專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢查痘病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢査病毒制備物中的外源病毒污染物的方法。特別地，本發(fā)明涉及檢查痘病毒或其重組病毒、特別是痘苗病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的方法。
背景技術(shù)：
：病毒制備物在毒種選育和生產(chǎn)過(guò)程中，都需要使用動(dòng)物或細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)。作為培養(yǎng)基質(zhì)的細(xì)胞可能存在病毒污染，因此有可能造成病毒制備物被外源因子(特別是外源病毒)所污染。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，需要對(duì)毒種和作為培養(yǎng)基質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行外源病毒檢查。通常，毒種外源病毒檢査的原理是使用非人源和非猴源的特異性抗血清中和適當(dāng)稀釋的毒種。將中和后的病毒懸液接種細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)"細(xì)胞法")、動(dòng)物(簡(jiǎn)稱(chēng)"動(dòng)物法")或者雞胚(簡(jiǎn)稱(chēng)"雞胚法")，觀察是否有外源病毒的存在。其中細(xì)胞法是較為簡(jiǎn)便，且使用最多的方法。細(xì)胞法的具體步驟包括將中和后的病毒懸液分別接種人源、猴源和生產(chǎn)用細(xì)胞，并將細(xì)胞于36士1'C培養(yǎng)2周；鏡下觀察是否有細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象；如結(jié)果無(wú)細(xì)胞病變和血球吸附現(xiàn)象則表明毒種無(wú)外源病毒污染(xnc病毒外源因子檢査，《中國(guó)藥典三部》，2005)。然而細(xì)胞法不能用于檢査一些不能被特異性抗血清完全中和的病毒("不完全中和病毒")的制備物中是否存在外源病毒污染，這類(lèi)不能被特異性抗血清完全中和的病毒例如為痘病毒等。這類(lèi)病毒即使在經(jīng)適當(dāng)稀釋后仍不能被其特異性抗血清完全中和，接種細(xì)胞后未被中和的病毒也將與外源病毒類(lèi)似地產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象，導(dǎo)致無(wú)法判斷結(jié)果。因此這類(lèi)病毒及其重組病毒制備物無(wú)法在細(xì)胞上完成外源病毒污染物的檢查。這類(lèi)不能被特異性抗血清完全中和的病毒通常用動(dòng)物法和雞胚法進(jìn)行外源病毒污染物的檢査，即將經(jīng)特異性抗血清中和后的病毒懸液接種小鼠和乳鼠的腦室和腹腔、雞胚尿囊腔和卵黃囊。試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)是(1)7天后雞胚尿囊液血球凝集試驗(yàn)陰性且80%雞胚存活；(2)14天后乳鼠80%存活且死亡動(dòng)物無(wú)病毒感染，解剖死亡的乳鼠，取病變組織、腦、脾制成細(xì)胞懸液再次接種乳鼠，觀察14天，乳鼠無(wú)病毒感染現(xiàn)象；(3)21天后小鼠80%存活且死亡動(dòng)物無(wú)病毒感染；解剖死亡的小鼠，取病變組織、腦、脾制成細(xì)胞懸液再次接種小鼠，觀察21天，小鼠無(wú)病毒感染現(xiàn)象。當(dāng)雞胚、乳鼠、小鼠試驗(yàn)均為陰性時(shí)，表明無(wú)外源病毒污染(XDC病毒外源因子檢查，《中國(guó)藥典三部》，2005)。該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且易受外界因素影響。PCR和免疫化學(xué)方法是WHO建議的方法(參見(jiàn)，WHORECOMMENDATIONSFORPRODUCTIONANDCONTROLOFSMALLPOXVACCINE*REVISED2003，p5)，但迄今為止這兩種方法均未建立，其最大的技術(shù)障礙在于，無(wú)法囊括所有可能存在的外源病毒，極易造成漏檢。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)不能被其特異性抗血清完全中和的痘病毒或其重組病毒提出了一種在細(xì)胞上進(jìn)行痘病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的檢查的新方法。應(yīng)用本發(fā)明的方法，可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞上對(duì)痘病毒(特別是痘苗病毒)或其重組病毒制備物進(jìn)行外源病毒污染物的檢查。具體而言，本發(fā)明提供了一種檢查痘病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的方法，該方法包括以下步驟a)將待檢痘病毒或其重組病毒制備物用對(duì)應(yīng)的痘病毒特異性抗血清進(jìn)行中和；b)將中和后的病毒懸液經(jīng)濾膜過(guò)濾；和C)將濾液接種細(xì)胞，其中所接種的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象表明所述痘病毒或其重組病毒制備物存在外源病毒的污染。在前述方法中，還可進(jìn)一步包括在步驟a)之前用濾膜對(duì)待檢痘病毒或其重組病毒制備物進(jìn)行過(guò)濾以除去制備物中的細(xì)胞碎片的步驟。在前述方法中，采用孔徑大于0.22^im的濾膜在中和之前對(duì)病毒制備物進(jìn)行過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片；采用孔徑為約0.22Min的濾膜過(guò)濾中和后的病毒懸液。特別地，在本發(fā)明的方法中所述痘病毒是痘苗病毒。圖1:將痘苗病毒天壇株制備物用特異性抗血清中和后經(jīng)0.22pm孔徑的濾膜過(guò)濾，將所得濾液接種CEF細(xì)胞后的顯微照片。從圖中可見(jiàn)，接種后的CEF細(xì)胞后未出現(xiàn)細(xì)胞病變。圖2A:將痘苗病毒天壇株制備物用特異性抗血清中和后不經(jīng)過(guò)濾直接接種CEF細(xì)胞，然后用血球吸附法顯示病變部位。從圖中可見(jiàn)，接種后的CEF細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞病變，且出現(xiàn)病變的細(xì)胞表面均吸附了雞血球。圖2B:用熒光抗體染色顯示圖2A中的病變部位。從圖中可見(jiàn)，在經(jīng)痘苗病毒特異性抗體的熒光染色后，吸附雞血球的病變部位顯示出熒光，這說(shuō)明CEF細(xì)胞的病變是由痘苗病毒引起的(圖中箭頭所示血球吸附明顯的區(qū)域亦是熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的區(qū)域)。圖3A:痘苗病毒天壇株制備物不經(jīng)特異性抗血清中和而直接經(jīng)0.22拜孔徑的濾膜過(guò)濾，將所得濾液接種CEF細(xì)胞，然后用血球吸附法顯示病變部位。從圖中可見(jiàn)，接種后的CEF細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞病變，且出現(xiàn)病變的細(xì)胞表面均吸附了雞血球。圖3B:用熒光抗體染色顯示圖3A中的病變部位。從圖中可見(jiàn)，在經(jīng)痘苗病毒特異性抗體的熒光染色后，吸附雞血球的病變部位也顯示出熒光，這說(shuō)明CEF細(xì)胞的病變是由痘苗病毒引起的。具體實(shí)施例方式術(shù)語(yǔ)"不完全中和病毒"大多數(shù)病毒與特異性中和抗體結(jié)合后將失去感染敏感細(xì)胞的能力。但極少數(shù)種類(lèi)的病毒與特異性中和抗體結(jié)合后，仍有少量病毒可以感染敏感細(xì)胞，這類(lèi)病毒稱(chēng)之為不完全中和病毒o不完全中和病毒的實(shí)例是痘病毒，例如痘苗病毒。"毒種"一定數(shù)量的已驗(yàn)明其來(lái)源、歷史和生物學(xué)特性并經(jīng)臨床研究證明其安全性和免疫原性良好的病毒株(或菌株)或用于制備原疫苗(OriginalVaccine)的活病毒(或菌體)懸液。"血球吸附"部分病毒表面的蛋白具有凝集紅細(xì)胞的能力，在病毒感染的細(xì)胞中加入紅細(xì)胞，感染細(xì)胞的表面會(huì)凝集紅細(xì)胞，這一現(xiàn)象稱(chēng)為血球吸附。"血吸點(diǎn)"被病毒感染的細(xì)胞吸附紅細(xì)胞后，肉眼觀察可見(jiàn)棕褐色的小點(diǎn)，稱(chēng)之為血吸點(diǎn)。"血抑效價(jià)"部分病毒表面的蛋白具有凝集紅細(xì)胞的能力，病毒特異性抗血清可以與這些蛋白結(jié)合，從而抑制血細(xì)胞的凝集(簡(jiǎn)稱(chēng)"血抑")。能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)即為血抑效價(jià)。"痘苗病毒VTT":痘苗病毒天壇株。"細(xì)胞病變"病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，可引起不同的結(jié)果，有的細(xì)胞完全被破壞，有的只有輕微的病變，這些統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞病變。痘病毒科病毒是已知?jiǎng)游锊《局蓄w粒最大的一類(lèi)DNA病毒，這類(lèi)病毒即使在經(jīng)適當(dāng)稀釋后仍不能被其特異性抗血清完全中和，接種細(xì)胞后未被中和的痘病毒也將與外源病毒類(lèi)似地產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確判斷痘病毒制備物是否存在外源病毒的污染。因此，不能將傳統(tǒng)的"細(xì)胞法"用于對(duì)痘病毒進(jìn)行外源病毒污染物的檢査。然而，用"動(dòng)物法"和"雞胚法"對(duì)痘病毒進(jìn)行外源病毒污染物的檢查不僅費(fèi)時(shí)且結(jié)果易受外界影響。目前，對(duì)痘苗病毒的需求正日益增加。痘苗病毒屬于痘病毒科正痘病毒屬，長(zhǎng)期以來(lái)作為天花疫苗在世界范圍內(nèi)廣泛使用，主要有Lister株、紐約株、天壇株、MVA等。80年代初世界衛(wèi)生組織宣布天花消滅后，天花疫苗停止接種。我國(guó)在1980-1983年間，逐漸停止了天壇株的接種，疫苗的生產(chǎn)也隨即終止。此后，天壇株作為一種新型疫苗載體，構(gòu)建了EBV、HBV、麻疹以及艾滋病重組疫苗。2001年"9.11"事件后，美國(guó)出于生物反恐的需要，在軍隊(duì)和醫(yī)護(hù)人員中重新開(kāi)始天花疫苗接種。包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家也重新開(kāi)始生產(chǎn)天花疫苗作為戰(zhàn)略?xún)?chǔ)備。根據(jù)新頒布的《中國(guó)藥典三部》(2005),天花疫苗和以痘苗病毒為載體構(gòu)建的重組疫苗都需要進(jìn)行病毒外源因子檢査。痘病毒的顆粒大小接近常用濾膜0.22Mm的孔徑，例如，痘苗病毒的大小約為270X218nm(《分子病毒學(xué)》，侯云德，22頁(yè))，猴痘病毒大小約為300X150nm，金絲雀痘病毒大小約為320X260nm。而其他容易造成痘病毒制備物被污染的外源病毒遠(yuǎn)小于0.22nm，例如腺病毒直徑約為7090nrn，雞白血病病毒直徑約為80130nm，皰疹病毒直徑約為110180nm。在痘病毒的特異性抗血清中含有中和抗體和結(jié)合抗體，盡管中和抗體不能完全中和病毒，但結(jié)合抗體仍然能夠與未被中和的病毒相結(jié)合。將經(jīng)適當(dāng)稀釋的病毒與特異性抗血清混合、孵育后，抗體與病毒結(jié)合形成病毒/抗體復(fù)合物，該復(fù)合物的大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.22pm的孔徑，因此不能通過(guò)孔徑約0.22pm的濾膜。而其他外源病毒因?yàn)闊o(wú)抗體結(jié)合將仍然能夠被孔徑約0.22miti的濾膜濾過(guò)。將痘病毒或其重組病毒制備物與特異性抗血清中和后，經(jīng)孔徑約0.22拜的濾膜過(guò)濾；過(guò)濾后，除痘病毒外其他可能存在的外源病毒將仍存在于濾液中；再將濾液接種不同種類(lèi)的細(xì)胞，如果發(fā)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象，則說(shuō)明痘病毒或其重組病毒制備物存在外源病毒的污染，如果接種后不發(fā)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象，則說(shuō)明痘病毒或其重組病毒制備物不存在外源病毒的污染。本發(fā)明的方法可以對(duì)痘病毒或其重組病毒制備物在細(xì)胞上進(jìn)行外源病毒的檢查。與傳統(tǒng)的細(xì)胞法相比較，本發(fā)明的方法在中和步驟之后，增加了過(guò)濾的步驟。具體地，可按照如下實(shí)施本發(fā)明的方法將適當(dāng)稀釋的痘病毒或其重組病毒制備物與特異性抗血清混勻，進(jìn)行中和；將中和后的病毒懸液經(jīng)適當(dāng)孔徑的濾膜過(guò)濾；以及將濾液接種細(xì)胞，其中所接種的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象表明所述痘病毒或其重組病毒制備物存在外源病毒的污染。為保證約0.22^im孔徑的濾膜能夠?qū)?jīng)特異性抗血清中和后的病毒懸液順利地進(jìn)行過(guò)濾，防止作為培養(yǎng)基質(zhì)的細(xì)胞的碎片阻塞濾孔，可以在實(shí)施中和步驟之前，采用適當(dāng)孔徑的濾膜先對(duì)經(jīng)稀釋的痘病毒制備物進(jìn)行過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片。用以除去細(xì)胞碎片的濾膜的孔徑的選擇原則是既能保證除去細(xì)胞碎片，又保證痘病毒制備物中的痘病毒及其他外源病毒能順利通過(guò)該濾膜，因此濾膜孔徑應(yīng)大于0.22|im?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的用以除去細(xì)胞碎片的濾膜例如有Coring公司濾膜孔徑為0.45nm的針式濾器。在本發(fā)明的方法中，病毒滴度與抗血清血抑效價(jià)優(yōu)選在一定比例范圍內(nèi)進(jìn)行，決定該比例的原則是抗血清中的抗體與病毒的比例應(yīng)該大于l。不同來(lái)源的抗血清的效價(jià)通常不相同，當(dāng)效價(jià)不同時(shí)，抗血清的稀釋比例也不同；相應(yīng)地，病毒的稀釋度也不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)的試驗(yàn)容易地確定適當(dāng)?shù)亩徊《鞠♂尪?，以及病毒稀釋度與特異性抗血清的稀釋度之間的配合比例。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，痘病毒被稀釋至終濃度2X1058X105PFU/ml，血抑效價(jià)為1:5120的特異性抗血清被稀釋20-100倍；且經(jīng)稀釋的痘病毒與經(jīng)稀釋的特異性抗血清被等體積混勻，進(jìn)行中和反應(yīng)。對(duì)中和后的病毒懸液進(jìn)行過(guò)濾的濾膜的孔徑的大小應(yīng)接近0.22^im。這樣，除痘病毒外的其它外源病毒由于其顆粒大小遠(yuǎn)小于該孔徑，將被完全過(guò)濾到濾液中；而大于該孔徑的痘病毒或其重組病毒/抗體復(fù)合物將被完全留在濾膜上。對(duì)中和后的病毒懸液進(jìn)行過(guò)濾的濾膜例如有Coring公司濾膜孔徑為0.22jmi的針式濾器。在本發(fā)明的方法中，可將中和后的病毒懸液經(jīng)過(guò)濾后所得的濾液接種細(xì)胞。接種的細(xì)胞種類(lèi)可以包括1)生產(chǎn)痘病毒制備物所用的細(xì)胞，例如CEF細(xì)胞；2)人^I的貼壁細(xì)胞，例如Hela細(xì)胞；3)猴源的貼壁細(xì)胞，例如Vero細(xì)胞。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的非限制性闡述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明的精神的范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行各種變形和修飾。實(shí)施例中所使用的通用材料痘苗病毒vTT制備物自制，將痘苗病毒vTT接種CEF細(xì)胞，于37。C培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融三次即獲得痘苗病毒vTT制備物。兔源vTT特異性抗血清自制，用痘苗病毒vTT免疫新西蘭白兔，2個(gè)月后采兔血，待血液凝固后，吸取血清即獲得兔源vTT特異性抗血清。病毒稀釋液含10°/。小牛血清的Eargle，s液(Gibco公司)10%雞血球自制，采敏感雞血放入ALSERVER，S液中，離心，漂洗，然后按照l(shuí):IO加入生理鹽水，即配得10%雞血球。健康兔血清采集健康兔血，待血液凝固后，吸取血清，56X:滅活30min即獲得健康兔血清。實(shí)施例l:中和實(shí)驗(yàn)(1)材料痘苗病毒vTT制備物1.5X107PFU/ml兔源vTT特異性抗血清血抑效價(jià)l:5120，56'C滅活30min(2)實(shí)驗(yàn)步驟1)將兔源vTT特異性抗血清用PBS(0.01M，pH7.2~7.4)進(jìn)行20X、50X、IOOX、500X、IOOOX稀釋?zhuān)粚⒍幻绮《緑TT制備物用病毒稀釋液稀釋成100PFU/ml、1000PFU/ml、10000PFU/ml。2)將2ml不同稀釋度的痘苗病毒vTT制備物分別與2ml病毒稀釋液混勻后放置于4'C過(guò)夜，作為無(wú)血清對(duì)照組P、Q、R(分別對(duì)應(yīng)于100PFU/ml、1000PFU/ml、10000PFU/ml的病毒滴度)。將不同稀釋度的痘苗病毒vTT制備物分別與不同稀釋度的特異性抗血清等體積混勻，于4'C放置過(guò)夜進(jìn)行中和，制得vTT+特異性抗血清組A-0(見(jiàn)下表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3)血球吸附法測(cè)定病毒滴度a.將上述無(wú)血清對(duì)照組(P、Q、R)及vTT+特異性抗血清組(A-O)各2ml分別用病毒稀釋液作10倍連續(xù)稀釋?zhuān)都懊總€(gè)稀釋度取0.3ml分別與2.7mlCEF細(xì)胞懸液(1X106個(gè)CEF細(xì)胞/ml)充分混勻后，加入24孔板，每孔lml，每個(gè)稀釋度3個(gè)復(fù)孔，然后放置于37匸孵箱培養(yǎng)6872小時(shí)。b.向每孔中加入10%雞血球0.5ml以完全覆蓋CEF細(xì)胞，于室溫放置30分鐘。c.標(biāo)示出無(wú)血清對(duì)照組及各vTT+特異性抗血清組中可見(jiàn)血吸點(diǎn)的最高稀釋度孔，肉眼計(jì)數(shù)孔內(nèi)血吸點(diǎn)數(shù)，并計(jì)算各組中3個(gè)復(fù)孔的平均血吸點(diǎn)，結(jié)果示于下表2表2原病毒滴度vTT+特異性抗血清組中可見(jiàn)血吸點(diǎn)的最高稀釋度孔的平均血吸點(diǎn)無(wú)血清對(duì)照組(PFU/ml)20X50X100X500X,x平均血吸點(diǎn)1000000(原倍)"0.3(原倍)4.41000(原倍)0.3(原倍)0.6(原倍)0.6(原倍)3.2(原倍)2.8(1(T1)3.210000(原倍)4.4(原倍)4.0(原倍)3.6(l(T')1.6(10—')2.7(10_2)'2.4l表示可見(jiàn)血吸點(diǎn)的最高稀釋度孔中的各組被病毒稀釋液稀釋的倍數(shù)d.按如下公式計(jì)算病毒滴度病毒滴度(PFU/ml)二平均血吸點(diǎn)X病毒稀釋倍數(shù)/0.1ml在上述公式中，"病毒稀釋倍數(shù)"指各無(wú)血清對(duì)照組及vTT+特異性抗血清組被病毒稀釋液稀釋的倍數(shù)；"0.1ml"為每孔中混合液的體積。病毒滴度結(jié)果示于下表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4)按下列公式計(jì)算中和率中和率=(對(duì)照組病毒滴度一vTT+特異性抗血清組病毒滴度)/對(duì)照組病毒滴度在上述公式中，vTT+特異性抗血清組A-E對(duì)應(yīng)于對(duì)照組P;vTT+特異性抗血清組F-J對(duì)應(yīng)于對(duì)照組Q;vTT+特異性抗血清組K-0對(duì)應(yīng)于對(duì)照組R。中和率(％)的計(jì)算結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)下表4表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)以上結(jié)果可以看出，vTT僅在100PFU/ml可以被高效價(jià)血清中和，隨著病毒滴度的升高，中和效率逐漸降低。而100PFU/ml的滴度很低，不符合《中國(guó)藥典三部》(2005)中關(guān)于病毒外源因子檢查對(duì)病毒濃度的要求。實(shí)施例2:痘苗病毒vTT制備物的中和、過(guò)濾實(shí)驗(yàn)(1)材料痘苗病毒vTT制備物1.5X107PFU/ml。兔源vTT特異性抗血清血抑效價(jià)l:5120，56。C滅活30min。(2)實(shí)驗(yàn)步驟A.將兔源vTT特異性抗血清用PBS(0.01M,pH7.27.4)進(jìn)行50X稀釋。B.將痘苗病毒vTT制備物用病毒稀釋液稀釋成4X105PFU/ml，用0.45pm的濾膜過(guò)濾，以除去病毒制備物中的細(xì)胞碎片。C.中和無(wú)血清對(duì)照組將稀釋后的痘苗病毒vTT制備物與病毒稀釋液等體積混勻后放置于4'C過(guò)夜，終體積30ml;vTT+特異性抗血清組將稀釋后的vTT與稀釋的特異性抗血清等體積混勻后放置于4'C過(guò)夜，終體積30ml;D.過(guò)濾無(wú)血清對(duì)照組和vTT+特異性抗血清組各取15ml用0.22pm濾膜過(guò)濾。其余樣品不過(guò)濾，備用。E.接種細(xì)胞用無(wú)血清對(duì)照組和vTT+特異性抗血清組的過(guò)濾及未過(guò)濾樣品分別接種CEF細(xì)胞(25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞90%成片)，每種樣品接種3瓶細(xì)胞，每瓶接種2ml。37"C培養(yǎng)，觀察。F.結(jié)果培養(yǎng)72小時(shí)后，只有vTT+特異性抗血清組且過(guò)濾的樣品沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病變(圖1)，vTT+特異性抗血清組未過(guò)濾的樣品及經(jīng)過(guò)濾的無(wú)血清對(duì)照組均出現(xiàn)細(xì)胞病變(圖2A，圖3A)。對(duì)各組中的病變細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，方法如下a)傾去細(xì)胞培養(yǎng)物上清，用甲醇丙酮(1:1)混合溶液固定細(xì)胞2min，然后用PBS(0.01M,pH7.2~7.4)漂洗兩次。b)加入一抗(一抗為兔源vTT抗血清，用含3。/。胎牛血清的PBS稀釋一抗，稀釋度為1:100)，在搖擺平臺(tái)上于室溫孵育1小時(shí)。然后，用PBS(0.01M,pH7.27.4)漂洗兩次，每次2min。c)加入熒光標(biāo)記的第二抗體(GoatF(ab，)2FragmentAnti-rabbitIgG(H+L)-TRITC，BD公司，Cat:54546.1,l:200稀釋)，在搖擺平臺(tái)上室溫孵育30-45min。d)PBS漂洗兩次，每次2min。熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。觀察結(jié)果顯示，病變部位均有特異性免疫熒光(圖2B,圖3B)，證實(shí)病變是由痘苗病毒感染所致。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，痘苗病毒vTT可以通過(guò)0.22mjti濾膜，而與特異性抗血清結(jié)合后不能通過(guò)0.22拜的濾膜。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)利用孔徑為約0.22pm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾可以去除不能被特異性抗血清中和的痘苗病毒，從而使得可以在細(xì)胞上進(jìn)行痘苗病毒制備物的外源病毒污染物的檢查。實(shí)施例3:重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗的外源因子檢查(1)材料重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00610007567.7):2.2X107PFU/ml。兔源vTT特異性抗血清血抑效價(jià)l:5120,56'C滅活30min(2)實(shí)驗(yàn)步驟A.將兔源vTT特異性抗血清用PBS(0.01M,pH7.27.4)進(jìn)行50X稀釋。B.將重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4用病毒稀釋液稀釋成4X105PFU/ml，經(jīng)0.45nm的濾膜過(guò)濾，除去病毒液中的細(xì)胞碎片。C.中和將20ml經(jīng)稀釋的7A2-4與20ml經(jīng)稀釋的兔源vTT特異性抗血清混勻后放置于4'C過(guò)夜，進(jìn)行中和反應(yīng)。D.過(guò)濾將中和后的病毒/血清混合懸液用0.22pm濾膜過(guò)濾。E.接種細(xì)胞用濾液接種CEF細(xì)胞、Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞，每種細(xì)胞各接種6瓶，每瓶接種2ml。置37'C培養(yǎng)14天。F.同時(shí)設(shè)立3種細(xì)胞對(duì)照，每種細(xì)胞2瓶不接種任何濾液。置37'C培養(yǎng)14天。G.血球吸附外源因子檢查按2000年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》通則中"生物制品病毒外源因子檢查規(guī)程"進(jìn)行。在培養(yǎng)的6~8天和14天，接種濾液的3種細(xì)胞各取2瓶，3種細(xì)胞對(duì)照各取1瓶進(jìn)行血球吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示接種濾液的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞均未見(jiàn)血吸點(diǎn)。非血球吸附外源因子檢查按2000年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》通則"生物制品病毒外源因子檢測(cè)規(guī)程"進(jìn)行。結(jié)果顯示，培養(yǎng)14天后，3種被接種的細(xì)胞均未見(jiàn)細(xì)胞病變。以上檢查結(jié)果顯示，重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗7A2-4不存在外源病毒污染。權(quán)利要求1.一種檢查痘病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的方法，該方法包括以下步驟a)將待檢痘病毒或其重組病毒制備物用對(duì)應(yīng)的痘病毒特異性抗血清進(jìn)行中和；b)將中和后的病毒懸液經(jīng)濾膜過(guò)濾；和c)將濾液接種細(xì)胞，其中所接種的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象表明所述痘病毒或其重組病毒制備物存在外源病毒的污染。2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟a)之前用濾膜對(duì)待檢痘病毒或其重組病毒制備物進(jìn)行過(guò)濾以除去制備物中的細(xì)胞碎片的步驟。3.權(quán)利要求2的方法，其中用以除去制備物中的細(xì)胞碎片的步驟中所使用的濾膜的孔徑大于0.22pm。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)中所用濾膜的孔徑為約0.22nm。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述痘病毒是痘苗病毒。全文摘要本發(fā)明涉及檢查痘病毒或其重組病毒、特別是痘苗病毒或其重組病毒制備物中的外源病毒污染物的方法。所述方法包括以下步驟將待檢痘病毒或其重組病毒制備物用對(duì)應(yīng)的痘病毒特異性抗血清進(jìn)行中和；經(jīng)合適孔徑的濾膜對(duì)中和后的病毒懸液進(jìn)行過(guò)濾；和將濾液接種細(xì)胞，其中所接種的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變或血球吸附現(xiàn)象表明所述待檢痘病毒或其重組病毒制備物存在外源病毒的污染。文檔編號(hào)G01N33/48GK101387635SQ200710148950公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2007年9月12日優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日發(fā)明者穎劉,段丹麗,邵一鳴申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心