一種檢測(cè)b、e型人腺病毒核酸的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種病毒核酸檢測(cè)試劑盒，特別設(shè)及一種檢測(cè)B、E型人腺病毒核酸的 試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人腺病毒是一類無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，分為A-G 7個(gè)血清學(xué)組，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)60多個(gè) 血清型，HAdV感染人體可引發(fā)急性腺病毒型肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間 質(zhì)性腎炎等多種疾病。腺病毒作為普通的機(jī)會(huì)性病原體長(zhǎng)期存在于人群中，在居住密集的 人群，如軍隊(duì)、學(xué)校人員中都可引起暴發(fā)流行。
[0003] 不同的腺病毒亞種會(huì)引起不同的疾病，C亞種主要引起小兒科的上呼吸道感染，人 腺病毒F亞種會(huì)引起感染性腹瀉，B亞種和E亞種可長(zhǎng)引起成人急性發(fā)熱性呼吸道疾病，在成 人特別是學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行，由于傳染性強(qiáng)且 癥狀較重，嚴(yán)重者可引起死亡，因而引起人們廣泛關(guān)注。
[0004] 腺病毒主要通過(guò)呼吸道和消化道傳播，具有較高傳染性，因此快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技 術(shù)對(duì)預(yù)防和控制腺病毒的傳播有重要意義。目前，檢測(cè)方法大體概括可分為兩類免疫學(xué)方 法和分子生物學(xué)方法。前者主要包括化ISA技術(shù)。但是此技術(shù)存在一定的局限性即免疫檢測(cè) 法實(shí)效性低，在感染初期抗體未形成時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)。分子生物學(xué)方法主要為PCR技術(shù)。但 是PCR技術(shù)對(duì)儀器及實(shí)驗(yàn)室的要求高，運(yùn)些局限性使其應(yīng)用大多限制于條件優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)，無(wú)法作為便攜式儀器應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)防疫檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前腺病毒診斷技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型的基于RPA- LFD技術(shù)的檢測(cè)B、E型人腺病毒核酸的試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] -種檢巧化、E兩型人腺病毒核酸的試劑盒，所述試劑盒包括:RPA凍干顆粒，RPA反 應(yīng)引物，RPA反應(yīng)探針，RPA緩沖液，儀鹽溶液，橫向流動(dòng)試紙條，緩沖液，雙蒸水和腺病毒基 因組DNA。
[0007] 所述1??4反應(yīng)引物的序列如序列表569 10齡.1和569 10齡.2所示。
[000引所述RPA反應(yīng)探針的序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0009] 所述RPA凍干顆粒包括隧菌體重組酶UvsX，輔助因子UvsY，DNA聚合酶，單鏈DNA結(jié) 合蛋白和dNTPs。
[0010] 所述儀鹽溶液為醋酸儀溶液。
[00川序列表中沈Q ID No.2所示的引物的5'端用生物素標(biāo)記。
[001 ^ 所述RPA反應(yīng)探針中，5 '端用FAM標(biāo)記，32位堿基用一個(gè)四氨巧喃堿基隔開(kāi)。
[0013] 所述橫向流動(dòng)試紙條前端包被有帶FAM抗體的納米金粒，檢測(cè)線上包被有生物素 抗體，質(zhì)控線上包被有固定抗體。
[0014] -種非醫(yī)療目的的檢測(cè)B、E兩型人腺病毒核酸的方法，按照如下步驟進(jìn)行：
[0015] (1)反應(yīng)體系：在RPA凍干顆粒中加入25-3化L反應(yīng)緩沖液，2.0-2.3化lOiiM序列表 SEQIDNo.l所示的引物，2.0-2.310μM序列表沈QIDNo.2所示的引物，0.6-l化10μMRPA 反應(yīng)探針，1-3化乙型腦炎病毒基因組DNA，10.2-12.2化雙蒸水，在反應(yīng)管蓋上加醋酸儀溶 液2.化L，蓋嚴(yán)管蓋并離屯、，使醋酸儀與溶液混合，上下顛倒反應(yīng)管使之充分混勻后再次離 屯、；
[0016] (2)反應(yīng)過(guò)程:利用帶生物素標(biāo)記的引物和FAM標(biāo)記的RPA反應(yīng)探針與祀核酸進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)，使最終擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)攜帶FAM和生物素標(biāo)記，橫向流動(dòng)試紙條前端包被有帶FAM 抗體的納米金粒，檢測(cè)線上包被有生物素抗體，當(dāng)反應(yīng)液進(jìn)入試紙條時(shí)，帶有FAM和生物素 的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)通過(guò)抗原抗體結(jié)合作用，在檢測(cè)線上形成生物素抗體-核酸-納米金粒復(fù)合 體并顯色，橫向流動(dòng)試紙條上還有一條質(zhì)控線，包被有固定抗體，直接與帶FAM抗體的納米 金粒結(jié)合，在質(zhì)控線上顯色；
[0017] (3)結(jié)果判定:待測(cè)樣品中含有B、E型人腺病毒核酸的，試紙條可見(jiàn)兩條線;不含腺 病毒核酸的，試紙條上只可見(jiàn)一條質(zhì)控線。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明利用橫向流動(dòng)試紙條對(duì)RPA核 酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化定性檢測(cè)，整個(gè)反應(yīng)在38°C恒溫條件下進(jìn)行，5-20分鐘內(nèi)即可通過(guò) 肉眼觀察試紙條上條帶，判讀結(jié)果，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需特殊檢測(cè)儀器。本發(fā)明所述試劑盒具有靈 敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)快速，儀器設(shè)備便攜等特點(diǎn)，非常適合應(yīng)用于腺病毒的床 旁快速診斷及防疫疾控。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)B-7,14,55Ξ型腺病毒及無(wú)感染患者進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果 圖；
[0020] 圖中，1-2，B-7型腺病毒標(biāo)本;3-4, B-14型腺病毒標(biāo)本;5-6，B-55型腺病毒標(biāo)本;γ? ιο ， 無(wú)腺病毒感染標(biāo)本; 11 ， 雙蒸水。
[0021 ]圖2是應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)Β-7，14，55型人腺病毒、乙腦病毒、血吸蟲(chóng)及大腸桿菌 進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0022] 圖中，1，Β-7型腺病毒標(biāo)本;2，Β-14型腺病毒標(biāo)本;3，Β-55型腺病毒標(biāo)本;4，血吸蟲(chóng) 核酸;5，乙型腦炎病毒核酸;6，大腸桿菌核酸;7，雙蒸水。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受【具體實(shí)施方式】的限制。
[0024] 實(shí)施例1 [00巧]實(shí)驗(yàn)材料；
[00%] RPA凍干試劑、緩沖液及儀鹽溶液購(gòu)自Twi S tDX公司Twi stAmpTM試劑盒;橫向流動(dòng) 試紙條及其緩沖液購(gòu)自Mi lenia Biotec公司HybriDetect MG皿1試劑盒。
[0027] 實(shí)驗(yàn)原理：
[0028] 利用帶生物素標(biāo)記的引物和FAM標(biāo)記的探針與祀核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，使最終擴(kuò)增 產(chǎn)物同時(shí)攜帶FAM和生物素標(biāo)記。LF的式紙條前端包被有帶FAM抗體的納米金粒，檢測(cè)線上包 被有生物素抗體，當(dāng)反應(yīng)液進(jìn)入試紙條時(shí)，帶有FAM和生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)通過(guò)抗原抗體 結(jié)合作用，在檢測(cè)線上形成生物素抗體-核酸-納米金粒復(fù)合體并顯色。橫向流動(dòng)試紙條上 還有一條質(zhì)控線，包被有固定抗體，可W直接與帶FAM抗體的納米金粒結(jié)合，在質(zhì)控線上顯 色，W確保試紙條的有效性。
[0029] 引物設(shè)計(jì)：
[0030] 從Geneba址下載B、E型人腺病毒編碼六鄰體蛋白的基因序列，
[0031] 應(yīng)用軟件進(jìn)行