一種流感病毒滴度的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種流感病毒感染滴度的檢測方法，其特點是利用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染性滴度，于35℃培養(yǎng)箱，流感病毒吸附Vero細胞90min后，加入終濃度為1％Agarose覆蓋物，3天后加入第二層覆蓋物，完全凝固后35℃倒置培養(yǎng)24～48小時判定結(jié)果。選擇出斑數(shù)在10～100個進行數(shù)斑，計算出空斑形成單位，并分別與雞胚法檢測病毒滴度進行比較，利用空斑法檢測流感病毒感染滴度。具有靈敏度高，重復(fù)性好的特點，精密度在1.5％～5.3％之間，適合用來檢測流感病毒感染滴度。
【專利說明】一種流感病毒滴度的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種流感病毒感染滴度的檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的流感病毒病毒滴度的檢測方法是利用雞胚法。選擇9~11日齡的雞胚，將流感病毒按10倍系列稀釋，至少取3個稀釋度尿囊腔注射，每只注射0.2ml.每個稀釋度注射4只雞胚。37°C孵箱培養(yǎng)3天，取尿囊液做血凝滴度檢測。計算出病毒滴度。利用空斑法檢測病毒滴度的方法早在50年代就開始研究使用了。1952年，Dulbecco把噬菌體空斑技術(shù)應(yīng)用于動物病毒學(xué)，從而使病毒蝕斑技術(shù)(Virus plaque formation)成為許多病毒的滴定和研究方法。病毒感染細胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周邊擴展。經(jīng)過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑是由最初感染細胞的一個病毒顆粒形成的，因而該項技術(shù)常用于病毒顆粒計數(shù)和分離病毒克隆。但在實際操作中，常出現(xiàn)幾個病毒顆粒同時感染一個細胞的情況，影響滴定的準(zhǔn)確性和克隆的純一性，為此，接種的病毒液要充分分散和稀釋。對于細胞結(jié)合性病毒，如MDV，需用單層細胞；對細胞釋放性病毒，即可用固相介質(zhì)懸浮的細胞，也可用單層細胞，但后者需用瓊脂等固體介質(zhì)蓋在細胞上，以防釋放的病毒在液體介質(zhì)中流動。固體介質(zhì)的濃度由病毒的大小而定，大病毒用濃度較低的介質(zhì)，小病毒用濃度較高的介質(zhì)，以便將蝕斑的生長速度控制在適宜的范圍內(nèi)。小蝕斑需用顯微鏡觀察，1-1Omm的大蝕斑可用肉眼計數(shù)。為便于肉眼觀察，常用中性紅等染料染色。因病變細胞不吸收中性紅，病變細胞區(qū)便呈現(xiàn)無色蝕斑。病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位(PFU/ml)來表示。例如，3個細胞瓶的平均蝕斑是58,接種量為0.2ml,病毒的稀釋度為2.5X IO3,則病毒原液的滴度為:58 + 0.2X2.5 XlO3 = 7.25 X IO5 (PFU/ml)。
[0003]蝕斑技術(shù)可以應(yīng)用于分離病毒的克隆(無性繁殖純系)、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的`生物學(xué)特性。
[0004]1.病毒生物學(xué)純化(Virus biological purification)在進行血清中和試驗時，常常會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)病毒株的滴度下降，因而影響了試驗的準(zhǔn)確性，這種情況多見于蟲煤病毒。這可能是由于原始毒種的混雜，或者已有許多變異病毒粒子存在其中，甚至出現(xiàn)數(shù)量眾多的缺陷病毒所致。這時，有必要把手上掌握的標(biāo)準(zhǔn)毒株進行純化，應(yīng)用病毒蝕斑技術(shù)，挑選出各個不同的純化病毒，亦稱“克隆株”?？寺『蟮牟《窘?jīng)在敏感細胞上增殖，測定其滴度，選用合適的毒株用于血清中和試驗。為了更有效地進行純化，必須在覆蓋營養(yǎng)瓊脂之前用營養(yǎng)液洗去單層細胞上未被吸附的病毒。同時要控制好稀釋的濃度，一個培養(yǎng)瓶中的蝕斑數(shù)目最好不超過10個，挑取在其附近IOmm都是健康細胞的蝕斑。挑取后的病毒應(yīng)傳兩代或兩代以上。一般認為，中性紅染料會由于“光敏”作用而抑制病毒蝕斑的形成和破壞宿主細胞。因此，加了中性紅覆蓋層的培養(yǎng)物應(yīng)在暗處培養(yǎng)。
[0005]2.蝕斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test)蝕斑減少中和試驗是檢測血清中和抗體的一種敏感性較高的方法,試驗以使蝕斑數(shù)減少50%的血清稀釋度作為其中的效價。試驗使用定量的病毒(IOOPFU)與不同稀釋度的等量血清混合后感作，接種預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細胞，再覆蓋上營養(yǎng)瓊脂置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，數(shù)天后分別統(tǒng)計蝕斑數(shù)，用Karber法計算該血清的蝕斑中和效價。其操作原理與傳統(tǒng)的血清中和試驗大致相同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于公開了一種利用VeiO細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的檢測方法。
[0007]本發(fā)明給出的技術(shù)方案是:這種流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于:采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度，其步驟有:
[0008](I)將流感病毒10倍系列稀釋，取各稀釋度病毒液加入VeiO細胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每個稀釋度加4孔。35°C吸附90min后倒掉病毒液。
[0009](2)加入保持37°C~42°C的第一層覆蓋物，每孔3ml。完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)72小時。
[0010](3)加入保持37°C~42°C的第二層覆蓋物，每孔2ml。完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)24~48小時判定結(jié)果。選擇出斑數(shù)在10~100個進行數(shù)斑。
[0011](4)采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度。
[0012](5)將流感病毒稀釋至每0.5ml含I~5個病毒(即每孔I~5個空斑)，分別用雞胚法和空斑法檢測流感病毒感染滴度。檢測陽性檢出率，比較兩種方法的靈敏度。
[0013](6)分別采用終濃度為1%和0.5%的Agarose覆蓋物，進行試驗操作。比較不同的終濃度對出斑的影響。
[0014](7)35°C培養(yǎng)箱流感病毒分別吸附60min和90min后加入第一層覆蓋物。比較不同吸附時間對出斑的影響。
[0015](8)流感病毒在33°C和35°C培養(yǎng)時能很好的繁殖，但在較高溫度時繁殖減弱，甚至不繁殖。本次試驗在33°C和35 °C條件下進行了比較。
[0016](9)按上述方法，五個不同操作者同時用空斑法檢測同一個流感病毒感染滴度，分別重復(fù)5次以上，對結(jié)果進行分析。
[0017]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用VeiO細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的病毒稀釋液為含6ug/ml胰酶的無血清培養(yǎng)基。
[0018]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用VeiO細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第一層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養(yǎng)基43.2ml,2% Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml、(λ 25%胰酶 0.3ml、雙抗 lml。
[0019]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第二層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養(yǎng)基38.2ml,2% Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml、(λ 25%胰酶 0.3ml、雙抗 lml、中性紅 5ml。
[0020]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持37°C~42°C的第一層覆蓋物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)72小時。
[0021]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用VeiO細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持37°C~42°C的第二層覆蓋物，每孔2ml，完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)24~48小時判定結(jié)果。
[0022]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用VeiO細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時選擇出斑數(shù)在30~70個進行數(shù)斑。
[0023]為更好地實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的
【權(quán)利要求】
1.一種流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于:采用Ver0細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度，其步驟有: (1)將流感病毒按10倍系列稀釋，取各稀釋度病毒液加入Vero細胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每個稀釋度加4孔，，35°C吸附90min后倒掉病毒液； (2)加入保持37°C~42°C的第一層覆蓋物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)72小時； (3)加入保持37°C~42°C的第二層覆蓋物，每孔2ml，完全凝固后，35°C倒置培養(yǎng)24~48小時判定結(jié)果，選擇出斑數(shù)在10~100個進行數(shù)斑； (4)根據(jù)Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度: (5)將流感病毒稀釋至每0.5ml含I~5個病毒(即每孔I~5個空斑)，分別用雞胚法和空斑法檢測流感病毒感染滴度，檢測陽性檢出率，比較兩種方法的靈敏度； (6)分別采用終濃度為I%和0.5%的Agarose覆蓋物，進行試驗操作，比較不同的終濃度對出斑的影響； (7)35°C培養(yǎng)箱流感病毒分別吸附60min和90min后加入第一層覆蓋物，比較不同吸附時間對出斑的影響； (8)流感病毒在33°C和35°C培養(yǎng)時能很好的繁殖，但在較高溫度時繁殖減弱，甚至不繁殖； (9)按上述方法，五個不同操`作者同時用空斑法檢測同一個流感病毒感染滴度，分別重復(fù)5次以上，對結(jié)果進行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的病毒稀釋液為含6ug/ml胰酶的無血清培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第一層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養(yǎng)基43.2ml,2%Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml,0.25%胰酶 0.3ml、雙抗Iml0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的第二層覆蓋物為每100ml含2倍無血清培養(yǎng)基38.2ml,2%Agarose50ml、7.5% NaHC03 3ml、HEPES 1.5ml、3%谷氨酰胺 lml,0.25%胰酶 0.3ml、雙抗lml、中性紅5ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持40°C的第一層覆蓋物，每孔3ml，完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)72小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時加入保持40°C的第二層覆蓋物，每孔2ml，完全凝固后35°C倒置培養(yǎng)24~48小時判定結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度時選擇出斑數(shù)在30~70個進行數(shù)斑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述流感病毒滴度的檢測方法，其特征在于采用Vero細胞空斑法檢測流感病毒感染滴度的
【文檔編號】C12Q1/70GK103773892SQ201210397723
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】周荔葆, 廖輝, 劉苗苗, 趙新, 吳瓊, 曲格霆 申請人:遼寧成大生物股份有限公司