使用條件下是熱穩(wěn)定的。
在這方面，寬范圍變化的、具有熱穩(wěn)定特性的蛋白水解酶是已知的。例如，在本發(fā)明具體實(shí)施方案中使用的各種蛋白水解酶在35℃、40℃、50℃、60℃、或者甚至在100℃下還是熱穩(wěn)定的。
蛋白水解酶可以是任何合適類型的蛋白水解酶，可以包括單一酶的物種或多種酶的混合物。所述酶可以以純凈的形式和濃縮的形式使用，或者也可以以稀釋的形式使用。優(yōu)選將酶溶于溶劑中，形成濃度約0.2g/L至約1.0g/L的酶溶液。
本發(fā)明中使用的說明性的蛋白水解酶包括但不局限于，角蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶類、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、極熱嗜菌蛋白酶、羰基水解酶、木瓜蛋白酶、胰酶、鏈激酶、鏈脫酶、無花果蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶以及菠蘿蛋白酶。
優(yōu)選的酶物種包括角蛋白酶。一種特別優(yōu)選的角蛋白酶包括地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶。在本發(fā)明實(shí)踐中使用的蛋白水解酶物種包括蛋白水解酶的活性片段，例如角蛋白酶例如地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶的活性片段。當(dāng)本發(fā)明使用角蛋白酶時(shí)，酶溶液需要的有效濃度顯著地比常規(guī)的酶洗滌劑或消毒劑低。此外，角蛋白酶的特征是在pH值從約6.0至約9.5的范圍內(nèi)，角蛋白酶最佳的活性溫度范圍從約50℃至約65℃之間，大大高于那些最常見的酶洗滌劑。因此，本發(fā)明方法的凈化溫度可以顯著地提高，其更有效率地提高了手術(shù)器械上感染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性。
用本發(fā)明的方法處理組織時(shí)，被處理的組織可以是任何合適類型的組織，包括事實(shí)上或潛在地包含感染性朊病毒蛋白的哺乳動(dòng)物組織、非哺乳動(dòng)物組織、甚至植物組織。哺乳動(dòng)物組織可以包括人類以及非人類的哺乳動(dòng)物組織。
在一具體方面，本發(fā)明的方法適合處理的組織包括，但不限于，牛組織、羊組織、猴組織和人組織，以及包括不同的組織類型，例如腦、垂體、腸、肺、心臟、腎、和/或脾組織。一方面，本發(fā)明的方法被用于處理神經(jīng)系統(tǒng)組織，其可以是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織。
根據(jù)本發(fā)明，在蛋白水解酶促處理結(jié)束之后，從組織或消毒的/殺菌的物品例如外科器械等等中用蛋白水解酶去除感染性朊病毒蛋白的方法，可以進(jìn)一步包括檢驗(yàn)組織或物品以證實(shí)其中的感染性朊病毒蛋白被破壞的一個(gè)或多個(gè)步驟。組織或物品中感染性朊病毒蛋白的檢驗(yàn)可以以任何合適的方式以及用任何合適的檢驗(yàn)技術(shù)或方法進(jìn)行，例如將該組織或物品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)、三明治免疫分析試驗(yàn)、ELISA、熒光免疫分析試驗(yàn)、毛細(xì)管免疫電泳試驗(yàn)、纖維蛋白溶酶原界限試驗(yàn)或其它合適的試驗(yàn)，上述各種試驗(yàn)可有效的確定在處理的組織中是否存在感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的酶處理方法可以以任何合適的方式進(jìn)行，用任何合適的處理步驟順序。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)需要或要求，將要處理的組織或物品進(jìn)行最初的非酶熱處理，接著進(jìn)行酶處理以破壞感染性或污染的朊病毒蛋白，接著漂洗和非酶處理，檢驗(yàn)已處理的組織或物品；根據(jù)需要，如果后處理檢驗(yàn)顯示沒有完全從組織或物品中除去感染性朊病毒蛋白，可以進(jìn)一步進(jìn)行熱/酶處理(例如以一種交替的和重復(fù)循環(huán)的非酶熱處理以及酶高溫處理)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過步驟在足夠高的溫度下將組織或物品加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，并同時(shí)將其暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分降解在包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織或物品中的感染性朊病毒蛋白。然后，將已處理的組織或物品進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定感染性朊病毒蛋白是否被除去。
另外，在任何熱/酶處理之前，本發(fā)明的方法可以包括首先測(cè)定要處理的組織或物品中是否存在感染性朊病毒蛋白，以便使處理僅僅針對(duì)包含感染性朊病毒蛋白的組織或物品。
或者，盡管預(yù)先沒有明確地確定是否存在感染性朊病毒蛋白，可以對(duì)可能潛在地包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織或物品給予熱/酶處理，接著檢驗(yàn)處理過的產(chǎn)品確定其中是否存在任何感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的方法有效地用于破壞肉和肉類副產(chǎn)品中的感染性朊病毒蛋白，這些肉以及肉類副產(chǎn)品對(duì)包含介導(dǎo)TSEs，例如BSE的感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染是敏感的。
因此，本發(fā)明提供了一種可靠的處理牛及其它畜牧產(chǎn)品以及副產(chǎn)品的方法，而不是將其焚化以避免BSE及其它感染性朊病毒蛋白疾病的傳播，該方法是將所述產(chǎn)品在食品加工和/或加工操作中進(jìn)行進(jìn)一步的處理。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種畜產(chǎn)品和畜副產(chǎn)品的處理方法，其中例如通過加熱至一溫度，該溫度低于感染性朊病毒蛋白的熱解破壞溫度(＜＜200℃)(通常在該溫度下進(jìn)行焚化)，將朊病毒蛋白進(jìn)行非酶熱處理，接著酶促降解感染性朊病毒蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)說明性的具體實(shí)施方案中，在約100℃至約150℃的溫度范圍內(nèi)蒸煮牛組織，例如約5分鐘至約5小時(shí)，接著在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)，將該牛組織暴露于蛋白水解酶中，在該溫度范圍內(nèi)蛋白水解酶是熱穩(wěn)定的并且對(duì)水解蛋白是有效的，以破壞所述牛組織中的感染性朊病毒蛋白，從而從包含感染性朊病毒蛋白的牛組織中除去感染性朊病毒蛋白。
蒸煮處理可以在一個(gè)合適的槽或容器中進(jìn)行，其中適當(dāng)?shù)鼐S持高溫條件，在蒸煮操作中選擇性地控制壓力以提供一個(gè)理想的大氣壓、低于大氣壓、或超大氣壓。
在蒸煮之后，將牛組織用地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶進(jìn)行蛋白水解酶處理，以破壞其中所有的感染性朊病毒蛋白。按照熱/酶處理方法，可以以任何合適的方式處理該組織。
例如，在檢驗(yàn)或測(cè)定以證實(shí)感染性朊病毒蛋白被完全破壞后，可以將例如牛的組織加工得到動(dòng)物飼料成分(例如肉骨粉)或飼料添加劑。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，首先在約125℃至約150℃的高溫范圍內(nèi)進(jìn)行蒸煮，然后在約40℃至約60℃的高溫范圍內(nèi)使用地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶對(duì)牛組織進(jìn)行酶處理。
使用本發(fā)明的方法使加工的牛肉類副產(chǎn)品能夠利用，否則(懷疑或證實(shí)存在感染性朊病毒蛋白)這些牛肉類副產(chǎn)品需要焚化和填埋。
因此本發(fā)明的方法在本領(lǐng)域中取得了重大的進(jìn)步，允許將材料作為營養(yǎng)使用，否則沒有處理的這些材料將構(gòu)成生物危害性。本發(fā)明的方法同時(shí)避免了焚化和填埋被感染的或被污染的動(dòng)物組織需要的成本和基礎(chǔ)設(shè)施。
本發(fā)明具體表現(xiàn)為一種簡(jiǎn)單的由組織中除去感染性朊病毒蛋白，例如介導(dǎo)BSE的朊病毒蛋白的方法，該方法是通過在足夠高的溫度和足夠長(zhǎng)的時(shí)間下，將所述組織暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分地從所述組織中清除感染性朊病毒蛋白。
本發(fā)明的方法廣泛地適用于破壞朊病毒蛋白，該朊病毒蛋白可引起可傳染的海綿狀腦病(TSE)和/或其它朊病毒蛋白介導(dǎo)的疾病，包括但不限于，牛海綿狀腦病(BSE)和羊瘙癢病。
本發(fā)明的方法適于處理人類食物中的動(dòng)物肉類以及加工動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料成分的畜牧副產(chǎn)品。
在組合物方面，本發(fā)明包括一種組織組合物，其中包括(i)組織，例如牛組織，其包含感染性朊病毒蛋白，例如介導(dǎo)BSE的朊病毒蛋白，和(ii)蛋白水解酶，例如地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶，其在酶處理使用的溫度范圍內(nèi)例如從約40℃至約60℃是熱穩(wěn)定的。
這種組織組合物可以在高溫下存在。組合物在合適的高溫下是酶活性的，以得到包括蛋白水解酶和無感染性朊病毒蛋白的已處理組織的產(chǎn)品組合物。
雖然在上文中，本發(fā)明已經(jīng)說明性地描述了本發(fā)明的方法主要應(yīng)用于處理感染的或污染的收獲期的動(dòng)物組織，例如用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料成分的加工動(dòng)物部分，本發(fā)明同樣包括用蛋白水解酶處理體內(nèi)朊病毒疾病的應(yīng)用。
在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括蛋白水解酶作為活性成分的治療組合物，用于治療體內(nèi)朊病毒疾病，該蛋白水解酶能有效地對(duì)抗朊病毒疾病。
另一個(gè)實(shí)施方案包括治療組合物，其包含角蛋白酶和作為體內(nèi)感染性朊病毒蛋白的分子識(shí)別蛋白的非感染性朊病毒蛋白(例如PrPc、或改性的PrPSc使其具有相同的非感染性、或非感染性PrPSc片段)的結(jié)合。
可以理解的是，其它治療組合物包括角蛋白酶或其它向量化構(gòu)造的蛋白水解酶或組合。
另一種說明性的治療組合物包括致熱劑，例如無毒改性內(nèi)毒素類似物，和蛋白水解酶的結(jié)合，其能有效地抗擊引起體內(nèi)發(fā)熱的朊病毒疾病。
本發(fā)明同樣包括體內(nèi)治療組合物，其包括多核苷酸序列，作為重組體多核苷酸表達(dá)載體的一部分，該多核苷酸序列包括用于產(chǎn)生蛋白水解酶或其活性片段的第一區(qū)域編碼以及產(chǎn)生致熱肽的第二區(qū)域編碼。轉(zhuǎn)移感染后，耐熱的蛋白水解酶或其活性片段以及致熱肽的體內(nèi)表達(dá)具有對(duì)抗感染性朊病毒蛋白的作用。
作為更進(jìn)一步的例子，該治療組合物可以與血腦屏障穿越劑，例如能穿越血腦屏障的兩親藥物低聚共軛物配制在一起，用于治療感染性海綿狀腦病。這種組合物可以包括與低聚物共軛的治療化合物，例如角蛋白酶、其它蛋白水解酶、或它們的活性片段，其中低聚物包括偶合于親水性部分的親脂性部分。用于配制這種治療組合物的低聚物在國際公布WO00/09073(2000年2月24日公開)有更詳細(xì)地描述。
本發(fā)明方法的另一個(gè)重要應(yīng)用是物品，例如外科器械、刀具、廚房用具、實(shí)驗(yàn)儀器以及獸醫(yī)裝置的消毒和/或滅菌。這種方法廣泛適用于破壞被朊病毒蛋白污染的下述物品(a)外科器械，例如鉗、鑷子、剪刀、刀、電纜、鉆孔器、鉗子、插管、卡鉗、雕刻器、刮匙、刮器、擴(kuò)張器、夾鉗涂藥器、收縮裝置、收縮器、挖器、針托、吸管、凝固電極、腦電圖儀的深度電極、肋骨和胸骨擴(kuò)張器、雙極探針以及肋骨剪等等；(b)刀具和廚房用具，例如刀、叉、剪刀、去皮機(jī)、削皮刀、切片機(jī)、刮鏟、以及切肉刀；(c)實(shí)驗(yàn)儀器，例如過濾裝置、離心機(jī)、分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)和各種容器；和(d)獸醫(yī)裝置，例如鉗、鑷子、刀、鋸、探針以及電子擊昏設(shè)備。
上述目錄僅僅是本發(fā)明幾個(gè)應(yīng)用的說明，它不應(yīng)被認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下表表示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的消毒/滅菌周期表1
在另一實(shí)施方案中，將熱穩(wěn)定的蛋白水解酶用于這種消毒/滅菌過程，以便可以同時(shí)進(jìn)行加熱和酶洗滌步驟，在足夠高的溫度下和足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行消毒/滅菌處理，以完全破壞感染性朊病毒蛋白和對(duì)已處理的物品進(jìn)行滅菌。
在組合物方面，本發(fā)明包括一種清洗組合物，其包括(i)在酶處理使用溫度范圍內(nèi)，例如從約40℃至約60℃的溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定的蛋白水解酶，例如地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶；和(ii)溶劑。
在本發(fā)明的組合物中可以使用適合于酶洗滌劑使用的任何溶劑?？紤]到生物的兼容性和低成本，蒸餾水是優(yōu)選的溶劑。本發(fā)明還可以使用其它常規(guī)的無機(jī)和有機(jī)溶劑例如醇、緩沖溶液、洗滌劑溶液，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以容易地挑選和使用與特定酶相容的溶劑。常見的化學(xué)添加劑也可以加入到本發(fā)明的清洗組合物中，其包括但不局限于，表面活性劑、助洗劑、助促進(jìn)劑、填料及其它助劑。
本發(fā)明的清洗組合物甚至在非常低的濃度例如小于0.3g/L時(shí)仍保持其破壞感染性朊病毒蛋白的有效性。當(dāng)在所述清洗組合物中使用角蛋白酶時(shí)，這種組合物的酶濃度優(yōu)選在約0.2g/L至約1.0g/L的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的清洗組合物在高溫是酶反應(yīng)活性的，因此它可以在高溫使用以完全破壞外科器械、刀具、廚房用具、獸醫(yī)裝置、和實(shí)驗(yàn)儀器上的感染性朊病毒蛋白。
通過參考以下說明性的實(shí)施例，本發(fā)明發(fā)明特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將更加充分地顯現(xiàn)。
實(shí)施例1在該實(shí)施例中，使用從家禽糞肥的嗜熱厭氧消化池中分離得到的降解羽毛細(xì)菌，地衣芽孢桿菌株P(guān)WD-1，作為角蛋白酶的來源。(參見M.Williams和J.C.H.Shih，J.Appl.Bacteriol.，67，25(1989)；J.C.H.Shih，Poultry Sci.72，1617(1993))(見X.Lin，C.G.Lee，E.S.Casale，和J.C.H.Shih，Appl.Environ.Microbiol.58，3271(1992))。
將該角蛋白酶的基因編碼進(jìn)行分離并測(cè)序(參見X.Lin，D.W.Kelemen，E.S.Miller和J.C.H.Shih，Appl.Env.Microbiol.，61，1469(1995))并進(jìn)行這種酶的規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)(參見J.J.Wang and J.C.H.Shih，J.Ind.Microb.Biotech.，22，608(1999))。這種酶是一種絲氨酸蛋白酶。
粗制的和提純的角蛋白酶按以前描述的方法制備(參見X.Lin，C.G.Lee，E.S.Casale，和J.C.H.Shih，Appl.Environ.Microbiol.58，3271(1992)and J.J.Wang和J.C.H.Shih，J Ind.Microb.Biotech.22，608(1999))并從the Fermentation Facility at North Carolina State University，Raleigh，North Carolina(NCSU)獲得。角蛋白酶對(duì)PrP作用試驗(yàn)在Lelystad(ID-Lelystad)，荷蘭的畜牧學(xué)和健康學(xué)會(huì)進(jìn)行。
在與各種底物的反應(yīng)中，將提純的角蛋白酶與其它蛋白酶包括彈性蛋白酶、膠原酶、蛋白酶K和胰蛋白酶(所有都來自Sigma化學(xué)公司)進(jìn)行比較。角蛋白、彈性蛋白、和膠原蛋白的水解用游離氨基增加的茚三酮顯色反應(yīng)(A450)進(jìn)行測(cè)定(參見X.Lin，C.G.Lee，E.S.Casale，和J.C.H.Shih，Appl.Environ.Microbiol.58，3271(1992))。以游離亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算游離氨基的當(dāng)量。酪蛋白水解用上清液中A280的增加進(jìn)行測(cè)定(參見Price and Johnson，1989)。結(jié)果表示在下面的表1中。對(duì)于每一給定的底物，測(cè)定所有蛋白酶的相對(duì)活性。累積相對(duì)活性(CRA)表明角蛋白酶具有寬范圍的底物和高的活性。
表1 蛋白酶作用于不同底物時(shí)相對(duì)的特異活性a
a所有的酶活性分別在它們的最佳條件下測(cè)定和比較。
b蛋白水解用茚三酮反應(yīng)測(cè)定(Lin等人，1992)。
c蛋白水解用增加的可溶A280測(cè)定(Price和Johnson 1989)。
d累積相對(duì)活性。
角蛋白酶對(duì)病原性PrP作用的試驗(yàn)在ID-Lelystad的分子識(shí)別實(shí)驗(yàn)室中的一種隔離設(shè)備中進(jìn)行。使用歐盟認(rèn)證的檢驗(yàn)朊病毒的程序(European Union-Validation Procedure of Prionics Check)(朊病毒AG，蘇黎士)測(cè)定病原性PrP。朊病毒檢驗(yàn)程序基于蛋白質(zhì)印跡技術(shù)并使用6H4單克隆抗體以觀察特定形式的PrP[prionsin AG，牛中BSE-朊病毒的檢驗(yàn)，(Test for Detection of B SE-prionsin Cattle)Practical ProductInformation，蘇黎士(2000)]。
為了模仿肉骨粉加工過程，對(duì)原始程序進(jìn)行修改。首先，用角蛋白酶代替標(biāo)準(zhǔn)方法中的蛋白酶K。使用粗制的角蛋白酶。其次，檢驗(yàn)預(yù)先蒸煮的BSE組織的作用。用Vulcain壓力鍋在115℃蒸煮均質(zhì)的組織40分鐘。第三，檢驗(yàn)抗氧化劑，亞硫酸鈉(Na2SO3)的作用。步驟與Practical Product Information相同[prionsin AG，牛中BSE-朊病毒的檢驗(yàn)，(Test for Detection of BSE-prionsin Cattle)Practical ProductInformation，蘇黎士(2000)]。
使用下面的方案將1g BSE陽性的腦組織與9ml朊病毒緩沖劑混合并攪勻。分成兩份，每份5ml，其中一份加入Na2SO3，最后濃度為0.1％，另一份沒有加入Na2SO3。分成4×2.0ml，將其分別裝入高壓福爾肯(Falcon)管中。另外1.0ml用作陽性對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)朊病毒方法處理，另外1.0ml用于沒有角蛋白酶的對(duì)照。將有和沒有Na2SO3的兩個(gè)管加壓蒸煮40分鐘，其它兩個(gè)管不進(jìn)行蒸煮。將樣品，每份150μl，在PCR板的孔中，在50℃用角蛋白酶(150μg，1,000EU/mg)處理零-時(shí)間或4小時(shí)。角蛋白酶預(yù)先溶于磷酸鹽緩沖劑中，0.05M，pH為7.5。通過加入Prionics Pefabloc，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑使反應(yīng)停止。酶培養(yǎng)結(jié)束的時(shí)候，將每種樣品混合物10μl裝載到SDS-PAGE凝膠上，接著進(jìn)行朊病毒的電泳、蛋白質(zhì)印跡、免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示在圖1中(角蛋白酶對(duì)BSE朊病毒蛋白的降解作用)，其中帶1-17如下帶1只有緩沖溶液。
帶2試驗(yàn)用BSE腦組織。
帶3用Na2SO3預(yù)先蒸煮，角蛋白酶在零-時(shí)間停止。
帶4和帶3一樣，除角蛋白酶消化4小時(shí)之外。
帶5在沒有Na2SO3的情況下預(yù)先蒸煮，角蛋白酶在零-時(shí)間停止。
帶6和帶5一樣，除角蛋白酶消化4小時(shí)之外。
帶7無預(yù)先蒸煮，用Na2SO3，角蛋白酶在零-時(shí)間停止。
帶8和帶7一樣，除角蛋白酶消化4小時(shí)之外。
帶9無預(yù)先蒸煮，無Na2SO3，角蛋白酶在零-時(shí)間停止。
帶10和帶9一樣，除角蛋白酶消化4小時(shí)之外。
帶11無預(yù)先蒸煮，用Na2SO3，沒有角蛋白酶。
帶12和帶11一樣，除培育4小時(shí)之外(注角蛋白酶是隨意添加的)。
帶13提純的瘙癢病PrP，用Na2SO3，角蛋白酶在零-時(shí)間停止。
帶14和帶13一樣，除角蛋白酶消化4小時(shí)之外。
帶15提純的瘙癢病PrP，用Na2SO3，無角蛋白酶。
帶16和帶15一樣，除培育4小時(shí)之外。
帶17PrP標(biāo)準(zhǔn)。
如圖1所示，角蛋白酶對(duì)感染性PrP的消化作用是明顯的，特別是當(dāng)樣品在115℃預(yù)煮40分鐘(帶3-6)的時(shí)候。無預(yù)先蒸煮(帶7-10)時(shí)，角蛋白酶的效力較低，但角蛋白酶仍然降解一半以上的感染性PrP陽性材料。在提純的羊瘙癢病PrP上，發(fā)現(xiàn)角蛋白酶同樣具有活性(帶13-16)。Na2SO3單獨(dú)存在或者與角蛋白酶一起存在看起來沒有太多區(qū)別(帶15-16)。帶12的樣品是隨意添加角蛋白酶的，因此顯示陽性。
實(shí)施例2根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行的試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明的效力。
PWD-1角蛋白酶，來源于地衣芽孢桿菌菌株P(guān)WD-1的絲氨酸蛋白酶，被用來降解感染的牛和羊腦干組織中的PrPSc。朊病毒的檢驗(yàn)(朊病毒AG，蘇黎士，瑞士)用于測(cè)定樣品中的PrPSc，按下面步驟檢驗(yàn)朊病毒預(yù)煮組織樣品，用作為消化酶的提純PWD-1角蛋白酶消化組織樣品。
在每種情況中，將1g BSE陽性腦干組織與9ml朊病毒均化緩沖劑混合并攪勻，接著在115℃用Vulcan壓力鍋蒸煮40分鐘。在96孔板中，每個(gè)孔中加入150μl樣品，用預(yù)先溶于磷酸鹽緩沖劑的PWD-1角蛋白酶(0.05M，pH為7.5)處理。使用的酶濃度是250μg/ml。在50℃酶消化60分鐘。加入15μl Pefabloc，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，停止反應(yīng)。時(shí)間-零樣品按如下處理在加入PWD-1角蛋白酶之前，首先加入抑制劑。酶培養(yǎng)結(jié)束的時(shí)候，將每個(gè)樣品10μl裝載到SDS-PAGE凝膠上。用電泳、蛋白質(zhì)印跡法和免疫化學(xué)發(fā)光法等在朊病毒檢測(cè)試劑盒中進(jìn)行檢測(cè)。
用純凈的PWD-1角蛋白酶對(duì)腦干組織樣品，3 BSE陽性(樣品B1，B2，B3)，1陰性(牛樣品N)，2瘙癢病陽性(樣品S1和S2)和1陰性(羊樣品N)和相應(yīng)的對(duì)照，進(jìn)行試驗(yàn)。
圖2表示結(jié)果，左側(cè)板(＂角蛋白酶處理＂)是角蛋白酶消化的結(jié)果，右側(cè)板(＂對(duì)照＂)是標(biāo)準(zhǔn)朊病毒檢驗(yàn)的結(jié)果。角蛋白酶能水解所有試驗(yàn)的PrPSc、BSE(帶3-5)以及瘙癢病(帶8和9)。
圖2表明，當(dāng)這些樣品根據(jù)本發(fā)明用熱和酶結(jié)合處理時(shí)，在包含感染性朊病毒蛋白的牛組織樣品(樣品B1、B2、B3)和包含感染性朊病毒蛋白的羊樣品(樣品S1和S2)中的感染性朊病毒蛋白被完全破壞。
結(jié)果證明角蛋白酶在降解各種類型試驗(yàn)蛋白中的通用性。在檢測(cè)角蛋白酶對(duì)BSE PrP的效力中，特別是當(dāng)BSE腦組織樣品預(yù)先蒸煮時(shí)，結(jié)果是肯定的。這是首次用實(shí)驗(yàn)證明病原性PrP可用酶降解。
在將牲畜副產(chǎn)品變成肉骨粉時(shí)，在125左右加壓蒸煮是一種常規(guī)的步驟。根據(jù)本發(fā)明用角蛋白酶進(jìn)行后-蒸煮處理，用于破壞感染性PrP，提供了一種有效的方法以控制BSE的蔓延。角蛋白酶處理的肉骨粉很容易地被檢驗(yàn)證實(shí)沒有PrP，因此肉骨粉可以再循環(huán)用于飼料。
因此，本發(fā)明的方法提供一種簡(jiǎn)單的和有用的用酶處理畜牧產(chǎn)品和副產(chǎn)品的方法。
雖然本發(fā)明已經(jīng)描述了各種說明性特點(diǎn)、方面和實(shí)施方案，應(yīng)該理解，本發(fā)明并不因此受這些限制，對(duì)本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員容易理解的是，根據(jù)本發(fā)明可以擴(kuò)展到包括其它的變種、修改和其它實(shí)施方案。
因此，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明廣義地解釋為和理解為包括其它變種、修改、及其它實(shí)施方案。
工業(yè)的實(shí)用性本發(fā)明的方法和組合物用于破壞感染性朊病毒蛋白，適用于處理生物材料，例如包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的動(dòng)物組織。本發(fā)明能夠處理生物材料以使其變成有用的和安全的動(dòng)物飼料或其它營養(yǎng)最終產(chǎn)品，所述生物材料(在懷疑或證實(shí)存在感染性朊病毒蛋白)是需要焚化和銷毀的。本發(fā)明的方法和組合物對(duì)物品的消毒和/或滅菌同樣有用，例如外科器械、刀具、廚房用具、實(shí)驗(yàn)儀器、以及獸醫(yī)裝置的消毒和/或滅菌，并有效地防止由于這些物品的重復(fù)使用而引起的感染性朊病毒蛋白的交叉污染和繁殖。
權(quán)利要求
1.在被感染性朊病毒蛋白污染或懷疑被感染性朊病毒蛋白污染的位點(diǎn)處減少感染性朊病毒蛋白的處理方法，該方法包括步驟(a)加熱位點(diǎn)至足夠高的溫度并保持該溫度足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所在位點(diǎn)的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；(b)將已加熱的位點(diǎn)暴露于蛋白水解酶中，以使該位點(diǎn)至少部分有效地減少傳染性蛋白朊病毒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的溫度不超過約150℃。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的溫度在約100℃至約150℃之間。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的溫度在約125℃至約140℃之間。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在約35℃至約100℃之間的溫度下進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在高于約40℃的溫度下進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在高于約50℃的溫度下進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在低于步驟(a)的溫度下進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在約40℃至約75℃之間的溫度下進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在約50℃至約60℃之間的溫度下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶包括選自下述的酶角蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶類、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、極熱嗜菌蛋白酶、羰基水解酶、木瓜蛋白酶、胰酶、鏈激酶、鏈脫酶、無花果蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶以及菠蘿蛋白酶。
12.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶包括角蛋白酶和/或其活性片段。
13.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白水解酶包括地衣芽孢桿菌PWD-1酶和/或其活性片段。
14.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括步驟(c)檢驗(yàn)所述位點(diǎn)以證實(shí)感染性朊病毒蛋白已減少。
15.權(quán)利要求14的方法，其中檢驗(yàn)步驟(c)包括將所述位點(diǎn)用蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)、三明治免疫分析試驗(yàn)、ELISA、熒光免疫分析試驗(yàn)、毛細(xì)管免疫電泳試驗(yàn)以及纖維蛋白溶酶原界限試驗(yàn)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
16.權(quán)利要求14的方法，其中檢驗(yàn)步驟(c)包括將所述位點(diǎn)用蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的位點(diǎn)包括含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括哺乳動(dòng)物組織。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括神經(jīng)系統(tǒng)組織。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括牛組織。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括感染BSE的組織。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括羊組織。
23.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織包括感染瘙癢病的組織。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織選自腦、垂體、腸、肺、心臟、腎以及脾組織。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述的組織來自一種攜帶感染性朊病毒蛋白的動(dòng)物。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述的位點(diǎn)包括易受感染性朊病毒蛋白污染的物品。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的物品包括外科器械。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的外科器械選自鉗、鑷子、剪刀、刀、電纜、鉆孔器、鉗子、插管、卡鉗、雕刻器、刮匙、刮刀器、擴(kuò)張器、夾鉗涂藥器、收縮裝置、收縮器、挖器、針托、吸管、凝固電極、腦電圖儀的深度電極、肋骨和胸骨擴(kuò)張器、雙極探針以及肋骨剪。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述的物品包括刀具和廚房用具。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的刀具和廚房用具選自刀、叉、剪刀、去皮機(jī)、削皮刀、切片機(jī)、刮鏟、以及切肉刀。
31.權(quán)利要求26的方法，其中所述的物品包括實(shí)驗(yàn)儀器。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的實(shí)驗(yàn)儀器選自容器、過濾裝置、離心機(jī)、分光光度計(jì)以及熒光計(jì)。
33.權(quán)利要求26的方法，其中所述的物品包括獸醫(yī)裝置。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的獸醫(yī)裝置選自鉗、鑷子、刀、鋸、探針以及電子擊昏設(shè)備。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述的蛋白水解酶包括蛋白酶。
36.權(quán)利要求35的方法，其中蛋白酶包括羰基水解酶。
37.權(quán)利要求36的方法，其中羰基水解酶包括枯草桿菌蛋白酶。
38.權(quán)利要求37的方法，其中枯草桿菌蛋白酶包括野生型的淀粉液化芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的變異體，包含一種或多種氨基酸置換、添加或刪除。
39.通過蛋白水解酶促降解處理以提高感染性朊病毒蛋白的降解性的方法，該方法包括(a)將朊病毒蛋白加熱至低于朊病毒蛋白熱解破壞的溫度，接著(b)進(jìn)行朊病毒蛋白的酶促降解處理。
40.從包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的牛組織中除去感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在約100℃至約150℃的溫度范圍內(nèi)蒸煮所述的牛組織，接著(b)在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)將該牛組織暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以有效地進(jìn)行蛋白水解，至少部分破壞所述牛組織中的感染性朊病毒蛋白。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述的蒸煮進(jìn)行約5分鐘至約5小時(shí)。
42.權(quán)利要求40的方法，其中蛋白水解酶包括地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶。
43.降解感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在第一高溫范圍內(nèi)將感染性朊病毒蛋白加熱，接著(b)在第二高溫范圍內(nèi)將感染性朊病毒蛋白冷卻至較低的高溫，以及(c)將感染性朊病毒蛋白在此較低的高溫下有效的暴露于蛋白水解酶中，以將感染性朊病毒蛋白降解為良性的降解產(chǎn)物。
44.至少部分降解包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織或物品中的感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括步驟在足夠高的溫度下和足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，加熱該組織或物品并同時(shí)將其暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分降解在組織或物品中的感染性朊病毒蛋白。
45.破壞可介導(dǎo)BSE的感染性朊病毒蛋白的動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品的加工方法，該方法包括在足夠高的溫度下和足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)用耐熱的蛋白酶處理所述動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品，以破壞介導(dǎo)BSE的感染性朊病毒蛋白。
46.一種組織組合物，其中包括含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織，以及在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定的蛋白水解酶。
47.處理組織以減少感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)加熱組織至足夠高的溫度并保持該溫度足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所述組織中傳染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；和(b)將已加熱的組織暴露于蛋白水解酶中，以使該組織至少部分有效地減少傳染性蛋白朊病毒。
48.消毒易被感染性朊病毒蛋白污染的物品的方法，該方法包括以下步驟(a)在足夠高的溫度下將所述的物品加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所述物品上朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；和(b)將已加熱的物品暴露于蛋白水解酶中，以至少部分有效地減少所述物品上的感染性朊病毒蛋白。
49.從被感染性朊病毒蛋白污染的外科器械中除去感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在約100℃至約150℃的溫度范圍內(nèi)將該外科器械加熱，，接著(b)在約35℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)，將所述已加熱的外科器械暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分有效地破壞污染所述外科器械的感染性朊病毒蛋白。
50.消毒易受感染性朊病毒蛋白污染的物品的清洗組合物，所述的組合物包括(i)一種或多種蛋白水解蛋白質(zhì)，選自角蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶類、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、極熱嗜菌蛋白酶、羰基水解酶、木瓜蛋白酶、胰酶、鏈激酶、鏈脫酶、無花果蛋白酶、羧肽酶、木瓜凝乳蛋白酶以及菠蘿蛋白酶；和(ii)溶劑。
51.權(quán)利要求50的清洗組合物，其中包括角蛋白酶。
52.權(quán)利要求51的清洗組合物，其中所述的角蛋白酶的濃度在約0.2g/L至約1.0g/L的范圍內(nèi)。
53.權(quán)利要求50的清洗組合物，其中溶劑選自蒸餾水、醇、緩沖溶液以及洗滌液。
54.權(quán)利要求50的清洗組合物，其中還包括一種或多種選自表面活性劑、助洗劑、助促進(jìn)劑和填料的化學(xué)添加劑。
55.減少其中的感染性朊病毒蛋白的組織處理方法，該方法包括以下步驟(a)在至少40℃的溫度下將組織加熱足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所在組織的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解的敏感性；和(b)將已加熱的組織暴露于蛋白水解酶中，以使該組織至少部分有效地減少傳染性蛋白朊病毒。
56.降解感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)在第一高溫范圍內(nèi)加熱感染性朊病毒蛋白，所述第一高溫高于60℃但低于所述朊病毒蛋白的熱解破壞溫度，接著(b)在第二高溫范圍內(nèi)，將感染性朊病毒蛋白冷卻至較低的高溫，接著(c)在此較低的高溫下將感染性朊病毒蛋白有效的暴露于蛋白水解酶中，以將感染性朊病毒蛋白降解為良性的降解產(chǎn)物。
57.在包含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織中至少部分降解感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括以下步驟在高于40℃但低于朊病毒蛋白的熱解破壞溫度下以及在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)加熱該組織，同時(shí)將其暴露于熱穩(wěn)定的蛋白水解酶中，以至少部分降解感染性朊病毒蛋白。
58.加工處理動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品以清除其中家道BSE的感染性朊病毒蛋白的方法，該方法包括在高于60℃但低于朊病毒蛋白熱解破壞溫度下，用耐熱的蛋白酶處理動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以破壞其中介導(dǎo)BSE的感染性朊病毒蛋白。
59.組織組合物，其中包括含感染性朊病毒蛋白或被感染性朊病毒蛋白污染的組織，以及一種選自角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽酶、寡肽酶、嗜熱菌蛋白酶、bacillolysin、mycilysins、羧肽酶、亮氨酰氨基肽酶、氨基肽酶、以及極嗜熱菌蛋白酶的蛋白水解酶。
60.動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品的加工方法，該方法包括在高于40℃但低于朊病毒蛋白的熱解破壞溫度下，用能有效破壞任何與此有關(guān)的感染性朊病毒蛋白的蛋白酶處理所述動(dòng)物肉制品或其副產(chǎn)品足夠長(zhǎng)的時(shí)間。
61.在被感染性朊病毒蛋白污染或懷疑被感染性朊病毒蛋白污染的位點(diǎn)上減少感染性朊病毒蛋白的處理方法，該方法包括以下步驟(a)在至少40℃下加熱位點(diǎn)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以提高所在位點(diǎn)的感染性朊病毒蛋白的蛋白水解敏感性；和(b)將已加熱的位點(diǎn)暴露于蛋白水解酶中，以使該位點(diǎn)至少部分有效地減少感染性蛋白朊病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種破壞感染性朊病毒蛋白的方法和組合物，該朊病毒蛋白與傳染性海綿狀腦病(TSE)和/或其它由朊病毒蛋白引起的疾病有關(guān)，通過用破壞朊病毒的蛋白酶進(jìn)行熱/酶處理感染性朊病毒蛋白。該方法和組合物用于處理含感染性朊病毒或被感染性朊病毒蛋白菌株污染的組織，或者用于對(duì)朊病毒污染的物品，例如外科器械、廚房用具、實(shí)驗(yàn)儀器等的消毒或殺菌。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1516740SQ02808204
公開日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月12日
發(fā)明者石家興 申請(qǐng)人:百瑞國際公司