專利名稱：關(guān)于提高病毒滴度的材料與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與提高病毒滴度有關(guān)的材料與方法。特別是，但不是唯一地，本發(fā)明涉及從包裝細胞上清液中純化和濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒的新方法。本發(fā)明也涉及這些方法在導(dǎo)向特定組織、疾病治療領(lǐng)域和篩查與診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因治療需要可釋放大量傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，和/或提高逆轉(zhuǎn)錄病毒/靶細胞相互作用效率的方法(優(yōu)選地同時采用這兩種方法)。優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有效滴度的努力集中于以下三種策略。
1)設(shè)計新的載體構(gòu)建體，它們將用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA的更有效的表達和包裝1，2。通過離心6或人補體5，6，它們與能產(chǎn)生更多逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的新一代包裝細胞系偶聯(lián)3-5，也可能具有更廣的靶細胞趨向性(trophism)3，5，6，并且對滅活有更強的抗性。
2)改進最佳逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒生產(chǎn)的培養(yǎng)條件和逆轉(zhuǎn)錄病毒/靶細胞相互作用的效率。提高逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)量的方法包括可相互傳染的包裝細胞的“乒乓”機制7、超感染8、靶細胞9或包裝細胞在32℃時的培養(yǎng)10，有時加入組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鈉11。分泌到上清液中后，通過與聚陽離子(如polybrene和魚精蛋白硫酸酯)溫育12，13，逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與脂質(zhì)體或脂質(zhì)體脂類復(fù)合14，培養(yǎng)上清液的流通15和低速離心逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與其靶細胞9，10，能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染靶細胞的可能性。通過在排除磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10，或加入纖連蛋白及其截短衍生物16，也能使靶細胞更易感染。
3)上述多種方法能與濃縮或純化的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合。曾經(jīng)報道，使逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液通過分子量截止濾器9，17，20，凍干，與磷酸鈣共沉淀21，能減少上清液體積而保持逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染性。然而，也能通過濃縮可抑制感染22或?qū)Π屑毎卸拘?1的其它成分，實現(xiàn)這種減少。這種發(fā)展是由于離心作為完整傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種純化方法的限制?！敖?jīng)典方法”的不同形式包括以18000g超離心可達16小時23，似乎效果極好。然而，能夠純化的上清液體積相對較少，傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒的回收率較低，使用低滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒時該方法效果最好23。文獻中提到的其它變型使用速度降低的離心24-26(可低至3000g)，而保持時間長度，或者提高g值并減少時間19。然而離心有許多優(yōu)點，它易于進行，在不與感染抑制劑共純化的情況下能減少上清液體積。離心濃縮有許多潛在的優(yōu)點，因此已經(jīng)設(shè)計了用于生產(chǎn)假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細胞，主要考慮對離心應(yīng)力滅活的抗性4，6。這種VSV-G(水泡性口炎病毒G)假型載體能50000g離心90分鐘6，27，使體積減少可達2000倍，而傳染性病毒的回收率高于70％6。
如果沒有用于VSV-G假型之外的載體的最佳逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮方案，人們不能簡單地通過使用較多的上清液來提高用于靶細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的數(shù)量。這是由于37℃下5-7小時的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體半衰期與在此期間它接觸靶細胞的可能性之間的平衡。僅僅通過布朗運動移動的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒在一個半衰期內(nèi)不可能移動600μm以上28。因此，在1ml的靜置培養(yǎng)物中，多達90％的逆轉(zhuǎn)錄病毒可能不能用于感染。由于靶細胞利用性有限，人們不能使用足夠數(shù)量的細胞與所有可用的逆轉(zhuǎn)錄病毒有效地相互作用。
發(fā)明概述本發(fā)明者認為，需要有提高病毒滴度，從而增加可用于感染的病毒數(shù)量的方法。因此，在上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例中，為了充分利用不可能接觸細胞的90％的逆轉(zhuǎn)錄病毒，發(fā)明者設(shè)計了使用能與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)合成員的方法。然后能從包裝細胞上清液中有效收集該復(fù)合物。發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)，短時低速離心能實現(xiàn)這種收集，使得在體積只減少200倍后，滴度至少提高1000-2000倍。
因此，本發(fā)明提供一種提高含病毒顆粒樣品的病毒滴度的方法，該方法包括使樣品接觸能與病毒顆粒結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)合成員；濃縮該復(fù)合物，例如通過離心樣品；必要時測定病毒滴度。
病毒滴度的提高不會引起樣品中病毒數(shù)量的增加。實際上，不必知道樣品中病毒的準確數(shù)量，對于本發(fā)明，病毒滴度的提高肯定是病毒感染靶細胞的數(shù)量和可能性的函數(shù)。因此，濃縮后病毒滴度的提高可根據(jù)靶細胞的傳染性確定。
為方便起見，下文參照逆轉(zhuǎn)錄病毒說明了本發(fā)明及其各方面。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，本發(fā)明適用于所有病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒假型包裝細胞系，例如具有vsvg假型包膜的MoMulv載體。例如，發(fā)明者特別關(guān)注逆轉(zhuǎn)錄病毒科，它在復(fù)制病毒中包含ssRNA、陽性有義、非節(jié)段基因組、包膜和DNA步驟。逆轉(zhuǎn)錄病毒科的亞科包括腫瘤病毒亞科(即莫洛尼鼠白血病病毒)、慢病毒亞科(即HIV和其它慢病毒載體)和泡沫病毒亞科。
然而，本發(fā)明也適用于其它病毒科，如皰疹病毒科(dsDNA和包膜病毒)，例子包括單純皰疹病毒、EB病毒、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。
其它科包括腺病毒科(ds和非包膜病毒)，例子包括腺病毒和腺病毒載體，如基于Ad.5的；乳頭多瘤空泡病毒科(ds和非包膜病毒)，例如猿空泡病毒40和多瘤病毒；小RNA病毒科(ssRNA+有義，非包膜，非節(jié)段病毒)，例如腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒；彈狀病毒科(ssRNA，-ve有義，非節(jié)段，包膜病毒)，例如水泡性口炎病毒；痘病毒科(dsDNA，非包膜病毒)，例如痘病毒(天花)和牛痘。本發(fā)明適用的其它科包括沙粒病毒科、雙RNA病毒科、布尼亞病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科、嗜肝DNA病毒科、虹色病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、細小病毒科、呼腸病毒科、披膜病毒科。此清單并非全部。如上所述，為方便起見，下文涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒。
按照上述方法，希望將逆轉(zhuǎn)錄病毒與結(jié)合成員分離。然而，本發(fā)明者已經(jīng)確定了大量結(jié)合成員，它們可用于上述方法，不需與逆轉(zhuǎn)錄病毒分離，逆轉(zhuǎn)錄病毒即可保持有效的傳染性。以下作為本發(fā)明的一個方面描述。
例如，在本發(fā)明的第一方面，發(fā)明者設(shè)計了一種使用便宜、易于獲得、顆粒性、稠密底物的方法。當包裝細胞上清液中的逆轉(zhuǎn)錄病毒與過量底物混合時，形成逆轉(zhuǎn)錄病毒/底物復(fù)合物，其足夠稠密，在病毒半衰期內(nèi)在靜置培養(yǎng)中因重力而沉淀。必要時這種復(fù)合物也能進行短時低速離心，以進行逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮。使用這種顆粒性稠密底物，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)病毒意外地保持傳染性，促進其釋放不需要特殊處理，這種無毒底物能在培養(yǎng)物中長時間保留，足以引起最佳逆轉(zhuǎn)錄病毒/靶細胞的相互作用14，29。
因此，本發(fā)明提供一種提高樣品中逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的方法，包括向樣品中加入一種能與逆轉(zhuǎn)錄病毒形成復(fù)合物的稠密、顆粒性底物；離心樣品以濃縮該復(fù)合物；根據(jù)靶細胞的傳染性，確定逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃度。
優(yōu)選地，這種稠密、顆粒性底物是Pansorbin，一種加熱殺死的福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌，盡管也可使用其它底物，如Sansorbin。情況可能是，其它細菌具有與Pansorbin和Sansorbin相同的能力。這可能是基于細菌表面存在的纖連蛋白結(jié)合蛋白(fnb)，fnb型蛋白質(zhì)可以在不同細菌中表達。因此，根據(jù)此處所述，技術(shù)人員能確定其它合適的稠密、顆粒性底物。
如下文“發(fā)明詳述”部分所述，發(fā)明者證實，從鼠成纖維細胞衍生的PG13包裝細胞(Gibbon Apc白血病病毒[GaLv]包膜蛋白假型)釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒能有效濃縮為傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。PG13衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒自發(fā)地與加熱殺死的福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(Pansorbin)復(fù)合。這種復(fù)合物能夠離心濃縮，結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒保留感染靶細胞的能力，而不需要促進其釋放的預(yù)先措施。
Kayman S.C.等人(J.Virology.99年3月，第1802-1808頁)描述了使用Pansorbin排除(或負富集)野生型病毒的上清液，盡管他們沒有涉及提高逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。然而，與本發(fā)明不同，該作者使用針對以前插入病毒(SC258)env基因中的表位的抗體，將其與病毒和Pansorbin混合，這是根據(jù)抗體的Fc將與Pansorbin上的蛋白A結(jié)合。作者認為，正富集需要從結(jié)合態(tài)回收傳染性病毒，而且用來破壞抗體-抗原復(fù)合物的標準條件對逆轉(zhuǎn)錄病毒是致死的。與之相反，本發(fā)明者驚奇地確定，對于逆轉(zhuǎn)錄病毒保持傳染性，逆轉(zhuǎn)錄病毒和Pansorbin的復(fù)合物不需要破壞。因此，Pansorbin或其它類似的顆粒性、稠密底物，例如Sansorbin，可用于幫助提高病毒滴度，而濃度乃至傳染性不丟失，因為能夠避免與逆轉(zhuǎn)錄病毒形成的復(fù)合物的破壞。
本發(fā)明者認為，在Pansorbin中使用的、最近克隆的存在于金黃色葡萄球菌Cowan I株表面的纖連蛋白結(jié)合蛋白(fnbA32和fnbB33)能解釋觀察到的這種結(jié)合，以及感染能力的保持。這些蛋白質(zhì)可與PG13包裝細胞基于的NIH 3T3細胞分泌的鼠纖連蛋白相互作用。上清液中的纖連蛋白然后可與PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒結(jié)合。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒似乎不直接與Pansorbin相互作用，而是通過纖連蛋白中間物結(jié)合。已知這種纖連蛋白相互作用加強而不是抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染性，并且可以解釋當與Pansorbin復(fù)合時逆轉(zhuǎn)錄病毒為何保持傳染性。
盡管該方法對于PG13、PA317和GP+envAM12產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒十分有效，但是使用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒(如基于NIH 3T3的GP+E-86和基于人HT1080的FLYRD18和A13包裝細胞)的結(jié)果并不令人滿意。
因此，本發(fā)明者設(shè)計了另一種方法作為本發(fā)明的第二方面，前提是能利用抗纖連蛋白抗體從上清液中捕獲逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，結(jié)合成員是一種針對可與病毒結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體或抗體結(jié)合域。該抗體可以針對實際存在于病毒表面上的蛋白質(zhì)，或者可以針對可與病毒結(jié)合的蛋白質(zhì)，即具有逆轉(zhuǎn)錄病毒自然結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)。
當抗體結(jié)合成員不是稠密底物時，能通過靜置培養(yǎng)利用重力或通過短時低速離心濃縮形成的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的第二方面也提供捕獲劑捕獲復(fù)合物使其濃縮的用途。這類捕獲劑的例子包括可利用磁體濃縮的順磁顆粒(PMP)(Promega；其它供應(yīng)商包括Dynal，MiltenyiBiotec)。也能使用非磁珠，只要它們較小，例如為1μm數(shù)量級，并且對低速離心敏感。在此處所述實施例中，所述抗體針對鼠纖連蛋白，發(fā)明者使用與多克隆兔抗小鼠纖連蛋白抗體偶聯(lián)的鏈霉親和素包被的順磁顆粒，根據(jù)與鼠纖連蛋白的結(jié)合，磁性純化PG13產(chǎn)生的顆粒。發(fā)明者表示，抗體可通過其Fc域結(jié)合蛋白A。蛋白A可通過生物素結(jié)合PMP形成復(fù)合物。此外也可使用生物素化的多克隆抗體。
因此，本發(fā)明的第二方面需要使用可與捕獲劑結(jié)合的第一種偶聯(lián)配偶體，例如鏈霉親和素；和可與抗體結(jié)合域結(jié)合的第二種偶聯(lián)配偶體，例如生物素。技術(shù)人員能夠設(shè)計可與本發(fā)明聯(lián)合使用的其它偶聯(lián)配偶體。
然而，根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法只適用于分泌纖連蛋白并產(chǎn)生具有纖連蛋白結(jié)合活性的病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)的鼠包裝細胞。因此，為了提供更加通用的策略，發(fā)明者改進了這一方法，使用基于凝集素的親和捕獲方法，這將親和捕獲策略的適用范圍擴展到其它病毒包裝細胞，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，如人HT1080衍生的包裝細胞。這基于以下發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白被包裝細胞特異地糖基化，這些細胞釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒的表面修飾反映了這一事實。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第三方面，結(jié)合成員是一種能結(jié)合病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)表面上糖基化蛋白質(zhì)的凝集素。發(fā)明者第一次認識到，該方法可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒的表面蛋白質(zhì)(例如包膜蛋白)的翻譯后糖基化修飾，而不需要為了保持傳染性從結(jié)合成員釋放。在下文關(guān)于本發(fā)明該方面的實施例中，使用的凝集素是從Bandeiraea Simplicifolia分離的同工凝集素B4(BS-IB4)(結(jié)合人類中不存在的α-半乳糖基)或主要結(jié)合α-甘露糖修飾的琥珀酰-伴刀豆球蛋白A。也可以使用技術(shù)人員所知的可與糖基化位點結(jié)合的其它凝集素，例如PHA。
對于本發(fā)明的第二方面，可能需要捕獲劑捕獲凝集素/逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物，以便在靜置培養(yǎng)中通過重力或通過短時低速離心濃縮。捕獲劑優(yōu)選地是順磁顆粒。
關(guān)于本發(fā)明的第二和第三方面，捕獲劑需要一種能捕獲復(fù)合物(例如偶聯(lián)配偶體，如抗體/逆轉(zhuǎn)錄病毒或凝集素/逆轉(zhuǎn)錄病毒)的機制。該機制可由偶聯(lián)配偶體引起，如生物素/生物胞素-親和素/鏈霉親和素、受體-配體、抗體-抗原等。于是可以設(shè)計復(fù)合物，使它進一步含有偶聯(lián)配偶體的一個成員，例如生物素，并且可以設(shè)計捕獲劑，使其含有偶聯(lián)配偶體的另一個成員，例如鏈霉親和素。這樣，當復(fù)合物與捕獲劑接觸時，偶聯(lián)配偶體結(jié)合(生物素結(jié)合鏈霉親和素)，從而連接復(fù)合物與捕獲劑。
還存在其它實例。例如，本發(fā)明者使用可與抗體Fc區(qū)結(jié)合的蛋白A。因此可以使用一種可結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗體，它對逆轉(zhuǎn)錄病毒表面存在的蛋白質(zhì)是特異性的。蛋白A可以生物素化，使其被捕獲劑(例如鏈霉親和素包被的PMP)捕獲，并與抗體/逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸?？贵w的Fc區(qū)和蛋白A用作偶聯(lián)配偶體，并用于使抗體/逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物與捕獲劑(PMP)接觸。技術(shù)人員應(yīng)當理解，蛋白G和蛋白L同樣可以代替蛋白A使用。
利用偶聯(lián)配偶體，例如配體，優(yōu)選地將其與捕獲劑(如PMP)結(jié)合，之后導(dǎo)入病毒上清液中。這樣能優(yōu)化捕獲劑/偶聯(lián)配偶體與上清液中的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物之比。
最后，發(fā)明者研究了第四種策略，它適用于所有病毒，優(yōu)選地是當前可以獲得的(和尚未發(fā)展的)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞型。除了包裝細胞特異的逆轉(zhuǎn)錄病毒翻譯后修飾外，發(fā)明者還研究了包括向逆轉(zhuǎn)錄病毒表面引入修飾的對蛋白質(zhì)更有效(proactive)的方法。該方法使用琥珀酰酯(例如，生物素琥珀酰酯)的蛋白質(zhì)特異的共價偶聯(lián)活性。生物素修飾包裝細胞的表面蛋白產(chǎn)生可被例如鏈霉親和素PMP有效捕獲的傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。
發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)配偶體可用來向逆轉(zhuǎn)錄病毒表面表添加結(jié)合成員。這優(yōu)選地利用琥珀酰酯衍生物實現(xiàn)，它能將生物素與包裝細胞表面的蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)。這些生物素化細胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒例如與捕獲劑上的鏈霉親和素親和偶聯(lián)。
因此，本發(fā)明的第五方面提供了一種修飾病毒顆粒，以便于從含有這種修飾病毒顆粒的樣品中捕獲，以提高其滴度的方法，該方法包括在病毒包裝細胞表面添加偶聯(lián)配偶體的步驟，使包裝細胞產(chǎn)生的病毒顆粒在其表面上展示這種偶聯(lián)配偶體。
根據(jù)本發(fā)明的方法不僅可使病毒從包裝細胞上清液中濃縮為升高的滴度，而且具有使用此處所述結(jié)合配偶體帶來的其它優(yōu)點。
例如，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒不需要從結(jié)合表面分離才具有傳染性。進而，發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，捕獲劑/結(jié)合成員/病毒復(fù)合物能夠冷凍。盡管融化過程將丟失可達50％的逆轉(zhuǎn)錄病毒活性，但這大大優(yōu)于已知的其它方法。另外，由于根據(jù)本發(fā)明的方法逆轉(zhuǎn)錄病毒的初始濃度較高但體積較小，與未濃縮的病毒相比，只使用極少量的冷凍溶液，例如DMSO。這在治療因DMSO毒性的患者中極有價值。
發(fā)明者進一步認為，根據(jù)本發(fā)明形成的復(fù)合物可用于疾病的治療。例如，PMP/逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物可用于體內(nèi)導(dǎo)向。使用適當?shù)腜MP將允許利用NMR聚焦所需的磁場將其分離到特定區(qū)域。
因此，本發(fā)明也提供根據(jù)上述方法形成的復(fù)合物在制備用于向組織體內(nèi)導(dǎo)向病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)的藥物中的用途。此處，本發(fā)明提供一種向人體或動物(哺乳動物)體內(nèi)組織導(dǎo)向逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物的方法，該復(fù)合物含有逆轉(zhuǎn)錄病毒和磁性顆粒，該方法包括對人體或動物體施用該復(fù)合物，并利用磁場將復(fù)合物吸引到組織。
也提供另一種導(dǎo)向組織的方法，它使用對結(jié)合成員或捕獲劑的任何空余的結(jié)合能力。例如，如果根據(jù)本發(fā)明的第四方面修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒表面使其攜帶生物素，它可被鏈霉親和素PMP捕獲。然而，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，不是所有的鏈霉親和素都結(jié)合。因此，生物素化的抗特定組織抗原的抗體也可以通過鏈霉親和素-生物素偶聯(lián)配偶體與PMP結(jié)合。這樣，抗體將與特定組織抗原結(jié)合，從而使結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒與該組織接觸。此外，蛋白A也可用來結(jié)合抗體的Fc域。組織抗原可以是對選擇用于導(dǎo)向的組織類型特異的任何已知抗原。在一個實施方案中，組織抗原可以是一種腫瘤抗原，它可使逆轉(zhuǎn)錄病毒與特定腫瘤接觸。逆轉(zhuǎn)錄病毒可進一步修飾，以攜帶外源核酸用于基因治療。該方法具有逆轉(zhuǎn)錄病毒不需要根據(jù)導(dǎo)向的組織類型修飾的優(yōu)點。
發(fā)明者也認為，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于病毒的標記或鑒定。例如，上述捕獲劑和/或偶聯(lián)配偶體可用來從生物樣品(如血液、血清、尿、精液等)中鑒定或分離病毒?？梢詮难獦又杏行崛IV病毒。這可提供敏感性提高(提高約100倍)的HIV檢測。此外，該方法也可與用來處理生物樣品的其它技術(shù)結(jié)合使用。例如，在透析過程中可以利用捕獲劑和/或偶聯(lián)配偶體從血清中去除病毒。
因此，另一方面，本發(fā)明提供一種從樣品(例如血液)中分離或去除病毒的方法，該方法包括下列步驟(a)使樣品接觸能特異結(jié)合該病毒的結(jié)合成員，使該病毒和結(jié)合成員形成復(fù)合物；(b)使該復(fù)合物接觸一種能捕獲該復(fù)合物的捕獲劑；和(c)從樣品中分離或去除該復(fù)合物和捕獲劑。
如上所述，捕獲劑可以通過偶聯(lián)配偶體(如生物素和鏈霉親和素)捕獲復(fù)合物。如果捕獲劑是PMP，可以利用磁場將它與它捕獲的復(fù)合物一起去除。捕獲劑也可以是偶聯(lián)配偶體(如鏈霉親和素)包被的固體載體，樣品在其上流過。如果結(jié)合成員是可與偶聯(lián)配偶體(如生物素)結(jié)合的抗體或凝集素，它將與固體載體偶聯(lián)，從而從樣品(如血液、尿或血清)中去除或分離復(fù)合物。
此處描述了適用于鼠源和人源包裝細胞上清液的本發(fā)明每一方面的詳細方法。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種試劑盒，或一種試劑盒在實施根據(jù)上述方法提高包裝細胞上清液逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的方法中的用途；該試劑盒含有一種能與病毒結(jié)合的結(jié)合成員，和任選地如上所述的一種捕獲劑和/或偶聯(lián)配偶體。該試劑盒也可含有實施本發(fā)明的方法的說明書。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的組件的實例有順磁珠、磁體、蛋白A-生物素復(fù)合物、抗鼠纖連蛋白抗體、抗人纖連蛋白抗體、伴刀豆球蛋白A-生物素復(fù)合物、BSI-B4-生物素復(fù)合物、生物素琥珀酰亞胺酯和洗滌緩沖液。
現(xiàn)在將通過實施例，參照


本發(fā)明的各方面和實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白其它方面和實施方案。本文提到的所有文件均在此引用作為參考。
附圖簡述圖1。逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液與濃度逐漸升高的Pansorbin預(yù)溫育提高了有效滴度。在與福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌溫育后測定PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(IL-2/B7)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(T＝0，對照)或在不含Pansorbin(T＝0，對照)或含指定體積的Pansorbin時4℃溫育2小時，之后用連續(xù)稀釋的混合物感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖2。Pansorbin/逆轉(zhuǎn)錄病毒預(yù)溫育的持續(xù)使有效滴度成比例升高。5ml等份PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(IL-2/B7)上清液在不含Pansorbin下或與25μl Pansorbin溫育，在指定時間用連續(xù)稀釋的混合物感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖3。PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(IL-2/B7)上清液/Pansorbin復(fù)合物的離心濃縮。收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，采樣，連續(xù)稀釋，立即感染K562細胞(T＝0)。然后將上清液分為50ml等份，在4℃下不加其它(T＝3)、只與250μl Pansorbin(P)或250μl Sansorbin(S)溫育3小時。然后用連續(xù)稀釋的T＝3、P和S樣品感染K562細胞。另外，對5ml等份的T＝3和P樣品進行0.45μm過濾，用于感染(第二次過濾和P過濾)。然后離心濃縮所有樣品，并從T＝3和P中吸出上清液進行滴定(Cont Dep和Pdep)。T＝3的剩余上清液充分混合(如同懸浮沉淀)，用于滴定(Cont conc)。剩余的Pansorbin和Sansorbin樣品沉淀重懸浮于10ml新鮮培養(yǎng)基中，再次離心，重懸浮于最小體積的培養(yǎng)基中(比初始體積減少180倍)，進行感染(P conc和S conc)。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖4。Pansorbin介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的提高不只是對K562有效。收集PG13 IL-2/B7產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，分為50ml等份，在4℃下不加其它(T＝3)、與250μl Pansorbin(P)溫育。3小時后，用所有條件的樣品感染NB4、U937和HeLa細胞(T＝3)。如上所述離心濃縮所有Pansorbin/逆轉(zhuǎn)錄病毒樣品的剩余體積，再次用來感染NB4、U937和HeLa細胞(P conc)。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖5。Pansorbin與逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合不依賴于載體插入片段。收集PG13 RaRT產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，立即用來感染K562、NB4、U937和HeLa細胞(T＝0)。剩余的50ml上清液在Pansorbin存在下4℃溫育3小時(P)。溫育后，離心濃縮樣品，用于感染(P conc)。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖6。Pansorbin介導(dǎo)的濃縮效率隨包裝細胞型不同而不同。收集GP+envAM12IL-2/B7、PA317IL-2/B7、FLYRD18pBabe.puro、FLYA13pBabe.puro和GP+E-86pBabe.puro產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，立即對人K562或鼠32Dp210骨髓細胞滴定(對照)。剩余的樣品分為50ml(FLYRD18、FLYA13和GP+E-86)或10ml(GP+envAM12和PA317)等份，并在4℃下與250μl或50μl Pansorbin溫育。3小時后，如上所述離心濃縮樣品，再次感染靶細胞(Pansorbin濃縮物)。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖7。纖連蛋白結(jié)合的PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒的順磁顆粒介導(dǎo)的濃縮。在與順磁顆粒(PMP)溫育之前和之后測定PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(對照)，或在4℃下與2.5×109鏈霉親和素磁球(預(yù)先單獨與蛋白A-生物素偶聯(lián)，或與蛋白A-生物素和多克隆Ig兔抗小鼠纖連蛋白偶聯(lián))溫育2小時。在如上所述磁性濃縮并洗滌后，用連續(xù)稀釋的混合物感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖8。凝集素/PMP介導(dǎo)的PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲和濃縮。在與順磁顆粒(PMP)溫育之前和之后測定PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(對照)，或在4℃下與2.5×109鏈霉親和素磁球(預(yù)先與生物素化的凝集素同工凝集素4(BSI-B4)、生物素化的凝集素伴刀豆球蛋白A(ConA)偶聯(lián))溫育2小時。在如上所述磁性濃縮并洗滌后，用連續(xù)稀釋的混合物感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖9。凝集素/PMP介導(dǎo)的FLYRD18和A13逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲和濃縮。在與順磁顆粒(PMP)溫育之前和之后測定FLYRD18和A13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(對照)，或在4℃下與2.5×109鏈霉親和素磁球(預(yù)先與生物素化的凝集素同工凝集素4(BSI-B4)、生物素化的凝集素伴刀豆球蛋白A(ConA)偶聯(lián))溫育2小時。在如上所述磁性濃縮并洗滌后，用連續(xù)稀釋的混合物感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖10a。生物素琥珀酰亞胺酯/PMP介導(dǎo)的PG13逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲和濃縮。在與順磁顆粒(PMP)溫育之前和之后測定PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。未處理、DMSO溫育或生物素琥珀酰亞胺酯標記的包裝細胞的5ml等份逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(對照，DMSO，生物素SE)，或者DMSO溫育或生物素標記的包裝細胞的上清液在4℃下與2.5×109鏈霉親和素磁球溫育2小時。在如上所述磁性濃縮并洗滌后，用連續(xù)稀釋的混合物(DMSOconc，生物素SE conc)感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖10b。生物素標記的包裝細胞的流式細胞分析。PG13細胞如上所述生物素化，并在37℃下溫育過夜。在收集上清液進行逆轉(zhuǎn)錄病毒加工后，如上所述從底層取出細胞，1×106個細胞用親和素FITC標記。兩張分布圖代表單獨與載體(DMSO，實線)溫育的細胞或在親和素-FITC標記24小時前生物素化的細胞(生物素SE，虛線)。載體對照的平均熒光指數(shù)(MFI)為6.5，生物素化細胞的MFI為2000。
圖11。生物素琥珀酰亞胺酯/PMP介導(dǎo)的FLYRD18和A13逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲和濃縮。在與順磁顆粒(PMP)溫育之前和之后測定FLYRD18和A13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。未處理、DMSO溫育或生物素琥珀酰亞胺酯標記的包裝細胞的5ml等份逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即滴定(對照，DMSO，生物素SE)，或者DMSO溫育或生物素標記的包裝細胞的上清液在4℃下與2.5×109鏈霉親和素磁球溫育2小時。在如上所述磁性濃縮并洗滌后，用連續(xù)稀釋的混合物(DMSO conc，生物素SE conc)感染K562細胞。每個值代表一式三份集落計數(shù)的平均值和標準差。
圖12顯示制品的凍融。未濃縮的對照逆轉(zhuǎn)錄病毒以2-5ml等份置于-20℃下冷凍。PMP捕獲的濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒通過加入三倍體積的標準冷凍混合液(10％DMSO，20％FCS，終DMSO濃度為7.5％)并置于-20℃下冷凍。逆轉(zhuǎn)錄病毒制品盡可能快地融化，取出一等份進行檢測，其余的放回-20℃。
圖13。磁場介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細胞的定位。平板a)顯示未感染培養(yǎng)物的嘌呤霉素選擇的毒性作用，平板b)證實在沒有磁性導(dǎo)向的情況下感染均勻擴散，c)顯示靶細胞向培養(yǎng)物特定區(qū)域的有效定向感染，由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后存活的抗藥性細胞的模型證實。平板d)顯示用來引導(dǎo)局部感染的最初磁性模板，并證實定向感染非常接近地反映最初模板的形狀。
關(guān)于本發(fā)明第一方面的詳述PG13上清液與福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(Pansorbin)的溫育為了基因治療的目的，我們使用含GaLv(Gibbon Ape白血病病毒)包膜蛋白的鼠成纖維細胞衍生的假型PG13包裝細胞3。利用軟瓊脂集落計數(shù)試驗對K562細胞滴定產(chǎn)生基于MoMuLv的載體(pWZLIL2/B7M Fusagene30，賦予鹽酸殺稻瘟菌素S抗性，以后稱為IL-2/B7)的混合細胞群體。圖1中可見由這種混合群體獲得的滴度(1.95×104cfu/ml)的代表性實例(T＝0，對照)。盡管這種滴度比以前的包裝細胞大大提高，但仍不足以用于我們的目的。
發(fā)明者于是決定檢驗這樣一種假說由于已知Galv假型31逆轉(zhuǎn)錄病毒和金黃色葡萄球菌32，33附著于纖連蛋白，那么與相對較大和稠密的細菌結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒能在培養(yǎng)中在重力下沉淀，從而提高能感染靶K562細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒的局部濃度。與細胞培養(yǎng)物相容的金黃色葡萄球菌的易于獲得的來源經(jīng)加熱殺死，甲醛固定，但在表面上仍保留功能性蛋白A34，因而可能保留其它表面表達的蛋白質(zhì)活性。
圖1顯示一個實驗，它使用與Pansorbin預(yù)溫育的PG13產(chǎn)生的IL-2/B7逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。不含Pansorbin時，新鮮收獲的上清液對K562細胞的cfu/ml滴度為1.95×104±4×103/ml(T＝0，對照)。在不含Pansorbin時4℃溫育2小時后(T＝2，對照)，cfu/ml不變，為1.75×104±4×103/ml。然而，預(yù)溫育中存在Pansorbin對逆轉(zhuǎn)錄病毒的cfu/ml滴度具有劑量依賴的影響?？蛇_25μl的Pansorbin與PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體預(yù)溫育2小時使得對K562細胞的有效cfu/ml滴度提高多達3倍。
Pansorbin/逆轉(zhuǎn)錄病毒預(yù)溫育時間對傳染性的影響使用25μl Pansorbin/5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，研究了最佳預(yù)溫育時間(圖2)。溫育2小時后，Pansorbin介導(dǎo)的滴度增加達到穩(wěn)定期(5.3×104±9.5×103cfu/ml)，而不含Pansorbin的對照cfu/ml滴度保持穩(wěn)定(T＝0，9×103±1.1×103cfu/ml；2小時，8.33×103±1.7×103cfu/ml)，但在4小時后降低為5.4×103±1.1×103cfu/ml。在隨后的實驗中，常規(guī)使用3小時的溫育時間和25μl Pansorbin/5ml上清液。值得注意的是，在使用25μl Pansorbin的圖1中，2小時后cfu/ml滴度提高3倍，而在圖2中在相同條件下超過7倍。這與其它實驗(數(shù)據(jù)未顯示)一致，這類實驗平均約有5倍cfu/ml提高。
與Pansorbin復(fù)合后逆轉(zhuǎn)錄病毒的低速離心濃縮圖1和圖2所述的實驗以小體積上清液進行，但為了成為實用方法需要放大。逆轉(zhuǎn)錄病毒只在重力下的Pansorbin特異的沉淀提示，低速離心可從包裝細胞上清液中濃縮并純化逆轉(zhuǎn)錄病毒。本發(fā)明者于是將50ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液樣品與250μl Pansorbin溫育，并試圖濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒；圖3顯示一個典型實驗的結(jié)果。
溫育前的對照滴度約等于圖1和圖2中的類似滴度(1.4×104±7.5×102cfu/ml)，4℃預(yù)溫育3小時后減半為7.2×103±7.3×102cfu/ml，表明這可能是溫育時間的上限。與Pansorbin溫育3小時再次將有效cfu/ml由1.4×104提高到2.3×105(即16倍)。這部分過程的效率是最佳結(jié)合時間、逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染性降低和逆轉(zhuǎn)錄病毒或Pansorbin與容器非特異性結(jié)合之間的平衡。這可以解釋單獨預(yù)溫育在只溫育3小時后在放大形式中為何更加有效。為了證實病毒與Pansorbin物理復(fù)合，從溫育混合物中取出5ml等份，通過0.45μm濾器過濾一次，立即滴定。在不含Pansorbin情況下溫育3小時后，第二次過濾逆轉(zhuǎn)錄病毒使滴度降低38％(由7.2×103cfu/ml[T＝3]降為4.4×103cfu/ml[第二次過濾])。對Pansorbin溫育樣品(P)進行的相同處理使滴度降低97％以上(PP過濾，2.3×105cfu/ml5.4×103cfu/ml)。因此只通過過濾就能從共溫育中除去97％以上的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。
在滴定之前低速離心剩余的45ml Pansorbin逆轉(zhuǎn)錄病毒混合物，洗滌一次，重懸浮于250μl新鮮培養(yǎng)基中(體積減少180倍)，使cfu/ml為1.1×108cfu/ml(Pconc)，代表cfu/ml提高7.8×103倍。當單獨與對照上清液比較時，濃縮物中檢測到的有效滴度大大高于預(yù)期。當濃縮物和與Pansorbin溫育并不經(jīng)離心滴定的上清液相比較時，這種異常并不顯著(P conc，1.1×108cfu/mlP，2.3×105cfu/ml)，盡管在體積只減少180倍的情況下仍達到滴度提高473倍。用離心樣品(Pdep)的上面25ml上清液進行感染滴定證實，不是所有逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染性都與Pansorbin一起沉淀，在上清液中仍保留了2.7×104cfu/ml的滴度。這可能代表不與Pansorbin結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者與低速離心下不沉淀的Pansorbin結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
作為對照，也在不含Pansorbin下溫育3小時后，進行逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的離心。將不可見的沉淀重懸浮于250μl漿液中，不需要洗滌步驟(cont conc)，顯示1.6×106cfu/ml的驚人的高滴度；與對照相比提高115倍，盡管比單獨Pansorbin達到的低＞60倍。理論上，在這種條件下不可能達到68-123％的逆轉(zhuǎn)錄病毒回收率(根據(jù)與作為對照的T＝0或T＝3比較)，因為2600g 10分鐘在時間和g值上都大大低于其它任何離心方案。
為了排除B7-135的胞外Ig樣域可顯示于逆轉(zhuǎn)錄病毒表面36，37并與Pansorbin蛋白A結(jié)合的可能性，利用Sansorbin(蛋白A陰性的金黃色葡萄球菌，Wood 46)平行進行濃縮。利用Sansorbin仍能將逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮為1.15×107cfu/ml，盡管效率比Pansorbin低10倍(也在未離心的Sansorbin中見到)，但仍好于單獨的離心。這表明，Pansorbin濃縮的蛋白A成分可能主要貢獻于濃縮作用。然而，也可能是Sansorbin(Wood 46)以通常不可檢測的水平表達蛋白A，或者Wood46對纖連蛋白有較低的親和力。
逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮不是靶細胞特異的為證明該作用不是只對K562細胞特異，平行使用相同的逆轉(zhuǎn)錄病毒制品感染其它兩種人骨髓細胞系，NB4和U937，它們示于圖4，同時用分別的逆轉(zhuǎn)錄病毒制品感染人粘附上皮HeLa細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液溫育3小時后，對照物對NB4細胞的滴度極低(46±40.4)，標準差極大，這是用稀釋于1ml細胞懸液中的100μl純上清液測定的。體積減少180倍后，有效滴度升高到1.3×104cfu/ml，表示滴度只升高了282倍。
利用稀釋于1ml細胞懸液中的100μl純上清液，U937細胞根本不感染，因此對K562細胞的滴度為7.2×103cfu/ml的PG13產(chǎn)生的相同上清液(圖3)對NB4細胞的滴度減少150倍，對U937細胞的滴度為0。U937細胞的可靠感染只在濃縮后實現(xiàn)(P conc，1.3×103cfu/ml)，并且由于初始滴度為0，無法估計濃縮效率。最后，對于HeLa細胞，在160倍濃縮后，逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的初始滴度由410±46提高了超過4×103倍(P conc，1.65×106cfu/ml)。雖然病毒(對于K562、NB4和U937，同一天，相同的病毒制品)的初始滴度有很大差異，但在任何情況下通過與Pansorbin溫育和離心，滴度都會增加，盡管對于NB4不是特別有效。
逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮不是載體插入片段特異的已經(jīng)表明逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮對于其它靶細胞是有效的(盡管易變)，我們設(shè)法確定逆轉(zhuǎn)錄病毒與Pansorbin偶聯(lián)是只限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中特異插入片段(即B7-1)的作用，還是適用于PG13釋放的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。發(fā)明者擴展到研究與pWZLIL2/B7MFusagene30相同但含有另一個插入片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體spine(pWZLblast38)。該載體編碼一種不含信號肽的截短基因，被稱為RaRT(截短的視黃酸受體α)。圖5顯示，這種PG13生產(chǎn)細胞混合群體釋放能以相同方式濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒。過濾后立即對K562細胞滴定顯示滴度為1.25×105cfu/ml(比IL-2/B7約高10倍)。Pansorbin介導(dǎo)的離心濃縮在體積減少200倍后使滴度提高到7.7×108cfu/ml(Pconc，提高6333倍)。通過離心(和洗滌)濃縮對照逆轉(zhuǎn)錄病毒證實，在體積減少200倍的情況下，滴度提高50倍(6.6×106±8.6×105cfu/ml)(數(shù)據(jù)未作圖)。
同樣濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒制品當用來感染NB4細胞時，也顯示有限的滴度升高(875倍)(T＝05.6×103cfu/ml，P conc4.9×106cfu/ml)。在這種情況下，該病毒上清液對U937的初始滴度為9.4×103cfu/ml，在P conc中升高到4.65×107cfu/ml(4900倍)。初始滴度為3.35×104cfu/ml的HeLa細胞顯示滴度并不顯著地提高約2500倍。逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮不是PG13特異的Pansorbin介導(dǎo)的濃縮用PG13釋放的不同載體進行，對K562靶細胞不是特異性的。表1顯示了對當前其它包裝細胞系和不同插入片段的有限調(diào)查。PG13包裝細胞似乎最有效地濃縮(3500倍，體積減少200倍)。然而，僅次于它的是GP+envAM1239(當對200倍濃縮標準化時，滴度提高3500倍)和PA31740(當對200倍濃縮標準化時，滴度提高1500倍)。鼠成纖維細胞衍生的包裝細胞似乎以完全不同的方式對人肉瘤細胞衍生的FLY5包裝細胞反應(yīng)，對于后者Pansorbin介導(dǎo)的濃縮基本無效。親嗜性GP+E-8641細胞不能只對鼠靶細胞檢測，因此與感染人細胞的比較是不恰當?shù)?，但是來自這些細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒不能十分有效地濃縮。
討論Pansorbin用作不溶性稠密底物證明了這些高密度顆粒在傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒壽命內(nèi)能與相對較低滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液相互作用的原理。在圖1中，顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液與Pansorbin共溫育能提高轉(zhuǎn)錄病毒的有效滴度(cfu/ml)。這種相互作用時程的確定(圖2)顯示，盡管最初的相互作用極快，但是在超過60分鐘的溫育后獲得最佳結(jié)果。發(fā)明者將這種結(jié)果解釋為，逆轉(zhuǎn)錄病毒與Pansorbin復(fù)合，在靜置培養(yǎng)中一定比例的復(fù)合物在重力作用下沉淀，從而提高了可與靶細胞結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒的局部濃度。顯然，K562細胞暴露于Pansorbin即便過夜溫育也沒有毒性。可以認為，Pansorbin不是促進感染而是螯合上清液中可能存在的某些抑制因子8，22。然而，發(fā)明者認為這一解釋是不可能的，因為在標準感染方案中加入未感染的PG13生產(chǎn)細胞的上清液不能抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的有效滴度(數(shù)據(jù)未顯示)，過濾逆轉(zhuǎn)錄病毒/Pansorbin共溫育物表明cfu/ml活性與Pansorbin分離。也清楚逆轉(zhuǎn)錄病毒不需要與Pansorbin分離也具有傳染性，或者僅僅37℃溫育過夜就足以促使其釋放。然而，在使用Pansorbin和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜抗體介導(dǎo)復(fù)合物形成的其它方法中可能不是這樣，此時逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染性似乎受到損害42。
使用圖1和圖2所示的數(shù)據(jù)，合理選擇Pansorbin體積和共溫育時間，并在放大實驗和離心濃縮中使用。在我們的方案中Pansorbin/逆轉(zhuǎn)錄病毒相互作用十分強，允許在2600g下進行兩輪離心，相對劇烈地重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，之后滴定。靜置培養(yǎng)中重力引起的體積減少和傳染性提高可能是對K562測定的滴度升高遠高于單獨體積減少所預(yù)期的這一事實的一種解釋。某些靶細胞對Pansorbin也可能有親和力，它能在靶細胞附近保留逆轉(zhuǎn)錄病毒。圖3顯示，無論機制如何，在體積只減少180倍的情況下，有效滴度能提高可達7500倍。另一個意外是，在不含Pansorbin的情況下離心上清液也能提高滴度，盡管有效性很低。這可能表明，PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒能與培養(yǎng)物中的未知因子復(fù)合，使可離心的沉淀物交聯(lián)并濃縮。
圖3的排除研究(Pdep)不很清楚；發(fā)明者將上清液的活性解釋為，在這種速度下Pansorbin不會完全沉淀。在復(fù)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒通過0.45μm濾器時，樣品形成更清楚的圖片，預(yù)過濾物的滴度降低多達90％(PP過濾)。但是滴度不會降為零，可能表明多數(shù)可利用的逆轉(zhuǎn)錄病毒仍未結(jié)合Pansorbin(甚至是優(yōu)化的方案)，或者過濾足以將結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒與Pansorbin分離。
在沒有陰性對照的情況下，對于濃縮方案(理解地沒有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的Pansorbin)，Pansorbin上蛋白質(zhì)A的活性不能完全降低。應(yīng)用Sansorbin的平行實驗顯示，作用可能相當復(fù)雜，盡管Sansorbin遠不如蛋白A陽性相應(yīng)物有效，但它仍產(chǎn)生非常令人鼓舞的結(jié)果。Sansorbin(Wood 46株)不是只缺乏蛋白A的Cowan I(Pansorbin)的遺傳工程亞株，而是一種完全不同的菌株，因此這些細胞中也可能缺乏完全不同的細胞表面蛋白。用鏈霉親和素偶聯(lián)的順磁珠(與從分泌型變異金黃色葡萄球菌株中純化的生物素化蛋白A復(fù)合)再次濃縮的努力只顯示較低的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性(數(shù)據(jù)未顯示)，這可有助于將(discount)蛋白A作為配體。
為了確定該濃縮方法的用途如何廣泛，發(fā)明者希望確定K562是否是這類方法的唯一靶細胞。圖4相當清楚地顯示，附著HeLa細胞以與K562細胞相同但程度較低的方式反應(yīng)。IL-2/B7逆轉(zhuǎn)錄病毒對U937細胞的傳染性的低滴度也意味著對這些細胞不能估計濃縮比。
盡管濃縮病毒感染細胞系的能力不是細胞特異的，但對于確定逆轉(zhuǎn)錄病毒對Pansorbin的向性是否是IL-2/B7插入片段獨有的至關(guān)重要。因此，發(fā)明者用其它載體(如pWZLblast中的RaRT插入片段)重復(fù)了該方案。圖5中詳述的結(jié)果顯示，濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的能力不是對特定插入片段/載體構(gòu)建體特異的。然而，令人感興趣的是注意到，在這種情況下，U937靶細胞比NB4細胞更易于感染。這可能是由于插入片段的作用，如對U937細胞具有毒性的IL-2表達，盡管發(fā)明者不能證明在只加入濃度高達50000U/ml的人IL-2的三種懸浮細胞中軟瓊脂克隆效率有任何抑制。在IL-2存在或不存在下，U937、K562和NB4的克隆效率分別為78％、43％和10％(細胞以200個細胞/平皿接種；數(shù)據(jù)未顯示)。因此，外源IL-2對這些細胞無毒，但是為了確定從頭合成的胞內(nèi)IL-2的存在對這些細胞是否具有不同的毒性，需要調(diào)節(jié)型表達載體。
通常對50ml上清液樣品進行Pansorbin離心濃縮，并且放大，該方法主要依賴于能輸入系統(tǒng)中的上清液的量。利用50ml離心管每10分鐘能離心400ml上清液，使得從成升的上清液中生產(chǎn)病毒變得相對容易。最初是由于病毒滴度較低的問題進行該研究，并推測用高滴度原料能達到什么程度。Pansorbin購買時為10％(w/v)懸液，但用血細胞計數(shù)器能獲得估計的顆粒數(shù)，表明濃度為1×1010-1×1011/ml。因此，濃縮50ml上清液的標準方案(250μl Pansorbin)使用約1.25×1010個顆粒，甚至假定每個顆粒只能結(jié)合一個傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，這使Pansorbin具有攜帶50ml上清液中1.25×1010個逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的能力。該方法利用高滴度生產(chǎn)細胞可能與利用發(fā)明者研究的細胞同樣(或更加)有效。假定上清液含有1×106cfu/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒，當與正常濃度的Pansorbin(2.5×108/ml)混合時，每個逆轉(zhuǎn)錄病毒距其鄰近病毒平均100μm，而Pansorbin顆粒平均相距只有16μm。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒在到達Pansorbin顆粒附近之前只需要運動10-20μm，因此提高或降低上清液中的逆轉(zhuǎn)錄病毒含量(假如它低于Pansorbin的攜帶能力)使逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸Pansorbin顆粒的可能性差異極小。人們可能預(yù)期逆轉(zhuǎn)錄病毒當與Pansorbin結(jié)合時將不能感染靶細胞，事實上當在37℃下用靶細胞稀釋時確實如此，此時存在向培養(yǎng)基中逐漸釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆反應(yīng)。然而，發(fā)明者認為逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染靶細胞時仍與Pansorbin復(fù)合。
盡管沒有關(guān)于結(jié)合機制的權(quán)威性數(shù)據(jù)，但發(fā)明者確信病毒與Pansorbin結(jié)合，如圖3所見(P和P過濾)，過濾共溫育的上清液將不會降低滴度。
此處顯示本發(fā)明的第一方面對PG13細胞有效，濃縮方法對PG13優(yōu)化。然而，利用相同方案導(dǎo)向K562細胞，發(fā)明者也發(fā)現(xiàn)單獨的Pansorbin對GP+envAM1239和PA31740(小鼠包裝細胞，兼嗜性鼠白血病病毒包膜)很有效，當對200倍體積減少標準化后，滴度分別增加1500倍和600倍。此外，也對其它包裝細胞系實施該方法，如FLYA135(人HT1080纖維肉瘤細胞，兼嗜性鼠白血病病毒包膜)、FLYRD185(具有RD114貓內(nèi)源病毒包膜的HT1080)。另外，發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，對鼠32Dp21043骨髓細胞滴定的親嗜性包裝細胞GP+E-8641(Mo-LULV env)產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒在體積減少200倍的情況下Pansorbin能被濃縮150倍，這符合FLYA13對K562細胞的效率。
發(fā)明者認為，纖連蛋白中間物可介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒與Pansorbin的結(jié)合。至少兩種細菌基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物似乎是特化的膜結(jié)合纖連蛋白結(jié)合蛋白(fnbA32和fnbB33)，它們均從金黃色葡萄球菌(不是CowanI株)中克隆。然而，外源應(yīng)用重組fnbB短肽33能阻斷Cowan I的纖連蛋白結(jié)合能力(fnbA未檢測)。盡管沒有這樣直接檢測Wood 46株，但已經(jīng)證實，Cowan I在纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白存在下凝集的能力在Wood 46中基本不存在44。也注意到這兩種菌株同樣地附著于纖連蛋白包被的塑料組織培養(yǎng)器皿44，表明Wood 46可能fnbA或fnbB缺陷，但或許不會兩者都缺陷。也曾經(jīng)報道，包裝細胞系GP+E-86、GP+envAM12、PA317和PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒都可結(jié)合重組人纖連蛋白片段(CH-296116，31，也稱作RetroNectinTM)。因此，NIH3T3衍生的包裝細胞45產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒和纖連蛋白在培養(yǎng)過程中能與纖連蛋白結(jié)合是合理的，這種纖連蛋白/逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物然后可通過fnbA或fnbB與Pansorbin結(jié)合。大多數(shù)包裝細胞表達纖連蛋白的水平肯定是測定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的限制因素，在RetroNectin處理后未見提高。盡管沒有正式檢測鼠包裝細胞的纖連蛋白分泌，但FLYA13和FLYRD18核心處的人HT1080纖維肉瘤細胞只表達占總蛋白質(zhì)0.004％的纖連蛋白，相比而言，與正常人二倍體成纖維細胞相關(guān)的占0.3％46，F(xiàn)LYRD18包膜甚至不能結(jié)合纖連蛋白47。FLYA13細胞盡管應(yīng)用與GP+envAM12和PA317相同的env蛋白，在濃縮試驗中也表現(xiàn)極差。
Pansorbin/纖連蛋白/逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物也可能以類似于RetroNectin的方式促進感染，因為纖連蛋白中的細胞結(jié)合域可與靶細胞交聯(lián)16，這在NB4細胞中效率較低，因為它們表達的許多VLA-4和VLA-5可能無活性48。
發(fā)明者曾經(jīng)使用不同的4批Pansorbin、兩批Sansorbin和一批來自Sigma Aldrich的Pansorbin相當物。他們發(fā)現(xiàn)Pansorbin的濃縮能力有2-4倍的批間差異(濃縮后滴度升高2000-7500倍)，他們發(fā)現(xiàn)Pansorbin總比Sansorbin更有效，而且總是優(yōu)于Sigma Aldrich的產(chǎn)品。初看起來，可能擔心這種批間差異。然而，Cowan I的制備方法已經(jīng)優(yōu)化，并且對蛋白A但未對fnb進行質(zhì)量控制。Sigma Aldrich產(chǎn)品的較差活性似乎與它在2600g下沉淀的程度相關(guān)，因此優(yōu)化更好的離心條件可提高其活性。
盡管本發(fā)明明顯適用于體外研究，但對治療的適用性則有爭議，因為在高濃度Pansorbin存在下甚至體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞也必須花費時間?？梢哉J為，在感染過程中毒性因子可以濾除Pansorbin，如果它們附著于細胞疫苗則可能具有體內(nèi)毒性。但是，本領(lǐng)域的其他作者不考慮這種可能性。然而，盡管這樣，只有Pansorbin的蛋白A成分獲準用于人體(自身免疫性血小板減少性紫癜，ITPP)50。此外，只用蛋白A離體吸收患者血漿在病毒誘導(dǎo)的大鼠惡性腫瘤51中獲得的下列有希望的結(jié)果對轉(zhuǎn)移性乳腺癌52，53、卡波氏肉瘤53和結(jié)腸癌53已經(jīng)到達臨床試驗階段，這基于去除認為抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的抗體復(fù)合物52，53。然而試圖推測蛋白A和fnb在治療其它惡性腫瘤中對Cowan I的相對貢獻，逆轉(zhuǎn)錄病毒作用的證據(jù)十分引人注目，病毒敗血癥的減少將取決于循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄病毒/抗體復(fù)合物54，55。
Pansorbin的作用證明，在逆轉(zhuǎn)錄病毒的半衰期內(nèi)能發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄病毒與顆粒性底物的相互作用。這允許我們發(fā)展一種簡單的濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法。但是，本發(fā)明的其它方面是使用可能更加有助于臨床實踐并適用于多種包裝細胞系的試劑的改進。
關(guān)于本發(fā)明第一方面的材料與方法細胞系人(NB4、U937、K562)和小鼠(32Dp21043)骨髓細胞系和HeLa上皮細胞在RPMI+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素(均為Sigma，Poole，UK)中常規(guī)生長。懸浮細胞保持于1×105-1×106/ml，而HeLa細胞通過胰蛋白酶消化傳代，并保持低于7×106/90mm組織培養(yǎng)皿。
小鼠胚胎成纖維細胞衍生的GP+envE-8641、PG13 GaLv假型3(CRL-10686，從ATCC獲得)、GP+envAM12、GP+E-86、PA317和人肉瘤衍生的FLYA13和FLYRD18包裝細胞在DMEM+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素中常規(guī)生長。細胞保持于90mm組織培養(yǎng)皿中，通過胰蛋白酶消化傳代，保持于5×105-7×106/90mm組織培養(yǎng)皿。
試劑Pansorbin(Calbiochem-Novabiochem，Nottingham，507858)是加熱殺死的、福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(Cowan I)的10％(w/v)懸液，攜帶高細胞表面密度蛋白A的1μm顆粒，在4℃下貯存，4-6周后更換。Sansorbin(Calbiochem-Novabiochem，Nottingham，557601)是加熱殺死的、福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(Wood 46)的10％(w/v)懸液，不含蛋白A的1μm顆粒，在4℃下貯存，4-6周后更換。不溶性蛋白A(Sigma，Poole，UK，P-7155)細胞懸液，約10％(濕重/體積)不能存活的金黃色葡萄球菌Cowan株，在4℃下貯存，4-6周后更換。標記的蛋白A-生物素(Sigma，Poole，UK，P-2165)從分泌蛋白A的金黃色葡萄球菌株的培養(yǎng)基中純化(2mg/ml，于pH8.0的PBS中，-20℃貯存)。鹽酸殺稻瘟菌素S(ICN Pharmaceuticals，Basingstoke，UK，150477)過濾除菌，以5mg/ml-20℃貯存于水中。純凈瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，USA，0142-17-0)。polybrene(Sigma，Poole，UK，H-9268)在水中制成8mg/ml，過濾除菌貯存于-20℃。鏈霉親和素磁球順磁顆粒(Promega，Madison，USA，Z5482)為1mg/ml(5×108顆粒/ml)1μm直徑順磁顆粒，在PBS中4℃貯存。
生產(chǎn)細胞的產(chǎn)生和培養(yǎng)FG13、GP+envAM12和PA317包裝細胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接種；4小時后，吸出培養(yǎng)基，更換為10ml過濾(0.45μM)的含4μg/ml polybrene的GP+E-86上清液。這些磷酸鈣轉(zhuǎn)染的GP+E-86混合細胞群體產(chǎn)生pWZLIL-2/B730或pWZLRaRT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(賦予殺稻瘟菌素S抗性)或pBabe.puro載體(賦予嘌呤霉素抗性)。24小時后重復(fù)感染，細胞再培養(yǎng)48小時，在含10μg/ml殺稻瘟菌素S或5μg/ml嘌呤霉素的DMEM+10％FCS中篩選4周，凍存抗性細胞的混合群體。
FLYRD18和FLYA13包裝細胞以7.5×105/90mm平皿的密度開始，過夜培養(yǎng)后吸出培養(yǎng)基，更換為10ml過濾(0.45μm)的含8μg/mlpolybrene的PG13.pBabe.puro。72小時后吸出培養(yǎng)基，更換為含5μg/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。細胞再培養(yǎng)7天，此時所有對照培養(yǎng)物均死亡，凍存存活細胞的混合群體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生PG13、GP+envAM12、PA317和GP+E-86生產(chǎn)細胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接種；72小時后更換培養(yǎng)基；24小時后吸出培養(yǎng)基，通過0.45μm濾器過濾，進一步處理。FLYA13和FLYRD18細胞以2×106/90mm平皿的密度接種，48小時和72小時后更換培養(yǎng)基，總共96小時后吸出培養(yǎng)基，通過0.45μm濾器過濾，進一步處理。
金黃色葡萄球菌的制備Pansorbin、sansorbin或不溶性蛋白A用PRMI+10％FCS 1∶20稀釋，4℃貯存18小時。離心(2600g，20分鐘，4℃)所需的量，在PRMI+10％FCS中重懸浮為希望的濃度。
Pansorbin/Sansorbin的制備和濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物將指定體積的Pansorbin/Sansorbin加入到無菌聚丙烯管中希望體積的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中，混合物在4℃和恒定搖動下溫育(StuartScientific SRT1傾斜旋轉(zhuǎn)混合器)。在指定時間時，直接取出混合物測定cfu/ml滴度或離心濃縮。對于濃縮離心45或50ml混合物(2600g，10分鐘，4℃)，棄去上清液，沉淀重懸浮于10ml冷DMEM+10％FCS中，如上所述再離心一次。傾出上清液，試管倒置貯存60秒排凈，沉淀重懸浮于約250μl冷RPMI+10％FCS中。重懸浮沉淀可能較困難，因為它傾向于凝塊(特別是Pansorbin)，250μl終體積傾向于由50％堆積體積和漿液和50％的新鮮培養(yǎng)基組成。必要時能以150g脈沖混合物(使之有效恢復(fù))，移到聚丙烯凍存瓶中在冰上貯存并測定cfu/ml滴度。
cfu/ml滴度的測定計數(shù)K562、U937、NB4和32Dp210細胞的懸液，用含有4.4μg/mlpolybrene的RPMI+10％FCS調(diào)節(jié)為4×105/ml。然后將細胞以1ml等份接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃/5％CO2下溫育1-3小時。逆轉(zhuǎn)錄病毒制品用RPMI+10％FCS 1∶10連續(xù)稀釋，將100μl加到一式三份孔中充分混合。18-24小時后，0.9ml細胞與3.8mlRPMI+24％FCS+1.3mM丙酮酸鈉混合，保持于37℃下，隨后加入0.3ml高壓滅菌的5％v/v純凈瓊脂水溶液(終濃度為0.3％)，保持于60℃。細胞然后接種于60mm組織培養(yǎng)皿中，使瓊脂凝固后，置于37℃/5％下。再過18-24小時后，小心加入含有20μg/ml殺稻瘟菌素S或10μg/ml嘌呤霉素的5ml RPMI+20％FCS+1mM丙酮酸鈉，分別使軟瓊脂選擇濃度為10μg/ml和5μg/ml。平皿再放回培養(yǎng)2-3周，之后測量軟瓊脂集落數(shù)。cfu/ml濃度計算為每個平皿的集落數(shù)/孔乘以稀釋倍數(shù)。在所有cfu/ml測定中進行倍數(shù)稀釋，盡管大多數(shù)沒有價值，含有太少或太多的集落而無法精確計數(shù)(即多于300/60mm平皿)。
附著的HeLa細胞用胰蛋白酶消化，計數(shù)，并用RPMI+10％FCS調(diào)節(jié)為1×105/ml，然后以0.5ml等份接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。溫育18小時后(37℃/5％)，感染1-3小時前，加入另外0.5ml含polybrene的培養(yǎng)基，使終濃度為4.4μg/ml。
逆轉(zhuǎn)錄病毒在RPMI+10％FCS中進行1∶10連續(xù)稀釋，向靶細胞中一式三份加入100μl等份的適當稀釋液，并混合。感染48小時后，培養(yǎng)基更換為含有10μg/ml殺稻瘟菌素S的新鮮培養(yǎng)基。每3-4天更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)2周，之后吸出培養(yǎng)基，培養(yǎng)板用2ml考馬斯藍染液染色(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)，用自來水洗滌，計數(shù)集落，測定滴度。
關(guān)于本發(fā)明第二、第三和第四方面的詳述纖連蛋白結(jié)合的PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒的順磁顆粒介導(dǎo)的濃縮為了確定PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒實際上是否與包裝細胞上清液中的纖連蛋白結(jié)合，發(fā)明者使用與PMP偶聯(lián)的抗鼠纖連蛋白多克隆抗體。圖7詳述了使用以前描述軟瓊脂集落形成試驗56測定這些顆粒捕獲傳染性PG13逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力。在未濃縮情況下，對人骨髓K562細胞的初始滴度(cfu/ml)為1.4×105±9×103cfu/ml(對照)，用蛋白A-生物素偶聯(lián)的PMP(PAB)將上清液體積濃縮125倍使其滴度提高100倍以上，至1.6×1 07±3.4×106cfu/ml。然而，多克隆兔抗小鼠纖連蛋白、通過蛋白A-生物素與PMP偶聯(lián)的抗體(蛋白A抗體生物素PAAB)在體積同樣減少125倍的情況下，使滴度提高到4×108±9.5×107cfu/ml，增加2800倍。導(dǎo)致定向特異性抗體錨定的抗體蛋白A-生物素組合比單獨的蛋白A-生物素效率高25倍。然而，單獨的蛋白A-生物素的效率不能提示蛋白A對纖連蛋白或逆轉(zhuǎn)錄病毒的有限親和力。
小鼠纖連蛋白抗體允許從逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中捕獲鼠纖連蛋白衍生的包裝細胞產(chǎn)生的傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。體積只降低125倍導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度提高2000-3000倍。捕獲的逆轉(zhuǎn)錄病毒群體的總傳染性(cfu/ml)約20倍于對照上清液。這可反映病毒向細胞的輸送增強，這是由于重力介導(dǎo)的PMP沉積，而不是單獨的布朗運動15，或在PMP捕獲后逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染性提高。在磁性濃縮后使用逆轉(zhuǎn)錄病毒/PMP混合物的上清液的排除(depletion)研究也表明，上清液的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度降低約90％。該數(shù)據(jù)證實PG13包裝細胞向上清液中分泌鼠纖連蛋白，大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與之結(jié)合，或者在不含纖連蛋白時逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有傳染性。
該方法的效率顯示，在這些條件下，負責逆轉(zhuǎn)錄病毒與纖連蛋白、纖連蛋白與靶細胞結(jié)合的表位不被抗體空間阻礙。該方法使用總共1.25×109PMP濃縮5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，而PMP數(shù)量減少的其它實驗導(dǎo)致廣泛的交聯(lián)，這由PMP的凝集證實。使用較低濃度蛋白A-生物素和抗體的其它試驗也使逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮效率降低。
凝集素/PMP介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲鼠包裝細胞釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對人血清滅活極敏感，這似乎依賴于使用的包裝細胞和包膜蛋白57。這種敏感性主要由鼠包裝細胞釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的包膜蛋白的末端Gal(α1-3)Gal修飾引起。這種鼠酶的人同源物具有遺傳獲得的突變，導(dǎo)致人細胞中(α1-3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性不明顯。針對人血清中可見的Gal(α1-3)Gal修飾的高水平抗體確保鼠包裝細胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)快速滅活57。PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒上存在Gal(α1-3)Gal修飾提供了捕獲PG13逆轉(zhuǎn)錄病毒的第二種策略。圖8顯示使用與Gal(α1-3)Gal結(jié)合同工凝集素B4(BSI-B4)61或伴刀豆球蛋白A(ConA)62偶聯(lián)的PMP的濃縮效率，ConA主要結(jié)合更多普遍存在的α-甘露糖修飾。使用與PMP偶聯(lián)的這兩種凝集素的任一種，在上清液體積減少125倍后，4×105±5.5×104cfu/ml的對照滴度能升高到7×108±6.4×107cfu/ml(1700倍)(生物素-BSI-B4)，或5.4×108±5×107cfu/ml(1300倍)(生物素-ConA)。單獨的PMP濃縮導(dǎo)致升高4倍(1.6×106±4×105cfu/ml)，證明逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮依賴于凝集素而不是鏈霉親和素。這一策略可以更廣泛地應(yīng)用，因為它對于不能結(jié)合纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也可能是有效的47。在這種情況下意外發(fā)現(xiàn)，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒與PMP緊密結(jié)合，并且不能被大的中間蛋白質(zhì)(如纖連蛋白)捕獲，它仍有傳染性，這是本發(fā)明的第二方面。對于ConA尤其如此，ConA是一種已知可抑制HIV-1體外傳染的凝集素63，盡管這可能是反映其獨特受體應(yīng)用的特殊情況64。類似的ConA捕獲策略實際上消除了HIV-1的傳染滴度(降低95％以上)65也令人感興趣，與之明顯相反的是應(yīng)用PG13產(chǎn)生的載體可見的提高。然而，凝集素也能以類似于纖連蛋白的方式結(jié)合上清液中作為中間物的蛋白質(zhì)，而不直接結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒本身。
應(yīng)用于人HT1080衍生的包裝細胞的凝集素/PMP介導(dǎo)的磁性濃縮也對FLYA13和FLYRD18產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒測試了凝集素策略5，66，發(fā)明者以前不能設(shè)計對它們有效的方法。圖9顯示凝集素/PMP介導(dǎo)的FLYRD18和FLYA13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮。FLYRD18細胞的(對照)滴度為3.5×104±1.1×104cfu/ml，ConA介導(dǎo)的濃縮(125倍)將其提高為1.2×107±3.6×106cfu/ml。這種342倍的提高遠少于用PG13能達到的1300倍，表明ConA/PMP介導(dǎo)的FLYRD18逆轉(zhuǎn)錄病毒效率通常比PG13產(chǎn)生的低5倍。BSI-B4/PMP濃縮的滴度只比對照高6倍(2.2×105±6.4×104cfu/ml)，證實人細胞上最低程度的存在α-半乳糖基。FLYA13細胞的(對照)滴度為6.2×10±5.7×102cfu/ml，在ConA/PMP介導(dǎo)的體積減少125倍后，滴度升高369倍，為2.3×106±2×105cfu/ml。BSI-B4在捕獲人源包裝細胞釋放的逆轉(zhuǎn)錄病毒中無效。盡管對FLY的有效性比PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒低，但凝集素介導(dǎo)的濃縮仍是至今對于HT1080(FLY)產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒家族所述中最有效的。
生物素琥珀酰亞胺酯/PMP介導(dǎo)的PG13逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的捕獲本發(fā)明的第二方面(抗體介導(dǎo))和第三方面(凝集素介導(dǎo))也許不能廣泛適用于或有效用于迄今在基因治療中使用的所有包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系。因此，發(fā)明者設(shè)計了本發(fā)明的第四方面，這也許是對于PMP介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮最有效的一方面。使用標記包裝細胞的方法67，68，用琥珀酰亞胺酯衍生物標記PG13包裝細胞，該衍生物共價偶聯(lián)生物素與包裝細胞表面上的蛋白質(zhì)。圖10a顯示生物素化包裝細胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒的PMP介導(dǎo)濃縮的結(jié)果。未濃縮時，包裝細胞的生物素化(BSE)或單獨的載體(DMSO)處理對滴度沒有影響(對照4.6×103±1.5×104cfu/ml，DMSO4.2×105±2.6×104cfu/ml，BSE4.2×105±3.6×104cfu/ml)。未生物素化時(單獨用DMSO載體處理細胞)，單獨的PMP不能捕獲逆轉(zhuǎn)錄病毒(DMSO濃縮4.6×105±1×105cfu/ml)。生物素化的包裝細胞分泌一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它與PMP上的鏈霉親和素親和偶聯(lián)，并在體積只減少125倍后使?jié)舛壬邽?.8×109±1.8×108cfu/ml的滴度(升高4200倍)，這似乎是迄今對PG13最有效的策略。此外，排除的上清液的滴度顯示降低為6.4×104/ml±1.4×104/ml，表示與對照滴度相比80％以上排除。圖10b顯示FACS圖，說明標記24小時后可用親和素-FITC檢測的表面修飾程度。關(guān)于該圖的詳述是，與24小時前用生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯處理并用親和素-FITC染色的(BSE-Av-FITC)細胞相比，單獨用DMSO處理并用親和素-FITC染色的(DMSO+Av-FITC)對照細胞的熒光。甚至在培養(yǎng)24小時后，熒光有大于2log的改變。生物素化反應(yīng)對包裝細胞無毒性，被認為是針對賴氨酸側(cè)鏈的NH2末端。以前懸浮細胞生物素化的經(jīng)驗提示，由于蛋白質(zhì)更新(turnover)，表面修飾非?？焖俚貎?nèi)吞。因此，幾乎沒有生物素化蛋白質(zhì)分泌到上清液中。包裝細胞表面上的包膜蛋白可在芽殖過程中在與逆轉(zhuǎn)錄病毒gag和pol結(jié)合前生物素化。這樣能從生物素化的包裝細胞中分泌生物素標記的逆轉(zhuǎn)錄病毒。由于其它細胞的表面蛋白也可以作為逆轉(zhuǎn)錄病毒外殼上的生物素化衍生物，env蛋白可能不被生物素化。另外，包裝細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(后來可與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合)也可能是生物素化的主要靶標。在逆轉(zhuǎn)錄病毒表面上估計有300個包膜分子，因而生物素過程的效率對于捕獲無關(guān)緊要，因為生物素/鏈霉親和素相互作用的強度太強，以致只有一個生物素與PMP接觸即可足以捕獲逆轉(zhuǎn)錄病毒。
有效的生物素琥珀酰亞胺酯/PMP介導(dǎo)的FLYRD18和A13捕獲伴刀豆球蛋白A介導(dǎo)的FLYRD18和FLYA13捕獲沒有獲得預(yù)期的成功。因此，發(fā)明者決定研究生物素SE捕獲是否有效捕獲這些包裝細胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒。圖11顯示測定生物素介導(dǎo)的FLYRD18(圖11)和FLYA13(圖11)磁性濃縮效率的實驗結(jié)果。再次檢測單獨的載體和生物素修飾對起始滴度的影響，對于FLYRD18(圖11)，對照滴度(4.6×104±8.7×103cfu/ml)與DMSO載體(4.7×104±1.2×104cfu/ml)或生物素修飾(5.4×104±3×103cfu/ml)沒有差異。單獨載體(DMSO)處理細胞在體積減少125倍后不能引起逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮，DMSO濃縮4.3×104±7×103cfu/ml。FLYRD18的生物素化導(dǎo)致在體積減少125倍后濃縮物的滴度為1×108±1.8×107cfu/ml，比起始物高2000倍，這是接近PG13的效率。也確定了本發(fā)明的第四方面也能有效濃縮FLYA13細胞。
對照和濃縮PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒的凍融穩(wěn)定性為了獨立進行所需的安全性測試，逆轉(zhuǎn)錄病毒制品必須預(yù)先制備，因此確定濃縮對于冷凍后傳染性保持的意義如何至關(guān)重要。圖12顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮物實際上比冷凍的對照上清液更加穩(wěn)定。對照在第一次凍融后均丟失80％以上的滴度，在第二次凍融后丟失94％以上。對于濃縮物，在第一次融化后大多數(shù)活性丟失(可達60％)，但隨后傳染性基本不丟失。因此，PG13衍生的濃縮物能比純凈的上清液更有效地貯存(對于ConA和BS-IB4，-20℃下6周多以后)。如下文所述，濃縮物以加入3倍體積的10％DMSO、20％FCS所達到的7.5％DMSO的終濃度冷凍(因此考慮這一稀釋度調(diào)節(jié)融化的濃縮物的滴度)。由于為了滴定濃縮物需要較大的稀釋度，DMSO的影響不是問題，也能使用PMP磁性濃縮器在融化后進一步洗滌逆轉(zhuǎn)錄病毒制品。然而，對照上清液不適于DMSO存在下冷凍，因為甚至將融化的逆轉(zhuǎn)錄病毒稀釋10倍仍將含有顯著的DMSO污染。
PMP/逆轉(zhuǎn)錄病毒偶聯(lián)物能用于感染的體外定位現(xiàn)在能生產(chǎn)有效的“傳染性、順磁性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?！?，然后能磁性吸引到希望的感染位置。圖13顯示體外磁性定位的一個例子，是對該方法的原理的證實。從磁片上切下的模型(d)，置于HeLa細胞亞鋪滿培養(yǎng)物之下，能吸引并保留逆轉(zhuǎn)錄病毒，主要感染存在磁體的區(qū)域。此處使用的特殊設(shè)計旨在顯示這一導(dǎo)向不是攪動過程中使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在平皿中渦旋的流體動力學的結(jié)果。另外，該實驗表明，在連續(xù)存在磁場的情況下能發(fā)生感染，逆轉(zhuǎn)錄病毒在培養(yǎng)中仍能被順磁顆粒捕獲。這種磁片盡管較弱，但在體外引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中極其有效，然而有效的體內(nèi)導(dǎo)向是一個三維問題，將需要更強的磁場。對于體內(nèi)環(huán)境，在易接近的部位使用小的永磁體，而體外產(chǎn)生的電磁場能一次集中于一個特定部位。對于所有導(dǎo)向，未導(dǎo)向的部位的感染抑制不是主要問題，因此如上所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的可逆滅活是令人激動和值得稱贊的進展(28)?？赡鏈缁畹哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體局限于特異組織、器官和轉(zhuǎn)移，以及隨后感染的局部復(fù)活，可使體內(nèi)導(dǎo)向進一步復(fù)雜化。
總之，鏈霉親和素PMP技術(shù)結(jié)合正確選擇配體能捕獲PG13和FLY包裝細胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該研究只檢測了三種包裝細胞型和兩種導(dǎo)向細胞系，因此每種靶細胞型的其它優(yōu)化可能將進一步提高濃縮物的傳染性，這可能是依賴于靶細胞型和逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的優(yōu)選捕獲方法。例如，對于通過α-甘露糖修飾的受體進入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，伴刀豆球蛋白A不是最佳選擇(25-27)。PMP上多余的生物素結(jié)合能力也可用來偶聯(lián)其它蛋白質(zhì)，實現(xiàn)迄今只能通過配體(31-34)或者逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜基因的單鏈Fv修飾(35-38)達到的這種導(dǎo)向。發(fā)明者意識到，配體與沒有遺傳修飾的傳染性制劑偶聯(lián)將使逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)向有更大的靈活性，可能不需要假型(pseudotyping)(31，33，37)和靶細胞特異的包裝細胞設(shè)計(32，34，35，38)。在不含其它配體的情況下，順磁逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也是向相同細胞背景內(nèi)的少數(shù)細胞體內(nèi)導(dǎo)向感染的一種有效策略。
優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄病毒/PMP比，降低聚陽離子增強劑依賴性(39)，捕獲當前的慢病毒載體構(gòu)建體(40)的改進PMP/逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)，提高了體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的可能性，用于PMP濃縮，并且通過磁場保留于或針對需要的部位。
材料與方法細胞系人骨髓懸液(K562)和HeLa附著上皮細胞在RPMI+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素(均為Sigma，Poole，UK)中常規(guī)生長。懸浮細胞保持于1×105-1×106/ml，而HeLa細胞通過胰蛋白酶消化傳代，并保持低于7×106/90mm組織培養(yǎng)皿。
PG13 GaLv假型包裝細胞3(CRL-10686，獲自ATCC，Rockville，MD，USA)在DMEM+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素中常規(guī)培養(yǎng)。細胞保存于90mm組織培養(yǎng)皿中，通過胰蛋白酶消化傳代，保持于5×105-7×106/90mm組織培養(yǎng)皿。
試劑鏈霉親和素磁球順磁顆粒，1mg/ml(5×108顆粒/ml)1μm直徑的順磁顆粒在PBS中4℃貯存。多克隆I兔抗小鼠纖連蛋白，10.8mg/ml于PBS中，4℃貯存(Biogenesis，Poole，UK，4470-4339)。標記的蛋白A-生物素(Sigma，Poole，UK，P-2165)從分泌蛋白A的金黃色葡萄球菌株培養(yǎng)基中純化(2mg/ml，于pH8.0的PBS中，-20℃貯存)。生物素標記的琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(Sigma，Poole，UK，L0767)以1mg/ml在pH8.0的PBS中-20℃貯存。來自Bandeiraea Simplicifolia的BS-I生物素標記的同工凝集素B4(BS-IB4)以1mg/ml在pH8.0的PBS(Sigma，Poole，UK，L2140)中-20℃貯存。生物素酰胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma，Poole，UK，B2643)用DMSO重建為366mM并貯存于-20℃，自此稱為BSE。親和素-FITC(Sigma，Poole，UK，A-2901)貯存于-20℃，在pH8.0的PBS中重建為1mg/ml。嘌呤霉素(Sigma，Poole，UK，P-8833)過濾除菌，在-20℃下以5mg/ml貯存于水中。
生產(chǎn)細胞的產(chǎn)生和培養(yǎng)PG13包裝細胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接種；4小時后，吸出培養(yǎng)基，更換為10ml過濾(0.45μM)的含4μg/mlpolybrene的GP+E-86上清液。這些磷酸鈣轉(zhuǎn)染的GP+E-86混合細胞群體產(chǎn)生賦予嘌呤霉素抗性的pBabe.puro載體。24小時后重復(fù)感染，細胞再培養(yǎng)48小時，在含5μg/ml嘌呤霉素的DMEM+10％FCS中篩選4周，凍存抗性細胞的混合群體。
FLYRD18和FLYA13包裝細胞以7.5×105/90mm平皿的密度開始，過夜培養(yǎng)后吸出培養(yǎng)基，更換為10ml過濾(0.45μm)的含8μg/mlpolybrene的PG13.pBabe.puro。72小時后吸出培養(yǎng)基，更換為含5μg/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。細胞再培養(yǎng)7天，此時所有對照培養(yǎng)物均死亡，凍存存活細胞的混合群體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生PG13生產(chǎn)細胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接種；72小時后更換培養(yǎng)基；24小時后吸出培養(yǎng)基，通過0.45μm濾器過濾，進一步處理。FLYRD18和FLYA13以2×106/90mm平皿的密度接種，48小時和72小時后腫出培養(yǎng)基，更換為新鮮培養(yǎng)基。再過24小時后，吸出含有可使逆轉(zhuǎn)錄病毒失能的培養(yǎng)基，通過0.45μm濾器過濾，進一步處理。
生物素標記的逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生細胞的生物素化基本如上所述，具有對附著細胞的改進67，68。簡言之，培養(yǎng)72小時后，完全吸出培養(yǎng)基，用含0.75mM CaCl2和0.48mMMgCl2的PBS(pH8.0)洗滌，更換為10ml新鮮稀釋的生物素SE(500μM于PBS pH8.0+Ca2+、Mg2+中)。細胞在室溫下溫育30分鐘，之后完全吸出試劑，更換為新鮮的生長培養(yǎng)基，細胞放回3℃下培養(yǎng)。再過3-4小時后，培養(yǎng)基再次更換為新鮮培養(yǎng)基，并放回繼續(xù)培養(yǎng)18小時，之后吸出逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。在所有情況中，單獨用載體(DMSO)標記的對照都平行處理。
免疫熒光生物素化的包裝細胞培養(yǎng)過夜。收獲逆轉(zhuǎn)錄病毒后，在凡爾生存在下通過輕輕移液從底層取出細胞，置于DMEM+10％FCS中?？偣?×106個細胞在含或不含10μg/ml親和素-FITC的100μl HBSS+1％FCS中標記。細胞在室溫下溫育，洗滌，通過流式細胞分析術(shù)分析。
順磁顆粒的制備對于5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，將2.5ml順磁顆粒(PMP)(5×108/ml)置于15ml聚丙烯試管中，放到Dynal MPC-6磁性顆粒濃縮器中，吸出上清液，PMP重懸浮于1ml過濾除菌的PBS+0.1％BSA中，并轉(zhuǎn)移到無菌1.5ml eppendorf管中。然后將PMP加到Dynal MPC-E磁性顆粒濃縮器中，吸出上清液，將PMP重懸浮于0.4ml過濾除菌的PBS+0.1％BSA中，加到MPC-E中，吸出上清液。
對于抗體偶聯(lián)PMP重懸浮于50μl PBS+0.1％BSA和50μl2mg/ml蛋白A-生物素中。在室溫下溫育30分鐘后，PMP利用MPC-E在PBS+0.1％BSA中洗滌三次，重懸浮于含5mg/ml多克隆Ig兔抗小鼠纖連蛋白的250ml PBS+0.1％BSA中。
對于凝集素偶聯(lián)PMP重懸浮于100μl 1mg/ml生物素琥珀酰-伴刀豆球蛋白A或100μl 500μg/ml生物素標記的同工凝集素B4(BS-IB4)中。對于生物素琥珀酰亞胺酯濃縮和對照未偶聯(lián)的PMPPMP重懸浮于100μl PBS+0.1％BSA中。
在室溫下溫育30分鐘后(定期攪拌)，利用MPC-E在500μlPBS+0.1％BSA中洗滌所有PMP偶聯(lián)物三次。最后一次洗滌后，將PMP重懸浮于希望體積的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中。
PMP的制備和濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)合物常規(guī)制備的1.25×109PMP重懸浮于無菌聚丙烯管中的5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中，混合物在恒速攪拌下4℃溫育(Stuart Scientific SRT1傾斜旋轉(zhuǎn)混合器)。2.5小時后，將混合物加到Dynal MPC-6上，吸出上清液，將PMP重懸浮于1ml PBS+0.1％BSA或RPMI+0.1％FCS中(凝集素濃縮)。然后用MPC-E再洗滌PMP三次，PMP重懸浮于最小體積的RPMI+10％FCS中。堆積體積1.25×109PMP可重懸浮于20μl RPMI+10％FCS中，產(chǎn)生40μl的終體積(5ml40μl，125倍體積)，然后進一步處理。
cfu/ml滴度的測定計數(shù)K562細胞懸液，用含有4.4μg/ml polybrene的RPMI+10％FCS調(diào)節(jié)為4×105/ml。然后將細胞以1ml等份接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，在37℃/5％CO2下溫育1-3小時。逆轉(zhuǎn)錄病毒制品用RPMI+10％FCS 1∶10連續(xù)稀釋，將100μl加入一式三份孔中充分混合。18-24小時后，0.9ml細胞與3.8ml RPMI+24％FCS+1.3mM丙酮酸鈉混合，保持于37℃下，隨后加入0.3ml高壓滅菌的5％純凈瓊脂(終濃度為0.3％)，保持于60℃。細胞然后接種于60mm組織培養(yǎng)皿中，使瓊脂凝固后，置于37℃/5％下。再過48小時后，小心加入5ml RPMI+20％FCS+1mM丙酮酸鈉(含有10μg/ml嘌呤霉素)，使軟瓊脂選擇濃度為5μg/ml嘌呤霉素。平皿再放回培養(yǎng)2-3周，之后測量軟瓊脂集落數(shù)。cfu/ml濃度計算為每個平皿的集落數(shù)/孔乘以稀釋倍數(shù)。在所有cfu/ml測定中進行倍數(shù)稀釋，盡管大多數(shù)是沒有價值，含有太少或太多的集落而無法精確計數(shù)(即多于300/60mm平皿)。
附著的HeLa細胞用胰蛋白酶消化，計數(shù)，并調(diào)節(jié)為1×105/ml(需要時用RPMI+10％FCS或DMEM+10％FCS)，然后以0.5ml等份接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。溫育18小時后(37℃/5％)，感染1-3小時前，加入另外0.5ml含polybrene的培養(yǎng)基，使終濃度為4.4μg/ml。
逆轉(zhuǎn)錄病毒在RPMI+10％FCS中進行1∶10連續(xù)稀釋，向靶細胞中一式三份加入100μl等份的適當稀釋液，并混合。感染48小時后，將培養(yǎng)基更換為含有5μg/ml嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。每3-4天更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)2周，之后吸出培養(yǎng)基，培養(yǎng)板用2ml考馬斯藍染液染色(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)，用自來水洗滌，計數(shù)集落，測定滴度。
凍融逆轉(zhuǎn)錄病毒制品未濃縮的對照逆轉(zhuǎn)錄病毒以2-5ml等份置于-20℃下冷凍。通過加入3倍體積的標準冷凍混合物(10％DMSO，20％FCS，終DMSO濃度為7.5％)并置于-20℃下，冷凍濃縮的PMP捕獲的逆轉(zhuǎn)錄病毒。盡可能快地融化逆轉(zhuǎn)錄病毒制品，取出一等份進行檢測，剩余的放回-20℃下。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的磁性增強HeLa細胞以2×106細胞/90mm平皿的密度接種，并在37℃下培養(yǎng)過夜。在感染之前，需要的磁性模型(從Bisiflex II片上切下)放置到(tap to)培養(yǎng)皿下面，培養(yǎng)基也調(diào)節(jié)為4μg/mlpolybrene，2-4小時后在5ml新鮮培養(yǎng)基中加入生物素化PG13產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載有的7.5×106磁性顆粒。然后在室溫下攪拌(40圈/分鐘)培養(yǎng)物30分鐘(the Belly Dancer，Stovall Life Sciences Inc，Greenboro，NC，USA)，之后將培養(yǎng)物置于37℃。24小時后取出磁體，更換培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物放回37℃?？偣哺腥?8小時后，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為5μg/ml嘌呤霉素，每日更換培養(yǎng)基后(保持藥物篩選)，培養(yǎng)物用考馬斯藍染液(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)染色(開始選擇72小時后)。
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1.一種提高含病毒顆粒樣品的病毒滴度的方法，該方法包括使樣品接觸能與病毒顆粒結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)合成員；并濃縮該復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過離心濃縮所述復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其進一步包括測定病毒滴度的步驟。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述病毒顆粒是逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述結(jié)合成員是一種顆粒性稠密底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中這種顆粒性稠密底物是pansorbin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中該方法還包括加入能捕獲該復(fù)合物的捕獲劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述捕獲劑是順磁顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的方法，其中結(jié)合成員是一種針對可與病毒顆粒結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體，該抗體可與第一種偶聯(lián)配偶體結(jié)合，該配偶體能偶聯(lián)可與捕獲劑結(jié)合的第二種偶聯(lián)配偶體。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的方法，其中結(jié)合成員是能與病毒顆粒表面上的糖基化蛋白質(zhì)結(jié)合的凝集素，該凝集素可與第一種偶聯(lián)配偶體結(jié)合，該配偶體能偶聯(lián)可與捕獲劑結(jié)合的第二種偶聯(lián)配偶體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中凝集素是同工凝集素B4或琥珀酰-伴刀豆球蛋白A。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項的方法，其中偶聯(lián)配偶體選自生物素/生物胞素-親和素/鏈霉親和素、受體-配體和抗體-抗原。
13.一種修飾病毒顆粒，以便于從含有這種修飾病毒顆粒的樣品中捕獲，以提高其滴度的方法，該方法包括在病毒包裝細胞表面上添加偶聯(lián)配偶體的步驟，使包裝細胞產(chǎn)生的病毒顆粒在其表面上展示這種偶聯(lián)配偶體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述偶聯(lián)配偶體是與包裝細胞表面上的蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)的生物素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中利用琥珀酰亞胺酯將所述生物素與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項的方法，其進一步包括下列步驟使用捕獲劑濃縮修飾的病毒顆粒，該捕獲劑包含能與添加到病毒顆粒表面上的偶聯(lián)配偶體偶聯(lián)形成復(fù)合物的第二種偶聯(lián)配偶體；和濃縮該復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-12和權(quán)利要求16任一項的方法，其中分離該復(fù)合物，用于制備醫(yī)學治療用藥物。
18.一種復(fù)合物，其含有病毒顆粒和通過第一種和第二種偶聯(lián)配偶體偶聯(lián)在一起的順磁顆粒，用于體內(nèi)導(dǎo)向。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的復(fù)合物在制備用于體內(nèi)導(dǎo)向的藥物中的應(yīng)用。
20.一種將根據(jù)權(quán)利要求18的復(fù)合物導(dǎo)向人體或動物體內(nèi)組織的方法，該方法包括對人體或動物體施用該復(fù)合物，和利用磁場將復(fù)合物吸引到組織的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的方法，其中所述病毒含有用于在靶向組織中表達的外源核酸序列。
23.一種利用根據(jù)權(quán)利要求13-15任一項的方法生產(chǎn)的修飾病毒顆粒，用于導(dǎo)向組織，該修飾病毒顆粒還包含對該組織特異的抗體或抗體結(jié)合域，該抗體或抗體結(jié)合域通過病毒顆粒表面的偶聯(lián)配偶體與顆粒偶聯(lián)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的修飾的病毒顆粒，它是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
25.一種從樣品中分離病毒的方法，該方法包括使樣品接觸一種能特異結(jié)合該病毒的結(jié)合成員，使該病毒和結(jié)合成員形成復(fù)合物；使該復(fù)合物接觸一種能捕獲該復(fù)合物的捕獲劑；和從樣品中分離該復(fù)合物和捕獲劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中該結(jié)合成員與第一種偶聯(lián)配偶體結(jié)合，該配偶體能偶聯(lián)與捕獲劑結(jié)合的第二種偶聯(lián)配偶體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中偶聯(lián)配偶體是生物素和鏈霉親和素。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的方法，其中結(jié)合成員是一種抗體，捕獲劑是一種順磁顆粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中利用磁場從樣品中分離復(fù)合物和捕獲劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的方法，其中捕獲劑位于一種固體載體上，樣品在該載體上通過，使復(fù)合物和捕獲劑在該固體載體上分離。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項的方法，其中結(jié)合成員是一種凝集素。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項的方法，其中樣品是血液、尿、血清或精液。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項的方法，其中病毒是HIV。
34.一種用于實施根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項方法的試劑盒，包含(i)能與病毒結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)合成員；和任選地(ii)能通過偶聯(lián)配偶體捕獲該復(fù)合物的捕獲劑。
全文摘要
本發(fā)明提供提高樣品中病毒滴度的方法。該方法使用特異結(jié)合成員(如凝集素和抗體)結(jié)合病毒顆粒，使它們能夠濃縮。本發(fā)明還提供從樣品(例如血液)中分離病毒顆粒的方法。也提供利用抗體或順磁顆粒將病毒顆粒導(dǎo)向特定組織的材料與方法。
文檔編號C12N7/00GK1516733SQ01809108
公開日2004年7月28日 申請日期2001年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者D·達靈, F·法贊尼, C·P·休吉斯, D 達靈, 休吉斯, 弈 申請人:癌癥研究技術(shù)有限公司