專利名稱：鑒定綿羊朊病毒蛋白第171位基因型的方法以及實(shí)施所述方法的試劑盒的制作方法
鑒定綿羊朊病毒蛋白第171位基因型的方法以及實(shí)施所述方法的試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種鑒定或者分析綿羊朊病毒蛋白(PrP)第171位基因型的方 法，以及實(shí)施該方法的試劑盒。本發(fā)明還涉及一種容許根據(jù)對傳染性亞急性海綿樣腦病(TSSE)的抗性 對綿羊種群進(jìn)行篩選的方法。本發(fā)明還涉及一種容許根據(jù)對TSSE的敏感性對綿羊種群進(jìn)行篩選的方法?，F(xiàn)有技術(shù)瘙癢病是一種感染綿羊的疾病，在歐洲從兩個(gè)世紀(jì)前已經(jīng)為人所知。其 特殊的病征是動(dòng)物的社會(huì)行為障礙，具有獨(dú)處、進(jìn)食障礙和運(yùn)動(dòng)障礙的傾向， 諸如其身體后部的顫抖和僵硬的發(fā)生。其他病征通常包括瘙癢和掉毛。關(guān)于綿羊瘙癢病實(shí)驗(yàn)性傳染的工作于1938年開始在不列顛綿羊上進(jìn)行， 非常有助于顯示該疾病傳染中遺傳因素的參與。雖然還沒有像其他傳染性亞急性海綿樣腦病(TSSE)那樣明確確定參與 瘙癢病的介質(zhì)的確切性質(zhì)，但是根據(jù)廣泛的實(shí)驗(yàn)證據(jù)今天已經(jīng)能夠給出接近 全部的科學(xué)共識(shí)。導(dǎo)致這些疾病的傳染介質(zhì)似乎是宿主的一種蛋白質(zhì)，PrP (朊病毒蛋白)，其處于異常形式，部分抵抗蛋白水解消化，通常稱作PrPres， 即"朊病毒蛋白抗性，，。已經(jīng)證明與這些異常朊病毒蛋白有關(guān)的傳染性質(zhì)對 于已知的用于滅活"常規(guī)"致病微生物(細(xì)菌、病毒、酵母)的滅活方法具 有極端的抗性。綿羊PrP的基因位于染色體13，編碼256個(gè)氨基酸的多肽。很久前已經(jīng)知道綿羊中瘙癢病的自然發(fā)病與PrP基因的多態(tài)性有關(guān)，特 別是該蛋白質(zhì)密碼子136、 154和171的多態(tài)性。已經(jīng)記載了PrP的數(shù)種等位基因(或者同種異型)，主要的是等位基因 ARQ、 VRQ、 ARR、 AHQ和ARH。這些等位基因中兩個(gè)的組合可以產(chǎn)生很 多不同的基因型。根據(jù)不列顛國家瘙癢病計(jì)劃(British National Scrapie Plan,NSP),大部分綿羊種群在密碼子136、 154和171上攜帶下列15種基因型中的 一種-A136R,54R17/Ai36R'54Rl71 ，才示注為ARR/ARR-A136R'54R17/Ai36H1540i71，標(biāo)注為ARR/AHQ-A136R，54Rn1/A136R154H171,標(biāo)注為ARR/ARH-A136Ri54R17/A136R154Qm，標(biāo)注為ARR/ARQ-A136H154Q17l/A136Hi54Qi7i，標(biāo)注為AHQ/AHQ陽A136H54Q17i/A136R154Hi7i ，標(biāo)注為AHQ/ARH-A136H54Q17/A136R154Q171,標(biāo)注為AHQ/ARQ-A136R,54Hn|/A136Ri54Hi7i,標(biāo)注為ARH/ARH-A136R,54H17/A136R154Q171,標(biāo)注為ARH/ARQ54Q17/A136R154Q171 ，標(biāo)注為ARQ/ARQ54R171/V136R154Q171,標(biāo)注為ARR/VRQ-A136H54Q17i/V 136R154Q171 ，標(biāo)注為AHQ/VRQ54Hn/V n6R154Q'71 ，標(biāo)注為ARH/VRQ-A,函54Q17/V 136Rl54Ql71,標(biāo)注為ARQ/VRQ-V136R，54Q17i/V 136R154Qn1,標(biāo)注為VRQ/VRQ。更簡單的說，根據(jù)綿羊的基因型和它們對TSSE的抗性，綿羊可以被分為3組-抗性動(dòng)物，它們即使處于疾病高發(fā)的環(huán)境中，也不(或者只有極少) 被感染，或者在實(shí)驗(yàn)性感染下顯示非常高的抗性。這些是具有基因型 ARR/ARR的動(dòng)物。但是要注意，瘙癢病也感染ARR/ARR^基因型的不典型病 例的最新發(fā)現(xiàn)部分引起對與該基因型常規(guī)有關(guān)的近乎絕對的抗性的質(zhì)疑。-高敏感性動(dòng)物，它們顯示疾病的高發(fā)和短潛伏期。這些是具有基因型 VRQ/VRQ (視為最敏感的基因型)、ARQ/VRQ和ARQ/ARQ的動(dòng)物，和-顯示不同疾病發(fā)病率和長潛伏期的動(dòng)物。這些是具有其他基因型的動(dòng)物。長期以來，抗擊瘙癢病的計(jì)劃是基于完全宰殺所有受感染的畜群。但是， 已經(jīng)確定了，之后重新引入的那些動(dòng)物通常會(huì)被感染。這種情況可能和傳染 介質(zhì)在飼養(yǎng)動(dòng)物的環(huán)境中強(qiáng)的持久性以及其對去污染技術(shù)的抗性有關(guān)。在美 國，自1952年已經(jīng)進(jìn)行清除運(yùn)動(dòng)，從全局觀點(diǎn)看還沒有獲得成功。這方面看來只有冰島領(lǐng)導(dǎo)的政策產(chǎn)生好的結(jié)果。但這是一項(xiàng)代價(jià)高昂和強(qiáng)制性的政 策。它具體基于于將領(lǐng)土劃分為傳染區(qū)和健康區(qū)，全面宰殺受感染的畜群并 銷毀所有詞養(yǎng)裝置，清除飼養(yǎng)區(qū)周圍的土壤，且五年內(nèi)禁止在所述區(qū)域重新 引入動(dòng)物。顯然，用于再繁殖"凈化"區(qū)域的動(dòng)物來自未感染區(qū)域。攜帶八1361115411171等位基因的純合動(dòng)物的選擇，即使它不能認(rèn)為是在綿羊 畜群中根除傳染性海綿樣腦病(TSE)的絕對方案，但仍然是控制大部分包含 牛海綿樣腦病(BSE)介質(zhì)的TSE系繁殖的最合適策略，并具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。為了抗擊瘙癢病，例如英國、法國和荷蘭已經(jīng)開始實(shí)施富集具有抗性動(dòng) 物的綿羊種群的計(jì)劃。法國的計(jì)劃具體包括清除攜帶與最高敏感性有關(guān)的￥13611154(5171等位基 因的動(dòng)物。它在種群中的高頻率是疾病傳播的主要危險(xiǎn)因素。因此，攜帶該 等位基因的綿羊被認(rèn)為是"不允許的"動(dòng)物。因此，它不能被出售用于繁殖 目的。標(biāo)記"瘙癢病敏感性基因型"是由提升動(dòng)物品種聯(lián)盟(Union for promoting animal races) (Union Pour la Promotion des Races Animales- UPRA) 或者任何其他機(jī)構(gòu)頒發(fā)的證書上給出的。所述目標(biāo)需要鑒定綿羊的PrP基因型。為此目的已經(jīng)提出一些基于分子 生物學(xué)的方法?？梢砸檬褂肞CR的數(shù)種方法， 一種稱為焦磷酸測序 (pyros叫uencing)的方法和通過PCR對PrP基因進(jìn)行單擴(kuò)增后允許簡單比色測 定的方法。但是，所有這些涉及PCR擴(kuò)增的方法必需由專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并且成本 很高，這代表了其大范圍應(yīng)用的真正障礙。已經(jīng)清楚八136111541117,/八1361115411171基因型是希望選作用于繁殖的動(dòng)物的 基因型。它是15種已知基因型中唯一的在PrP第171位具有2個(gè)R氨基酸的基因型。 該基因型標(biāo)注為R/R。我們已經(jīng)明白應(yīng)該設(shè)法在繁殖動(dòng)物中避免V,36R,54Qn,A^6R^Qm基因型。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是解決以下新的技術(shù)問題，即提供鑒定綿羊朊病毒蛋白(PrP)第171位基因型的方法。本發(fā)明的目的還包括解決以下新的技術(shù)問題，即提供鑒定綿羊PrP第171 位基因型的試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是解決以下新的技術(shù)問題，即提供鑒定第171位 基因型的方法和/或針對此基因型的鑒定試劑盒，以允許綿羊育種人員篩選、 選擇或者鑒定抗性動(dòng)物或者^t感性動(dòng)物，特別是將抗性動(dòng)物從壽文感性動(dòng)物中 區(qū)別出來或者相反。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是在繁殖計(jì)劃下解決這些技術(shù)問題，以清除或者 至少減少綿羊中朊病毒的存在。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是解決該技術(shù)問題，以抗擊綿羊搔癢病。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是利用除PCR或者Western印跡類型以外的方法 解決這些技術(shù)問題，PCR或者Westem印跡類型方法是昂貴的且需要專業(yè)實(shí)驗(yàn) 室設(shè)備。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用快速檢測來解決這些技術(shù)問題，值得 注意的是所述快速檢測不需要除常規(guī)分析實(shí)驗(yàn)室所用以外的任何專業(yè)設(shè)備。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是以可再現(xiàn)、工業(yè)化、可靠、迅速的方式和最低 的成本解決這些技術(shù)問題。發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有可能通過利用特異性識(shí)別PrP某些等位基因形式的至少 一種抗體來鑒定位于綿羊PrP第171位的氨基酸。該方法可應(yīng)用于綿羊的生物學(xué)體液，諸如血漿、血液、血清、乳汁、唾 液和尿液。此外，該方法4艮容易實(shí)施，并且快捷且經(jīng)濟(jì)。為此目的，本發(fā)明提出一種鑒定或者分析綿羊PrP第171位基因型的方 法，包括以下步驟a) 用導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液處理包含PrP的待測綿羊生物學(xué)體液，b) 將變性、還原后的PrP固定在固相上，任選通過配體來進(jìn)行固定，c) 使變性、還原、固定后的PrP與至少一種檢測用抗體接觸，并d) 檢測所述至少一種檢測用抗體的可能存在，且其中所述配體和所述至少 一種^r測用抗體之一能與第171位具有特定等 《立基因形式的PrP凈爭異'l"生結(jié)合(run du ligand et du au moins un anticorps de detection se lie sp6cifiquement a la PrP ayant une forme all61ique particuli6re en position 171》優(yōu)選的是，所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含a) 至少一種變性劑，其選自 -表面活性劑，其選自 陰離子表面活性劑，諸如SDS (十二烷基硫酸鈉)、十二烷基肌氨酸 鈉(月桂酰肌氨酸)、膽酸鈉、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛石黃膽酸鈉、辛酸 鈉、1-癸烷磺酸鈉、月桂基石克酸鈉和月桂基^ii酸鋰； 兩性離子表面活性劑，諸如SB3-10(癸基-磺基甜萊堿)、SB3-12(十 二烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-14 (十四烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-16 (十六烷 基-磺基甜萊堿)、SB 3-18 (十八烷基-磺基甜萊堿)、CHAPS和CHAPSO和 脫氧CHAPS; 非離子表面活性劑，諸如Triton X畫IOO、 Triton X-114、 Tween 20、 Tween 80、 Brij 35 (聚氧乙烯23月桂基醚)、nonidet P-40、正-癸基-(3-D-吡 喃葡萄糖苷、正-十二烷基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正-辛烷基-P-D-吡喃葡萄糖 苷和正-辛烷基-a-D-吡喃葡萄糖苷； 它們的混合物，和/或-離液劑，及b) 至少一種還原劑。所述離液劑選自尿素、胍、鹽酸胍、疏氰酸胍和它們的混合物之一。更優(yōu)選的是，所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含離子表面活性劑的 混合物，特別是陰離子表面活性劑，更特別的是SDS和十二烷基肌氨酸鈉。更確切的說，所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含相對于由待處理的 樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液構(gòu)成的混合物總體積至少0.5 wt. %的 表面活性劑，特別是等于或者大于相對于混合物總體積的2 wt. %。優(yōu)選的是，至少一種還原劑選自DTT (二硫蘇糖醇)、TCEP (三(2-羧基乙基)膦)鹽酸鹽、DTE (二硫赤蘚糖醇)、p-巰基乙醇、2-巰基乙胺和 它們的混合物之一。在這種情況下，優(yōu)選的是，由待處理的樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液構(gòu)成的混合物中包含的還原劑濃度在2.5mM和100mM之間，特別是5mM 和50mM之間，更特別的是5mM和30mM之間。最優(yōu)選的是，所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含十二烷基肌氨酸 鈉、SDS和DTT的混合物。如果導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含離液劑，那么所述離液劑的濃度 優(yōu)選等于或者大于1M，更特別的是等于或者大于3M。如果所述離液劑是尿 素，那么濃度優(yōu)選是8M。在本發(fā)明鑒定綿羊PrP第171位基因型方法的第一個(gè)實(shí)施方案中，通過配 體固定變性和還原后的PrP，所述配體是一種能夠通過親和結(jié)合保留PrP的捕 捉用抗體，且所述檢測用抗體是一種能與第171位具有特定等位基因形式的 PrP特異性結(jié)合的抗體，該位置不同于所述捕捉用抗體所識(shí)別的表位位點(diǎn)。在本發(fā)明方法的第二個(gè)實(shí)施方案中，通過配體固定變性和還原后的PrP， 所述配體是能與第171位具有特定等位基因形式的PrP特異性結(jié)合的捕捉用 抗體，且所述檢測用抗體是一種能夠通過親和結(jié)合結(jié)合PrP的抗體，所述結(jié) 合發(fā)生在不同于所述捕捉用抗體識(shí)別位點(diǎn)的表位位點(diǎn)。在本發(fā)明方法的第三個(gè)實(shí)施方案中，通過選自下列分子的配體固定變性 和還原后的PrP:纖溶酶原、親合素、鏈霉親合素、單糖氨基聚糖、橙皮堿、 卟啉、鏈霉素和四環(huán)素，且所述檢測用抗體是一種能與第171位具有特定等 位基因形式的PrP特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明方法的第四個(gè)實(shí)施方案中，變性和還原后的PrP被直接固定在 固相上，且所述檢測用抗體是一種能與第171位具有特定等位基因形式的PrP 特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明方法的所有實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，所述固相選自微量滴定板、 珠子、管，其是由聚合物制成的，值得注意的是聚苯乙烯、聚乙烯或者膠乳。 優(yōu)選的是，所述固相是聚苯乙烯制成的微量滴定板。此外，在本發(fā)明方法的所有實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，所述生物學(xué)體液樣 品選自血液、血漿、血清和乳汁。在本發(fā)明方法的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉用抗體是一種能結(jié)合PrP 的抗體，與所述檢測用抗體和PrP之間的結(jié)合沒有任何竟?fàn)帲?企測用抗 體對第171位的等位基因形式是特異性的。具體而言，此抗體可以選自抗體SAF-15、 SAF畫31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF畫34、 SAF畫35、 SAF國37、 3B5、 SAF畫84、 SHA隱31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8。作為捕捉用抗體，優(yōu)選靶向Prp八(肽)重復(fù)區(qū)域的抗體，即SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF-37和3B5。在這種情況下，所述檢測用抗體優(yōu)選選自經(jīng)過標(biāo)記的2A11抗體、經(jīng)過標(biāo) 記的11C6抗體、經(jīng)過標(biāo)記的BAR226抗體和經(jīng)過標(biāo)記的抗體12F10。但是，優(yōu)選的是，在本發(fā)明方法的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉用抗體 是SAF-34抗體或者3B5抗體，且所述^r測用抗體是經(jīng)過標(biāo)記的2All抗體。有利的是，在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述配體是選自2AU、 11C6、 BAR-226和12F10的捕捉用抗體。有利的是，所述檢測用抗體選自SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34 、 SAF-35 、 SAF-37 、 3B5 、 SAF-84 、 SHA-31 、 BAR-222 、 BAR-224、 BAR-233和8G8。優(yōu)選的是，在本發(fā)明方法的第二個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉用抗體選自 抗體2A11、 12F10、 BAR226和11C6，且所述4全測用抗體選自經(jīng)過標(biāo)記的抗 體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32 、 SAF-33 、 SAF-34 、 SAF-35 、 SAF-37 、 3B5、 BAR-224、 SHA-31和8G8。本發(fā)明還提供一種根據(jù)對傳染性亞急性海綿樣腦病的抗性對綿羊種群 進(jìn)行篩選的方法，其特征在于它包括先前所述方法的實(shí)施方案。本發(fā)明還提供一種根據(jù)對傳染性亞急性海綿樣腦病的敏感性對綿羊種 群進(jìn)行篩選的方法，其特征在于它包括先前所述方法的實(shí)施方案。這特別允許育種人員分出敏感性動(dòng)物或者只保留抗性動(dòng)物。這些篩選法 尤其可以在繁殖計(jì)劃下使用。有利的是，所述篩選方法包括一個(gè)將待分析樣品中測得的信號(hào)與抗性和 /或敏感性樣品進(jìn)行比較的步驟。本發(fā)明還提供一種鑒定綿羊PrP第171位基因型的試劑盒，包括-固定有至少一種捕捉用抗體的固相，所述捕捉用抗體特別是選自抗 體SAF畫15、 SAF-31 、 SAF-32 、 SAF-33 、 SAF-34 、 SAF-35 、 SAF-37 、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8;-導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種檢測用抗體，特別是選自經(jīng)過標(biāo)記的抗體12F10、 BAR226、11C6和2A11,更特別的是經(jīng)過標(biāo)記的2A11。本發(fā)明還提供一種用于鑒定綿羊PrP第171位基因型的試劑盒，其特征在 于它包括-固定有至少一種捕捉用抗體的固相，所述捕捉用抗體特別是選自抗 體12F10、 BAR226、 11C6和2A11,-導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種^r測用抗體，特別是選自經(jīng)過標(biāo)記的抗體SAF-15、 SAF曙31、 SAF畫32、 SAF-33 、 SAF-34、 SAF-35、 SAF-37、 3B5、 SAF曙84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8。附圖簡述在閱讀下面的說明性描述并參考附圖后，將更好的理解本發(fā)明，本發(fā)明 的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更清楚-

圖1顯示以ARR/ARR綿羊(即在PrP第171位具有R/R^基因型)、或者 ARR/VRQ綿羊(即在PrP第171位具有R/Q基因型)、或者VRQ/VRQ綿羊(即 在PrP第171位具有Q/Q基因型)的血漿獲得的相對于基因型Q/Q標(biāo)準(zhǔn)化的相 對吸光度。這些ELISA夾心格式的測試是按實(shí)施例1所述對血漿進(jìn)行變性和 還原后進(jìn)行的。所有夾心法涉及SAF-34抗體(抗八(肽)重復(fù))，其無差別 的識(shí)別第171位的所有同種異型。視情況而定，SAF-34抗體被用作捕捉用抗 體"^-34)，或者被用作檢測用抗體(SAF-34-AChE,用棵露的(gymnote) 乙酰膽堿酯酶標(biāo)記的SAF-34 )。-圖2顯示以PrP第171位具有氨基酸R/R、或者R/H、或者R/Q、或者H/Q、 或者Q/Q的綿羊的血漿獲得的光密度(OD)分布。這些測試是利用SAF-34抗體-圖3顯示以第171位具有氨基酸Q/Q、或者氨基酸R/Q、或者氨基酸R/R 的綿羊的血漿獲得的光密度(OD)分布。這些測試是利用SAF-34作為捕捉用抗 體和AChE標(biāo)記的2Al l抗體作為檢測用抗體進(jìn)行的。-圖4顯示在變性溶液的組成中還原劑(是二硫蘇糖醇)存在或者缺失 以及變性劑(即尿素)缺失的影響。這些測試是利用生物素標(biāo)記的2A11抗體 作為檢測用抗體和SAF-34作為捕捉用抗體進(jìn)行的。-圖5顯示以PrP第171位具有氨基酸R/R、或者R/H、或者R7Q、或者H/Q、或者H/H、或者Q/Q的綿羊的血清獲得的光密度(OD)分布。這些測試是利用 抗體3B5作為捕捉用抗體、生物素標(biāo)記的2A11作為檢測用抗體以及20 mM的 DTT濃度進(jìn)行的。-圖6顯示變性溶液中DTT濃度對血漿樣品的影響。這些測試是利用 3B5作為捕捉用抗體和生物素標(biāo)記的2A11作為檢測用抗體進(jìn)行的。-圖7顯示變性溶液中DTT濃度對血清樣品的影響。這些測試是利用抗-圖8顯示以取自綿羊的不同血清樣品獲得的光密度分布，證明對應(yīng)于 PrP的不同基因型。這些測試是利用抗體3B5作為捕捉用抗體和生物素標(biāo)記的 2 A11作為檢測用抗體進(jìn)行的。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是一種用于鑒定綿羊PrP第171位基因型的方法，其中用導(dǎo) 致變性且具有還原性的溶液處理包含PrP的待測綿羊生物學(xué)體液，固定變性 和還原后的PrP,使變性和還原后的PrP與至少一種如下抗體接觸，所述抗體 能與第171位具有特定等位基因形式的綿羊PrP特異性結(jié)合，并檢測PrP抗體 的可能存在。在本發(fā)明范圍內(nèi)，"生物學(xué)體液，，可以具體是血液、血漿、血清、尿液、 腦脊液、唾液、乳汁等等。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該生物學(xué)體液選自血液、血清、血漿和乳汁。 該生物學(xué)體液包含PrP。術(shù)語"抗體"是指包含或者由至少 一種抗原結(jié)合位點(diǎn)組成的任何完整抗 體或者抗體的功能性片段，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)使所述抗體能與抗原性化合 物的至少 一 種抗原決定簇結(jié)合。所提及的抗體片段的實(shí)例可以包括片段 Fab、 Fab'、 F(ab')2和scFv鏈(單鏈可變片段)、dsFv鏈(雙鏈可變片段)、 等等。這些功能性片段具體可以通過遺傳工程獲得?？梢栽诒景l(fā)明中使用的單克隆抗體或者單特異性多克隆血清的制備屬 于常規(guī)技術(shù)，下文將詳細(xì)描述。術(shù)語"特異性的"，當(dāng)涉及抗體對綿羊PrP第171位特定等位基因形式的特 異性識(shí)別或者特異性結(jié)合的時(shí)候，表示與其他可能的等位基因形式相比，該 抗體優(yōu)選的與特定等位基因形式相互作用，使之有可能區(qū)分和辯別可能的等位基因形式。大于l()SL.mol"的結(jié)合常數(shù)是優(yōu)選的。本發(fā)明使用的抗體是特異性針對朊病毒蛋白的抗體，因此它們優(yōu)選的是 單克隆抗體或者單特異性多克隆抗體，即它們不識(shí)別其他蛋白質(zhì)?？梢园凑誎6hler和Milstein (1975)記載的淋巴細(xì)胞融合和雜交瘤培養(yǎng)的 常規(guī)方法來獲得單克隆抗體。其他制備單克隆抗體的方法也是已知的 (Harlow等人，1988)?？梢酝ㄟ^免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、甚至人、 等等)并利用產(chǎn)生雜交瘤的淋巴細(xì)胞融合技術(shù)來制備單克隆抗體(K6hler和 Milstein， 1975)。存在這種常用方法的替代技術(shù)。例如有可能通過表達(dá)從雜交瘤克隆的核 酸來制備單克隆抗體。還有可能利用"噬菌體展示"技術(shù)來制備抗體，即添 加抗體cDNA至載體，所述載體通常是絲狀噬菌體(例如用于大腸桿菌的 fUSE5) (Scott等人，1990)。后者構(gòu)成庫，在它們的表面具有scFv片段。Marks 等人(1991)記載了這些抗體庫的構(gòu)建方案。遵循常用的操作方式，可以從針對肽類型的抗原免疫的動(dòng)物的血清獲取 多克隆抗體。通常有可能利用例如多肽作為免疫原，特別是重組多肽或者寡肽。遵循 常規(guī)方案，兔子用lmg肽免疫原的等同物免疫，遵循Benoit等人(1982)記載 的規(guī)程進(jìn)行。4周間隔后，動(dòng)物接受注射200pg抗原的處理，10到14天后取血。 第三次注射后，對抗血清與碘放射性標(biāo)記的肽抗原結(jié)合的能力進(jìn)行評價(jià)，利 用氯胺-T法進(jìn)行。然后在羧曱基纖維素(CMC)柱上通過離子交換層析進(jìn)行純 化。然后將通過洗脫收集的抗體分子利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法調(diào)節(jié)到 所需濃度，例如利用DEAE Sephadex來獲得IgG級分。為了提高多克隆血清的特異性，利用用于免疫并固定在固相上的滴度肽 (titer peptide),抗體可以通過免疫親和(或者免疫吸附)層析進(jìn)行純化。使 抗血清與所述固定在固相上的肽接觸足夠時(shí)間以引起肽與抗體分子發(fā)生免 疫反應(yīng)而形成固相免疫學(xué)復(fù)合物。作為與PrP第171位的特定等位基因形式特異性結(jié)合的合適抗體，可以提 到抗體2A11、 11C6、 BAR226、 12F10、 V5和V61。但是，作為與第171位具有特定形式的PrP特異性結(jié)合的抗體，優(yōu)選抗體 2A11、抗體11C6、抗體BAR226或者抗體12F10。更特別的優(yōu)選抗體2A11 。該抗體是遵循J. Bru等人；NeuroscienceResearch 48, 2004, 75-83記載的方案制備的，即用重組牛Prp免疫PrP^小鼠。 該抗體與牛PrP的171-179序列(QVYYRPVDQ)結(jié)合，與具有相同表位的大多 數(shù)哺乳動(dòng)物物種(綿羊、山羊、貓、兔、小鼠、豬和倉鼠)的PrP顯示強(qiáng)交 叉反應(yīng)，但與具有序列(QVYYRPMDE)的人PrP未顯示強(qiáng)交叉反應(yīng)。還顯示 當(dāng)PrP被還原和變性后，其親和力強(qiáng)烈升高，最大可能是由于表位與參與PrP 二硫橋的第一個(gè)絲氨酸殘基的接近。此外，免疫組化分析顯示在用蛋白酶K 處理后免疫反應(yīng)性大大升高。此外，已經(jīng)證明2A11抗體與第171位攜帶谷氨酰胺(Q)或者組氨酸(H)殘 基的綿羊PrP的等位基因形式特異性結(jié)合，而ARR等位基因未觀察到免疫反 應(yīng)性。換言之，2A11抗體不結(jié)合R殘基。因此，2All抗體與PrP蛋白之間的不 結(jié)合(所述2A11抗體既用作檢測用抗體又用作捕捉用抗體，不結(jié)合轉(zhuǎn)化為本 發(fā)明筌定法中的光密度等于零或者接近于零)，證明所測生物學(xué)體液中包含 的PrP第171位的基因型是R/R&因型，即基因型八1361115411171/八136^5411171。此外，因?yàn)榕cH殘基相比，2All抗體與PrP第171位Q殘基以定量上不同 的和優(yōu)選的方式結(jié)合，如果檢測到2All抗體與PrP之間的任何結(jié)合，那么有 可能根據(jù)獲得的信號(hào)強(qiáng)度(轉(zhuǎn)化為OD )來區(qū)別衍生自Q/Q純合綿羊的生物學(xué) 體液和衍生自Q/H雜合綿羊或者H/H純合綿羊的生物學(xué)體液。類似地，第171位攜帶單個(gè)R等位基因的雜合動(dòng)物(R/Q或R/H)將產(chǎn)生 甚至更弱的信號(hào)，因?yàn)闃悠分兴腜rP的一半不被2All抗體所識(shí)別。因此，本發(fā)明的鑒定方法中檢測到的實(shí)際上是樣品中的PrP與特異性抗 體之間可能結(jié)合的存在。因此，有可能設(shè)計(jì)一個(gè)簡單的免疫學(xué)分型測試，根據(jù)所表達(dá)的基因型來 顯示動(dòng)物之間的不同差異。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，該測試可用于鑒定 ARR/ARR動(dòng)物。根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，該測試可用于與其他基因型(Q/Q、 Q/H、 H/H)相比，鑒定雜合動(dòng)物(R/(Q,H))。本發(fā)明的方法包括將生物學(xué)體液樣品與合適數(shù)量的導(dǎo)致變性且具有還 原性的;容液4妄觸。有利的是，所述溶液包含a)至少一種變性劑，其選自-表面活性劑，其選自 陰離子表面活性劑，諸如SDS (十二烷基硫酸鈉)、十二烷基肌氨酸鈉(月桂酰肌氨酸)、膽酸鈉、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、辛酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、月桂基硫酸鈉和月桂基硫酸鋰； 兩性離子表面活性劑，諸如SB3-10(癸基-磺基甜萊堿)、SB3-12(十二烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-14 (十四烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-16 (十六烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-18 (十八烷基-磺基甜萊堿)、CHAPS和CHAPSO和脫氧CHAPS; 非離子表面活性劑，諸如TritonX-lOO、 TritonX-l 14、 Tween20、Tween80、 Brij 35(聚氧乙烯23月桂基醚)、nonidetP-40、正-癸基-卩-D-吡喃葡萄糖苷、正-十二烷基-卩-D-吡喃葡萄糖苷、正-辛烷基-卩-D-p比喃葡萄糖苷和正-辛烷基-a-D-。比喃葡萄糖苷； 這些表面活性劑的混合物，和/或-離液劑，及b)至少一種還原劑。還原劑是指能夠切割PrP蛋白二硫橋的試劑。在可用于本發(fā)明的還原劑中，可以特別提及DTT ( 二硫蘇糖醇)、TCEP (三(2-羧基乙基)膦)鹽酸鹽、DTE (二硫赤蘚糖醇)、(3-巰基乙醇、2-巰基 乙胺或者它們的混合物。由待處理的樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液構(gòu)成的混合物中存在 的還原劑的含量通常在2.5mM和100mM之間，特別是5mM和50mM之間，更 特別的是5mM和30mM之間。所述離液劑選自尿素、胍、鹽酸胍、硫氰酸胍和它們的混合物之一。如果存在離液劑，那么它們的濃度通常等于或者大于1M,優(yōu)選大于3M。優(yōu)選的離液劑是尿素，優(yōu)選的濃度是8M。由待處理的樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液構(gòu)成的混合物通常被 加熱到37。C和100。C之間的溫度，特別是50。C到70。C，更特別的是大約60。C， 達(dá)5分鐘到1小時(shí)，特別是7到20分鐘，更特別的是大約10分鐘。選擇這些條件以滿足如下矛盾的要求， 一方面PrP足夠變性以便第171位 氨基酸形成的表位未被遮擋，另 一 方面PrP不能過分變性以便表位仍能被抗 體識(shí)別。此外，這些處理決不能影響后續(xù)的抗體固定。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，所述溶液包含表面活性劑的混合物，值得注意的是離子表面活性劑的混合物，特別是陰離子表面活性劑，更特別的是 SDS和十二烷基肌氨酸鈉的混合物。由待處理的樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液構(gòu)成的混合物中表面活性劑的濃度通常等于或者大于相對于混合物總體積的0.5 wt. %,特別是等 于或者大于相對于混合物總體積的2 wt. %。因此，所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液包含至少一種變性劑和至少一 種還原劑，所述變性劑可以是表面活性劑和/或離液劑。如下文實(shí)施例4中所示，利用這種既是變性又是還原性的溶液對PrP的處 理是本發(fā)明方法的實(shí)施方案所不可缺少的。通常，讓包含對第171位氨基酸特異性的抗體的溶液與固定有PrP的固相 接觸至少10分鐘，特別是大約l小時(shí)，溫度范圍可以是4到50。C,特別是37。C。顯然，檢測固相上標(biāo)記的方法取決于所使用的標(biāo)記物。這些是本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的方法。例如可以提及生物素標(biāo)記。例如，在這種情況中，支持 物上固定的生物素的可能存在可以如下顯現(xiàn)，即添加鏈霉親合素-過氧化物 酶偶聯(lián)物的溶液，讓所述溶液在大約37。C的溫度反應(yīng)大約10到30分鐘。最后， 結(jié)合至支持物的過氧化物酶活性的存在可以如下顯現(xiàn)，即添加生色底物例如 四甲基聯(lián)苯胺，讓所述生色底物在20。C反應(yīng)大約30分鐘。最后，在450和620 nm測量吸光度?？紤]到變性、還原后的朊病毒蛋白的固定，這可能需要在固相上的直接 固定或者間接固定。所述固相可以是聚合物，特別是聚苯乙烯、聚乙烯或者膠乳制成的微量 滴定板、珠子、管。優(yōu)選的固相是聚苯乙烯制成的微量滴定板。對于PrP直接在固相上的固定，固定到板上的朊病毒蛋白，在固定PrP蛋 白自身之前，像所有蛋白質(zhì)一樣，必須進(jìn)行純化(變性)以從樣品中去除盡 可能多的不需要的蛋白質(zhì)。此外，朊病毒蛋白必須進(jìn)行還原。其次，使直接或者間接標(biāo)記的4企測用抗體發(fā)生反應(yīng)。對于PrP在固相上的間接固定，可以利用抗體或者另 一種不是抗體的特 異性配體進(jìn)行固定。如此，可以通過稱為捕捉用抗體的抗體(其能夠通過親 和結(jié)合來保留PrP),或者通過與第171位等位基因的特定形式特異性結(jié)合的抗體，或者通過不是抗體的配體進(jìn)行間接固定，所述捕捉用抗體能夠通過親和結(jié)合保留PrP。該配體可以是諸如纖溶酶原、親合素、鏈霉親合素、單糖 氨基聚糖、橙皮堿、紫菜堿、鏈霉素或者四環(huán)素的分子。如果PrP借助于能夠通過親和結(jié)合保留PrP的配體或者抗體進(jìn)行固定，那 么使固定后的PrP蛋白與能特異性結(jié)合第171位等位基因特定形式的抗體發(fā) 生反應(yīng)，所述抗體被直接或者間接標(biāo)記。另一方面，如果PrP通過能特異性結(jié)合第171位等位基因的特定形式的抗 體進(jìn)行固定，那么使固定后的PrP蛋白與能夠通過親和結(jié)合保留它的抗體發(fā) 生反應(yīng)。在這種情況中，是該抗體被直接或者間接標(biāo)記。然后，在所有情況中，檢測由經(jīng)過標(biāo)記的抗體進(jìn)行。有利的是，本發(fā)明的方法利用夾心式免疫測定法的形式實(shí)施，特別是 ELISA類型。在所述情況中，合適的是，使用能夠同時(shí)與純化、還原后的PrP 蛋白結(jié)合的所謂捕捉用抗體和所謂4全測用抗體。捕捉用抗體是指如下抗體或者抗體的一部分，其優(yōu)選通過簡單的親和結(jié) 合或者借助于通過特定表位位點(diǎn)識(shí)別的親和結(jié)合，被固定到固相上，所述固 相從而能夠保留生物學(xué)樣品中存在的抗原。當(dāng)抗原被捕捉用抗體固定時(shí)，檢測用抗體必須能夠使自身與仍然可接近 的并且不同于捕捉用抗體識(shí)別位點(diǎn)的表位位點(diǎn)結(jié)合。術(shù)語"(經(jīng)過)標(biāo)記的"是指直接標(biāo)記(通過酶、放射性同位素、熒光 染料、發(fā)光化合物、等等)和間接標(biāo)記(例如通過自身直接標(biāo)記的抗體或者 利用經(jīng)過標(biāo)記的"親和對"的試劑，諸如但不限于生物素-經(jīng)過標(biāo)記的親合 素對，等等)。因此，本發(fā)明的一個(gè)具體主題是用于鑒定PrP第171位基因型的方法，包 括以下步驟-處理待測生物學(xué)體液樣品，使得所述樣品中包含的PrP變性并且還原， -使所述處理后的樣品與固定有所謂捕捉用抗體的固相接觸， -清洗前述步驟中獲得的固相，-使所述清洗后的固相與稱為^r測用抗體的經(jīng)過標(biāo)記的抗體的溶液接觸，-清洗前述步驟中獲得的固相，然后-檢測固相上標(biāo)記的可能存在，一種抗體特異性識(shí)別PrP，不管PrP第171位的等位基因變體，另一種抗 體特異性結(jié)合第171位具有特定等位基因變體的綿羊PrP。作為不管PrP第171位等位基因變體而特異性識(shí)別PrP的抗體，可以特別 提及能夠特異性識(shí)別八肽重復(fù)結(jié)構(gòu)的抗體，諸如專利申請WO 01/35104中記 栽的那些。在這些抗體中，可以特別提及選自下組的抗體申請W001/35104 中記載的SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35和SAF-37。還可以提及Krasemann等人Krasemann， S., Groschup， M.H., Harmeyer， S" Hunsmann， G.和Bodemer, W. (1996a) Generation of monoclonal antibodies against human prion proteins in PrP0/Q mice. Mo/ecw/ar Medec/"e， 2, 725-734記 載的抗體3B5。jt匕夕卜，可以引用F6raudet等人的論文(Screening of 145 Anti-PrP Monoclonal Antibodies for Their Capacity to Inhibit PrPSc Replication in Infected Cells, the Journal of Biological Chemistry, Vol. 280, No. 12, Issue of March25，pp. 11247-11258,2005)。特別優(yōu)選抗體SAF-34或者抗體3B5。作為特異性識(shí)別PrP第171位特定等位基因變體的抗體，引用抗體2A11。 還引用Krasemann， S., Jurgens T.和Bodemer, W, (1999) Generation of monoclonal antibodies against prion proteins, an unconventional nucleic acid based immunization strategy, o/owma/ o/_6/c^c/z"o/ogy， 73， 119-129i己載的4元體 12F10,和Krasemann， S., Groschup, M.H., Hunsmann, G.和Bodemer, W. (1996b) Induction of antibodies against human prion proteins (PrP) by DNA-mediated immunization of PrP0/() mice. /■ 7mmw"o/. ^M^/zoiis, 199, 109-118"i己載的^元體 11C6。還提及Moudjou等人，Journal of Virology, Sept. 2004, 9270-9276記載的V5 和V61抗體。制備或者獲得與上述抗體具有相似或者相同表位特異性的單克隆抗體 顯然在本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的范圍內(nèi)，并且所述單克隆抗體適合于本發(fā) 明的實(shí)施方案。下列附圖和實(shí)施例是為了說明本發(fā)明而不是限制其范圍。實(shí)施例材料和方法獲取和表征對八肽重復(fù)結(jié)構(gòu)(SAF)特異性的單克隆抗體按專利申請WO 01/35104所述制備對八肽重復(fù)結(jié)構(gòu)特異性的抗體SAF-15、 31、 32、 33、 34、 35和37。人PrP 79-92肽的合成和標(biāo)記利用自動(dòng)合成儀(Milligen 9050， Waters, Milford, MI)合成代表PrP八肽重 復(fù)結(jié)構(gòu)的肽，例如結(jié)構(gòu)G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-(NH2)，對應(yīng)于人 PrP的序列79-92 。如同先前描述的用于其他肽或者蛋白質(zhì)的一樣 (McLaughlin等人，1987， Grassi等人，1989),通過異雙功能試劑琥珀酰亞胺基 4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC, Calbiochem, France),使肽 與gymnote乙酰膽堿酯酶(AChE)共價(jià)偶聯(lián)。該方法涉及被添加到肽的硫醇基 與通過與SMCC的反應(yīng)被固定到AChE的馬來酰亞胺功能團(tuán)的反應(yīng)。按照先前 的描述(McLaughlin等人，1987),通過與N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯 (SATA)的反應(yīng)，使硫醇基被添加到肽。通過使AChE-SMCC與過量的硫醇化 肽反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。-免疫和單克隆抗體的制備按照先前的描述(Lasmezas等人，1997)，從感染的倉鼠大腦(瘙癢病系263 K)獲得"瘙癢病相關(guān)原纖維"(SAF, PrPre制品)的制品。在免疫小鼠前通 過用曱酸處理來滅活該制品。用這些SAF制品免疫PrP基因敲除小鼠(PrP^小 鼠)，并按照先前的描述(Grassi等人，1988, 1989)制備雜交瘤細(xì)胞。按照下文 所述進(jìn)行培養(yǎng)物上清液的篩選。57個(gè)雜交瘤能被鑒定和穩(wěn)定它們被稱作 SAF-l到SAF-90。所有這些抗體均證明識(shí)別固定在孩i量滴定板上的SAF,而 其中少數(shù)顯示識(shí)別肽-AChE偶聯(lián)物的能力。在后者中，7個(gè)明顯識(shí)別八肽重 復(fù)結(jié)構(gòu)(與偶聯(lián)至AChE的79-92肽起反應(yīng))；它們是抗體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35和SAF-37。以腹水液態(tài)形式克隆和擴(kuò)增 后，在蛋白A Sepharose柱上通過親和層析純化單克隆抗體，在-20。C保存直 到使用。通過徑向免疫擴(kuò)散接著Ouchterlony氏技術(shù)確定抗體的同種型。-篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液以兩種方式證明雜交瘤培養(yǎng)物上清液中PrP特異性抗體的存在，測試它 們與肽-AChE偶聯(lián)物(特別是肽79-92-AChE)或者倉鼠SAF結(jié)合的能力。在 第一種情況中，在包含如先前描述固定的山羊抗小鼠IgG抗體的板上進(jìn)行篩選(Cr6minont等人，1993, Frobert等人，1991)。簡單的說，讓100pl培養(yǎng)物上清 液和100^1肽-AChE偶聯(lián)物在包含固定化山羊抗小鼠IgG抗體的板中在4。C反 應(yīng)過夜。在洗板后，向孔中添加200nl Ellman試劑(Ellman等人，1961)以檢測 被固定到固相上的AChE的存在。在第二種情況中，通過在0.05M磷酸鹽緩沖 液，pH 7.4中讓50pl 2pg/ml溶液在環(huán)境溫度反應(yīng)過夜，來制備包含固定化SAF 制品的板。清洗后，板用EIA緩沖液(lOOmM磷酸鹽緩沖液,ph7.4,包含150mM NaCl， 0.1。/。牛血清清蛋白(BSA)和0.01。/。疊氮化鈉)在4。C飽和過夜，并保持 這個(gè)溫度直到使用。按照先前的描述(Negroni等人，1998)，利用AChE標(biāo)記的 山羊抗小鼠IgG抗體來證明單克隆抗體與固定化SAF的結(jié)合。用AChE標(biāo)記單克隆抗體按照先前的描述(Grassi等人，1989)，利用異雙功能試劑即琥珀酰亞胺基 4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC, Calbiochem, France),通過將 還原的Fab'片段與酶的四聚體形式偶聯(lián)來制備用AChE標(biāo)記的單克隆抗體。該 方法需要還原的Fab'片段所攜帶的硫醇基與通過與SMCC的反應(yīng)被固定至 AChE的馬來酰亞胺功能團(tuán)的反應(yīng)。獲取單克隆抗體3B5、 11C6和12F10在用重組人PrP免疫PrP敲除小鼠并遵循Krasemann等人描述的不同技術(shù) 篩選后，獲得單克隆抗體3B5、 UC6和12F10。3B5是一種針對重組人PrP的抗體并識(shí)別肽79-92。11 C6是一種識(shí)別未鑒定構(gòu)象表位的抗體。12F1 O是一種針對重組人PrP的抗體并識(shí)別肽142-160。獲取單克隆抗體Bar226如C. Feraudet, N. Morel, S. Simon, H. Volland, Y. Frobert， C. Creminon， D. Vilette， S. Lehmann, J. Grassi (2005) Screening of 145 anti PrP Monoclonal antibodies for their capacity to inhibit PrPSc Replication in Infected Cells / 5Zo/. C77em.,2S0， "^7-7/Z5S所述，通過用重組PrP ( ARQ同種異型)免疫PrP基因 敲除小鼠，獲得了抗體Bar-226。獲取單克隆抗體2A11遵循Brun等人；J. Neuroscience Research 48， 2004， 75-83描述的方案，制 備單克隆抗體2A11。偶聯(lián)物單克隆抗體2All-生物素遵循Greg T. Hermanson， 1996描述的方案，制備用生物素標(biāo)記的單克隆 抗體2A11的偶聯(lián)物。條物用錄條酶梳的鏈霉親合素遵循GregT.Hermanson， 1996^苗述的方案，制備用it!Ut4勿酶標(biāo)記的鏈霉親合素 的微物。生物學(xué)體液所使用的生物學(xué)體液是來自Cheviot、 Romanov、 Casserarde和Manech品 種的綿羊的血清或者血漿。環(huán)境溫度環(huán)境溫度定義為18。C和30。C之間的溫度，包括8。C和30。C。實(shí)施例l:用不同的抗體對進(jìn)行測試血漿樣品取自PrP第171位具有基因型R/R或者R/Q或者Q/Q的綿羊。將65pl各綿羊血漿樣品與65pl包含8M尿素和10mM DTT的導(dǎo)致變性且 具有還原性的溶液混合。然后將混合物在50。C加熱30分鐘。在包含捕捉用抗體的微量滴定板的孔中添加10C^1所獲混合物，所述捕 捉用抗體是抗體12F10、或者抗體BAR233、或者抗體BAR226、或者抗體 SAF-34、或者抗體11C6。然后用包含10々M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4和0.05% Tween 20的清洗液將孔 清洗3次。清洗后，每孔添力口100nl檢測用抗體，所述檢測用抗體是AChE標(biāo)記的抗 體SAF-34 (如果捕捉用抗體是抗體12F10或者BAR233或者BAR226或者 11C6)，或者用AChE標(biāo)記的抗體BAR224,或者用生物素標(biāo)記的抗體2A11 ，或者用生物素標(biāo)記的抗體BAR208，相對于如此所獲最終混合物為每升3pg 抗體。將孔在37。C溫育1小時(shí)。然后，用清洗液進(jìn)行5次清洗，所述清洗液包含10^M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4和相對于清洗液總重0.05 wt 。/。的Tween 20。若經(jīng)過標(biāo)記的抗體是生物素標(biāo)記的抗體2A11和Bar208 ，則通過添加鏈霉 親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物對固相上標(biāo)記抗體的存在進(jìn)行顯色，所述偶聯(lián)物 為0.2ng/ml最終混合物。在這種情況中，將它們在37。C溫育30分鐘。然后， 用清洗液進(jìn)行5次清洗，所述清洗液包含10々M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4和相對于 清洗液總重0.05 wt 。/。的Tween 20。在各孔中添加100iul過氧化物酶底物和作 為色原體的2ml四曱基聯(lián)苯胺溶液(TMB)。將它們在黑暗中在環(huán)境溫度溫育 30分鐘。在各孔中添加10(^1 1N碌b酸溶液作為終止液。在450和620 nm測量 吸光度。對于AChE標(biāo)記的抗體，在孔中添力口200plEllman試劑(Ellman等人，1961) 后，通過測量414nm的吸光度來檢測固定到固相上的AChE的存在。 圖l顯示所得結(jié)果。從圖l可以清楚看出，捕捉用抗體/檢測用抗體對12F10/SAF-34-AChE、 BAR226/SAF-34-AChE、 11C6/SAF-34-AChE、 SAF-34/2A11-生物素能夠?qū)⒌?171位具有基因型R/R的動(dòng)物與該位置具有基因型R/Q的動(dòng)物和具有基因型 Q/Q的動(dòng)物明顯區(qū)分開來。還確定其余捕捉用抗體/檢測用抗體對不能在朊病毒蛋白PrP第171位的 不同基因型之間做出鑒別。從圖l還可以清楚看出，作為一種不結(jié)合第171位特定等位基因形式的抗 體，SAF-34抗體既可以用作捕捉用抗體也可以用作檢測用抗體。在用作檢測 用抗體時(shí)，它用AChE標(biāo)記。從圖l還可以清楚看出，能夠?qū)⒌?71位具有基因型R/R的動(dòng)物與具有基 因型R/Q的動(dòng)物和具有基因型Q/Q的動(dòng)物最佳區(qū)別鑒定的對是生物素標(biāo)記的 SAF-34/2All對。實(shí)際上，抗體2All根本不結(jié)合PrP第171位的R等位基因形式。實(shí)施例2:對血漿樣品進(jìn)行測試血漿樣品取自PrP第171位具有基因型R/R或者R/H或者R/Q或者H/Q或者 Q/Q的綿羊。將75nl各綿羊血漿樣品與75jal導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液混合，所述體積2 wt. 。/。的十二烷基肌氨酸鈉，相對于導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液總體 積2 wt. %的十二烷基硫酸鹽，和10mM的二硫蘇糖醇。 然后將混合物在60。C加熱IO分鐘。在包含捕捉用抗體的微量滴定板的孔中添加100pl所獲混合物，所述捕 捉用抗體是SAF-34抗體。然后，用清洗液對孔進(jìn)行3次清洗，所述清洗液包含0.01M Tris, 0.3M NaCl, pH 7.4和相對于洗滌液總重0.1 wt. 。/。的Tween 20。清洗液被緩沖到中性pH或者弱堿性，并包含低濃度的中性/非離子型去 污劑(0.01%Tween20)。清洗后，每孔添加100pl檢測用抗體，所述抗體是生物素偶聯(lián)的2A11抗 體，以相對于所獲最終混合物總重為每升3ng抗體的濃度存在。將孔在37。C溫育1小時(shí)。然后用先前描述的清洗液進(jìn)行3次清洗。通過添加"材料，，章節(jié)所述的鏈霉親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物對固相上標(biāo) 記抗體的存在進(jìn)行顯色，所述偶聯(lián)物為0.2pg/ml最終混合物。 將孔在37。C溫育30分鐘。 然后用先前描述的清洗液進(jìn)行5次清洗。在各孔中添加10(V1過氧化物酶底物和作為色原體的2ml四曱基聯(lián)苯胺 溶液(TMB)。將孔在黑暗中在環(huán)境溫度溫育3 O分鐘。 在各孔中添加100ji1 lN碌u酸溶液作為終止液。 在450和620nm測量吸光度(光密度)。 圖2給出所得結(jié)果。圖2顯示從各類綿羊基因型的血漿獲得的光密度分布。 從圖2可見，SAF-34抗體/生物素標(biāo)記的2All對能夠在不同的綿羊基因型 之間實(shí)現(xiàn)極好的鑒別。實(shí)施例3:在與實(shí)施例2不同的條件下對血漿樣品進(jìn)行測試在該實(shí)施例中，變性劑是離液劑，更確切的說是8旨素。 血漿樣品取自PrP第171位具有基因型R/R或者R/Q或者Q/Q的綿羊。 將65nl各綿羊血漿樣品與65nl包含8M尿素和10mM二硫蘇糖醇的導(dǎo)致變 性且具有還原性的溶液混合。然后將混合物在60。C加熱IO分鐘。然后，添加130nl EIA緩沖液(Enzyme Immuno Assay)，所述EIA緩沖液包 含lM磷酸鉀緩沖液,pH7.4, 0.15MNaCl，和相對于EIA緩沖液總體積O.l wt. 0/。的牛血清清蛋白(BSA)。在包含捕捉用抗體的微量滴定板的孔中添加100W所獲混合物，所述捕 捉用抗體是SAF-34抗體。將混合物在20。C溫育1小時(shí)。然后，用清洗液對孔進(jìn)行3次清洗，所述清洗液包含0.01M Tris， 0.3M NaCl, pH 7.4和相對于清洗液總體積0.1 wt. 。/。的Tween 20。清洗后，每孔添加100pl檢測用抗體，所述抗體是生物素標(biāo)記的2A11， 2A11抗體-生物素偶聯(lián)物的濃度為0.5 ng/ml所獲最終混合物。將孔在4。C溫育1小時(shí)。然后用先前描述的清洗液進(jìn)行3次清洗。清洗后，按照"材料"章節(jié)所述，每孔添加100nl鏈霉親合素-過氧化物 酶偶聯(lián)物，濃度為0.1ng/ml最終溶液。 將孔在20。C溫育30分鐘。 然后用先前描述的清洗液進(jìn)行5次清洗。在各孔中添加1 OOjal過氧化物酶底物和作為色原體的2ml四曱基聯(lián)苯胺 溶液(TMB)。將孔在黑暗中在環(huán)境溫度溫育30分鐘。 在各孔中添加lOOjil 1N石克酸溶液作為終止液。 在450和620 nm測量吸光度。 圖3給出所得結(jié)果。通過比較圖2和3,發(fā)現(xiàn)抗體對SAF-34/2Al 1能夠在不同的綿羊基因型之 間實(shí)現(xiàn)極好的筌別，無論導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液的組成如何。實(shí)施例4:變性劑/還原劑組合存在的影響的研究包含還原劑和變性劑的重要性。為了這個(gè)目的，遵循實(shí)施例3的方案對來自PrP第171位具有基因型Q/Q 或者R/R的綿羊的血漿進(jìn)行測試，即使用包含8M尿素作為變性劑和10mM DTT作為還原劑的溶液。使用僅包含變性劑即8M尿素的溶液對相同的綿羊血漿進(jìn)行測試。這些相同的樣品還用4又包含還原劑即10mM DTT的溶液進(jìn)行處理。在450-620 nm測量這些血漿中每份的光密度。所獲結(jié)果顯示于圖4，其中白色柱代表用包含變性劑和還原劑的溶液處 理的血漿所獲得的光密度，網(wǎng)格柱代表用只含變性劑且不含任何還原劑的溶 液處理的生物學(xué)體液樣品所獲得的密度，而斜線柱代表用只含還原劑且不含 任何變性劑的溶液處理的樣品所獲得的光密度。從圖4可以看出，還原劑和變性劑(表面活性劑和/或離液劑)的組合存 在對鑒別不同基因型是絕對必要的。應(yīng)當(dāng)注意，因?yàn)榭贵w2All與PrP第171位R等位基因形式不結(jié)合，所獲結(jié) 果在使用變性溶液進(jìn)行的測試間不顯示任何差異，不管變性溶液是否包含還 原劑。對綿羊血清進(jìn)行與實(shí)施例1到4相同的測試。獲得相似的結(jié)果。 一旦蛋白質(zhì)第171位的基因型被鑒定，有可能選擇預(yù)期用于繁殖的綿羊。 優(yōu)選的是，所選擇的綿羊是那些具有基因型R/R的綿羊，所述基因型最 抗瘙癢病。因此，有可能根據(jù)計(jì)劃選擇具有該基因型的雄綿羊和雌綿羊，使得只會(huì) 繁殖出基因型R/R的綿羊，或者只選擇基因型R/R的雄綿羊，并讓它們與各種 基因型的雌綿羊繁殖。有利的是，本發(fā)明的方法可以利用試劑盒來實(shí)施。 在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括- 一種固定有至少一種捕捉用抗體的固相，所述捕捉用抗體選自抗體 SAF-15、 SAF-31、 SAF畫32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF畫35、 SAF-37、 3B5 、 SAF-84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8，-導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種檢測用抗體，特別是選自經(jīng)過標(biāo)記的抗體12F10、 BAR226、 11C6和2A11，更特別的是經(jīng)過標(biāo)記的2A11。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括- 一種固定有至少一種捕捉用抗體的固相，所述捕捉用抗體選自抗體 12F10、 BAR226、 11C6和2A11,-導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種4企測用抗體，選自抗體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32 、 SAF畫33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF畫37、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8，所述抗體是經(jīng)過標(biāo)記的。優(yōu)選的是，在本發(fā)明的試劑盒中，所述固相是^f效量滴定板，優(yōu)選是由聚 苯乙烯制成的。優(yōu)選的是，在本發(fā)明試劑盒的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉用抗體是 SAF-34抗體或者3B5抗體，而且所述檢測用抗體是2A11抗體。并且優(yōu)選的是，在本發(fā)明的試劑盒中，所述變性溶液包含十二烷基硫酸 鈉、二硫蘇糖醇和十二烷基肌氨酸鈉。實(shí)施例5:對血清進(jìn)行測試研究從PrP第171位具有氨基酸R/R、或者R/H、或者R/Q、或者H7Q、 H/H 和Q/Q的綿羊血清得到的光密度(OD)分布，其中光密度測定遵循與實(shí)施例2 中所述相似的方案，只是所研究的樣品是血清，DTT濃度是20mM，捕捉用 抗體是3B5，檢測用抗體是2All且用量是相對于所獲最終混合物總重2.2)ig/L 抗體，而且固相上標(biāo)記抗體的存在是通過添加濃度為0.37pg/L最終混合物的、 "材料"章節(jié)所描述的鏈霉親合素/過氧化物酶偶聯(lián)物來顯色的。圖5顯示所得結(jié)果。在不同的綿羊基因型之間觀察到良好的鑒別。實(shí)施例6:還原劑濃度對血漿樣品影響的研究血漿樣品取自PrP第171位具有基因型R/R或者R/Q或者Q/Q的綿羊。 將75(al各綿羊血漿樣品與75pl導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液混合，所述體積2 wt %的十二烷基肌氨酸鈉，相對于導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液總體積2 wt.。/。的十二烷基硫酸鹽，和10mM、 20mM或者30mM的二硫蘇糖醇。 然后將混合物在60。C加熱IO分鐘。在包含捕捉用抗體的微量滴定板的孔中添加100pl所獲混合物，所述捕 捉用抗體是3B5抗體。然后，用清洗液對孔進(jìn)行3次清洗，所述清洗液包含0.01M Tris， 0.3M NaCl， pH 7.4和相對于清洗液總重0.1 wt. 。/。的Tween 20。清洗液被緩沖到中性pH或者弱堿性，并包含低濃度的中性/非離子型去 污劑(0.0P/。Tween20)。清洗后，每孔添力口100pl檢測用抗體，即偶聯(lián)物生物素2A11抗體，其以 相對于所獲最終混合物總重為每升3 pg抗體的濃度存在。將孔在37。C溫育l小時(shí)。然后用先前描述的清洗液進(jìn)行3次清洗。通過添加"材料"章節(jié)中描述的鏈霉親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物對固相上 標(biāo)記抗體的存在進(jìn)行顯色，所述偶聯(lián)物為0.4iig/ml最終混合物。 在37。C溫育30分鐘。然后，用先前描述的清洗液進(jìn)行5次清洗。在各孔中添加100nl過氧化物酶底物和作為色原體的2ml四曱基聯(lián)苯胺 溶液(T纖)。將孔在黑暗中與環(huán)境溫度溫育30分鐘。 在各孔中添力口100jil 1N石克酸溶液作為終止液。 在450和620nm測量吸光度(光密度)。 圖6顯示所得結(jié)果。觀察到，還原劑濃度的變異對種群之間的鑒別沒有顯著影響。實(shí)施例7:還原劑濃度對血清影響的研究血清樣品取自PrP第171位具有基因型R/R或者R/Q或者Q/Q的綿羊。 將75(il各綿羊樣品與75iil導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液混合，所述導(dǎo)致wt. %的十二烷基肌氨酸鈉，相對于導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液總體積2 wt. %的十二烷基硫酸鹽，和20mM或者30mM的二硫蘇糖醇。 然后將混合物在60。C加熱IO分鐘。在包含捕捉用抗體的微量滴定板的孔中添加1 OO(il所獲混合物，所述捕 捉用抗體是3B5抗體。然后，用清洗液對孔進(jìn)行3次清洗，所述清洗液包含0.01M Tris， 0.3M NaCl， pH 7.4和相對于清洗液總重0.1 wt 。/。的Tween 20。清洗液被緩沖到中性pH或者弱堿性，并包含低濃度的中性/非離子型去 污劑(0.01%Tween20)。清洗后，每孔添加100pl檢測用抗體，即生物素偶聯(lián)2A11抗體，其以相 對于所獲最終混合物總重為每升2pg抗體的濃度存在。將孔在37。C溫育1小時(shí)。然后用先前描述的清洗液進(jìn)行3次清洗。通過添加"材料，，章節(jié)中描述的鏈霉親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物對固相上 標(biāo)記抗體的存在進(jìn)行顯色，所述偶聯(lián)物為0.33pg/ml最終混合物。 接著在37。C溫育30分鐘。 然后，用先前描述的清洗液進(jìn)行5次清洗。在各孔中添加100^d過氧化物酶底物和作為色原體的2ml四曱基聯(lián)苯胺 溶液(TMB)。將孔在黑暗中在環(huán)境溫度溫育30分鐘。 在各孔中添加10(^1 1N石克酸溶液作為終止液。 在450和620nm測量吸光度(光密度)。 圖7顯示所得結(jié)果。觀察到，還原射濃度的變異對種群之間的鑒別沒有顯著影響。實(shí)施例8:盲試195份血清樣品取自不同的綿羊。 對這195份所采集的樣品進(jìn)行實(shí)施例5中描述的方案。 還使用其基因型已知是R/R、 R/Q和Q/Q的血清(對照)進(jìn)行實(shí)施例5中 描述的方案。圖8顯示所得結(jié)果。觀察到，可以最有利的鑒定出所測樣品的基因型。
權(quán)利要求
1.鑒定綿羊PrP第171位基因型的方法，其特征在于它包括以下步驟a)用導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液處理包含PrP的待測綿羊生物學(xué)體液樣品，b)將變性和還原后的PrP固定在固相上，任選通過配體來固定，c)使變性、還原和固定后的PrP與至少一種檢測用抗體接觸，并d)檢測所述至少一種檢測用抗體的可能存在，且其中所述配體和所述至少一種檢測用抗體中之一能與第171位具有特定等位基因形式的PrP特異性結(jié)合。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述導(dǎo)致變性且具有還原性的溶 液包含a) 至少一種變性劑，其選自 -表面活性劑，其選自 陰離子表面活性劑，諸如SDS (十二烷基硫酸鈉)、十二烷基肌氨酸鈉(月桂酰肌氨酸)、膽酸鈉、甘膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、辛酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、月桂基硫酸鈉和月桂基硫酸鋰； 兩性離子表面活性劑，諸如SB3-10(癸基-磺基甜萊堿)、SB3-12(十二烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-14 (十四烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-16 (十六烷基-磺基甜萊堿)、SB 3-18 (十八烷基-磺基甜萊堿)、CHAPS和CHAPSO和脫氧CHAPS; 非離子表面活性劑，諸如TritonX-lOO、 Triton X-114、 Tween 20、 Tween 80、 Brij 35(聚氧乙烯23月桂基醚)、nonidetP-40、正-癸基-卩-D-吡喃葡萄糖苷、正-十二烷基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正-辛烷基-(3-D-吡喃 葡萄糖苷和正-辛烷基-a-D-吡喃葡萄糖苷； 它們的混合物，和/或 -離液劑，及b) 至少一種還原劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述離液劑選自尿素、胍、鹽酸 胍、硫氰酸胍或它們的混合物之一。
4. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述導(dǎo)致變性且具 有還原性的溶液包含離子表面活性劑的混合物。
5. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述導(dǎo)致變性且具有還原 性的溶液包含相對于由待處理的樣品及導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液 構(gòu)成的混合物的總體積為至少0.5 wt. %的表面活性劑。
6. 如權(quán)利要求2到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述至少一種還原 劑選自DTT ( 二硫蘇糖醇)、TCEP (三(2-羧基乙基)膦)鹽酸鹽、DTE(二硫赤蘚糖醇)、P-巰基乙醇、2-巰基乙胺和它們的混合物之一。
7. 如權(quán)利要求2到6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中由待處理的樣品及導(dǎo)致變100mM之間。
8. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述導(dǎo)致變性且具 有還原性的溶液包含十二烷基肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉和二硫蘇糖醇 的混合物。
9. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述導(dǎo)致變性且具 有還原性的溶液中離液劑濃度等于或者大于1M。
10. 如任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述離液劑是尿素。
11. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)中，變性和還原 后的PrP通過配體固定，所述配體是能夠通過親和結(jié)合作用保留PrP的捕 捉用抗體，且其中在步驟c)中，所述檢測用抗體是能與第171位具有特定 等位基因形式的PrP特異性結(jié)合的抗體，該位置不同于所述捕捉用抗體 所識(shí)別的表位位點(diǎn)。
12. 如權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)中，變性和還 原后的PrP通過配體固定，所述配體是能與第171位具有特定等位基因形 式的PrP特異性結(jié)合的捕捉用抗體，并且其中在步驟c)中，所述檢測用抗 體是能夠通過親和結(jié)合作用與PrP結(jié)合的抗體，所述結(jié)合發(fā)生在不同于 所述捕捉用抗體識(shí)別位點(diǎn)的表位位點(diǎn)。
13. 如權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)中，變性和還 原后的PrP通過配體固定，所述配體選自纖溶酶原、親合素、鏈霉親合 素、單糖氨基聚糖、橙皮堿、卟啉、鏈霉素和四環(huán)素，且其中在步驟c) 中，所述^r測用抗體是能與第171位具有特定等位基因形式的PrP特異性結(jié)合的抗體。
14. 如權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)中，變性和還 原后的PrP直接固定在固相上，且其中在步驟c)中，所述檢測用抗體是 能與第171位具有特定等位基因形式的PrP特異性結(jié)合的抗體。
15. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述固相選自聚合物制成 的、聚苯乙烯制成的、聚乙烯制成的、或者膠乳制成的，微量滴定板、 珠子、管，和聚苯乙烯制成的微量滴定板。
16. 如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物學(xué)體液的樣品是 血液、血漿、血清或者乳汁。
17. 如權(quán)利要求l到ll、 13到16中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述配 體是捕4足用抗體，其選自抗體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF國37、 3B5、 SAF畫84、 SHA國31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8。
18. 如;K利要求l到ll、 13到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述檢 測用抗體選自經(jīng)過標(biāo)記的2A1 l抗體、經(jīng)過標(biāo)記的11C6抗體、經(jīng)過標(biāo)記 的B AR226抗體和經(jīng)過標(biāo)記的抗體12F10 。
19. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于所述捕捉用抗體是SAF-34抗體或 者3B5抗體，且所述檢測用抗體是經(jīng)過標(biāo)記的2A1 l抗體。
20. 如權(quán)利要求1到10、 12、和15到16中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于 所述配體是捕捉用抗體，其選自抗體2A11、 11C6、 BAR-226和12F10。
21. 如權(quán)利要求1到10、 12、 15到16、和20中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征 在于所述4企測用抗體選自SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF-37、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8。
22. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述捕捉用抗體選自抗體 2A11、 12F10、 BAR226和11C6，且所述^r測用抗體選自經(jīng)過標(biāo)記的抗 體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF-37、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR畫222、 BAR誦224、 BAR-233和8G8。
23. 根據(jù)對傳染性亞急性海綿樣腦病的抗性對綿羊種群進(jìn)行篩選的方法，其 特征在于它包括如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述方法的實(shí)施方案。
24. 根據(jù)對傳染性亞急性海綿樣腦病的敏感性對綿羊種群進(jìn)行篩選的方法，其特征在于它包括如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述方法的實(shí)施方案。
25. 鑒定綿羊PrP第171位基因型的試劑盒，包括-固相，所述固相上固定了至少一種捕捉用抗體，所述捕捉用抗體特 別是選自抗體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF-34、 SAF-35、 SAF-37、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR-222、 BAR-224、 BAR-233和8G8，-導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種檢測用抗體，特別是選自經(jīng)過標(biāo)記的抗體12F10、 BAR226、 11C6和2A11,更特別的是經(jīng)過標(biāo)記的抗體2A11 。
26. 鑒定綿羊PrP第171位基因型的試劑盒，其特征在于它包括-固相，所述固相上固定了至少一種捕捉用抗體，所述捕捉用抗體特 別是選自抗體12F10、 BAR226、 11C6和2A11， -導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液，和-至少一種檢測用抗體，特別是選自經(jīng)過標(biāo)記的抗體SAF-15、 SAF-31、 SAF-32、 SAF-33、 SAF國34、 SAF畫35、 SAF-37、 3B5、 SAF-84、 SHA-31、 BAR畫222、 BAR-224、 BAR-233和8G8。
全文摘要
本發(fā)明系涉及一種鑒定綿羊PrP第171位基因型的方法，以及選擇用于繁殖的綿羊的方法。本發(fā)明還涉及實(shí)施這些方法的試劑盒。本發(fā)明的鑒定方法包括以下步驟用導(dǎo)致變性且具有還原性的溶液處理包含PrP的待測綿羊體液樣品；將變性和還原后的PrP固定在固相上，任選通過配體來固定；使變性、還原和固定后的PrP與至少一種檢測用抗體接觸；并檢測所述至少一種檢測用抗體的可能存在，其中所述配體和所述至少一種檢測用抗體之一能與第171位具有特定等位基因形式的PrP特異性結(jié)合。本發(fā)明具體可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的是獸醫(yī)和衛(wèi)生領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101336374SQ200680051798
公開日2008年12月31日 申請日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者亞歷詹德羅·布倫托里斯, 納薩莉·莫雷爾, 胡安-瑪麗亞·托里斯特里洛, 讓-馬克吉勒斯·比爾霍伊德, 雅克斯·格拉西 申請人:比奧-雷德巴斯德有限公司;原子能委員會(huì);農(nóng)業(yè)和食品研究技術(shù)國家研究院