試劑盒及確定待測dna樣本預(yù)定snp位點的基因型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及試劑盒及確定待測DNA樣本預(yù)定SNP位點的基因型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)WHO統(tǒng)計，全球抑郁癥發(fā)病率為11%。在我國抑郁癥發(fā)病率約為3%~5%，目 前已經(jīng)有超過2600萬人患有抑郁癥。藥物是治療抑郁癥的最有效方法。在中國約10%的 患者接受了相關(guān)的藥物治療。美國人口中的10%在服用抗抑郁癥藥物，而其中45~55歲 婦女中服用抗抑郁癥藥物高達(dá)25%。然而，抗抑郁癥藥物在過去十年中為醫(yī)藥公司帶來可 觀利益同時，相關(guān)問題不容忽視：首先，抗抑郁癥藥物副作用大且存在顯著的個體化差異， 服用第二代抗抑郁癥藥物的患者平均有61%經(jīng)歷至少一種副作用。最常見的有頭痛、失眠 癥和性功能障礙等；其次，用藥劑量存在個體化的問題，用藥量不當(dāng)會導(dǎo)致死亡；再次，療 效個體化差異大，僅30%~45%的患者獲得臨床癥狀的完全緩解。研究表明，人群對抗抑 郁癥藥物的個體差異與單核苷酸多態(tài)性（SNP)密切相關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者正在紛紛開展此類研 究，并證實了 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680位點與個體的抗抑郁癥藥物用藥相關(guān)。因而，在抗抑郁癥藥物用藥之前，需藥個體的 上述SNP位點的基因型檢測和分型，意義重大。
[0003] 然而，現(xiàn)階段 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、 rs4986893和rs4680位點的檢測和基因型分型的方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0005] 目前檢測SNP位點的最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應(yīng)用特異性 限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)消化位點是否消失來判斷其變異存在與否。但該 方法操作復(fù)雜，樣本量多時易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度 而出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，可靠性低。熒光定量PCR和多重PCR方法盡管特異性有所提 高，但是這兩種方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，熒光信號的強(qiáng)弱，引物特異性以及 低保真Taq酶等這些因素均可造成對結(jié)果的影響。DNA測序法雖然是目前進(jìn)行基因診斷的 金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，過程復(fù)雜，試劑價格昂貴，容易出現(xiàn)樣本間的交叉污染而導(dǎo)致測序失 ??；另外測序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗實驗室的承受范圍。高分辨率熔解曲線法是 一種快速，簡便，經(jīng)濟(jì)，實用的分型方法，但基因分型依賴于儀器溫度控制的精密性，假陽性 高。Taqman探針雜交法采用特異性的熒光標(biāo)記的探針，特異性強(qiáng)，靈敏度高且操作方便，快 速。該方法同樣被認(rèn)為是SNP分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用的前景值得期待。Taqman探針雜 交法的原理為：在TaqMan探針法的PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針，探針只 與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間，探針的5'端標(biāo)記有報告基因，如FAM、 VIC，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，如MGB TAMRA ;當(dāng)探針完整的時候，報告基因所發(fā)射的熒光 能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號；隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與 模板結(jié)合的探針，其3' -5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能 量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。由此，應(yīng)用一對雙熒光標(biāo)記的Taqman探針，分別針對雙 等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能夠擴(kuò)增出各自的基因型；用兩種熒光信 號能夠被顯著區(qū)分的熒光染料分別標(biāo)記這兩種探針，就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對單個 SNP位點的基因型判定。因而，利用該方法進(jìn)行SNP基因型分型時，引物和探針的設(shè)計至關(guān) 重要，引物長度、探針長度、引物特異性和探針特異性均會顯著影響檢測結(jié)果的特異性和敏 感性。
[0006] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個 目的在于提出一種能夠有效用于 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、 rs4244285、rs4986893和rs4680位點檢測的試劑盒，以及確定待測DNA樣本的rs2032583、 rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位點的基因型的 方法。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑 盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；第二核酸 分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；第一探針，所述第一探針具 有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；第二探針，所述第二探針具有SEQ ID NO :4所示的核苷 酸序列；第三核酸分子，所述第三核酸分子具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；第四核酸 分子，所述第四核酸分子具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列；第三探針，所述第三探針具 有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列；第四探針，所述第四探針具有SEQ ID NO :8所示的核苷 酸序列；第五核酸分子，所述第五核酸分子具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列；第六核酸 分子，所述第六核酸分子具有SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；第五探針，所述第五探針 具有SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列；第六探針，所述第六探針具有SEQ ID NO :12所示 的核苷酸序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子具有SEQ ID NO :13所不的核苷酸序列； 第八核酸分子，所述第八核酸分子具有SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列；第七探針，所述 第七探針具有SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列；第八探針，所述第八探針具有SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；第九核酸分子，所述第九核酸分子具有SEQ ID NO :17所示的核苷酸 序列；第十核酸分子，所述第十核酸分子具有SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列；第九探針， 所述第九探針具有SEQ ID NO :19所示的核苷酸序列；第十探針，所述第十探針具有SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列；第十一核酸分子，所述第十一核酸分子具有SEQ ID NO :21所示 的核苷酸序列；第十二核酸分子，所述第十二核酸分子具有SEQ ID NO :22所示的核苷酸序 列；第十一探針，所述第十一探針具有SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列；第十二探針，所述 第十二探針具有SEQ ID NO :24所示的核苷酸序列；第十三核酸分子，所述第十三核酸分 子具有SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列；第十四核酸分子，所述第十四核酸分子具有SEQ ID NO :26所示的核苷酸序列；第十三探針，所述第十三探針具有SEQ ID NO :27所示的核苷 酸序列；第十四探針，所述第十四探針具有SEQ ID NO :28所示的核苷酸序列；第十五核酸 分子，所述第十五核酸分子具有SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列；第十六核酸分子，所述 第十六核酸分子具有SEQ ID NO :30所示的核苷酸序列；第十五探針，所述第十五探針具有 SEQ ID NO :31所示的核苷酸序列；第十六探針，所述第十六探針具有SEQ ID NO :32所示 的核苷酸序列，其中，所述探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，所 述第一探針與所述第二探針的熒光報告基團(tuán)不同，所述第三探針與所述第四探針的熒光報 告基團(tuán)不同，所述第五探針與所述第六探針的熒光報告基團(tuán)不同，所述第七探針與所述第 八探針的熒光報告基團(tuán)不同，所述第九探針與所述第十探針的熒光報告基團(tuán)不同，所述第 十一探針與所述第十二探針的熒光報告基團(tuán)不同，所述第十三探針與所述第十四探針的熒 光報告基團(tuán)不同，所述第十五探針與所述第十六探針的熒光報告基團(tuán)不同。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的試劑盒能夠用于rs2032583、rsl800532、rs6265、 rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位點的檢測。具體地，根據(jù) Taqman 探針雜交法，利用該試劑盒中的試劑，將待測DNA樣本進(jìn)行熒光定量PCR后，基于熒光定量 PCR 結(jié)果即可容易地確定 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、 rs4986893 和 rs4680 位點的基因型。進(jìn)而，可以將 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、 rsl065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位點的基因型信息，與其他臨床信息結(jié)合分 析，用于指導(dǎo)待測DNA樣本來源的個體的抗抑郁癥藥物用藥。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述熒光報告基團(tuán)為FAM或VIC，所述淬滅基團(tuán)為MGB。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了一種確定待測DNA樣本預(yù)定SNP位 點的基因型的方法，所述預(yù)定SNP位點為選自rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、 rsl065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位點的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方 法包括：根據(jù)Taqman探針雜交法，利用前面所述的試劑盒，將所述待測DNA樣本進(jìn)行熒光 定量PCR ;以及對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析，以便確定待測樣本預(yù)定SNP位點的基因型， 其中，針對rs2032583位點，采用所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探針和第二探針； 針對rsl800532位點，采用所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探針和第四探針；針對 rs6265位點，采用所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探針和第六探針；針對rs6311位 點，采用所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探針和第八探針；針對rsl065852位點，采 用所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探針和第十探針；針對rs4244285位點，采用所 述第i 核酸分子、第十二核酸分子、第i 探針和第十二探針；針對rs4986893位點，采 用所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探針和第十四探針；針對rs4680位點，采 用所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探針和第十六探針。。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明的方法能夠有效地確定待測DNA樣本 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位點 的基因型。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該方法成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、可重 復(fù)性好，且在一次PCR反應(yīng)中即可完成對單個SNP位點的基因型判定，操作方便、快速。
[0012] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的確定待測DNA樣本預(yù)定SNP位點的基因型的方法 還可以具有如下附加的技術(shù)特征：
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用ABI Stepone熒光定量PCR儀進(jìn)行所述熒光定量PCR。 由此，熒光定量PCR結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)的分析，進(jìn)而有利于預(yù)定SNP位點基因型的確定。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix ;3. 5重量份的超純水；0. 5重量份的組合物；以及1重量份的待測 DNA樣本，其中，針對rs2032583位點，所述組合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第 一探針和第二探針組成；針對rsl800532位點，所述組合物由所述第三核酸分子、第四核酸 分子、第三探針和第四探針組成；針對rs6265位點，所述組合物由所述第五核酸分子、第六 核酸分子、第五探針和第六探針組成；針對rs6311位點，所述組合物由所述第七核酸分子、 第八核酸分子、第七探針和第八探針組成；針對rsl065852位點，所述組合物由所述第九核 酸分子、第