專利名稱：檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體,使用該抗體的檢測(cè)方法,和使用該抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識(shí)別能在啤酒中生長(zhǎng)的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體，使用該抗體檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法，和鑒定啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
有一種意識(shí)到的危險(xiǎn)，即一旦某些類型的乳酸細(xì)菌污染啤酒生產(chǎn)的過(guò)程，則由該細(xì)菌引起的渾濁，味道不正等等可能會(huì)損害生產(chǎn)出的啤酒的質(zhì)量。例如，有代表性的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌包括一些屬于乳桿菌屬的乳酸細(xì)菌菌種，特別是屬于短乳桿菌和林氏乳桿菌那些，以及包括一些屬于片球菌屬的乳酸細(xì)菌菌種。因此，曾試圖開(kāi)發(fā)快速而且高敏感性的檢測(cè)這些啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法。
具體提到的是一種方法，其中用膜過(guò)濾器過(guò)濾要分析的啤酒之后，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且觀察生長(zhǎng)的菌落。但是，因?yàn)槠【浦写嬖诘钠【聘瘮【嬖诘牧啃?，而且它們?cè)谂囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)慢，使用該方法存在檢測(cè)它們的敏感性和費(fèi)時(shí)性的問(wèn)題。
開(kāi)發(fā)出了應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)啤酒中啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法。例如，制備出了抗乳酸細(xì)菌的多克隆抗體(抗血清)(Sharpe,M.E.,遺傳微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.),12,107(1955)；Sharpe,M.E.,國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志(Int.J.Syst.Bacteriol.),20,509(1970)；Knox,M.W.等，感染免疫學(xué)(Infect.Immun.),24,12(1979)；Shimohashi,H.和Mutai,M.,J.Gen.Microbiol.,103,337(1977)；和日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平4-72570)?，F(xiàn)在，通過(guò)調(diào)節(jié)各種條件，有可能制備這樣一種品質(zhì)的抗血清，使得它們的特異性和它們的敏感性在一定程度上為實(shí)際應(yīng)用所接受。但是其中在下面的幾方面還存在期望的進(jìn)一步改進(jìn)抗體滴定度或抗血清的特異性不可避免地隨著批次而不穩(wěn)定；抗某種類型乳酸細(xì)菌的抗血清對(duì)抗非啤酒腐敗菌也呈現(xiàn)陽(yáng)性；一些抗血清需要NaOH處理。
因?yàn)檫@些原因，提出過(guò)使用單克隆抗體的檢測(cè)方法(日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-46881和日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-105698)。根據(jù)日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-46881的描述，使用屬于乳桿菌屬第3族并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的短乳桿菌屬，丘狀菌落乳桿菌和豬雙臼乳桿菌作為抗原制備單克隆抗體；并且使用這些單克隆抗體來(lái)檢測(cè)啤酒中的第3族的乳桿菌屬。
但是證明在啤酒生產(chǎn)中生長(zhǎng)的乳酸細(xì)菌只是屬于乳桿菌屬第3族的那些的一部分。因此，根據(jù)日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-46881描述的方法的問(wèn)題是也可以檢測(cè)到其它非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌，即用該方法獲得假陽(yáng)性結(jié)果。
根據(jù)日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-105698的描述，使用屬于乳桿菌屬并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的植物乳桿菌屬作為抗原制備單克隆抗體；使用該單克隆抗體檢測(cè)啤酒中的乳桿菌和棒狀乳桿菌。但是該公開(kāi)的抗體具有相同的也檢測(cè)非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的問(wèn)題(假陽(yáng)性)。
因此，提出過(guò)只檢測(cè)可以在啤酒中生長(zhǎng)的啤酒腐敗細(xì)菌的方法(下文稱之為“啤酒腐敗能力”)(日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平10-104238)。根據(jù)日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平10-104238中描述的方法，使用在缺氧條件下不具備葡萄糖同化作用能力并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的短乳桿菌作為抗原用兔制備抗血清；使用該抗血清檢測(cè)具有啤酒腐敗能力的短乳桿菌。據(jù)信這樣制備的抗血清特異性地與短乳桿菌和有害片球菌反應(yīng)，這兩者都引起啤酒腐敗能力。
盡管如此，根據(jù)日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平10-104238中描述的方法，為了從抗血清中去除與短乳桿菌屬反應(yīng)的非特異性抗體(即與非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌反應(yīng)的非特異性抗體)，必須使用堿處理過(guò)的非啤酒腐敗短乳桿菌通過(guò)吸附來(lái)有效去除非特異性抗體。另外，存在一個(gè)問(wèn)題，就是以要用作抗原的短乳桿菌為基礎(chǔ)，得到的抗血清傾向于假性識(shí)別。此外，既然使用抗血清，其抗體滴定度和特異性不可避免地批次與批次之間不穩(wěn)定。
提到的作為代表性啤酒腐敗乳酸細(xì)菌是林氏乳桿菌；但是在日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平10-104238中沒(méi)有提到該抗血清抗這樣的細(xì)菌的效力。
綜上所述，在發(fā)酵工業(yè)需要改進(jìn)的檢測(cè)使啤酒腐敗的細(xì)菌的方法。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能檢測(cè)使啤酒腐敗損害啤酒質(zhì)量的乳酸細(xì)菌的試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種特異性的，快速，方便和可重復(fù)檢測(cè)在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中污染的且在生產(chǎn)出的啤酒中生長(zhǎng)的并降低啤酒質(zhì)量的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種有效而徹底地檢測(cè)例如短乳桿菌，林氏乳桿菌或有害片球菌的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種精確而方便地預(yù)測(cè)用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)出現(xiàn)的乳酸細(xì)菌的啤酒腐敗能力的鑒定試劑盒。
本發(fā)明的這些目的和其它目的可以用通過(guò)在啤酒中生長(zhǎng)具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌和通過(guò)用該啤酒免疫哺乳動(dòng)物而產(chǎn)生的檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的還可以用一種單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述單克隆抗體具有抗使啤酒腐敗的乳酸細(xì)菌的反應(yīng)性并且對(duì)非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌沒(méi)有反應(yīng)性，其中通過(guò)在啤酒中生長(zhǎng)具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌和通過(guò)用該啤酒免疫哺乳動(dòng)物而產(chǎn)生所述抗體。
本發(fā)明的目的可以用用來(lái)檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的所述抗體以及上述單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌是在缺氧條件下具備葡萄糖同化作用能力的乳酸細(xì)菌。
本發(fā)明的目的可以用用來(lái)檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的所述抗體以及上述單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌是選自啤酒腐敗短乳桿菌，啤酒腐敗林氏乳桿菌或啤酒腐敗有害片球菌的乳酸細(xì)菌。
本發(fā)明的目的也可以用使用上述抗體來(lái)檢測(cè)具有啤酒腐敗能力的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述啤酒腐敗能力的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌例如是短乳桿菌，林氏乳桿菌或有害片球菌的乳酸細(xì)菌。
本發(fā)明的目的也可以用一種生產(chǎn)與啤酒腐敗乳酸細(xì)菌特異性反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，BLb2F37(FERMBP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)或PQ3H8a9(FERM BP-6746)。
本發(fā)明的目的也可以用使用所述雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體的組合來(lái)檢測(cè)具有啤酒腐敗能力的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述啤酒腐敗能力的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌例如是短乳桿菌，林氏乳桿菌或有害片球菌的乳酸細(xì)菌。
本發(fā)明的目的也可以用鑒定啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的試劑盒來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述試劑盒具有至少以下成分(1)裝備有截留細(xì)菌的過(guò)濾器的離心管；(2)根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體；(3)抗上述抗體的第二抗體或抗體-樣物質(zhì)，各自用酶標(biāo)記；和(4)與第二抗體或抗體-樣物質(zhì)的標(biāo)記酶反應(yīng)和顯色的底物。
本發(fā)明的目的也可以用制備上述抗體和雜交瘤的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明結(jié)合附圖考慮時(shí)，通過(guò)參照下面詳細(xì)說(shuō)明，更好地理解容易實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的更完全的價(jià)值及其帶來(lái)的利益，其中

圖1是實(shí)施例3中獲得的結(jié)果的照片，即使用三種類型的抗體的快速鑒定。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式啤酒腐敗乳酸細(xì)菌如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“啤酒腐敗乳酸細(xì)菌”指能在啤酒中生長(zhǎng)并且由于其在其中生長(zhǎng)而引起啤酒渾濁的細(xì)菌。
這里關(guān)于本發(fā)明抗體和乳酸細(xì)菌之間的相互作用所使用的反應(yīng)，結(jié)合等等術(shù)語(yǔ)指抗體和細(xì)菌之間形成復(fù)合體，即一種抗體-抗原反應(yīng)。形成或不形成這樣的復(fù)合體是根據(jù)啤酒生產(chǎn)中使用的分析相關(guān)條件，例如在25℃下在磷酸緩沖鹽水(PBS)中(參見(jiàn)下面的實(shí)施例)。
有代表性的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌包括例如分類為短乳桿菌，林氏乳桿菌或有害片球菌的細(xì)菌(Back,W.等；Brauwlt,31/32,1358(1988)，這里引作參考)；但是并不是所有這些細(xì)菌都使啤酒腐敗。
在本發(fā)明中用作抗原的乳酸細(xì)菌是具有啤酒腐敗能力的那些，例如屬于短乳桿菌，林氏乳桿菌或有害片球菌屬的乳酸細(xì)菌。
通過(guò)直接將環(huán)境中產(chǎn)生的樣品加入到啤酒中，或生長(zhǎng)乳酸細(xì)菌后，利用乳酸細(xì)菌選擇培養(yǎng)基和通過(guò)選擇引起渾濁的那些，可以獲得這些啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。
以下面的方法進(jìn)行啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的傳代培養(yǎng)和保藏所述細(xì)菌在啤酒中生長(zhǎng)，在4℃下保藏，每幾個(gè)月傳代培養(yǎng)；或者，加入甘油使最后濃度是20％；所述細(xì)菌在-70℃下保藏。
可以以下面的方法進(jìn)行啤酒腐敗的測(cè)定向含有市售啤酒的小瓶(334ml)加入大約107個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，所述市售啤酒為100％麥芽，pH大約4.4，苦味單位是大約28；蓋上蓋子并且在25℃下貯存2個(gè)月；然后用眼觀察判斷啤酒中是否產(chǎn)生渾濁。
單克隆抗體根據(jù)公知的方法，用上述選擇的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌免疫小鼠。接著制備雜交瘤并且建立生產(chǎn)期望單克隆抗體的雜交瘤克隆。制備單克隆抗體和雜交瘤的方法描述于當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Current Protocolsin Molecular Biology),Vol.1-3,Ausubel等編著，John Wiley和Sons,1998，這里其全文引作參考。
1．制備抗原和免疫具體地說(shuō)，收獲在啤酒中生長(zhǎng)的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。用生理鹽水洗滌后，細(xì)菌細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBS)中并且用來(lái)免疫小鼠。以合適的時(shí)間間隔進(jìn)行另外的免疫，當(dāng)血液中抗體滴定度增大時(shí)進(jìn)行最后的免疫。
2．細(xì)胞融合最后免疫后三天取出免疫小鼠的脾。在合適的細(xì)胞融合劑存在下脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。融合的細(xì)胞接種到96孔微量培養(yǎng)板上并且在合適的選擇培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
3．篩選和克隆根據(jù)ELISA這樣的方法，選擇產(chǎn)生期望的抗體的雜交瘤并且進(jìn)行篩選。
使用例如有限稀釋這樣的方法對(duì)產(chǎn)生期望的抗體的雜交瘤進(jìn)行克隆并且建立雜交瘤克隆。
4．大量制備單克隆抗體產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤克隆在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)之后，回收細(xì)胞，然后腹膜內(nèi)接種到使用之前用降植烷刺激的小鼠體內(nèi)。從小鼠的腹膜內(nèi)收集合有所述抗體的腹水。接著使用硫酸銨沉淀法或者親和柱，例如ProteinA或ProteinG柱，從腹水純化單克隆抗體?；蛘唠s交瘤克隆大規(guī)模在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，使用硫酸銨沉淀法或者離子交換柱等方法從根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)物純化所述單克隆抗體。
這樣獲得的單克隆抗體具有下面的性質(zhì)表現(xiàn)出抗具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌的反應(yīng)性；對(duì)非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌沒(méi)有反應(yīng)性。
5．檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌舉例的檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法包括ELISA(生物科學(xué)。生物技術(shù)。生物化學(xué)(Biosci.Biotech.Biochem),59,2039(1995)，這里引作參考)，以膜上截留的細(xì)菌的抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的方法(日本未審專利申請(qǐng)公開(kāi)平6-46881，這里引作參考)，等等。
具體地說(shuō)，用膜過(guò)濾器過(guò)濾生產(chǎn)出的啤酒以截留啤酒中的細(xì)菌。接著，在用合適的緩沖液如磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌后，使細(xì)菌與上面獲得的單克隆抗體反應(yīng)，用PBS洗滌膜。然后使用與過(guò)氧化物酶綴合的抗-小鼠抗體檢測(cè)留在膜上的單克隆抗體，其能檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。
此外，如果直接標(biāo)記本發(fā)明獲得的抗體(例如使用酶，熒光染料或放射性同位素)，則不需要第二抗體直接檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌成為可能；并且檢測(cè)的敏感性也被提高了。
6．快速鑒定方法和試劑盒具有高特異性并且使快速鑒定的根據(jù)本發(fā)明的方法具有下列組分就是(1)裝備有截留細(xì)菌的過(guò)濾器的離心管；(2)根據(jù)本發(fā)明獲得的抗啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的三種單克隆抗體；(3)都用酶標(biāo)記的抗上述抗體的第二抗體或抗體-樣物質(zhì)；和(4)與第二抗體或抗體-樣物質(zhì)的標(biāo)記酶反應(yīng)和顯色的底物。此外，可以優(yōu)選獲得用作陽(yáng)性對(duì)照的乳酸細(xì)菌。
下文將詳細(xì)解釋根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定方法，檢測(cè)方法和快速鑒定試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的用于啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的快速鑒定試劑盒基于通過(guò)利用裝有過(guò)濾器的離心管截留細(xì)菌，并去除未反應(yīng)的抗體，與酶免疫測(cè)定相結(jié)合；其通過(guò)其顏色色調(diào)的程度判斷預(yù)測(cè)涉及試驗(yàn)細(xì)菌的啤酒腐敗能力。在本發(fā)明方法中，向帶有過(guò)濾器的離心管加入細(xì)菌懸浮液和酶標(biāo)記的抗體(例如單克隆抗體和酶標(biāo)記抗體，或者直接用酶標(biāo)記的單克隆抗體)并且使離心。當(dāng)抗體與試驗(yàn)細(xì)菌反應(yīng)時(shí)，其和標(biāo)記酶一起留在過(guò)濾器中；而當(dāng)抗體不反應(yīng)時(shí)，通過(guò)過(guò)濾器與濾液一起去除標(biāo)記酶。因此，當(dāng)加入一種酶底物溶液時(shí)，只有抗體與試驗(yàn)細(xì)菌反應(yīng)時(shí)才發(fā)生著色。這使得容易預(yù)測(cè)試驗(yàn)細(xì)菌的啤酒腐敗能力。另外，特異性很高，因?yàn)榛驹砼c直接熒光抗體技術(shù)的原理相同。
要求在帶有過(guò)濾器的離心管中使用的過(guò)濾器(filter)具有一定的孔徑，其足夠大以截留為測(cè)定目的的乳酸細(xì)菌并且使去除未反應(yīng)的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易選擇該孔徑。例如，可以使用具有0.2-0.45μm級(jí)孔徑并且由使蛋白質(zhì)吸附作用最小化的材料例如聚偏氟乙烯(PVDF)制備的過(guò)濾器；優(yōu)選地，其在用酪蛋白，牛血清白蛋白等等封閉后使用。
所述試驗(yàn)細(xì)菌懸浮于生理鹽水或適合抗原-抗體反應(yīng)的緩沖液中；然后，加入單克隆抗體和酶標(biāo)記第二抗體或用酶直接標(biāo)記的單克隆抗體。
使它們與試驗(yàn)細(xì)菌反應(yīng)之后，離心去除未反應(yīng)的單克隆抗體和酶標(biāo)記第二抗體或未反應(yīng)的用酶直接標(biāo)記的單克隆抗體。
此外，向抗體中加入性質(zhì)和濃度不抑制反應(yīng)的洗滌溶液，例如含有0.05％Tween20的10mM Tris-HCl(pH8.0)。然后離心進(jìn)行洗滌并且去除清洗溶液。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用帶有過(guò)濾器(或過(guò)濾裝置)的離心管，能夠進(jìn)行洗滌并且同時(shí)去除清洗溶液，而且有可能以極大的效率進(jìn)行徹底的清洗而沒(méi)有將試驗(yàn)細(xì)菌洗滌掉的危險(xiǎn)。
優(yōu)選的是，顯色底物在可見(jiàn)區(qū)具有其吸收最大波長(zhǎng)，是高度敏感性和容易區(qū)別的，并且具有對(duì)時(shí)間的高度穩(wěn)定性。為了符合這些要求，優(yōu)選過(guò)氧化物酶型的顯色底物，例如，可以使用四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ)和鄰苯二胺(OPD)。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒要用來(lái)鑒定啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。下面說(shuō)明根據(jù)該實(shí)施方案的一系列操作的具體實(shí)例1．生理鹽水，100μl，和啤酒腐敗乳酸細(xì)菌懸浮液--懸浮于生理鹽水中，通過(guò)熱處理滅菌，并且將其在660nm處的吸收度調(diào)節(jié)到0.3--，用作陽(yáng)性對(duì)照的100μl，各放置于凝集皿上。
2．將一接種環(huán)的試驗(yàn)細(xì)菌懸浮于生理鹽水中其濃度調(diào)節(jié)到接近和啤酒腐敗乳酸細(xì)菌懸浮液相同的水平。
3．各細(xì)菌懸浮液各25μl加入到三個(gè)過(guò)濾裝置中三個(gè)過(guò)濾裝置用于一個(gè)細(xì)菌并且標(biāo)記為Ⅰ至Ⅲ。
4．抗體溶液，50μl，加入到各過(guò)濾裝置通過(guò)用PBS稀釋，單克隆抗體和酶標(biāo)記第二抗體或用酶直接標(biāo)記的單克隆抗體等等給出合適的濃度獲得抗體溶液；向Ⅰ中加入BLb2F37溶液用作單克隆抗體，向Ⅱ中加入BG3A5b4溶液備用，向Ⅲ中加入PQ3H8a9溶液備用。
5．?dāng)嚢韬?，使過(guò)濾裝置在室溫下靜置15分鐘。
6．該裝置以2000rpm離心5分鐘。
7．向該裝置加入350μl的清洗溶液。
8．該裝置以2000rpm離心10分鐘。
9．向該裝置加入50μl的底物溶液。
10．?dāng)嚢韬?，使過(guò)濾裝置在室溫下靜置5分鐘。
11．向該裝置加入50μl的猝滅溶液。
12．?dāng)嚢韬?，首先確認(rèn)向其中加入陽(yáng)性對(duì)照的過(guò)濾裝置顯示出足夠的顏色。
13．接著，將加入試驗(yàn)細(xì)菌的三個(gè)過(guò)濾裝置的顯色模式與下面的表相比較并且作出判斷。
判斷表(“+”強(qiáng)顯色，“-”沒(méi)有顯色或弱顯色)抗體溶液 判斷結(jié)果Ⅰ Ⅱ Ⅲ- - - 沒(méi)有啤酒腐敗菌+ - - 啤酒腐敗短乳桿菌或有害片球菌- + - 啤酒腐敗林氏乳桿菌- - + 啤酒腐敗有害片球菌+ - + 啤酒腐敗短乳桿菌或有害片球菌當(dāng)分別使所有啤酒腐敗乳酸細(xì)菌與三種單克隆抗體反應(yīng)時(shí)，它們確實(shí)與一種或兩種單克隆抗體反應(yīng)，同時(shí)不與至少一種單克隆抗體反應(yīng)。另一方面，非啤酒腐敗菌不與三種單克隆抗體的任何一種反應(yīng)。本發(fā)明判斷方法使用下面參見(jiàn)實(shí)施例中抗體特異性測(cè)定部分。換句話說(shuō)，除非最初提供的細(xì)菌懸浮液的濃度太低或太高，當(dāng)使懸浮液與相當(dāng)量的三種抗體反應(yīng)時(shí)，與其余裝置相比，所有啤酒腐敗菌在至少一個(gè)或兩個(gè)過(guò)濾裝置中表現(xiàn)出非常強(qiáng)的顯色；而在非啤酒腐敗菌情況下，三種抗體中沒(méi)有一種抗體顯色，或者所有三種抗體發(fā)生程度相似的弱顯色。因此，在該方法中試驗(yàn)細(xì)菌的量無(wú)需精確；而且當(dāng)判斷細(xì)菌具有啤酒腐敗能力時(shí)，也可以以過(guò)濾裝置產(chǎn)生顯色為基礎(chǔ)鑒定細(xì)菌的種類。另外，因?yàn)橥瑫r(shí)處理啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的懸浮液并且在比較中作為陽(yáng)性對(duì)照，就有可能確定所述抗體是否被滅活，以及確定操作方法是否發(fā)生錯(cuò)誤。同時(shí)，使得能夠更精確地判斷。
偶爾情況下，當(dāng)從啤酒中分離后在培養(yǎng)基中傳代太多次時(shí)，一些啤酒腐敗菌實(shí)驗(yàn)降低了抗抗體反應(yīng)性。在這樣的情況下，例如，首先將細(xì)菌懸浮于大約0.1％氫氧化鈉溶液中并且使其在室溫下靜置10分鐘。然后，將它們加入過(guò)濾裝置。離心去除氫氧化鈉溶液后，加入抗體溶液。這樣獲得足夠的顯色。
已一般性描述了本發(fā)明，通過(guò)參照這里提供的只是為了詳細(xì)說(shuō)明的目的而不是限制本發(fā)明范圍的一些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1[制備對(duì)于啤酒腐敗乳酸細(xì)菌特異性的單克隆抗體](1)制備抗原從啤酒中分離的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌短乳桿菌，林氏乳桿菌和有害片球菌用作抗原。根據(jù)Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology中描述的分類體系鑒定這些菌株，所述文獻(xiàn)在這里引作參考。注意，根據(jù)該分類體系所述，使用的短乳桿菌在厭氧條件下具有葡萄糖同化作用能力。這些在4℃下在啤酒中保存的菌株接種新鮮啤酒并且在25℃下生長(zhǎng)直到啤酒變得渾濁，離心收集細(xì)胞。然后，在新鮮啤酒中傳代培養(yǎng)細(xì)菌溶液等份，在每一次免疫的時(shí)候使用新鮮細(xì)菌細(xì)胞。
離心收集細(xì)胞后用生理鹽水洗滌，將它們懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBs)中并且將其在660nm處的吸收度調(diào)節(jié)到0.5用于免疫。
(2)免疫小鼠從日本SLC購(gòu)得雌性BALB/C小鼠(8周齡)。初步喂養(yǎng)10天后將它們免疫。
對(duì)于免疫，將上述制備的三種類型的細(xì)菌懸浮液腹膜內(nèi)接種到各小鼠體內(nèi)。注射時(shí)間的間隔設(shè)定為一周一次，注射的懸浮液的量是，從開(kāi)始時(shí)計(jì)，0.1,0.5,1.0,1.0,1.0和1.0，共計(jì)6次總共注射了4.6ml。
(3)細(xì)胞融合根據(jù)單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Toyama,S；Yasuto,T.，編著；Kodansha,最后免疫后三天，從小鼠體內(nèi)取出脾，并且在沒(méi)有胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基-Nissui Pharmaceutical Co.Ltd.--中分離脾細(xì)胞。接著，在聚乙二醇(在細(xì)胞融合中使用，從Behringer Manheim AG購(gòu)得)存在下，使細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0.Ag14,DainipponPharmaceutical Co.Ltd.)進(jìn)行細(xì)胞融合。接著，在含有15％FCS和HAT(H-0.262，從Sigma Inc.購(gòu)得)的RPMI1640培養(yǎng)基中懸浮雜交瘤。該懸浮液在96孔微量培養(yǎng)板(從Nunc Inc.購(gòu)得的No.167008)中平板培養(yǎng)，在37℃下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后，以合適的時(shí)間間隔更換培養(yǎng)基。當(dāng)生長(zhǎng)雜交瘤時(shí)，根據(jù)如下所述通過(guò)ELISA測(cè)定上清液的抗體滴定度并且篩選抗體陽(yáng)性細(xì)胞。
(4)篩選抗體向96孔微量培養(yǎng)板(從Nunc Inc.購(gòu)得的No.168055)的每一個(gè)孔加入2.5％戊二醛溶液各50μl。在室溫下靜置3小時(shí)后傾析該溶液。分別制備已經(jīng)在啤酒中經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的三種類型的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的制劑，和在MRS培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌干酪乳桿菌AHU1057菌株(對(duì)照)的制劑，使得它們?cè)?60nm處的吸收度是0.3∶AHU∶微生物培養(yǎng)收集實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)系，Hokkaido大學(xué)，Sapporo，日本。向各孔中加入50μl等份的各制劑。在2000rpm下離心5分鐘后，使孔在4℃下靜置直到第二天。然后，棄除上清液，并且向各孔中加入100μl含有1％明膠的PBS。在室溫下靜置2小時(shí)后棄除上清液，制備已包被細(xì)菌的測(cè)試平板。
向如上所述制備的測(cè)試平板的每一個(gè)孔加入50μl的細(xì)胞融合的培養(yǎng)上清液。此外，向各孔中加入25μl的用含有0.1％明膠的PBS稀釋250倍的商業(yè)購(gòu)得的過(guò)氧化物酶綴合的抗小鼠IgG+M抗體(Wako純化學(xué)品)。室溫下靜置1小時(shí)之后，棄除上清液。然后各孔用含有0.05％Tween20的100μl所Tris緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.0)洗滌兩次。接著向各孔中加入50μl的底物溶液(含有1mg/ml鄰-苯二胺二鹽酸鹽的0.25M檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2))。室溫下靜置5分鐘之后，向各孔中加入50μl的猝滅溶液(10mM NaN3)終止反應(yīng)。測(cè)定“A492-A630”(從492nm處的吸收度減去630nm處的吸收度獲得的值)。如果用啤酒腐敗乳酸細(xì)菌包被的孔具有比用干酪乳桿菌(對(duì)照)包被的孔更高的吸收度，則測(cè)定為陽(yáng)性。
(5)克隆根據(jù)有限稀釋，對(duì)呈現(xiàn)陽(yáng)性的雜交瘤進(jìn)行克隆。以這種方法，從使用短乳桿菌為抗原的雜交瘤獲得4個(gè)產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。其中，一株命名為“BLb2F37”并且于1998年7月8日保藏在國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology,Agency ofIndustrial Science and Technology,Ministry of InternationalTrade and Industry)(保藏號(hào)FERM P-16884)。該菌株進(jìn)一步在1999年6月4日在國(guó)際保藏單位國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-8566，日本)進(jìn)行“國(guó)際保藏”(國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-6744)。還從使用林氏乳桿菌為抗原的雜交瘤獲得生產(chǎn)單克隆抗體的兩個(gè)雜交瘤。其中，一株命名為“BG3A5b4”并且于1998年7月8日保藏在國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(保藏號(hào)FERM P-16885)。該菌株進(jìn)一步在1999年6月4日在國(guó)際保藏單位國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566，日本)進(jìn)行“國(guó)際保藏”(國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-6745)。另外，從使用有害片球菌為抗原的雜交瘤獲得生產(chǎn)單克隆抗體的兩個(gè)雜交瘤。其中一株命名為“PQ3H8a9”,并且于1998年7月8日保藏在國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(保藏號(hào)FERM P-16886)。該菌株進(jìn)一步在1999年6月4日在國(guó)際保藏單位國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科學(xué)技術(shù)局國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3,Higashi 1chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566，日本)進(jìn)行“國(guó)際保藏”(國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-6746)。
(6)制備單克隆抗體培養(yǎng)所述雜交瘤直到大約80％的細(xì)胞矮化并且看起來(lái)帶黑色，然后離心取出細(xì)胞。4℃下以與培養(yǎng)上清液相當(dāng)量的量緩慢向其中加入飽和的硫酸銨。離心后，棄除上清液。沉淀物再溶解于PBS后，在4℃下將溶解的溶液對(duì)PBS透析過(guò)夜制備單克隆抗體。
(7)測(cè)定抗體特異性研究上面獲得的單克隆抗體(BLb2F37,BG3A5b4，和PQ3H8a9抗體)對(duì)下面在啤酒釀造廠和研究實(shí)驗(yàn)室分離的菌株的特異性44株表現(xiàn)出使啤酒腐敗，18株表現(xiàn)出不使啤酒腐敗，都屬于短乳桿菌；7株表現(xiàn)出使啤酒腐敗并且屬于林氏乳桿菌；3株表現(xiàn)出使啤酒腐敗，1株表現(xiàn)出不使啤酒腐敗，都屬于有害片球菌；47株其它乳酸細(xì)菌，表現(xiàn)出不使啤酒腐敗，包括干酪乳桿菌，Lactobacillus parvus，植物乳桿菌，食果糖乳桿菌，棒狀乳桿菌，嗜酸乳桿菌，布氏乳桿菌，丘狀菌落乳桿菌，希氏乳桿菌，Lactobacillus kandleri，高加索酸奶乳桿菌，戊糖片球菌和糊精片球菌。
培養(yǎng)各菌株并且收獲細(xì)胞；類似于(4)中描述的方法，使用它們來(lái)測(cè)定抗各菌株的反應(yīng)性。這里，啤酒腐敗菌株在啤酒中生長(zhǎng)，非啤酒腐敗菌株在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。作為對(duì)照，使用不使啤酒腐敗的干酪乳桿菌AHU1057的菌株。AHU1057情況下的吸收度認(rèn)為是空白，而表現(xiàn)出0.08或更高值的那些判斷為“反應(yīng)”。表1給出了結(jié)果。
表1

從表1明顯看出，BLb2F37抗體表現(xiàn)出抗所有啤酒腐敗短乳桿菌和大多數(shù)有害片球菌的反應(yīng)性，但是對(duì)非啤酒腐敗短乳桿菌和其它非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌，包括對(duì)有害片球菌，沒(méi)有表現(xiàn)出反應(yīng)性。BG3A5b4抗體對(duì)所有啤酒腐敗林氏乳桿菌表現(xiàn)出反應(yīng)性，但是對(duì)非啤酒腐敗菌沒(méi)有反應(yīng)性。PQ3H8a9抗體表現(xiàn)出抗所有啤酒腐敗有害片球菌和大多數(shù)啤酒腐敗短乳桿菌的反應(yīng)性，但是對(duì)非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌沒(méi)有表現(xiàn)出反應(yīng)性，除了非啤酒腐敗有害片球菌的一個(gè)菌株外。
從這些發(fā)現(xiàn)認(rèn)識(shí)到，上述抗體可以用來(lái)特異性檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌，即不與非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌反應(yīng)。此外，已表明當(dāng)結(jié)合使用三種類型的抗體時(shí)，可以特異性檢測(cè)所有啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。
實(shí)施例2[獲得的單克隆抗體的分類測(cè)定]使用市售的試劑盒(從Amersham Inc.購(gòu)得的小鼠單克隆抗體同型試劑盒)來(lái)研究實(shí)施例1中獲得的三種抗體的類和亞類，和L-鏈的類型。表2給出了結(jié)果。
表2

實(shí)施例3[快速鑒定方法和鑒定試劑盒]通過(guò)上述方法獲得用來(lái)識(shí)別啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的三種類型的單克隆抗體。
(1)制備安裝有過(guò)濾器(已經(jīng)封閉)的離心管向帶有過(guò)濾器(SUPRECTM-01，從Takara Shuzo Co.Ltd.購(gòu)得)加入1％的酪蛋白(于PBS中)100μl。室溫下靜置1小時(shí)后，使用半徑16.5cm的甩平式離心機(jī)以2000rpm離心5分鐘。接著加入200μl清洗溶液(10mM Tris-HCl/pH8.0/0.05％Tween20)，以2000rpm離心10分鐘。這樣就產(chǎn)生帶有過(guò)濾器(已經(jīng)封閉)的離心管，在4℃下貯存。
(2)抗體溶液分別稀釋抗體BLb2F37(抗體溶液Ⅰ)，抗體BG3A5b4(抗體溶液Ⅱ)和抗體PQ3H8a9(抗體溶液Ⅲ)，這樣給出類似水平的背景。將過(guò)氧化物酶-綴合的山羊抗小鼠IgG-IgM(H+L)(從Wako純化學(xué)品有限公司購(gòu)得)稀釋50-倍?；旌?體積份數(shù)的前者，5體積份數(shù)的后者，7體積份數(shù)的1％酪蛋白(于PBS中)和33體積份數(shù)的PBS，分成小的等份在-20℃保存。各溶液標(biāo)記為抗體溶液Ⅰ至Ⅲ。
對(duì)于每一個(gè)帶有過(guò)濾器的離心管使用這些溶液各50微升。
(3)洗滌溶液對(duì)于每個(gè)過(guò)濾器裝置使用含有0.05％Tween20的10mM Tris-HCl(pH8.0)350微升。
(4)顯色和猝滅溶液使用過(guò)氧化物酶(OPD)的顯色試劑盒(從Sumitomo BakeliteCo.Ltd.購(gòu)得)。對(duì)于每一個(gè)帶有過(guò)濾器的離心管使用溶解于5ml底物溶液中的顏色固定劑(1片)50微升。使用相同量的猝滅溶液。
(5)一接種環(huán)的在啤酒中培養(yǎng)之后的NBB斜面中保存的啤酒腐敗菌或者一接種環(huán)的NBB斜面中保存的非啤酒腐敗菌懸浮于100μl生理鹽水中，向三個(gè)過(guò)濾裝置各加入25μl，使分別與抗體溶液Ⅰ至Ⅲ反應(yīng)。進(jìn)行洗滌和顯色。接著，在非啤酒腐敗菌情況下，所有三種過(guò)濾裝置觀察到幾乎相似的弱顯色；在啤酒腐敗菌情況下，觀察到一個(gè)或兩個(gè)過(guò)濾裝置比剩下的過(guò)濾裝置顯示出明顯強(qiáng)的顯色。參見(jiàn)圖1。
獲得的結(jié)果表明，如果使用本發(fā)明方法，則試驗(yàn)菌的量不一定需要精確，并且當(dāng)判斷細(xì)菌為啤酒腐敗菌時(shí)，以試管(抗體)顯示的顏色為基礎(chǔ)有可能鑒定其類型。
此外，當(dāng)對(duì)表1中列出的所有乳酸細(xì)菌應(yīng)用這種快速鑒定方法時(shí)，獲得的結(jié)果與表1所示的抗體反應(yīng)性不相矛盾，盡管在圖中沒(méi)有給出。
此外，已清楚地表明根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定方法，用一接種環(huán)水平的細(xì)菌量可能進(jìn)行足夠的判斷。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明應(yīng)用廣泛。本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出抗啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的反應(yīng)性，但是對(duì)非啤酒腐敗乳酸細(xì)菌沒(méi)有反應(yīng)性；因此，它們用于快速，方便和高精確性檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。另外，因?yàn)楸景l(fā)明的抗體是單克隆抗體，因此可以重復(fù)制備，它們用作檢測(cè)啤酒腐敗菌的試劑。此外，通過(guò)組合本發(fā)明的抗體，有可能檢測(cè)認(rèn)為有問(wèn)題的所有類型的乳酸細(xì)菌。而且，根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定方法和試劑盒使用市售的安裝有過(guò)濾器的離心管并且利用了本發(fā)明三種抗體具有的特異性的優(yōu)點(diǎn)。這使得方便而精確地判斷對(duì)用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)出現(xiàn)的乳酸細(xì)菌的啤酒腐敗能力。
明顯地，從上面的教導(dǎo)出發(fā)，本發(fā)明的多種改變和變化是可能的。因此要理解在后面的權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)，除了這里具體說(shuō)明的以外，也可以以其它方式實(shí)施本發(fā)明。
本發(fā)明以1998年7月22日提交的日本專利申請(qǐng)系列號(hào)平10-206484和1999年1月11日提交的日本專利申請(qǐng)系列號(hào)平11-4096為基礎(chǔ)，其全文在這里引作參考。
權(quán)利要求
1．一種能檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體，其中所述抗體是通過(guò)下面的方法產(chǎn)生的在啤酒中生長(zhǎng)具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌，用生長(zhǎng)的乳酸細(xì)菌免疫非人的哺乳動(dòng)物，和從該哺乳動(dòng)物分離抗體。
2．權(quán)利要求1的抗體，其是抗血清或者其純化產(chǎn)物。
3．權(quán)利要求1的抗體，其中所述乳酸細(xì)菌能在厭氧條件下同化葡萄糖。
4．權(quán)利要求1的抗體，其中所述乳酸細(xì)菌選自啤酒腐敗短乳桿菌，啤酒腐敗林氏乳桿菌和啤酒腐敗有害片球菌。
5．權(quán)利要求1的抗體，其是能與具有啤酒腐敗能力的啤酒腐敗乳酸細(xì)菌反應(yīng)但是與不具有啤酒腐敗能力的啤酒腐敗菌不反應(yīng)的單克隆抗體。
6．產(chǎn)生權(quán)利要求5的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
7．權(quán)利要求6的雜交瘤細(xì)胞系，其是BLb2F37(FERM BP-6744)。
8．權(quán)利要求6的雜交瘤細(xì)胞系，其是BG3A5b4(FERM BP-6745)。
9．權(quán)利要求6的雜交瘤細(xì)胞系，其是PQ3H8a9(FERM BP-6746)。
10．一種檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的方法，包括用權(quán)利要求1的抗體接觸樣品，和分析抗體和乳酸細(xì)菌之間復(fù)合體的形成，其中存在復(fù)合體表明樣品中存在該細(xì)菌，和不存在復(fù)合體表明樣品中不存在該細(xì)菌。
11．權(quán)利要求10的方法，其中抗體是由選自雜交瘤細(xì)胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
12．權(quán)利要求10的方法，其中抗體是由雜交瘤細(xì)胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)產(chǎn)生的單克隆抗體的組合。
13．權(quán)利要求10的方法，其中啤酒腐敗乳酸細(xì)菌是選自短乳桿菌，林氏乳桿菌和有害片球菌中的至少一員。
14．一種檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的試劑盒，包括(1)包括截留細(xì)菌的過(guò)濾器的離心管；(2)權(quán)利要求1的抗體；(3)抗所述單克隆抗體的第二抗體或抗體-樣物質(zhì)，其用酶標(biāo)記；和(4)與該第二抗體或抗體一樣物質(zhì)的標(biāo)記酶反應(yīng)并顯色的底物。
15．權(quán)利要求14的試劑盒，其中抗體是由選自雜交瘤細(xì)胞系BLb2F37(FERM BP-6744),BG3A5b4(FERM BP-6745)和PQ3H8a9(FERMBP-6746)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
16．一種制備權(quán)利要求1的抗體的方法，包括在啤酒中生長(zhǎng)具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌，用生長(zhǎng)的乳酸細(xì)菌免疫非人的哺乳動(dòng)物，和從該哺乳動(dòng)物分離抗體。
17．一種制備權(quán)利要求6的雜交瘤的方法，包括用在啤酒中具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌免疫哺乳動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物不是人并具有脾，和使該哺乳動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。
全文摘要
本發(fā)明涉及能檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體。具有啤酒腐敗能力的乳酸細(xì)菌在啤酒中生長(zhǎng),免疫哺乳動(dòng)物產(chǎn)生用于檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌的抗體,并且使用該抗體檢測(cè)啤酒腐敗乳酸細(xì)菌。用來(lái)產(chǎn)生抗體的乳酸細(xì)菌是短乳桿菌,林氏乳桿菌和有害片球菌。雜交瘤細(xì)胞系是BLb2F37(BP－6744),BG3A5b4(BP－6745)和PQ3H8a9(BP－6746)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1309665SQ99808736
公開(kāi)日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月22日
發(fā)明者土屋陽(yáng)一 申請(qǐng)人:札幌啤酒株式會(huì)社