物，其中所述第十三核酸分子為上游引物，所述第十四核酸分子為下游引物， 所述第十三探針和第十四探針均為針對(duì)該位點(diǎn)的Taqman探針；所述第十五核酸分子和所 述第十六核酸分子為用于擴(kuò)增rs4680位點(diǎn)的一對(duì)引物，其中所述第十五核酸分子為上游 引物，所述第十六核酸分子為下游引物，所述第十五探針和第十六探針均為針對(duì)該位點(diǎn)的 Taqman 探針。
[0077] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行熒光定量PCR的儀器不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明一些 具體示例，利用ABI Stepone熒光定量PCR儀進(jìn)行所述熒光定量PCR。由此，熒光定量PCR 結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)的分析，進(jìn)而有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，熒光定量PCR的反應(yīng)體系不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的 一些具體示例，所述突光定量PCR的反應(yīng)體系為：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix (ABI公司，貨號(hào)：4371355) ;3. 5重量份的超純水；0. 5重量份的組合物；以及1重量份 的待測(cè)DNA樣本，其中，針對(duì)rs2032583位點(diǎn)，所述組合物由所述第一核酸分子、第二核酸 分子、第一探針和第二探針組成；針對(duì)rsl800532位點(diǎn)，所述組合物由所述第三核酸分子、 第四核酸分子、第三探針和第四探針組成；針對(duì)rs6265位點(diǎn)，所述組合物由所述第五核 酸分子、第六核酸分子、第五探針和第六探針組成；針對(duì)rs6311位點(diǎn)，所述組合物由所述 第七核酸分子、第八核酸分子、第七探針和第八探針組成；針對(duì)rsl065852位點(diǎn)，所述組合 物由所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探針和第十探針組成；針對(duì)rs4244285位點(diǎn)， 所述組合物由所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探針和第十二探針組成；針 對(duì)rs4986893位點(diǎn)，所述組合物由所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探針和第 十四探針組成；針對(duì)rs4680位點(diǎn)，所述組合物由所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第 十五探針和第十六探針組成。由此，熒光定量PCR效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)的分析，進(jìn) 而有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0079] 其中，待測(cè)DNA樣本的濃度不受特別限制，只要能夠有效完成熒光定量PCR即可。 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述待測(cè)DNA樣本的濃度為20ng/μ 1。由此，熒光定量PCR效 果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0080] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述待測(cè)DNA樣本的來源不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一 些具體實(shí)施例，所述待測(cè)DNA樣本來源于人唾液或外周血。
[0081] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述組合物中每種核酸分子的濃度均為18 μ mol/L，每種探 針的濃度均為5 μ mol/L。由此，熒光定量PCR效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基因 型的確定。
[0082] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?0°C下保持30 秒；第二步：95°C下保持10分鐘；第三步：92°C下保持15秒；第四步：60°C下保持90秒；第 五步：循環(huán)第三步第四步50次；以及第六步：60°C下保持30秒。由此，熒光定量PCR效果 好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0083] 然后，對(duì)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析，以便確定待測(cè)樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型。 其中，對(duì)所述熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用 Stepone software V2.1對(duì)所述熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。由此，對(duì)熒光定量PCR結(jié)果的 分析更準(zhǔn)確，有利于后續(xù)預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，發(fā)明人首先對(duì)多個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行測(cè)序得到其基因 型，然后采用本發(fā)明的引物及探針對(duì)上述多個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行taqman熒光定量PCR基因分 型，經(jīng)驗(yàn)證，證明利用本發(fā)明的方法進(jìn)行基因分型的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。然后，通過統(tǒng)計(jì)將測(cè)序 確定的特定的基因型與taqman熒光定量曲線圖相關(guān)聯(lián)。從而，在之后利用本發(fā)明的方法 對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行taqman基因分型時(shí)，基于待測(cè)樣本的taqman熒光定量曲線圖，根據(jù)特定的 基因型與taqman熒光定量曲線圖的關(guān)聯(lián)結(jié)果，確定待測(cè)樣本的基因型。例如，參照?qǐng)D1-圖 22,針對(duì)某一種基因型，其熒光信號(hào)曲線位于基線（即背景熒光的信號(hào)）以上，一般表明存 在對(duì)應(yīng)的基因型。
[0085] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地確定待測(cè)DNA樣本rs2032583、 rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位點(diǎn)的基因型， 并且該方法成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、可重復(fù)性好，且在一次PCR反應(yīng)中即可 完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定，操作方便、快速。
[0086] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的 實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條 件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀 器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0087] 實(shí)施例1 :
[0088] 根據(jù)本發(fā)明的確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型的方法，確定48例待測(cè) DNA 樣本（人外周血 DNA 樣本）的 rs2〇32583、rsl8〇〇532、rs 6265、rs63ll、rsl〇65852、 rs4244285、rs4986893和rs4680位點(diǎn)的基因型，具體步驟如下：
[0089] 1、設(shè)計(jì)并合成以下引物和探針：
[0090] (1)針對(duì) rs2032583 位點(diǎn)：
[0091] F 引物：5' -ACTAGAAGGTTCTGGGAA-3'（SEQ ID NO :1);
[0092] R 引物：5' -TGAAAAAGATTGCTTTGA-3'（SEQ ID NO :2);
[0093] FAM 探針：FAM-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTGGAATACTTTACTCTACTTAATTA-MGB ;
[0094] VIC 探針：VIC-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTAGAATACTTTACTCTACTTAATTA-MGB。
[0095] (2)針對(duì) rsl800532 位點(diǎn)：
[0096] F 引物：5, -GGTACCTGGCATGAAATA-3'（SEQ ID NO :5);
[0097] R 引物：5' -AGCTTTATGCAGGCAGAA-3'（SEQ ID NO :6);
[0098] FAM 探針：FAM-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTATCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB ;和
[0099] VIC 探針：VIC-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTAGCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB。
[0100] (3)針對(duì) rs6265 位點(diǎn)：
[0101] F 引物：5' -GAAAGAGAAGAGGAGGCT-3'（SEQ ID NO :9);
[0102] R 引物：5, -TTGGCTGACACTTTCGAA-3'（SEQ ID NO :10);
[0103] FAM 探針：FAM-CATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB ;
[0104] VIC 探針：VIC-CATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB。
[0105] (4)針對(duì) rs6311 位點(diǎn)：
[0106] F 引物：5, -AAGTGGCACTGTGGTAAT-3，（SEQ ID NO :13);
[0107] R 引物：5' -CCAATGTCAGTAATTCCA-3'（SEQ ID NO :14);
[0108] FAM 探針：FAM-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCAGACACTCACAGCACTCCG AGGAC-MGB ;
[0109] VIC 探針：VIC-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCGGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-MGB。
[0110] (5)針對(duì) rsl065852 位點(diǎn)：
[0111] F 引物：5, -TGGCCGTGATAGTGGCCA-3'（SEQ ID NO :17);
[0112] R 引物：5' -TCGAAGCAGTATGGTGTG-3'（SEQ ID NO :18);
[0113] FAM 探針：FAM-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGAGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB ;
[0114] VIC 探針：VIC-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGGGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB。
[0115] (6)針對(duì) rs4244285 位點(diǎn)：
[0116] F 引物：5, -TTTATTAAATGCTTTTAA-3'（SEQ ID NO :21);
[0117] R 引物：5, -TCTTTTACTTTCTCCAAA-3'（SEQ ID NO :22);
[0118] FAM 探針：FAM-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCTGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB ;
[0119] VIC 探針：VIC-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCCGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB。
[0120] (7)針對(duì) rs4986893 位點(diǎn)：
[0121] F 引物：5' -AAAGATCAGCAATTTCTT-3'（SEQ ID NO :25);
[0122] R 引物：5' -GTCAATATAGAATTTTGG-3'（SEQ ID NO :26);
[0123] FAM 探針：FAM-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATTCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB ;
[0124] VIC 探針：VIC-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATCCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB。
[0125] (8)針對(duì) rs4680 位點(diǎn)：
[0126] F 引物：5, -ATCACCATCGAGATCAAC-3，（SEQ ID NO :29);
[0127] R 引物：5, -AGGACAAAGTGCGCATGC-3，（SEQ ID NO :30);
[0128] FAM 探針：FAM-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCACGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB ;
[0129] VIC 探針：VIC-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCATGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB。
[0130] 2、熒光定量PCR :
[0131] 利用ABI St印one熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國應(yīng)用生物技術(shù)有限 公司），分別對(duì)各DNA樣本進(jìn)行熒光定量PCR，其中每個(gè)DNA樣本的每個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)都分別 進(jìn)行。
[0132] 其中，突光定量PCR的反應(yīng)體系的總體積為10 μ I :Taqman Genotyping Master Mix (ABI公司，貨號(hào)：4371355) 5 μ 1、ddH20 3. 5 μ 1、針對(duì)特定位點(diǎn)的探針和引物的混合液