專利名稱：異常型朊病毒蛋白結合劑和異常型朊病毒蛋白的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及異常型朊病毒蛋白結合劑和異常型朊病毒蛋白的檢測方法。
背景技術：
所謂的朊病毒病正成為嚴重的社會問題。作為該朊病毒病，已知的有傳染性海綿 狀腦病(TSE)，例如羊瘙癢癥(scrapie)、牛海綿狀腦病(BSE)、克羅伊茨費爾特-雅各布病 (CJD)等。由各種證據可知，這些朊病毒病是由于感染性朊病毒蛋白(異常型朊病毒蛋白) (PrPsc)而引起的。因此，為了避免人和動物傳染朊病毒病、并確保醫(yī)藥品和食品的安全性，對試樣中 的感染性朊病毒蛋白(異常型朊病毒蛋白)的檢測進行了各種嘗試。然而，人和動物在生物體內本來就具有不引起朊病毒病的非感染性朊病毒蛋白 (正常型朊病毒蛋白)(PrPe)。并且，令人驚奇的是，該正常型朊病毒蛋白與異常型朊病毒 蛋白具有相同的氨基酸序列(一級結構)，其不同之處僅在于由相同的氨基酸序列所形成 的高級結構。通常，作為區(qū)分并檢測兩種蛋白質的方法，有使用能夠區(qū)分這些蛋白質的特異性 抗體的方法。然而，也許是因為如上所述氨基酸序列相同，至今也沒有獲得能夠區(qū)分異常型 朊病毒蛋白和正常型朊病毒蛋白的特異抗體。即，使用特異性抗體來檢測試樣中的感染性 朊病毒蛋白(異常型朊病毒蛋白)的方法尚未有實用化的可能性。因此，目前，異常型朊病毒蛋白的檢測方法僅限于下面的大致2種方法。一種方法為將疑含有異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒蛋白)的試樣注入到試 驗動物的腦內，然后進行長時間的飼養(yǎng)，確認所得到的腦標本在神經病理學上的變化。該方法雖然為能夠信賴的方法，但令人遺憾的是，由于需要花費大量的時間和費 用，因而除了作為各種檢測方法的校準試驗使用之外，尚未成為常用的檢測方法。另一種方法為使用蛋白酶K的方法。也許是因為其高級結構的原因，已知正常型 朊病毒蛋白容易被蛋白酶K分解(敏感性)，另一方面，異常型朊病毒蛋白難以被蛋白酶K 分解(耐受性)。因此，利用這種對于被蛋白酶K分解的敏感性(耐受性)的不同，例如，在 蛋白酶K處理后，若能通過使用了多克隆抗體的免疫印跡法等檢測到與處理前位置相同的 條帶，則判斷蛋白質為異常型朊病毒蛋白，若對應的條帶消失(沒有檢測到)，則判斷為正 常型朊病毒蛋白，從而能夠進行檢測。使用了該蛋白酶K的檢測方法目前正被廣泛使用，并提出了許多變形(專利文獻 1 日本特開平10-267928號公報，專利文獻2 日本特開平11-32795號公報，專利文獻3 : 日本特開2003-121448號公報)。然而，該方法必須進行酶處理，因而必須準備適于酶反應的條件，從這點來看非常 繁雜，而且進行酶反應需要花費時間，其結果，在原理上存在迅速性和簡易性不充分、作為 試劑需要比較昂貴的酶等缺點。
專利文獻1 日本特開平10-267928號公報專利文獻2 日本特開平11-32795號公報專利文獻3 日本特開2003-121448號公報

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題因此，要求一種能夠簡便、迅速且以高靈敏度定量地從正常型朊病毒蛋白中區(qū)分 并檢測出異常型朊病毒蛋白而不需要利用蛋白酶K進行酶處理的方法。S卩，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠簡便、迅速且以高靈敏度定量地從正常型朊 病毒蛋白中區(qū)分并檢測出異常型朊病毒蛋白而不需要利用蛋白酶K進行酶處理的方法；以 及在該方法中使用的檢測劑。另外，為了在這種檢測方法中使用，要求一種不與正常型朊病毒蛋白結合、而與異 常型朊病毒蛋白特異性結合的試劑(結合劑)。S卩，本發(fā)明的目的還在于提供一種不與正常型朊病毒蛋白結合、而與異常型朊病 毒蛋白特異性結合的試劑(結合劑)。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了達到上述目的，對異常型朊病毒蛋白的特異性檢測方法進行了深 入研究，結果發(fā)現(xiàn)，屬于來源于哺乳動物乳的蛋白質的乳鐵蛋白，具有不與正常型朊病毒蛋 白結合、而僅與異常型朊病毒蛋白特異性結合的性質，由此完成了本發(fā)明。S卩，乳鐵蛋白即為長久以來一直要求的、不與正常型朊病毒蛋白結合而與異常型 朊病毒蛋白特異性結合的試劑(結合劑)，如果使用該乳鐵蛋白，則能夠從正常型朊病毒蛋 白中區(qū)分并檢測出異常型朊病毒蛋白而不需要利用蛋白酶K進行酶處理。另外，通過利用乳鐵蛋白的與異常型朊病毒蛋白特異性結合的性質，不僅能夠進 行異常型朊病毒蛋白的特異性檢測，還能夠進行異常型朊病毒蛋白的特異性分離(包括純 化和濃縮)、異常型朊病毒蛋白的特異性固定、異常型朊病毒蛋白的自締合的特異性抑制， 提供在利用蛋白酶K的酶處理的方法中不可能實現(xiàn)的新型的用途。即，本發(fā)明的異常型朊 病毒蛋白結合劑具有這種有用的用途。因此，本發(fā)明包含以下[1] [2]。[1] 一種異常型朊病毒蛋白結合劑，其包含乳鐵蛋白。[2] 一種異常型朊病毒蛋白結合劑，其具有由乳鐵蛋白構成的異常型朊病毒蛋白 結合部位。另外，若將乳鐵蛋白固定在載體上而使用的話，特別適合進行僅將異常型朊病毒 蛋白從正常型朊病毒蛋白中分離(包括純化和濃縮)而獲得；與異常型朊病毒蛋白結合而 將其固定；檢測異常型朊病毒蛋白。因此，本發(fā)明還包括以下[3] [6]。[3]根據[1] [2]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其中，乳鐵蛋白被 固定在載體上。[4]根據[1] [2]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其中，乳鐵蛋白作 為異常型朊病毒蛋白結合部位被固定在載體上。
[5]根據[3] [4]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其中，載體為珠。[6]根據[5]所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其中，珠為能夠磁性化的珠。這種異常型朊病毒蛋白結合劑能夠在檢測異常型朊病毒蛋白的用途中使用。因此，本發(fā)明還包括以下[7] [9]。
[7]根據[1] [6]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其為異常型朊病毒 蛋白檢測劑。[8]根據[1] [6]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其為具有由乳鐵蛋 白構成的異常型朊病毒蛋白結合部位的異常型朊病毒蛋白檢測劑。[9]根據[1] [6]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其為包含由乳鐵蛋 白構成的異常型朊病毒蛋白結合部位、和標記部位的異常型朊病毒蛋白檢測劑。此外，本發(fā)明還包括使用異常型朊病毒蛋白結合劑、或異常型朊病毒蛋白檢測劑 來檢測、結合、分離(包括純化的方法和濃縮的方法)、固定異常型朊病毒蛋白的方法；或使 用異常型朊病毒蛋白結合劑、或異常型朊病毒蛋白檢測劑來抑制異常型朊病毒蛋白的自締 合的方法。因此，本發(fā)明還包括以下[10] [18]。[10] 一種異常型朊病毒蛋白的檢測方法，其包括如下工序使[3] [6]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑與試樣接觸的工序；從與試樣接觸的該異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序；檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。[11]根據[10]所述的方法，其中，檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白 的工序是通過免疫學檢測法檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。[12]根據[11]所述的方法，其中，免疫學檢測法為蛋白質印跡(western blot) 法、ELISA (酶聯(lián)免疫分析，Enzyme-LinkedImmunosorbnent Assay)法、或免疫沉淀法。[13] 一種異常型朊病毒蛋白的分離方法，其包括如下工序使[3] [6]中任一項所述的異常型朊病毒蛋白結合劑與試樣接觸的工序；從與試樣接觸的該異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序。[14]根據[10] [13]中任一項所述的方法，其中，乳鐵蛋白固定在載體上而成的 異常型朊病毒蛋白結合劑為乳鐵蛋白固定化珠。[15]根據[10] [13]中任一項所述的方法，其中，異常型朊病毒蛋白結合劑為使 用能夠磁性化的珠的乳鐵蛋白固定化珠。[16]根據[10] [15]中任一項所述的方法，其中，試樣為在動物組織中添加表面 活性劑并使其均勻化而獲得的液體試樣。[17]根據[16]所述的方法，其中，動物組織為哺乳動物的腦、脊髓、眼和/或小腸。[18]根據[10] [17]中任一項所述的方法，其中，分離所結合的成分的工序通過 用含有乳鐵蛋白的溶液使其溶出來進行。此外，本發(fā)明還包括以下[19] [22]。[19] 一種異常型朊病毒蛋白的檢測方法，其包括如下工序使乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白結合的工序；檢測與異常型朊病毒蛋白結合的乳鐵蛋白的工序。
[20] 一種異常型朊病毒蛋白的檢測方法，其包括如下工序使具有標記部位的乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白結合的工序；檢測與異常型朊病毒蛋白結合的乳鐵蛋白的標記部位的工序。[21] 一種通過使乳鐵蛋白 與異常型朊病毒蛋白結合來抑制異常型朊病毒蛋白的 自締合的方法。[22] 一種異常型朊病毒蛋白的自締合抑制劑，其包含乳鐵蛋白。此外，本發(fā)明還包括乳鐵蛋白、具有標記部位的乳鐵蛋白、或被固定在載體上的乳 鐵蛋白的、用于與異常型朊病毒蛋白結合的用途(use)。此外，本發(fā)明還包括乳鐵蛋白、具有標記部位的乳鐵蛋白、或被固定在載體上的乳 鐵蛋白的、用于檢測異常型朊病毒蛋白的用途(use)。此外，本發(fā)明還包括乳鐵蛋白、具有標記部位的乳鐵蛋白、或被固定在載體上的乳 鐵蛋白的、用于分離異常型朊病毒蛋白的用途(use)。此外，本發(fā)明還包括乳鐵蛋白、具有標記部位的乳鐵蛋白、或被固定在載體上的乳 鐵蛋白的、用于抑制異常型朊病毒蛋白的自締合的用途(use)。發(fā)明的效果如本發(fā)明首次公開的那樣，乳鐵蛋白不與正常型朊病毒蛋白結合而僅與異常型朊 病毒蛋白特異性結合，因此根據基于該見解的本發(fā)明，能夠簡便、迅速且以高靈敏度定量地 從正常型朊病毒蛋白中區(qū)分并檢測出異常型朊病毒蛋白而不需要利用蛋白酶K進行酶處理。S卩，根據本發(fā)明，不需要為了從正常型朊病毒蛋白中區(qū)分異常型朊病毒蛋白而利 用蛋白酶K進行酶處理，因而不存在必須準備適于酶反應的條件的繁雜性，而且不需要用 于進行酶反應的時間。其結果，根據本發(fā)明，在原理上不會出現(xiàn)在利用蛋白酶K進行酶處理 時所產生的迅速性和簡易性不充分、作為試劑需要比較昂貴的酶等缺點。因此，根據本發(fā)明，對于使用了來源于動物的原材料的飲食品和醫(yī)藥品，能夠比以 往更簡便、迅速且以高靈敏度定量地、以更低成本進行異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒 蛋白)所致的污染的檢查。另外，能夠比以往更簡便、迅速且以高靈敏度定量地、以更低成 本進行人和動物的朊病毒病的診斷。由此，能夠順應對人和動物的朊病毒病的感染防止和 早期診斷等社會要求。此外，根據本發(fā)明，能夠從正常型朊病毒蛋白中分離回收并獲得異常型朊病毒蛋 白，由此，能夠實現(xiàn)異常型朊病毒蛋白的分離、濃縮和純化。因此，通過對其進行組合，能夠 更有效地進行上述異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒蛋白)所致的污染的檢查、以及人和 動物的朊病毒病的診斷。


圖1為表示異常型朊病毒蛋白在乳鐵蛋白固定化珠上特異性結合的免疫印跡的結果。圖2為表示利用現(xiàn)有方法即蛋白酶K處理來識別異常型朊病毒蛋白的免疫印跡的結果。
具體實施例方式接下來，詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式。然而，本發(fā)明不限于以下的優(yōu)選的實施方式，可以在本發(fā)明的范圍內自由變更。另外，本說明書中，如果沒有特別說明則百分率 表示的是質量百分率。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的異常型朊病毒蛋白的檢測方法，可以作為包含以 下工序的方法來實施使乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合劑與試樣接觸的工序；從與試樣接觸的異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序；檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。根據該方法，利用固定在異常型朊病毒蛋白結合劑中的乳鐵蛋白，能夠特異性結 合(吸附)試樣中所含的異常型朊病毒蛋白，接下來，能夠將與固定在異常型朊病毒結合劑 中的乳鐵蛋白結合的異常型朊病毒蛋白分離、回收，然后通過檢測這樣分離的異常型朊病 毒蛋白，能夠將異常型朊病毒蛋白與正常型朊病毒蛋白區(qū)分、檢測。檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序優(yōu)選是通過免疫學檢測法 檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。作為優(yōu)選的免疫學檢測法，可列舉出蛋白質印跡法、ELISA法、或免疫沉淀法。在檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序中進行的檢測，只要是包 括上述免疫學檢測法在內的、能夠檢測異常型朊病毒蛋白的方法即可，即便是無法區(qū)分異 常型朊病毒蛋白和正常型朊病毒蛋白的方法，也當然可以使用。這是因為，在本發(fā)明中，通 過在其之前的工序中進行與乳鐵蛋白的結合，從而已經確保了對于異常型朊病毒蛋白的特 異性。因此，在上述免疫學檢測法中，即便是無法區(qū)分異常型朊病毒蛋白和正常型朊病毒蛋 白的抗體，也當然可以使用。乳鐵蛋白(lactoferrin 以下，有時簡稱為LF。)是指主要包含在母乳中的分子 量約SOkDa的鐵結合性糖蛋白，已知的是其是一種對大腸桿菌、念珠菌、梭菌、葡萄球菌等 有害微生物具有抗菌作用且具有免疫激活作用、抗腫瘤作用等各種作用的乳蛋白質。由于 乳鐵蛋白為來源于乳的糖蛋白質，因而安全性高，能夠長期連續(xù)使用，且其自身也基本上無 臭無味，作為各種食品、醫(yī)藥品、飼料的添加物的通用性較高。然而，至今還不了解其與異常 型朊病毒蛋白的特異性結合能力。在本發(fā)明中使用的乳鐵蛋白，可以使用市售的乳鐵蛋白、或如下制得的乳鐵蛋 白以哺乳動物(例如，人、牛、山羊、綿羊、馬等。)的初乳、過渡乳、成熟乳、末期乳、或這些 乳的處理物即脫脂乳、乳清等為原料，通過例如離子交換色譜法等常規(guī)方法，由前述原料分 離而得到的乳鐵蛋白。其中，優(yōu)選使用以工業(yè)規(guī)模制造的市售的乳鐵蛋白(例如，森永乳業(yè) 公司制)。此外，也能夠使用利用基因工程的方法通過微生物、動物細胞、轉基因動物等生產 的乳鐵蛋白。來源于牛乳的乳清能作為乳制品制造的副產物而穩(wěn)定且大量地獲得，由于該 優(yōu)點，因而尤其優(yōu)選作為在本發(fā)明中使用的乳鐵蛋白的原料。其中，以下示出乳鐵蛋白的調制(從乳等原料中分離、純化乳鐵蛋白)方法的一 個例子。首先，將離子交換體(例如CM-S印harose FF(商品名，Amersham pharmacia公司 制))填充到柱中，通入鹽酸，并水洗，以平衡離子交換體。接著，將冷卻到4°C的pH6.9的脫 脂牛乳通入柱中，回收透過液，再次同樣地將液體通入柱中。接著，向柱中通入蒸餾水，通入食鹽水，得到吸附到離子交換體上的堿性蛋白質的洗脫液。向該洗脫液中添加飽和度80% 的硫酸銨，使蛋白質沉淀，離心分離而回收沉淀物。用飽和度80%的硫酸銨溶液洗滌所回 收的沉淀物，添加去離子水進行溶解，使用超濾膜組件(例如SLP0053 (商品名，旭化成公司 制))將所得到的溶液脫鹽，冷凍干燥，得到粉末狀牛乳鐵蛋白。這樣，得到純度在95質量％ 以上的牛乳鐵蛋白。另外，本說明書中的乳鐵蛋白的純度為通過液相色譜法測定所得的值。乳鐵蛋白與許多蛋白質同樣地，當然其基因會根據種、屬、個體等的差異而存在1 個或多個位置上的1個或多個堿基的置換、缺失、插入、添加或倒位等突變，具有這種突變 的基因所編碼的蛋白質的氨基酸中有時也會產生突變。在能夠用于本發(fā)明的乳鐵蛋白中， 在不損害與異常型朊病毒蛋白的特異性結合性的范圍內，還包括包含這種突變的乳鐵蛋 白。能夠用于調制將乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合劑的乳鐵 蛋白的固定方法，只要是不損害與異常型朊病毒蛋白的特異性結合性的方法即可，可以使 用通常的固定方法。作為這種方法，例如，可列舉出與多肽的伯氨基直接形成共價鍵的方 法；與多肽的硫氫基(巰基)直接形成共價鍵的方法等。
在將乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合劑中，固定有乳鐵蛋白 的載體只要是在所期望的條件下能夠作為固體層操作的載體即可，只要是蛋白質被固定而 使用的一般的載體則都能夠使用。作為這種載體，例如，可列舉出在表面具有親水性或疏水 性的樹脂的載體，作為其形狀，例如，可列舉出顆粒狀(珠狀)、膜狀、纖維狀、中空纖維狀、 網狀等。作為優(yōu)選的載體，可列舉出形狀為珠狀(顆粒狀)的載體。珠(顆粒)的粒徑(直 徑)可以根據目的來選擇，例如，通常可以使用0. 5 200 μ m、優(yōu)選為1.0 10(^111、進一 步優(yōu)選為1. 0 50 μ m、進一步優(yōu)選為1. 0 20 μ m、進一步優(yōu)選為1. 0 10 μ m、尤其優(yōu)選 為1. 0 5. 0 μ m的范圍的粒徑(直徑)。在優(yōu)選的方式中，作為載體，可以使用表面具有疏水性或親水性的樹脂的珠(顆 粒)，此時，乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合活性載體為乳鐵蛋白固定 化珠。若使用這種載體的話，一方面能在液體中懸浮并使其分散，另一方面也容易根據操作 上的需要而使其沉降并回收。在進一步優(yōu)選的方式中，作為載體，可以使用在表面具有疏水性或親水性的樹脂 的珠(顆粒)、且其內部(中心部)包含能夠磁性化的材料的載體，此時，乳鐵蛋白固定在載 體上而成的異常型朊病毒蛋白結合活性載體為使用能夠磁性化的珠的乳鐵蛋白固定化珠。 若使用這種載體的話，一方面能在液體中懸浮并使其分散，另一方面也容易根據操作上的 需要而利用磁體使其沉降并回收。本領域技術人員可以根據操作上的要求，在將乳鐵蛋白 固定化珠與試樣接觸的工序、分離所結合的成分的工序等工序中或者在該工序的前后進行 這種操作。試樣可以使用疑存在異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒蛋白)的所有液體試樣， 但在存在異常型朊病毒蛋白的情況下，優(yōu)選被充分分散而成的試樣。在檢查對象為動物組 織的情況下，優(yōu)選其被充分增溶。作為這樣增溶的試樣，例如可列舉出在動物組織中添加表 面活性劑并均勻化而得到的液體試樣。這種液體試樣的PH優(yōu)選為中性附近，通?？梢詢?yōu) 選使用PH5. 5 7. 8、優(yōu)選為pH6. 0 7. 7、尤其優(yōu)選為pH6. 5 7. 6的范圍的pH，但不限 于此。作為用于調制這種液體試樣而使用的表面活性劑，只要是通常用于使動物組織增溶而使用的表面活性劑則都能夠使用，但從增溶與保持朊病毒蛋白的高級結構的觀點來看， 優(yōu)選使用非離子性表面活性劑，作為能夠優(yōu)選使用的表面活性劑，例如可列舉出tween20、 tritonX-100、NP-40，優(yōu)選為 tween20、tritonX-100、NP_40，尤其優(yōu)選為 tween20、NP_40。為 了確保乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白的特異性結合性，優(yōu)選在后述那樣的條件下，將試樣 調制成能夠與異常型朊病毒蛋白結合活性載體接觸的液體試樣。為了確保乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白的特異性結合性，異常型朊病毒蛋白結合 活性載體與試樣的接觸通常適合在PH5. 5 7. 8、優(yōu)選為pH6. 0 7. 7、尤其優(yōu)選為pH6. 5 7. 6的范圍內，通常在3 30°C、優(yōu)選為3°C 20 V、尤其優(yōu)選為3 5°C的范圍的溫度下， 通常在5 300分鐘、優(yōu)選為10 180分鐘、尤其優(yōu)選為15 90分鐘的范圍的接觸時間 的條件下進行，但不限于這些條件。 作為被增溶的動物組織，可以使用疑存在異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒蛋 白)的所有動物組織，但為了早期診斷，優(yōu)選已知異常型朊病毒蛋白的蓄積較多的、哺乳動 物的腦、脊髓、眼和/或小腸。在從與試樣接觸的異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序中，可以用 在通常用于蛋白質-蛋白質的相互作用的解離中的條件之中比較強的解離條件進行解離， 并分離和溶出所結合的成分。作為這種條件，例如，可列舉出在中性附近的PH下、通過含有 表面活性劑的溶液在3 30°C的范圍的溫度下進行的條件。另外，為了使乳鐵蛋白與異常 型朊病毒蛋白的特異性結合解離，可以通過用含有乳鐵蛋白的溶液使其溶出來進行。在優(yōu)選的實施方式中，在使乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合 劑與試樣接觸的工序之后、且在從與試樣接觸的異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成 分的工序之前，可以設置洗滌與試樣接觸的異常型朊病毒蛋白結合劑的工序。當存在主要 是進行非特異性吸附的成分時，該洗滌是為了將其從與試樣接觸的異常型朊病毒蛋白結合 劑中除去而進行的，可以根據以這種目的所進行的常規(guī)方法來進行，例如，可以使用用于調 制與異常型朊病毒蛋白結合劑接觸的試樣而使用的、不含被增溶的動物組織等的溶液來進 行洗滌，但不限于此。此外，本發(fā)明還包括異常型朊病毒蛋白的分離方法，關于本發(fā)明的異常型朊病毒 蛋白的分離方法，在優(yōu)選的實施方式中，可以作為包含以下工序的方法來實施使乳鐵蛋白固定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合劑與動物組織被增溶的 試樣接觸的工序；從實施了試樣接觸處理工序的異常型朊病毒蛋白結合活性載體分離所結合的成 分的工序。根據該方法，能夠利用被固定在異常型朊病毒結合劑中的乳鐵蛋白來特異性結合 (吸附)試樣中所含的異常型朊病毒蛋白，接下來，能夠將與固定在異常型朊病毒結合劑中 的乳鐵蛋白結合的異常型朊病毒蛋白分離、回收。由此，能夠分離、濃縮、和純化異常型朊病 毒蛋白。上述本發(fā)明的異常型朊病毒蛋白的分離方法的實施方式能夠如下實施在作為本 發(fā)明的異常型朊病毒蛋白的檢測方法的優(yōu)選實施方式而說明的工序中，除了檢測所分離的 成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序以外，以同樣的工序來實施。因此，在異常型朊病毒 蛋白的檢測方法的優(yōu)選實施方式中已經記載過的內容，在異常型朊病毒蛋白的分離方法的實施方式中能夠直接適用。本發(fā)明的包含乳鐵蛋白的異常型朊病毒蛋白結合劑，除了能夠作為將乳鐵蛋白固 定在載體上而成的異常型朊病毒蛋白結合劑而在上述那樣的實施方式中使用以外，還能夠 在以下那樣的實施方式中使用。S卩，作為本發(fā)明的異常型朊病毒蛋白結合劑的優(yōu)選使用方式，可列舉出包含以下 工序的異常型朊病毒蛋白的檢測方法使乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白結合的工序；檢測與異常型朊病毒蛋白結合的乳鐵蛋白的工序。根據該異常型朊病毒蛋白的檢測方法，能夠使用乳鐵蛋白作為異常型朊病毒蛋白 結合劑而不需要進行特別的修飾。異常型朊病毒蛋白的檢測能夠通過所結合的乳鐵蛋白的 檢測來進行。作為乳鐵蛋白的檢測法，可以使用通常使用的所有檢測方法，例如，可以使用利用 了針對乳鐵蛋白的抗體的免疫學檢測法。另外，作為本發(fā)明的異常型朊病毒蛋白結合劑的優(yōu)選使用方式，可列舉出包含以 下工序的異常型朊病毒蛋白的檢測方法使具有標記部位的乳鐵蛋白與異常型朊病毒蛋白結合的工序；檢測與異常型朊病毒蛋白結合的乳鐵蛋白的標記部位的工序。根據該異常型朊病毒蛋白的檢測方法，使乳鐵蛋白預先帶有標記部位，并使用具 有該標記部位的乳鐵蛋白作為異常型朊病毒蛋白結合劑。異常型朊病毒蛋白的檢測能夠通 過乳鐵蛋白上帶有的標記部位的檢測來進行。作為標記部位，只要是通常對于生物高分子使用的標記部位則都能夠使用。作 為這種標記部位，例如，可列舉出熒光標記、放射線標記、酶標記。作為熒光標記，例如，可 列舉出AlexaFluor (注冊商標)(Becton, Dickinson and Company制)系列的染料、和 CyeDye (注冊商標)(Becton，Dickinson and Company制)系列的染料，例如，可列舉出 Alexa Fluor (注冊商標)488 和 AlexaFluor (注冊商標)647、或者 Cy3、Cy5. 5 和 Cy7 作為 優(yōu)選的例子。作為放射線標記，例如，可列舉出使用了 14C和35S的標記。作為酶標記，例 如，可列舉出使用了辣根過氧化物酶(HRP,HorseRadish Peroxydase)或堿性磷酸酶(ALP， Alkaline Phosphatase)的標記。本發(fā)明還包括使用異常型朊病毒蛋白結合劑來抑制異常型朊病毒蛋白的自締合 的方法、和異常型朊病毒蛋白的自締合抑制劑。目前相信異常型朊病毒蛋白的多個分子會 自締合而形成多聚體、以及也許是因為這個原因而提高了朊病毒病的病原性，但本發(fā)明的 異常型朊病毒蛋白結合劑能夠與異常型朊病毒蛋白特異性結合，從而抑制該自締合。另一 方面，本發(fā)明的異常型朊病毒蛋白結合劑由于不與正常型朊病毒蛋白結合，因而不必擔心 其對正常型朊病毒蛋白所具有的未知的生物體功能造成不良影響。實施例以下舉出實施例來詳細說明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于以下的實施 例。[實施例1][利用乳鐵蛋白固定化珠從感染腦檢測異常型朊病毒蛋白]使用異常型朊病毒蛋白感染后的小鼠腦，如下所述利用乳鐵蛋白固定化珠進行異常型朊病毒蛋白的檢測。
(乳鐵蛋白固定化珠的制作)用ImL 的磷酸鹽緩沖液(PBS)對 ImL 的 Dynabeads M_280Tosylactivated 進行 2次洗滌后，向其中加入將Img乳鐵蛋白溶解到ImL 0. IM硼酸緩沖液中而得到的溶液，在 37°C下顛倒混合24小時。除去上清，用ImL的PBS洗滌Dynabeads 2次，向Dynabeads中 加入含有0. 1 %乳鐵蛋白的0. 2M Tris鹽酸緩沖液(pH8. 5) ImL,在37°C下顛倒混合4小時。接下來，除去上清，用ImL的含有0. 乳鐵蛋白的PBS洗滌Dynabeads 1次，接著 用含有0. 1 % Tween 20的PBS洗滌1次。接下來，除去上清，用ImL的含有0. 1 %乳鐵蛋白的PBS洗滌Dynabeads 1次，除 去上清，用ImL的含有0. 乳鐵蛋白的PBS保存如此獲得的乳鐵蛋白結合DynabeadM以 下，也稱為乳鐵蛋白結合珠、或乳鐵蛋白固定化珠)。(將腦組織增溶的試樣(腦乳劑)的調制)從感染異常型朊病毒蛋白的小鼠中取出腦。將異常型朊病毒蛋白感染的小鼠腦 (以下，也稱為感染腦)放入均質器(BioMasher)中，以10，000 X g離心分離2分鐘，向回收 的顆粒(pellet)中加入NP-40 RIPA制成10% (w/v)腦乳劑。將其在4°C下孵育15分鐘 后，攪拌混合，以10，OOOXg離心分離2分鐘，回收上清。向回收的上清中加入NP-40 RIPA， 調制2% (w/v)腦乳劑(將腦組織增溶的試樣)。這樣，獲得了感染腦的腦乳劑(以下也稱 為感染腦乳劑)。(利用乳鐵蛋白固定化珠分離異常型朊病毒蛋白)向腦乳劑500 μ 1中加入乳鐵蛋白結合Dynabeads 20 μ 1，在4°C下顛倒混合1小 時。之后，用ImL的NP-40 RIPA將珠洗滌10分鐘，洗滌3次，進而用ImL的NP-40 RIPA通 宵洗滌。回收洗滌后的乳鐵蛋白結合Dynabeads，加入20 μ 1中性緩沖液(NuPAGE LDS樣品 緩沖液(4Χ)，Invitrogen公司制)，在95°C下加熱10分鐘制成試驗試樣。另外，由于珠為磁性體的珠，因而珠的回收在操作中使用適當的磁體來進行。(利用免疫印跡法的檢測)對所調制的試驗試樣通過免疫印跡法進行朊病毒蛋白質的檢測。S卩，對試驗試樣使用NuPAGE凝膠進行電泳(40mA恒定電流，70分鐘)，接著，使用 槽式轉印(Tank blotter)裝置向PVDF膜轉印(220mA恒定電流，60分鐘)凝膠中的蛋白質。轉印后的PVDF膜使用Block Ace(大日本制藥)在4°C下封閉30分鐘，接著，將以 包含0. Tween20的Block Ace稀釋至5，000倍的含有HRP結合抗朊病毒蛋白單克隆抗 體(T2-HRP)的溶液添加到PVDF膜上，在4°C下孵育1小時。與抗體反應的PVDF膜用含有0. 1 % Tween20的PBS洗滌10分鐘，洗滌3次，用化 學發(fā)光檢測試劑展開膜，使用圖像分析裝置檢測化學發(fā)光。[比較例1][利用乳鐵蛋白固定化珠從非感染腦檢測異常型朊病毒蛋白]使用正常的小鼠腦(以下，也稱為正常腦或非感染腦)，如下所述利用乳鐵蛋白固 定化珠進行異常型朊病毒蛋白的檢測。
(乳鐵蛋白固定化珠的制作)與實施例1同樣進行。
(將腦組織增溶的試樣(腦乳劑)的調制)代替感染異常型朊病毒蛋白的小鼠，使用從正常的小鼠(非感染小鼠)中取出的 腦，除此之外與實施例1同樣進行，獲得了正常腦的腦乳劑(以下也稱為正常腦乳劑、或非 感染腦乳劑)。(利用乳鐵蛋白固定化珠分離異常型朊病毒蛋白)代替感染腦乳劑，使用非感染腦乳劑，除此之外與實施例1同樣進行，得到試驗試樣。(利用免疫印跡法的檢測)代替來源于感染腦乳劑的試驗試樣，使用來源于非感染腦乳劑的試驗試樣，除此 之外與實施例1同樣進行。(結果)圖1為表示實施例1和比較例1中得到的免疫印跡的結果的圖。所有泳道均未實 施蛋白酶K處理(PK-)。泳道1、2和3為對感染腦乳劑利用乳鐵蛋白固定化珠進行了異常型朊病毒蛋白的 分離而得的試驗試樣(實施例1)。將泳道1的試樣稀釋10倍而進行免疫印跡的泳道為泳 道2，泳道1的100倍稀釋為泳道3。泳道4為對非感染腦乳劑利用乳鐵蛋白固定化珠進行 了異常型朊病毒蛋白的分離而得的試驗試樣(比較例1)。在泳道1、2和3中，呈濃度依賴性地觀察到朊病毒蛋白的條帶，在泳道1的100倍 稀釋即泳道3中也明確地觀察到朊病毒蛋白的條帶。根據試樣的來源，這表示異常型朊病 毒蛋白。即，通過與乳鐵蛋白固定化珠的結合，來源于感染腦的異常型朊病毒蛋白被分離并 被檢測到。另一方面，在泳道4中，雖然在操作上為與泳道1同等程度的濃度的試樣，但沒有 觀察到朊病毒蛋白的條帶。即，通過與乳鐵蛋白固定化珠的結合，來源于非感染腦的正常型 朊病毒蛋白沒有被回收、且沒有被檢測到。由以上內容可知，來源于感染腦的異常型朊病毒蛋白與乳鐵蛋白固定化珠特異性 結合，來源于非感染腦的正常型朊病毒蛋白不與乳鐵蛋白固定化珠結合。此外，使用乳鐵蛋 白固定化珠，能夠從正常型朊病毒蛋白分離回收并獲得異常型朊病毒蛋白，由此，可知能夠 檢測異常型朊病毒蛋白。[比較例2][使用蛋白酶K來檢測異常型朊病毒蛋白]根據使用蛋白酶K而進行的現(xiàn)有方法，如下所述進行從正常型朊病毒蛋白區(qū)分并 檢測異常型朊病毒蛋白的實驗(比較例2)。(腦乳劑的調制)準備感染了異常型朊病毒蛋白的小鼠的腦(以下也稱為感染腦)和非感染小鼠 (正常小鼠)的腦(以下也稱為非感染腦或正常腦)，將這些小鼠腦分別放入均質器中，以 10，000Xg離心分離2分鐘，向回收的顆粒中加入NP-40 RIPA制成10% (w/v)腦乳劑。將 其在4°C下孵育15分鐘后，攪拌混合，以10，OOOXg離心分離2分鐘，回收上清。向回收的上清中加入NP-40 RIPA，調制0.5% (w/v)腦乳劑，獲得感染腦乳劑和非感染腦乳劑。(利用蛋白酶K的酶分解處理)向這些腦乳劑500 μ 1中添加蛋白酶K，使最終濃度為20yg/ml，在37°C下孵育30 分鐘。反應后，加入蛋白酶K抑制劑(Pefablock) 5 μ 1，進而加入丁醇-甲醇溶液250 μ 1， 攪拌混合后，以20，OOOXg離心分離10分鐘。離心分離后，向顆粒中加入50 μ 1中性緩沖 液(NuPAGE LDS樣品緩沖液(4Χ)，Invitrogen公司制)，在95°C下加熱10分鐘，分別獲得 來源于感染腦乳劑的試樣和來源于非感染腦乳劑的試樣。(利用免疫印跡法的檢測)對于如上所述獲得的、利用蛋白酶K進行了酶分解處理的感染腦乳劑(蛋白酶K 處理感染腦乳劑)、利用蛋白酶K進行了酶分解處理的非感染腦乳劑(蛋白酶K處理非感染 腦乳劑)、以及沒有利用蛋白酶K進行酶分解處理的感染腦乳劑(原本的感染腦乳劑)、沒 有利用蛋白酶K進行酶分解處理的非感染腦乳劑(原本的非感染腦乳劑)這4種試樣，通 過免疫印跡法進行朊病毒蛋白質的檢測。S卩，對試樣使用NuPAGE凝膠進行電泳(40mA恒定電流，70分鐘)，接著，使用槽式 轉印裝置向PVDF膜轉印(220mA恒定電流，60分鐘)凝膠中的蛋白質。轉印后的PVDF膜使用Block Ace(大日本制藥)在4°C下封閉30分鐘，接著，將以 包含0. Tween20的Block Ace稀釋至5，000倍的含有HRP結合抗朊病毒蛋白單克隆抗 體(T2-HRP)的溶液添加到PVDF膜上，在4°C下孵育1小時。與抗體反應的PVDF膜用含有0. 1 % Tween20的PBS洗滌10分鐘，洗滌3次，用化 學發(fā)光檢測試劑展開膜，使用圖像分析裝置檢測化學發(fā)光。(結果)圖2為表示比較例2中得到的免疫印跡的結果的圖。泳道1和2為沒有利用蛋白 酶K進行酶分解處理的泳道(PK-)，泳道3和4為利用蛋白酶K進行了酶分解處理的(PK+) 泳道。泳道1為以沒有利用蛋白酶K進行酶分解處理的感染腦乳劑(原本的感染腦乳 齊U)為試樣的泳道。泳道2為以沒有利用蛋白酶K進行酶分解處理的非感染腦乳劑(原本 的非感染腦乳劑)為試樣的泳道。泳道3為以利用蛋白酶K進行了酶分解處理的感染腦乳 劑(蛋白酶K處理感染腦乳劑)為試樣的泳道。泳道4為以利用蛋白酶K進行了酶分解處 理的非感染腦乳劑(蛋白酶K處理非感染腦乳劑)為試樣的泳道。在泳道1和2中顯示，通過免疫印跡法檢測到了朊病毒蛋白質的條帶，在蛋白酶K 未處理的狀態(tài)下，無論是異常型朊病毒蛋白(泳道1)，還是正常型朊病毒蛋白(泳道2)，均 被檢測到。與此相對，在泳道3和4中，通過免疫印跡法僅在異常型朊病毒蛋白(泳道3) 中檢測到了條帶，在正常型朊病毒蛋白(泳道4)中沒有檢測到條帶，由此顯示，通過蛋白酶 K處理，能夠區(qū)分異常型朊病毒蛋白與正常型朊病毒蛋白，僅檢測異常型朊病毒蛋白。將以上所示的比較例2的結果(圖2)與實施例1和比較例1中得到的結果(圖 1)進行比較，獲得了以下見解。即，可知利用乳鐵蛋白固定化珠的異常型朊病毒蛋白與正常 型朊病毒蛋白的辨別，具有與使用蛋白酶K的現(xiàn)有方法相比更高的準確性和可靠性。產業(yè)上的可 利用性根據本發(fā)明，對于使用了來源于動物的原材料的飲食品和醫(yī)藥品，能夠比以往更簡便、迅速且以高靈敏度定量地 、以更低成本進行異常型朊病毒蛋白(感染性朊病毒蛋白) 所致的污染的檢查。另外，能夠比以往更簡便、迅速且以高靈敏度定量地、以更低成本進行 人和動物的朊病毒病的診斷。由此，能夠順應對人和動物的朊病毒病的感染防止和早期診 斷等社會要求。這樣，本發(fā)明具有產業(yè)上的可利用性。
權利要求
一種異常型朊病毒蛋白結合劑，其包含乳鐵蛋白。
2.根據權利要求1所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其中，乳鐵蛋白被固定在載體上。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的異常型朊病毒蛋白結合劑，其為異常型朊病毒 蛋白檢測劑。
4.一種異常型朊病毒蛋白的檢測方法，其包括如下工序使權利要求2所述的異常型朊病毒蛋白結合劑與試樣接觸的工序； 從與試樣接觸的該異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序； 檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白 的工序是通過免疫學檢測法檢測所分離的成分中所含的異常型朊病毒蛋白的工序。
6.一種異常型朊病毒蛋白的分離方法，其包括如下工序使權利要求2所述的異常型朊病毒蛋白結合劑與試樣接觸的工序； 從與試樣接觸的該異常型朊病毒蛋白結合劑分離所結合的成分的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠簡便、迅速且以高靈敏度定量地從正常型朊病毒蛋白中區(qū)分并檢測出異常型朊病毒蛋白而不需要利用蛋白酶K進行酶處理的方法；以及在該方法中使用的試劑。本發(fā)明提供一種包含乳鐵蛋白的異常型朊病毒蛋白結合劑；以及使用異常型朊病毒蛋白結合劑來檢測異常型朊病毒蛋白的方法。
文檔編號G01N33/53GK101868726SQ20088011662
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權日2007年11月20日
發(fā)明者久原徹哉, 巖丸祥史 申請人:森永乳業(yè)株式會社