一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法利用水痘病毒感染單層細(xì)胞初期，在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并大量表達(dá)與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白，通過免疫反應(yīng)的方法，確定感染病灶，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算所述水痘病毒滴度。該方法大大縮短了傳統(tǒng)滴度測(cè)定法，即蝕斑法，的測(cè)定時(shí)間，是一種快速、靈敏的檢測(cè)水痘病毒滴度的方法。
【專利說明】一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水痘是一種常見、多發(fā)、有高度接觸傳播性的兒童急性傳染病，15歲以下少兒家庭 內(nèi)接觸感染率為61 %?87 %，少數(shù)研究報(bào)道家庭內(nèi)接觸感染率甚至可達(dá)92 %?100 %。由 于兒童期水痘發(fā)病絕大多數(shù)癥狀輕微，過去常不被人們所重視，但患水痘后處理不當(dāng)，會(huì)并 發(fā)肺炎、腦炎等嚴(yán)重疾病，甚至死亡，且感染后潛伏在體內(nèi)，激活后又可發(fā)生帶狀皰疹。我國 兒童水痘的發(fā)病和危害日益凸顯，接種水痘疫苗是目前控制水痘感染與流行的有效手段。
[0003] 水痘病毒屬皰疫病毒科a皰疫病毒亞科成員。病毒顆粒呈球形，直徑180nm? 200nm，為橢圓形顆粒，由帶有糖蛋白突起的脂質(zhì)包膜和和一個(gè)含雙鏈DNA基因組的核衣殼 組成。病毒核衣殼是由162個(gè)殼微粒組成的對(duì)稱20面體，殼外有一層或多層的含脂蛋白的 包膜。包膜上的糖蛋白至少有8種^￡^8^1141^(：41^1(及§11。糖蛋白主要存在于病 毒囊膜和感染細(xì)胞的包膜中，與病毒的致病性和免疫原性有著密切關(guān)系。糖蛋白的結(jié)構(gòu)和 分子量都已清楚，病毒糖蛋白gE、gB、gC均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。gE的分子量最大，在 病毒包膜上含量最高，是病毒主要抗原，也是制備病毒亞單位疫苗和DNA疫苗的主要候選 抗原。糖蛋白gE (也稱gp I)，分子質(zhì)量為60?98kDa，是水痘病毒囊膜和感染細(xì)胞膜上含 量最豐富、抗原性最強(qiáng)的糖蛋白，具有典型的I型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。
[0004] 目前病毒滴度是表觀水痘疫苗質(zhì)量的主要指標(biāo)，也是生產(chǎn)過程中水痘疫苗原液和 成品的主要檢測(cè)項(xiàng)目。滴度傳統(tǒng)檢測(cè)方法為蝕斑法（單層法），其操作步驟為：
[0005] (1) 6孔板接種細(xì)胞將濃度IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種6孔板，每孔3ml，置25? 45°C CO2孵箱培養(yǎng)。一般3天，細(xì)胞長成單層，接種病毒。
[0006] (2)6孔板接種病毒將疫苗按適當(dāng)比例用病毒釋液稀釋。將細(xì)胞長成單層的6孔 板，吸去細(xì)胞生長液，加入稀釋后的病毒液，0. Iml/孔，置25?45°C，CO2孵箱吸附90min， 中間輕搖6孔板2?3次，吸附完畢后，加入細(xì)胞維持液，3ml/孔，置25?45°C，CO2孵箱培 養(yǎng)。7天后染色，判定結(jié)果。
[0007] 水痘帶狀皰疹病毒極不穩(wěn)定，不能在結(jié)痂或污染物中長期存活。病毒感染也僅限 于很窄的pH范圍，pH < 6. 2或pH > 7. 8時(shí)即喪失感染性。水痘病毒對(duì)溫度同樣敏感，無穩(wěn) 定劑的條件下很快喪失感染性。目前一般水痘疫苗生產(chǎn)企業(yè)需要獲得原液后，-80°C凍存， 待滴度檢測(cè)結(jié)果出來以后再進(jìn)行配制凍干。期間需要等待至少7天時(shí)間。
[0008] 因此，目前急需一種能夠快速、靈敏檢測(cè)水痘病毒滴度的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速、靈敏檢測(cè)水痘病毒滴度的方法。所述檢測(cè)方 法利用水痘病毒感染單層細(xì)胞初期，在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并大量表達(dá)與病毒致病性相關(guān)的水 痘病毒包膜糖蛋白，通過免疫反應(yīng)的方法，確定感染病灶，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算所述 水痘病毒滴度。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法利用水痘病毒感染單層細(xì)胞初 期，在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并大量表達(dá)與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白，通過免疫反 應(yīng)的方法，確定感染病灶，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算所述水痘病毒滴度；
[0012] 所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0013] 1)病毒接種
[0014] 取人正常胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞），鋪滿96孔板單層，將待測(cè)水痘病毒樣品 做梯度稀釋，取2?4孔為一組，每組加同一濃度所述水痘病毒稀釋液25ul，同時(shí)做平行孔 和陰性對(duì)照孔，輕輕搖動(dòng)平板使所述水痘病毒均勻地分布，25?45°C，吸附30?90分鐘， 棄去孔內(nèi)液體，加入甲基纖維素溶液，25?45°C孵育43?47小時(shí)；
[0015] 2)滴度測(cè)定
[0016] 向經(jīng)過上述經(jīng)病毒接種的每孔以及平行孔和陰性對(duì)照孔內(nèi)，加入新配制預(yù)冷甲醛 丙酮緩沖液，室溫放置5?20分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，每孔加入洗液，洗滌 1?5次，再加入普通山羊血清封閉，室溫放置2?8分鐘，棄去液體，輕輕拍干，加入小鼠抗 水痘病毒包膜糖蛋白單克隆抗體，25?45°C孵育20?40分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙紙 上輕拍，洗滌1?5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，在25?45°C孵育20?40分鐘， 棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙紙上輕拍，洗滌1?5次，加入TMB顯色底物，并在室溫下避光孵育 1?4小時(shí)；
[0017] 3)滴度計(jì)算
[0018] 使用光學(xué)顯微鏡觀察，判定經(jīng)上述處理后每孔的病灶數(shù)，接種同一稀釋度的孔病 灶數(shù)取平均值，所述病毒滴度計(jì)算公式為：
[0019] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶數(shù)X稀釋倍數(shù)X40(lml + 25ul)。
[0020] 進(jìn)一步的，所述的與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白為糖蛋白gE、gB、gH 中的一種。
[0021] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0022] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gB的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0023] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gH的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述的甲醛丙酮緩沖液為PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述 PBS、甲醛和丙酮的體積比為：
[0025] PBS 1. 2
[0026] 甲醛 1.0
[0027] 丙酮 1.8。
[0028] 進(jìn)一步的，所述的甲醛丙酮緩沖液配置后在_20°C放置3小時(shí)以上再使用。
[0029] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述的洗液為PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的 濃度為〇.〇1?〇. 1%，其優(yōu)選濃度為〇.〇5%。
[0030] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：
[0031] 1、傳統(tǒng)的蝕斑法經(jīng)過7天時(shí)間形成蝕斑，然后染色觀察，計(jì)數(shù)再計(jì)算病毒滴度，此 方法耗時(shí)較長，加上前期準(zhǔn)備細(xì)胞時(shí)間一共需要10天，而本發(fā)明所述的檢測(cè)方法得出結(jié)果 僅需2天就能測(cè)出水痘病毒滴度，相比傳統(tǒng)蝕斑法（10天）大大縮短檢測(cè)周期，提高檢測(cè)效 率，同時(shí)也輔助縮短生產(chǎn)周期；
[0032] 2、本發(fā)明在節(jié)約檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，也保持了較高的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法利用水痘病毒感染單層細(xì)胞初 期，在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并大量表達(dá)與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白，通過免疫反 應(yīng)的方法，確定感染病灶，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算所述水痘病毒滴度；
[0035] 所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0036] 1)病毒接種
[0037] 取人正常胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞），鋪滿96孔板單層，將待測(cè)水痘病毒樣品 做梯度稀釋，取2?4孔為一組，每組加同一濃度所述水痘病毒稀釋液25ul，同時(shí)做平行孔 和陰性對(duì)照孔，輕輕搖動(dòng)平板使所述水痘病毒均勻地分布，25?45°C，吸附30?90分鐘， 棄去孔內(nèi)液體，加入甲基纖維素溶液，25?45°C孵育43?47小時(shí)；
[0038] 2)滴度測(cè)定
[0039] 向經(jīng)過上述經(jīng)病毒接種的每孔以及平行孔和陰性對(duì)照孔內(nèi)，加入新配制預(yù)冷甲醛 丙酮緩沖液，室溫放置5?20分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，每孔加入洗液，洗滌 1?5次，再加入普通山羊血清封閉，室溫放置2?8分鐘，棄去液體，輕輕拍干，加入小鼠抗 水痘病毒包膜糖蛋白單克隆抗體，25?45°C孵育20?40分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙紙 上輕拍，洗滌1?5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，在25?45°C孵育20?40分鐘， 棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙紙上輕拍，洗滌1?5次，加入TMB顯色底物，并在室溫下避光孵育 1?4小時(shí)；
[0040] 3)滴度計(jì)算
[0041] 使用光學(xué)顯微鏡觀察，判定經(jīng)上述處理后每孔的病灶數(shù)，接種同一稀釋度的孔病 灶數(shù)取平均值，所述病毒滴度計(jì)算公式為：
[0042] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶數(shù)X稀釋倍數(shù)X40(lml + 25ul)。
[0043] 進(jìn)一步的，所述的與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白為糖蛋白gE、gB、gH 中的一種。
[0044] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0045] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gB的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0046] 進(jìn)一步的，所述糖蛋白gH的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0047] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述的甲醛丙酮緩沖液為PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述 PBS、甲醛和丙酮的體積比為：
[0048] PBS 1. 2
[0049] 甲醛 1.0
[0050] 丙酮 1.8。
[0051] 進(jìn)一步的，所述的甲醛丙酮緩沖液配置后在_20°C放置3小時(shí)以上再使用。
[0052] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述的洗液為PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的 濃度為0.01?o. 1%，其優(yōu)選濃度為0.05%。
[0053] 實(shí)施例2
[0054] 本實(shí)施例是實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，所用的原料的品質(zhì)與實(shí)施例1相同，其中 與實(shí)施例1相同的部分不再次重復(fù)，請(qǐng)參照實(shí)施例1。
[0055] 所述水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0056] 1)病毒接種
[0057] 取人正常胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞），鋪滿96孔板單層，每孔3 X IO4個(gè)細(xì)胞， 25?45°C孵育1小時(shí)，用移液器吸出培養(yǎng)基，注意不要掛上細(xì)胞；
[0058] 將待測(cè)水痘病毒樣品做梯度稀釋，取2孔為一組，每組加同一濃度所述水痘病 毒稀釋液25ul，同時(shí)做平行孔和陰性對(duì)照孔，輕輕搖動(dòng)平板使所述水痘病毒均勻地分布， 25?45°C，吸附60分鐘，期間每20分鐘輕輕搖動(dòng)一次；
[0059] 用移液器吸出培養(yǎng)基，注意不要掛上細(xì)胞，加入50 iU甲基纖維素溶液，37°C孵育 43小時(shí)；
[0060] 2)滴度測(cè)定
[0061] 向經(jīng)過上述經(jīng)病毒接種的每孔以及平行孔和陰性對(duì)照孔內(nèi)，加入150iU新配制 預(yù)冷甲醛丙酮緩沖液，室溫放置10分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，每孔加入200 iil 洗液，洗滌3次，每次5分鐘；
[0062] 再加入50 ii 1普通山羊血清封閉，輕輕搖動(dòng)混勻，室溫放置5分鐘，棄去液體，輕輕 拍干；
[0063] 再加入25 ill小鼠抗水痘病毒包膜糖蛋白gE單克隆抗體，37°C孵育25分鐘，棄去 孔內(nèi)液體，在吸水紙紙上輕拍，每孔加入200 iU洗液，洗滌2次，每次5分鐘；
[0064] 加入50iU HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，在37°C孵育25分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸 水紙紙上輕拍,每孔加入200 ii 1洗液，洗滌2次，每次5分鐘；
[0065] 再加入50 ill TMB顯色底物，并在室溫下避光孵育3小時(shí)；
[0066] 3)滴度計(jì)算
[0067] 使用光學(xué)顯微鏡觀察，判定經(jīng)上述處理后每孔的病灶數(shù)，接種同一稀釋度的孔病 灶數(shù)取平均值，最高稀釋度孔病灶數(shù)為5?25個(gè)時(shí)能得到較準(zhǔn)確的結(jié)果，若病灶數(shù)不在此 范圍內(nèi)，需改變樣品稀釋倍數(shù)稀釋重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
[0068] 所述病毒滴度計(jì)算公式為：
[0069] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶數(shù)X稀釋倍數(shù)X40(lml + 25ul)。
[0070] 帶入數(shù)據(jù)即可，如最高100倍稀釋，平均病灶數(shù)為10
[0071] 病毒滴度（PFU/ml) = 10X100X40(lml + 25ul) = 40000PFU/ml
[0072] 本實(shí)施例發(fā)明檢測(cè)滴度結(jié)果與普通蝕斑法檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比數(shù)據(jù)請(qǐng)參見表1。
[0073] 表1兩種方法檢測(cè)水痘培養(yǎng)滴度比較（單位：PFU/ml)
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法利用水痘病毒感染單 層細(xì)胞初期，在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并大量表達(dá)與病毒致病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白，通 過免疫反應(yīng)的方法，確定感染病灶，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算所述水痘病毒滴度； 所述檢測(cè)方法包括以下步驟： 1) 病毒接種 取人正常胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞），鋪滿96孔板單層，將待測(cè)水痘病毒樣品做梯 度稀釋，取2?4孔為一組，每組加同一濃度所述水痘病毒稀釋液25ul，同時(shí)做平行孔和陰 性對(duì)照孔，輕輕搖動(dòng)平板使所述水痘病毒均勻地分布，25?45°C，吸附30?90分鐘，棄去 孔內(nèi)液體，加入甲基纖維素溶液，25?45°C孵育43?47小時(shí)； 2) 滴度測(cè)定 向經(jīng)過上述經(jīng)病毒接種的每孔以及平行孔和陰性對(duì)照孔內(nèi)，加入新配制預(yù)冷甲醛丙酮 緩沖液，室溫放置5?20分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，每孔加入洗液，洗滌1?5 次，再加入普通山羊血清封閉，室溫放置2?8分鐘，棄去液體，輕輕拍干，加入小鼠抗水痘 病毒包膜糖蛋白單克隆抗體，25?45°C孵育20?40分鐘，棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙紙上輕 拍，洗滌1?5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，在25?45°C孵育20?40分鐘，棄去 孔內(nèi)液體，在吸水紙紙上輕拍，洗滌1?5次，加入TMB顯色底物，并在室溫下避光孵育1? 4小時(shí)； 3) 滴度計(jì)算 使用光學(xué)顯微鏡觀察，判定經(jīng)上述處理后每孔的病灶數(shù)，接種同一稀釋度的孔病灶數(shù) 取平均值，所述病毒滴度計(jì)算公式為： 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶數(shù)X稀釋倍數(shù)X40(lml + 25ul)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的與病毒致 病性相關(guān)的水痘病毒包膜糖蛋白為糖蛋白gE、gB、gH中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述糖蛋白gE的 氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述糖蛋白gB的 氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述糖蛋白gH的 氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)中所述的 甲醛丙酮緩沖液為PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述PBS、甲醛和丙酮的體積比為： PBS 1. 2 甲醛 1.0 丙酮 1.8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的甲醛丙酮 緩沖液配置后在_2〇°C放置3小時(shí)以上再使用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水痘病毒滴度快速檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)中所述的 洗液為PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的濃度為0? 01?0? 1 %，其優(yōu)選濃度為 0? 05%。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104407147SQ201410419594
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】高輝 申請(qǐng)人:北京合康源生物科技有限公司