一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重pcr檢測引物、試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測引物、試劑盒和檢測方法。該方法為羊口瘡病毒和羊痘病毒的診斷提供了一種快速檢測方法，尤其是檢測羊痘病毒的PCR引物涉及了羊痘病毒屬所有成員，包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒，使得該檢測方法凸顯集成性、高通量性等特點，為羊口瘡病毒和羊痘病毒的診斷、流行病毒調查、防控及治療提供技術支持與幫助。本發(fā)明方法具有特異性強、敏感性高、省時省力的優(yōu)點。
【專利說明】
一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測引物、試劑盒和檢測方法
技術領域
[0001]本發(fā)明具體涉及一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測引物、試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002]據(jù)統(tǒng)計，2016年I月I日生效的世界動物衛(wèi)生組織(OIE)最新法定動物傳染病共118種，其中能感染多種物種的25種，牛病14種、羊病和馬病各11種、禽病13種、豬病6種。據(jù)美國食品安全與公共衛(wèi)生中心統(tǒng)計，在這118種動物傳染病中，有69種人獸共患病，約占58.5%。人獸共患病不僅危害國家畜牧業(yè)健康發(fā)展，而且關系到人民百姓食品安全和公共衛(wèi)生安全、關系社會和諧穩(wěn)定，是獸醫(yī)科技人員研究的熱點。目前，我國分別把羊痘和羊口瘡列為一類動物疫病和三類動物疫病。
[0003]羊痘，由羊痘病毒屬的羊痘病毒(Capripoxvirus，CaPV)感染引起山羊、綿羊和人等的急性、熱性、接觸性的人獸共患傳染病，以皮膚和粘膜發(fā)生痘疹為特征，病羊有較高的死亡率，常引起嚴重的經濟損失。牛疙瘩皮膚病由牛疙瘩病毒感染引起，病牛主要表現(xiàn)為發(fā)熱和皮膚變硬、長疙瘩、形成膿皰等，影響牛只的外表，以致影響牛只的銷售，經濟損失也很嚴重。該病毒也是羊痘病毒屬成員，與山羊痘和綿羊痘病毒有一定的交叉免疫保護反應，臨床上可以用羊痘疫苗進行預防。牛疙瘩皮膚病于1929年發(fā)現(xiàn)于非洲，隨后迅速傳播到世界其它地區(qū)。我國于1989年正式報道分離出這種病毒，在我國也分布廣泛。
[0004]廣義上的羊痘病毒包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒和牛疙瘩皮膚病病毒，它能引起山羊痘、綿羊痘和牛的結節(jié)性疹塊病。由于分離于不同的動物，叫法不一樣。
[0005]羊口瘡，又稱為羊傳染性膿皰，是由副痘病毒屬羊口瘡病毒(Orf virus，0RFV)引起的綿羊、山羊和人等的一種急性、接觸性和嗜上皮性的人獸共患傳染病，以感染動物或人類口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結成疣狀結痂為特征。該病最早在歐洲發(fā)現(xiàn)，目前，幾乎所用的養(yǎng)羊國家和地區(qū)都有該病的流行。不同地區(qū)分離的病毒抗原性不完全一致。本病多發(fā)于羔羊，常呈群發(fā)性，發(fā)病率可高達100%，由于羔羊嘴巴生瘡疼痛，加上年齡小，無法采食及飲水，導致羔羊的大量死亡。疫區(qū)的成年羊多有一定的抵抗力，但肺炎性的羊只多以死亡轉歸。此外，駱駝、牛、鹿、麝牛、貓、幼犬、猴也易感。近年來，隨著肉羊產業(yè)的發(fā)展及羊只的頻繁調運，該病傳播迅速，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經濟損失，嚴重危害了肉羊產業(yè)的健康發(fā)展。更為嚴重的是，此病可以通過傷口感染養(yǎng)殖場飼養(yǎng)員、獸醫(yī)，感染者表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。
[0006]目前，羊痘和羊口瘡混合感染嚴重，臨床上很難區(qū)分，給預防與治療帶來挑戰(zhàn)。研發(fā)出鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的檢測方法和試劑盒，具有重大意義，可以節(jié)約診斷時間、診斷試劑以及人力成本。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于運用分子生物學、生物信息學等方法進行引物設計、序列比對及反應體系優(yōu)化，構建一種同時鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測方法和試劑盒， 實現(xiàn)羊口瘡病毒和羊痘病毒“一樣兩檢”的快速檢測效果。
[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測引物，其核苷酸序列如下所示: ORFV-F: CATCATTGCCGTTTACCTCAGA(SEQ ID N0:1)或者CATCATTGCCGTTTACTTCAGA(SEQ ID N0:2)；ORFV-R: TAAGATCYGTGTCGTGTATTCC(SEQ ID ID N0:4)；CaPV-F: CTGGAAGCAAGTGGTAACGGAATACSEQ ID NO:5)；CaPV-R: AACGATACGAAGGAAATGTGGGCSEQ ID N0:6)〇
[0009]—種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含上述檢測引物。
[0010]—種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測方法，包括下列步驟:1)從樣品中提取病毒核酸；2)以核酸為模板，用上述所述的引物對進行PCR擴增反應獲得擴增產物；3)將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，確定病毒類型。
[0011]優(yōu)選的，步驟2)中PCR擴增反應體系為:2XTaq PCR Master Mix 25此，引物01^^_ F、0RFV-R、CaPV-F和CaPV-R各1 yL，病毒核酸模板5-10yL，余量水，總體積為50yL。[0〇12]優(yōu)選的，步驟2)中PCR反應程序:95°C預變性5min; 95 °C變性30s，64°C退火30s，72。(:延伸30s，共計40個循環(huán);72°C終延伸lOmin。[〇〇13]優(yōu)選的，步驟3)中在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，如果僅含有603bp大小的片段，則判定待檢測樣品為羊口瘡病毒;如果僅含有325bp大小的片段，則判定待檢測樣品為羊痘病毒;如果同時含有上述兩種大小的片段，則判定待檢測樣品中既含有羊口瘡病毒，又含有羊痘病毒。[〇〇14]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明公開了可以同時檢測羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR方法和試劑盒，具有特異性強、敏感性高、省時省力等優(yōu)點。該方法為羊口瘡病毒和羊痘病毒的診斷提供一種快速檢測方法，尤其是檢測羊痘病毒的PCR引物涉及了羊痘病毒屬所有成員(山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒)，使得該檢測方法凸顯集成性、高通量性等特點，為羊口瘡病毒和羊痘病毒的診斷、流行病毒調查、防控及治療提供一定的技術支持與幫助。
[0015]本發(fā)明所述的應用或者檢測方法不僅僅用于牛羊養(yǎng)殖場的臨床樣品檢測，還可以應用于城市動物園、野生動物園中的反芻動物樣品以及疑似感染的其他動物樣品檢測。【附圖說明】
[0016]圖1是特異性試驗結果；泳道M: DNA Marker 2000;泳道1:0RFV陽性質粒；泳道2: CaPV陽性質粒;泳道3: ORFV+CaPV陽性質粒;泳道4:牛病毒性腹瀉與粘膜病病毒核酸;泳道 5:藍舌病病毒核酸;泳道6:小反芻獸疫病毒核酸;泳道7:雞痘病毒核酸;泳道8: 口蹄疫病毒核酸；
圖2 二重PCR敏感性結果。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0018]材料和方法
羊口瘡病毒活疫苗和羊痘病毒活疫苗分別購自山東泰豐生物制品有限公司和哈藥集團生物疫苗有限公司。牛病毒性腹寫與粘膜病病毒毒株、藍舌病病毒毒株、羊口瘡病毒和羊痘病毒陽性重組質粒由廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所制備保存。此外，雞痘病毒疫苗購自廣東永順生物制藥股份有限公司，口蹄疫O型+亞洲I型+A型三價滅活疫苗購自中農威特生物科技股份有限公司，小反芻獸疫苗購自新疆天康生物技術股份有限公司。
[0019]主要試劑
DNA/RNA提取試劑盒購自Axygen，PCR試劑購自北京天根公司及DNA Marker 2000購自Takara公司。
[0020]實施例1引物設計
根據(jù)GenBank中羊口瘡病毒、山羊痘病毒、綿羊痘病毒和牛皰瘡皮膚病病毒的基因組序列，設計2對引物，其中ORFV引物對可以最大限度的覆蓋更多的羊口瘡病毒;CaPV引物對可以擴增山羊痘病毒、綿羊痘病毒和牛疙瘩皮膚病病毒等三種病毒。其堿基序列如下所示。
[0021]ORFV-F: CATCATTGCCGTTTACCTCAGACSEQ ID NO:1)或者CATCATTGCCGTTTACTTCAGA(SEQ ID N0:2)；
ORFV-R: TAAGATCYGTGTCGTGTATTCCCSEQ ID N0:3)或者TAAGTTCYGTGTCGTGTATTCC(SEQID N0:4)；
CaPV-F: CTGGAAGCAAGTGGTAACGGAATA(SEQ ID NO:5);
CaPV-R: AACGATACGAAGGAAATGTGGG(SEQ ID N0:6)。
[0022]實施例2 二重PCR檢測方法 DDNA的提取
按照Axygen公司的DNA/RNA提取試劑盒說明書進行病毒核酸的提取。
[0023]2) 二重PCR擴增反應
以羊口瘡病毒和(或)羊痘病毒核酸混合物為二重PCR的模板，建立二重PCR檢測方法。采用 50yL PCR 反應體系:2XTaq PCR Master Mix 25yL，引物ORFV-F、ORFV-R、CaPV-F和CaPV-R各I yL，ORFV和CaPV模板分別5yL，滅菌H2O IlyL0
[0024]PCR反應程序:95°C預變性5min;95°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，共計40個循環(huán);72 °C終延伸I Omin。
[0025]結果觀察:取30yLPCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。
[0026]實施例3特異性試驗
按照實施例2的方法，利用二重PCR檢測方法對羊口瘡病毒、羊痘病毒陽性重組質粒及小反芻獸疫病毒、牛病毒性腹瀉與粘膜病病毒、藍舌病病毒、雞痘病毒、口蹄疫病毒進行檢測。
[0027] 結果見圖1。泳道M: DNA Marker 2000;1:0RFV陽性質粒；2: CaPV陽性質粒；3: ORFV+CaPV陽性質粒;4:牛病毒性腹瀉與粘膜病病毒核酸;5:藍舌病病毒核酸;6:小反芻獸疫病毒核酸;7:雞痘病毒核酸;8: 口蹄疫病毒核酸。
[0028]由圖1可知:采用優(yōu)化好的二重PCR檢測方法對羊口瘡病毒和羊痘病毒陽性重組質粒及混合液進行擴增，結果獲得大小約為600bp及300bp的片段，與測序結果603bp和325bp 的片段相吻合。而小反芻獸疫病毒、牛病毒性腹瀉與粘膜病病毒、藍舌病病毒、雞痘病毒、口蹄疫病毒等核酸擴增后未呈現(xiàn)條帶，表明該方法具有較好的特異性。
[0029]實施例4敏感性試驗分別測定羊口瘡病毒和(或)羊痘病毒陽性重組質粒的模板濃度，然后進行倍比稀釋， 來測定該方法的敏感性。結果見圖2,其中泳道M: DNA Marker 2000;泳道1-10:陽性質粒按照101倍、1〇2倍、1〇3倍、1〇4倍、1〇5倍、1〇6倍、1〇7倍、1〇8倍、1〇9倍、101°倍比稀釋結果。
[0030]經檢測，優(yōu)化后的二重PCR對羊口瘡病毒和羊痘病毒的敏感性分別為8.572 pg/ml (0RFV)和15.44pg/ml(CaPV)。[〇〇31]實施例5臨床樣品檢測試驗對采集的20份疑似羊口瘡或羊痘的樣本進行檢測，結果顯示0RFV核酸陽性10份、CaPV 核酸陽性3份，其中有2份為0RFV和CaPV混合感染。進一步經核酸測序，確定上述結果完全正確，準確率為100%。
[0032]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測引物，其核苷酸序列如下所示: ORFV-F: CATCATTGCCGTTTACCTCAGA(SEQ ID N0:1)或者CATCATTGCCGTTTACTTCAGA(SEQID N0:2)；ORFV-R: TAAGATCYGTGTCGTGTATTCC(SEQ ID ID N0:4)；CaPV-F: CTGGAAGCAAGTGGTAACGGAATACSEQ ID NO:5)；CaPV-R: AACGATACGAAGGAAATGTGGGCSEQ ID N0:6)〇2.—種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒 包含權利要求1所述的檢測引物。3.—種用于鑒別羊口瘡病毒和羊痘病毒的二重PCR檢測方法，其特征在于，包括下列步 驟:1)從樣品中提取病毒核酸；2)以核酸為模板，用權利要求1所述的引物對進行PCR擴增反應獲得擴增產物；3)將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，確定病毒類型。4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中PCR擴增反應體系為:2 X Taq PCR Master Mix 25yL，引物ORFV-F、ORFV-R、CaPV-F和CaPV-R各 1 yL，病毒核酸模板5-10y L，余量水，總體積為50yL。5.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中PCR反應程序:95°C預變性 5min;95°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，共計40個循環(huán)；72°C終延伸lOmin。6.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟3)中在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結 果，如果僅含有603bp大小的片段，則判定待檢測樣品為羊口瘡病毒;如果僅含有325bp大小 的片段，則判定待檢測樣品為羊痘病毒;如果同時含有上述兩種大小的片段，則判定待檢測 樣品中既含有羊口瘡病毒，又含有羊痘病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086232SQ201610397352
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月6日 公開號201610397352.4, CN 106086232 A, CN 106086232A, CN 201610397352, CN-A-106086232, CN106086232 A, CN106086232A, CN201610397352, CN201610397352.4
【發(fā)明人】翟少倫, 溫肖會, 呂殿紅, 魏文康, 賈春玲, 周秀蓉
【申請人】廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所