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調(diào)控基因的花藥特異性表達(dá)的序列及其在生產(chǎn)雄性不育植物和雜種種子中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):586094閱讀:552來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:調(diào)控基因的花藥特異性表達(dá)的序列及其在生產(chǎn)雄性不育植物和雜種種子中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
農(nóng)業(yè)。本發(fā)明涉及獲得調(diào)控DNA序列(啟動(dòng)子),和應(yīng)用所述的序列構(gòu)建新的能夠在轉(zhuǎn)基因植株的花藥中特異表達(dá)的嵌合基因。同時(shí)本發(fā)明還涉及雄性不育植株和雜種種子的生產(chǎn)。
背景技術(shù)
為了激發(fā)轉(zhuǎn)基因植株的花藥中特定基因的特異表達(dá),已經(jīng)分離鑒定并應(yīng)用了不同的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的表達(dá)對(duì)花藥的給定組織是特異的。其中一些應(yīng)用于細(xì)胞缺損(cellablation)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)對(duì)生產(chǎn)雜種種子具有很大利用價(jià)值的不育植株。當(dāng)前,植物細(xì)胞的遺傳缺損用于研究特異的組織或器官中細(xì)胞功能與信號(hào)傳導(dǎo),并用于產(chǎn)生雄性不育(雄性-不育)。
遺傳缺損基于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,通過(guò)表達(dá)任何一種能夠摧毀細(xì)胞完整性的酶如蛋白酶,脂肪酶和RNA酶(例如芽孢桿菌RNA酶和T1 RNA酶)而實(shí)現(xiàn)。采用將有毒物質(zhì)引入細(xì)胞的辦法也可達(dá)到同樣的效果(DayCD and Irish VF.Trends Plant Sci.,2106-111,1997)。后一種方法的事例是應(yīng)用滅活核糖體的多肽,例如白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria)(DTA)中毒素的A鏈和銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)中的外毒素A。幾個(gè)小組提出通過(guò)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生雄性不育。采用非植物基因如Ti質(zhì)粒的基因1和2,或Ri質(zhì)粒的基因rolA,B和C合成植株生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素,代表這些方法,其中由于表達(dá)的規(guī)模和不恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)時(shí)機(jī)這些因子變成了毒素。
通過(guò)促使細(xì)胞對(duì)特異的缺損試劑敏感而不是直接摧毀組織的方法也有所開(kāi)發(fā)。這個(gè)方法的實(shí)例是應(yīng)用先前已知基因的“反義”RNA。這提供了對(duì)化學(xué)試劑的遺傳抗性,如對(duì)除草劑的耐藥性(Fabijanski SF等,In vitro Cell.Dev.Biol.2846-52,1992)。反義RNA的效果在于特異性的去除化學(xué)抗性,如在花粉中,如此以來(lái)應(yīng)用這種除草劑導(dǎo)致花粉的破壞。這種方法將除草劑轉(zhuǎn)化成殺配子劑。
為了得到有效的遺傳缺損,關(guān)鍵是得到只在它表達(dá)的地方起作用的細(xì)胞毒素基因以及調(diào)控該細(xì)胞毒素基因時(shí)空表達(dá)的合適的啟動(dòng)子。因此,表征不同類型細(xì)胞和/或花藥的不同分化階段中的活性基因啟動(dòng)子,允許以細(xì)胞缺損的辦法來(lái)檢測(cè)配子形成時(shí)期花藥不同組織的功能(Mariani C等.Nature,347737-741,1990;Paul W等,Plant Mol.Biol.,19611-622,1992;Hird DL等.,Plant J.,41023-1033,了1993),重點(diǎn)特別在于細(xì)胞間相互作用(Roberts MR等.,Sex.PlantReprod.,8299-307,1995)。相似的,大型生產(chǎn)種子公司利用這種辦法開(kāi)發(fā)雄性不育,在獲得雜種種子的過(guò)程中雄性不育是富有價(jià)值的特點(diǎn)(Williams ME,Trends Biotechnol.,13344-349,1995)。
在幾項(xiàng)工作中分析了生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞間相互作用。例如,采用幾種不同的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)花藥絨氈層細(xì)胞中細(xì)胞毒素基因的表達(dá),目的是確定缺損對(duì)花粉發(fā)育的影響(Mariani C等.Nature,347737-741,1990;Roberts MR等.,Sex.Plant Reprod.,8299-307,1995)。不同的研究中缺損絨氈層細(xì)胞對(duì)花粉發(fā)育有不同的影響。采用煙草絨氈層細(xì)胞中特異性的啟動(dòng)子(TA29)調(diào)節(jié)花粉發(fā)育的四分體階段中芽孢桿菌RNA酶(核酸酶)基因的表達(dá),來(lái)產(chǎn)生雄性不育,這說(shuō)明該階段絨氈層對(duì)產(chǎn)生可育花粉是必要的(Mariani C等.Nature,347737-741,1990)。相反的,特異于花粉小孢子階段的絨氈層用擬南芥的APG啟動(dòng)子代替TA29啟動(dòng)子,對(duì)花粉沒(méi)有任何效果(RobertsMR等.,Sex.Plant Reprod.,8299-307,1995)。后者的數(shù)據(jù)顯示絨氈層對(duì)四分小孢子分裂形成花粉來(lái)說(shuō)不是關(guān)鍵的。采用TA29-芽孢桿菌RNA酶構(gòu)建物對(duì)蕓苔屬(Brassica)轉(zhuǎn)基因植株花藥的形成進(jìn)行的組織化學(xué)分析說(shuō)明絨氈層細(xì)胞內(nèi)RNA的降解伴隨著來(lái)自小孢子的RNA的消失(De Block M and Debrouwer D,Planta 189218-225,1993)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示孢粉素沉積開(kāi)始之后以及在小孢子發(fā)育的后期階段小孢子能滲漏小分子,因?yàn)門A29啟動(dòng)子并不直接調(diào)節(jié)小孢子中基因的表達(dá)。
Beals TP和Goldberg RB(Plant Cell,91527-1545,1997)采用新的細(xì)胞缺損策略來(lái)確定花藥中哪些種類型的細(xì)胞涉及開(kāi)裂過(guò)程。他們用兩個(gè)構(gòu)建物來(lái)轉(zhuǎn)化煙草植株構(gòu)建物由TA56啟動(dòng)子與芽孢桿菌RNA酶基因構(gòu)成,該啟動(dòng)子在隔膜(spetum),裂縫或藥隔(花藥)組織中有活性,同時(shí)伴有以下替換形式的構(gòu)建物之一a)在花藥的大多數(shù)組織中有活性的TP12啟動(dòng)子與barstar基因(芽孢桿菌RNA酶抑制劑),b)在花藥的大多數(shù)組織中均有活性但分布模式與TP12不同的TA20啟動(dòng)子與barstar基因,和c)在藥隔(花藥)組織,隔膜和裂縫的細(xì)胞中有活性的大豆凝集素基因啟動(dòng)子與barstar基因。分析轉(zhuǎn)基因植物不同的表型說(shuō)明分裂過(guò)程只依賴于功能性裂縫的存在。
Shull(J.Ind.Abst.Vererb.1297-149,1914)第一個(gè)引入單詞雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)描述雜合現(xiàn)象帶來(lái)的關(guān)于有機(jī)體在細(xì)胞分裂,成長(zhǎng)或其它的生理活動(dòng)等方面的優(yōu)勢(shì)。上述優(yōu)勢(shì)的結(jié)果如大小、活力或產(chǎn)量的增長(zhǎng),早熟,抗病等幾十年來(lái)一直促使大家努力獲得雜交品種(Tsaftaris SA,Physiol.Plantarum 94362-370,1995)。大多數(shù)自身具有雄性和雌性繁殖器官的植物自花傳粉(玉米,水稻,大豆,番茄等),而這為生產(chǎn)雜種種子帶來(lái)問(wèn)題(Kriete G et al.,Plant J.9809-818,1996)。為了避免這個(gè)問(wèn)題必須采用某種系統(tǒng)來(lái)控制自花傳粉。這個(gè)系統(tǒng)可以是機(jī)械的,化學(xué)的或遺傳的。
機(jī)械的系統(tǒng)包括人工摘除花的花藥,這是費(fèi)力和費(fèi)錢的工作。
化學(xué)的方法基于應(yīng)用可以特異性破壞花粉而導(dǎo)致短時(shí)間雄性不育的化學(xué)產(chǎn)品(殺配子劑)。當(dāng)遇到花期較長(zhǎng)或變化的,不可控制的花期時(shí)這種近似的方法便沒(méi)有顯著的效果。另外,通過(guò)殺配子劑來(lái)商業(yè)生產(chǎn)雜種細(xì)胞的特點(diǎn)是昂貴,和化學(xué)產(chǎn)品相對(duì)較高的效率。
大多數(shù)生產(chǎn)雜種種子的商業(yè)系統(tǒng)都是基于遺傳學(xué)方法來(lái)控制開(kāi)花,如此以來(lái)應(yīng)用相互不兼容的植株或雄性不育植株,即不產(chǎn)生花粉的植株,該植株不能釋放花粉或使花粉發(fā)育從而不能產(chǎn)生自體受精繁殖(Horner HT and Palmer RG,Crop Sci.351527-1535,1995)。生產(chǎn)雄性不育植株對(duì)獲得雜種種子有很大的作用。雄性不育去除了植株自身傳粉的可能性,有利于雜種種子的生產(chǎn),后者在遺傳改良計(jì)劃中有重要的應(yīng)用。
目前所有的獲得雜種種子的方法都有局限性,并且不能應(yīng)用于許多有農(nóng)業(yè)價(jià)值的重要作物?,F(xiàn)在,正在發(fā)展基于基因工程的生產(chǎn)雄性不育植株的新方法(Gates P,Biotechnol.Genet.Engineering Rev.13181-195,1994)。這種方法的發(fā)展基于重組DNA和鑒定涉及花粉發(fā)育的基因,已經(jīng)允許激發(fā)核雄性不育(NMS)的分子系統(tǒng)的增殖(Scott RJ et al.,Plant Sci.80167-191,1991)。如前所述,細(xì)胞缺損方法可以阻礙小孢子或?qū)е滦℃咦影l(fā)育的組織(絨氈層和花粉囊壁)的發(fā)育,采用這個(gè)方法能獲得分子系統(tǒng)的雄性不育。另外,也可能產(chǎn)生具有完全功能的花粉,但因?yàn)榛ㄋ幗Y(jié)構(gòu)的缺陷花粉不能釋放。為了得到用于生產(chǎn)雜種種子的雄性不育植株,重要的量得到對(duì)涉及花粉發(fā)育組織有特異性的啟動(dòng)子,用于選擇雄性不育系的系統(tǒng),和用于恢復(fù)F1雜交系育性的系統(tǒng)。特異性啟動(dòng)子大多數(shù)植物基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到空間和時(shí)間上的調(diào)控?;蚧钚缘恼{(diào)節(jié)通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)域的反式因子和順式調(diào)控元件的相互作用來(lái)完成。因而,啟動(dòng)子就是直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列,位于基因的5’區(qū)域。
那些只在花的生殖器官(雄蕊和心皮)中表達(dá)的基因值得引起特殊的注意,因?yàn)樗鼈兊膯?dòng)子具有潛在的能力來(lái)調(diào)控其他基因向所述器官表達(dá),并引發(fā)花的雄性或雌性不育。這就是花藥中某些特異表達(dá)的基因啟動(dòng)子,聯(lián)合只影響花粉發(fā)育的缺損試劑,已經(jīng)應(yīng)用于生物技術(shù)方法來(lái)生產(chǎn)不能自花傳粉的雄性不育植株。因此,這些類型的方法極大依賴于能提供適當(dāng)表達(dá)的啟動(dòng)子的存在。過(guò)去的一些年中,已經(jīng)分離并鑒定了大量在涉及花粉發(fā)育的組織或細(xì)胞中特異表達(dá)的基因,因此這些啟動(dòng)子可用于這個(gè)目的(Scott RJ et al.,Plant Sci.80167-191,1991)。
選擇用來(lái)表達(dá)毒性物質(zhì)或那些使組織退化的物質(zhì)的啟動(dòng)子通常是發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子,對(duì)靶細(xì)胞有充分的活性和特異性。如果靶細(xì)胞是絨氈層組織,啟動(dòng)子應(yīng)該在小孢子發(fā)育的早期起作用,這樣才可能在小孢子不依賴絨氈層支持之前阻止過(guò)程。相似的,如果致死基因是半合子的,啟動(dòng)子也應(yīng)該在減數(shù)分裂之前起作用來(lái)防止部分小孢子缺乏退化的活性。
可由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)替代發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子的作用。然而,具有特異化學(xué)誘導(dǎo)性的已述啟動(dòng)子的數(shù)量非常小。當(dāng)需要保持并增加母系時(shí),應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)阻止花粉發(fā)育有很多優(yōu)點(diǎn),因?yàn)橹仓昕捎⒛芡ㄟ^(guò)自交繁殖。如果雄性不育基于抑制基因在涉及花粉發(fā)育的組織中表達(dá),如通過(guò)“反義”,遺傳活性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也可以應(yīng)用。選擇雄性不育系為了生產(chǎn)工業(yè)數(shù)量的雜種種子,增加母系是必須的。盡管可以通過(guò)體外繁殖的方法為具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物生產(chǎn)許多雄性不育植株,但這樣會(huì)太昂貴。通常繁殖雄性不育系的策略是給缺損基因連接抗除草劑基因(Mariani C et al.,Nature 357384-387,1992)。用同一基因的雄性不育系雜交可育系,沒(méi)遺傳到不育性的植株通過(guò)除草劑去除。經(jīng)過(guò)類推,任何允許區(qū)別這兩個(gè)表型的基因都可以應(yīng)用,如影響種子色素沉著的基因?;謴?fù)可育恢復(fù)雜種植物的可育性,可以通過(guò)將他們與表達(dá)特異于用于產(chǎn)生雄性不育的毒性酶的抑制劑的轉(zhuǎn)基因植株雜交,如barstar基因,該基因的產(chǎn)物抑制芽孢桿菌RNA酶(Mariani C et al.,Nature 357384-387,1992),或所用致死基因的“反義”RNA(Schmulling T eral.,Mol.Gen.Genet.237385-394,1993)。獲得雄性不育植株的分子系統(tǒng)用來(lái)生產(chǎn)雄性不育的缺損方法由Mariani et al第一個(gè)提出(Nature 347737-741,1990)。特異于絨氈層的TA29煙草基因的啟動(dòng)子用來(lái)調(diào)節(jié)兩種不同的RNA酶(來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)的T1 RNA酶和來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的芽孢桿菌RNA酶)在煙草和歐洲油菜(Brassicanapus)中的表達(dá)。得到的雄性不育轉(zhuǎn)基因植株缺少絨氈層,并具有無(wú)小孢子或無(wú)花粉粒的花粉囊。TA29-芽孢桿菌RNA酶構(gòu)建物與bar基因融合而允許從群體中選擇出雄性不育植株,bar基因帶來(lái)對(duì)ammoniumgluphosinate類除草劑的抗性。應(yīng)用除草劑除去雜交后代中的雄性可育植株,而提高分離不育植株的效率。盡管如此,如果不存在回復(fù)雄性不育的可能性,上述轉(zhuǎn)基因植株不優(yōu)于自然變異(Mariani C et al.,Nature 357384-387,1992)。采用攜帶含TA29啟動(dòng)子調(diào)控的核酸酶芽孢桿菌RNA酶抑制基因(barstar)構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植株可以解決問(wèn)題。TA29-barstar植株作為恢復(fù)系,當(dāng)它們與TA29-芽孢桿菌RNA酶構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植株雜交就可以獲得雄性可育的植株。
除了這個(gè)系統(tǒng),文獻(xiàn)還包含有其他生產(chǎn)雄性不育系的方法。
在碧冬茄(Detunia hybrida)中,通過(guò)抑制花藥中類黃酮的合成而激發(fā)核雄性不育,類黃酮阻止花粉成熟。上述結(jié)果可以通過(guò)兩條不同的途徑完成采用查爾酮合成酶基因(chalconsynthetase)RNA的“反義”效果(van der Meer IM等,Plant Cell 4253-262,1992),和采用共抑制查爾酮合成酶基因(Taylor LP and Jorgensen R,J.Hered.8311-17,1992),該酶涉及類黃酮合成路線。為了恢復(fù)可育性,可將類黃酮應(yīng)用到柱頭或同花粉混合,來(lái)允許雄性不育系通過(guò)自花傳粉來(lái)繁殖,這樣以來(lái)不需要用任何選擇標(biāo)記就可獲得雄性不育表型的純合基因系(Ylstra B T等,Plant J.6201-212,1994)。
在煙草中,表達(dá)融合啟動(dòng)子CaMV 35S的毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolC基因也可以誘導(dǎo)雄性不育。遺憾的是,轉(zhuǎn)基因植株中雄性不育表型伴有其他的表型改變(Schmulling T等,EMBO J.72621-2629,1988)。在F1雜種中表達(dá)基因rol C的反義RNA可以恢復(fù)不育(Schmulling Ter al.,Mol.Gen.Genet.237385-394,1993)。
O’Keefe等(Plant Physiol.105473-482,1994)描述了以在煙草絨氈層細(xì)胞中表達(dá)P450SU1細(xì)胞色素為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)型雄性不育。該蛋白可以將外源加入的R7402殺配子劑的無(wú)害衍生物轉(zhuǎn)化成它的活性形式(毒性加強(qiáng)500倍)。然而,可能因?yàn)镽7402的快速代謝,在應(yīng)用該種化合物期間雄性不育局限在處于特定發(fā)育階段的花中。另外,R7402本身有毒,當(dāng)用量是傳統(tǒng)生產(chǎn)雄性不育用量的四倍時(shí)它就開(kāi)始抑制生長(zhǎng)。
另外一種獲得誘導(dǎo)型雄性不育的系統(tǒng)建立在應(yīng)用絨氈層TA29啟動(dòng)子和來(lái)自E.coli的argE基因的基礎(chǔ)上。該基因的產(chǎn)物將N-乙酰-L-phosphinotrycin脫乙?;D(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性化合物gluphosinate。當(dāng)N-乙酰-L-phosphinotrycin應(yīng)用于煙草植株時(shí),絨氈層退化而獲得雄性不育植株(Kriete G等,Plant J.9809-818,1996)。最后,我們想指出,除了是獲得雜種種子的重要工具,雄性不育也是植株在缺少受精(單性結(jié)實(shí)的果實(shí))條件下果實(shí)能夠發(fā)育的有利特點(diǎn)。在這種類型的果實(shí)中缺少種子,從而消費(fèi)者對(duì)它的消費(fèi)或接受就會(huì)增加(Rotino G et al.,Nat.Biothecnol.151398-1401,1997)。一些有農(nóng)業(yè)價(jià)值的單性結(jié)實(shí)的植物有梨樹,檸檬,黃瓜,葡萄和棗椰子。
發(fā)明簡(jiǎn)述總之,本發(fā)明涉及的問(wèn)題關(guān)于開(kāi)發(fā)用于在植物中產(chǎn)生雄性不育的系統(tǒng)。
本發(fā)明提供的解決方法基于分離并鑒定植物發(fā)育早期調(diào)節(jié)花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子,尤其是來(lái)源于豌豆(Pisum sativum L.)的END1基因啟動(dòng)子。應(yīng)用上述啟動(dòng)子可以產(chǎn)生表達(dá)特異于花藥的基因的轉(zhuǎn)基因植物,如激發(fā)花藥缺損的基因,從而產(chǎn)生雄性不育植株,在為獲得雜種種子的遺傳改良計(jì)劃中有極大的用途。在實(shí)施例1中,記述了生產(chǎn)含有不同構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植株,這些構(gòu)建物包含融合報(bào)告基因的END1啟動(dòng)子,觀察到它調(diào)節(jié)花藥報(bào)告基因表達(dá)的特異性。實(shí)施例2描述了采用芽孢桿菌RNA酶基因通過(guò)END1啟動(dòng)子來(lái)生產(chǎn)擬南芥雄性不育植株。得到的結(jié)果說(shuō)明構(gòu)建物激發(fā)花藥在發(fā)育很早階段的完全缺損,阻礙其中花粉的形成并以100%效率得到雄性不育植株。
因此,本發(fā)明的目的就是調(diào)控基因在花藥特異性表達(dá)的核苷酸序列,該序列包含SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列,或其中一段,或與所述序列基本同源的核苷酸序列。應(yīng)用所述核苷酸序列生產(chǎn)雄性不育植株和雜種種子成為本發(fā)明附加的目的。
本發(fā)明另一個(gè)附加目的是構(gòu)建包括整個(gè)或部分所述核苷酸序列的DNA構(gòu)建物,以及含所述的序列或DNA構(gòu)建物的載體和上述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明另一個(gè)附加目的是應(yīng)用所述的DNA序列或所述的DNA構(gòu)建物生產(chǎn)在花藥中特異表達(dá)目的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株,如表達(dá)細(xì)胞毒性多肽和RNA的轉(zhuǎn)基因雄性不育植株,而這種表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)花藥的缺損。獲得的轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)成本發(fā)明另一個(gè)附加目的。
本發(fā)明另一個(gè)附加目的是生產(chǎn)雜種種子的方法,包括向植株引入所述DNA構(gòu)建物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示豌豆花不同階段縱向切片中END1基因表達(dá)的時(shí)空分析。紫色的沉積指示表達(dá)位置。A.開(kāi)花前12天的花牙,其中普通的原基尚沒(méi)有分化出花的花瓣和雄蕊特征,而END1基因開(kāi)始表達(dá)。B.開(kāi)花前10天的花。C.原位雜交的對(duì)照采用“正義”核糖核酸探針(riboprobe)雜交的部分。D.開(kāi)花前8天的花。E和F.開(kāi)花前6天的花,分別采用較小和較大的倍數(shù)攝影。G和H.開(kāi)花前5天,花的連續(xù)的切片分別與“正義”核糖核酸探針(對(duì)照)和“反義”核糖核酸探針雜交。C,心皮;E,雄蕊;P,花瓣;Co,藥隔組織;M,小孢子;T,絨氈層;1,2,3和4,花的輪生體1,2,3和4。
圖2表示END1基因啟動(dòng)子部分的序列。兩個(gè)可能的TATA框(tataaat和tatatata),CAAT框和兩個(gè)CCAAT框以下劃線表示。藍(lán)色,表示三個(gè)可能的CarG框,綠色表示GTCAAAA基元,粉紅表示ACGTCA元件,紅色的表示三個(gè)C(A)6/8基元。GTCAAAA框最后五個(gè)核苷酸與一個(gè)C(A)6/8框共有。符號(hào)+1表示克隆162的cDNA序列。翻譯起始密碼子(ATG)用黑體字表示。另外,表示出了推導(dǎo)的氨基酸序列。黑體的核苷酸表示終止翻譯的密碼子(taa)和可能的多聚酰苷酸化信號(hào)(aataaa)。
圖3表示與END1啟動(dòng)子區(qū)域推定的對(duì)等序列連接AGAMOUSDNA(CarG框和鄰近的序列)的共同序列的堆疊。
圖4表示用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬(Arabidopsis)植物,煙草和番茄的構(gòu)建物pBI101-F3和pBI101-F1.5的示意圖。用來(lái)構(gòu)建構(gòu)建物的質(zhì)粒pBI101包括胭脂堿合成酶的遺傳啟動(dòng)子(nos-pro)同帶來(lái)抗卡那霉素抗性的nptII基因融合,編碼酶E-葡萄糖苷酸酶(GUS-內(nèi)含子)的uidA基因,和位于兩種基因的3’末端的胭脂堿合成酶的多聚酰苷酸信號(hào)(nos-ter)。
圖5表示融合于uidA基因(GUS-內(nèi)含子)的豌豆END1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物擬南芥中的表達(dá)結(jié)果。A和B對(duì)處于不同發(fā)育階段的花中進(jìn)行相應(yīng)的E-葡萄糖苷酸酶的活性(GUS)組織化學(xué)檢驗(yàn)以后,所述活性只能在花藥(藍(lán)色)中檢測(cè)到,而不會(huì)在花的其他器官或植株的其余部分中檢測(cè)到。C包被于石蠟中有GUS活性的雄蕊縱向切片。在形成上皮,藥隔組織,內(nèi)皮組織的細(xì)胞中檢測(cè)到GUS活性(藍(lán)色)。絨氈層或花粉中沒(méi)有檢測(cè)到GUS活性。盡管圖中一些花粉粒是藍(lán)色的,但那是人為造成的,因?yàn)樗{(lán)色只顯現(xiàn)在花粉粒外壁而非內(nèi)部。Co藥隔,En內(nèi)皮,Ep上皮。
圖六表示融合于uidA基因(GUS-內(nèi)含子)的豌豆END1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)植物中的表達(dá)結(jié)果。A,B和C組織化學(xué)檢測(cè)在不同發(fā)育階段煙草花中的GUS活性顯示活性只存在于花藥(藍(lán)色)。D展示花粉粒的花藥新鮮橫切面,并且剩余的絨氈層組織沒(méi)有藍(lán)色。E雄蕊,C心皮,P花瓣,S萼片,Po花粉。
圖7表示融合于uidA基因(GUS-內(nèi)含子)的豌豆END1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄(Lycopersicom sculentum)植株中的表達(dá)結(jié)果。a組織化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄花的GUS活性表明活性特異存在于花藥(St)。b上述花的石蠟切片,GUS活性局限于形成花粉囊的組織(內(nèi)皮,上皮,藥隔等),但不存在于絨氈層或花粉中。Se萼片,Pe花瓣,St雄蕊,Ca心皮,Ep上皮,Co藥隔,En內(nèi)皮,Tp絨氈層和Po花粉。
圖8表示采用END1啟動(dòng)子調(diào)控芽孢桿菌RNA酶基因得到轉(zhuǎn)基因擬南芥雄性不育植株的結(jié)果。a擬南芥屬對(duì)照植株(WT)顯示以成熟花粉受精子房的結(jié)果形成的長(zhǎng)角果(箭頭,右框)。除此以外,可以看到END1啟動(dòng)子調(diào)控芽孢桿菌RNA酶基因的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的影響衰老的子房(右框)因?yàn)闆](méi)有受粉(箭頭)而留在植株中。b以花藥分裂進(jìn)行柱頭傳粉之后野生型擬南芥植株的正?;?階段14)?;ㄋ幊墒煲院?,花絲伸長(zhǎng),直到花粉囊位于柱頭的頂點(diǎn)從而有助于它們傳粉。c在同一階段的轉(zhuǎn)基因植株的花,顯示芽孢桿菌RNA酶影響花藥發(fā)育?;ㄋ幦睋p是完全的,沒(méi)有花粉囊形成。花絲沒(méi)有經(jīng)歷伸長(zhǎng)過(guò)程,因?yàn)榛ㄋ幍陌l(fā)育不完全。在這種條件下,傳粉是不可能的,并且植株是100%不育的。
圖9表示細(xì)胞類型的掃描電鏡(SEM)研究結(jié)果,該細(xì)胞類型存在于帶有pEND1-芽孢桿菌RNA酶構(gòu)建物轉(zhuǎn)基因植株的花藥位置形成的結(jié)構(gòu)中。a對(duì)照擬南芥花的雄蕊。黑色的箭頭代表存在于花藥(鋸齒狀邊緣)上皮的細(xì)胞類型,黑的代表花絲(伸長(zhǎng)的)。b從相反的位置看同一雄蕊。在花絲到達(dá)花藥(箭頭)的地方觀察到細(xì)胞類型的變化(更多圓的)。c轉(zhuǎn)基因植物的雄蕊,觀察花絲中存在的細(xì)胞類型,圓的位于插入帶,但并非花粉囊上皮的那些。d花絲末端帶的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),在那里花絲伸長(zhǎng)的細(xì)胞類型和插入帶的圓形類型共存。
圖10表示石蠟切片的組織化學(xué)研究結(jié)果,關(guān)于帶有pEND1-芽孢桿菌RNA酶構(gòu)建物轉(zhuǎn)基因植物中花藥位置形成的結(jié)構(gòu)。a花藥發(fā)育早期階段擬南芥花對(duì)照的縱向切片。紅的是經(jīng)過(guò)連續(xù)分裂將會(huì)形成成熟花粉的小孢子母細(xì)胞團(tuán)。b在較高級(jí)發(fā)育階段的對(duì)照花藥(12-13,分裂之前),可以觀察到絨氈層幾乎全部消失,且花粉正在成熟(紅色)?;ńz開(kāi)始伸長(zhǎng)。c和d轉(zhuǎn)基因花分別在階段13和12的縱向切片,可觀察到在雄蕊位置形成的結(jié)構(gòu)。在末端帶產(chǎn)生的加寬部分內(nèi)可觀察到小團(tuán)花粉母細(xì)胞,可能是某些停止發(fā)育(沒(méi)有分裂)的絨氈層(紅色)外部細(xì)胞?;ńz沒(méi)有開(kāi)始加長(zhǎng)。e圖d中所示結(jié)構(gòu)之一的細(xì)節(jié),其中展示圓的花粉母細(xì)胞團(tuán)和可能的絨氈層細(xì)胞細(xì)節(jié)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供調(diào)控基因在花藥中特異表達(dá)的核苷酸序列,下文中稱為本發(fā)明的核苷酸序列,其選自a)包含SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列的核苷酸序列;b)所述SEQ ID NO 1中保持有在花藥中調(diào)控特異表達(dá)能力的片段;和c)與a)或b)中定義的核苷酸序列基本類似的核苷酸序列。
在本說(shuō)明書所用的意義上,單詞“類似”意在包括任何至少具有在花藥中調(diào)控特異表達(dá)能力的核苷酸序列。典型的類似DNA序列以SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)可從任何產(chǎn)該類似序列的生物中分離得到,或以SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)通過(guò)替換一或多個(gè)堿基,在序列中插入一或多個(gè)堿基,在序列的任一末端添加一或多堿基或,在任一末端或序列內(nèi)部缺失一或多個(gè)堿基構(gòu)建而得。如,類似的DNA序列可能是SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的子序列。
一般說(shuō)來(lái),類似的DNA序列與SEQ ID NO1中定義的核苷酸序列基本同源。從本說(shuō)明書的意義來(lái)看,“基本同源”意即在核苷酸水平所討論的核苷酸序列至少有60%的同一性,優(yōu)選至少85%或更優(yōu)選至少95%。
本發(fā)明的核苷酸序列可源于包含它的任一生物,如來(lái)自豌豆(Pisum sarivum L.)或來(lái)自該DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明的核苷酸序列可用傳統(tǒng)技術(shù)分離,應(yīng)用本發(fā)明核苷酸序列的信息制備寡聚核苷酸探針從任何其他物種的DNA中起始。
在具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明的核苷酸序列是SEQ ID NO1中所示的序列,與豌豆(Pisum sativm L.)END1基因啟動(dòng)子的核苷酸序列相對(duì)應(yīng)。
在我們實(shí)驗(yàn)室以前進(jìn)行的工作中,我們分離并表征僅在花藥的特定組織中表達(dá)的豌豆(Pisum sativm)基因。它采用先分離并鑒定它編碼的蛋白的方法來(lái)進(jìn)行對(duì)它的分離和表征。為了做到這一點(diǎn),用花的其他器官(萼片,花瓣和心皮)的抽提液來(lái)免疫兔子得到多克隆血清,用該血清進(jìn)行雄蕊抽提液的免疫減法過(guò)程。這個(gè)過(guò)程的結(jié)果就是產(chǎn)生了富含特異于雄蕊的蛋白抽提液,去除了那些在花其他器官中共有的蛋白。用所述的富集抽提液免疫小鼠,獲得產(chǎn)生特異于特定雄蕊蛋白的單克隆抗體的雜交瘤系。其中之一(MabA1)識(shí)別在雄蕊中大量存在的一種26kD蛋白(END1),它的原位免疫說(shuō)明它僅在花藥中組成花粉囊結(jié)構(gòu)的組織中積累。采用親和層析,我們純化了一定量的所述蛋白,測(cè)定了它N-末端20個(gè)氨基酸序列。得到的序列與先前所述的豌豆子葉中作用未知的另外一種蛋白(PA2)有高的同源性(Higgins等,Plant Mol Biol.837-45,1987)。采用PA2的cDNA作探針篩選豌豆花的基因文庫(kù),我們分離到帶有完全編碼序列(910bp,我們稱之為END1,SEQ ID NO 2)的克隆,其表現(xiàn)和PA2有72%的同源性。Northern印跡分析說(shuō)明這種新蛋白表達(dá)的特異性,由于它局限于花藥的抽提液,而在花的其他器官,子葉和植株組織中沒(méi)有檢測(cè)到。另一方面,原位雜交檢測(cè)證實(shí)了END1基因在豌豆花藥組織中在發(fā)育不同階段的表達(dá)特異性。(圖1)早期發(fā)育階段(在花瓣和雄蕊中普通原基細(xì)胞分化)它開(kāi)始表達(dá),并持續(xù)到花藥裂開(kāi),只在上皮,藥隔,中層和內(nèi)皮表達(dá)。該基因的表達(dá)在營(yíng)養(yǎng)組織(絨氈層)和生殖組織(花粉)中檢測(cè)不到。同時(shí)檢測(cè)花的其他器官,該植株的其他部分(莖,葉,根等)和種子(子葉),結(jié)果均呈陰性。
END1基因在花藥的形成花粉囊的組織中特異性的表達(dá)提示我們分離并分析所述基因的啟動(dòng)子。研究這個(gè)啟動(dòng)子具有不同原因的價(jià)值。首先,我們能夠確定啟動(dòng)子的哪一個(gè)基元決定基因在花藥中的特異表達(dá)。相似的,分析何種轉(zhuǎn)錄元件調(diào)控END1基因的表達(dá),及確定它們是否與調(diào)控花器官身份的MADS-框同源異型基因相關(guān),尤其是是否與涉及雄蕊發(fā)育的基因組B和C相關(guān)是很有趣的。帶著這些目標(biāo),我們采用END1 cDNA(SEQ ID NO 2)完整片段作為探針篩選豌豆基因組DNA文庫(kù)。初篩了500,000噬菌斑,其中我們發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性克隆(克隆162)。再三次篩選后進(jìn)行分離與純化。采用培養(yǎng)物和陽(yáng)性噬菌體裂解我們純化得到它的DNA。采用HindII消化DNA,因?yàn)樵撁缚稍谄鹗嫉?10個(gè)堿基處裂解cDNA片段,從噬菌體消化物中我們獲得了包含cDNA前210個(gè)堿基的DNA片段以及其上游更多的啟動(dòng)子序列。采用克隆162的cDNA片段5’末端的210bp作探針與消化的DNA雜交做southern雜交分析。該片段用作探針來(lái)確定限制酶切得到的哪一個(gè)片段是由210個(gè)堿基和部分或全部的啟動(dòng)子序列組成的。southern印跡分析表明來(lái)自噬菌體DNA Hind II消化的大約3Kb的片段與探針雜交。采用QUIARXII的方法純化3Kb片段,在Bluescript-KS(-)載體的HindII克隆位點(diǎn)進(jìn)行克隆然后測(cè)序。圖2和SEQ ID NO 1(圖2中的核苷酸從-2736和1與SEQ ID NO 1中的核苷酸1和2766分別相關(guān))表示了END1啟動(dòng)子的全長(zhǎng)核苷酸序列。
測(cè)定克隆片段的序列之后,我們發(fā)現(xiàn)我們已經(jīng)分離得到2946bp的片段。其中,3’末端的210bp與cDNA162克隆前210bp的片段相對(duì)應(yīng)。在-263位置(SEQ ID NO1,2474)和-56(SEQ ID NO1,2681),將分離得到的cDNA162的第一個(gè)作為核苷酸+1(在SEQ ID NO1中核苷酸+1對(duì)應(yīng)于核苷酸2377),發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)可能的TATA框,在位置-347(SEQ ID NO1,2390)和-66(SEQ ID NO1,2671),兩個(gè)推定的CCAAT框,和在位置-401 CAAT框(SEQ ID NO1,2336)(圖2)。除了這些真核生物啟動(dòng)子中普通的框,典型的植物啟動(dòng)子框也被發(fā)現(xiàn)。在表1中從END1基因啟動(dòng)區(qū)域的核苷酸-400(SEQ ID NO1,1977)和+1之間發(fā)現(xiàn)的植物啟動(dòng)子的所有基元,采用National Institute forAgro-biological Resource of Japan的數(shù)據(jù)庫(kù)定義。我們以啟動(dòng)子中的功能框相對(duì)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的距離通常不超過(guò)400個(gè)核苷酸為基礎(chǔ)選擇這個(gè)區(qū)域,這是根據(jù)參考研究不同框的科學(xué)文獻(xiàn)得到的。表I.位于end1啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸序列-400到-1之間片段中的順式元件的描述基元 位置 共有序列 參考文獻(xiàn)(鏈)ELEMENT-300 -157(+)TGHAAARK Thomas和Flavell,1990AP3 -209(+)TGTGGWWW Mercurio和Karin,1989ASF1 -122(-)TGACG Terzaghi和Cashmore,1995G-BOX -84(+) CACGTG Foster等.,1994E-BOX -333,-295,-30(+) CANNTG Kawagoe等.,1994GATA -265,-205(+) GATA Gilmartin等.,1990GT1 -278,-156(+) GRWAAW Lawton等.,1991HEXMOTIF1 -127(+)ACGTCA Mikami等.,1989I-BOX -356(-),-194(-) GATAA Giuliano等.,1988MYB-PH3 -234(+)CNGTTA Solano等.,1995MYB-ST1 -206(+)GGATA Baranowskij等.,1994ROOTMOTIF1-202(+),-96(+)ATATT Elmayan和Tepfer,1995RY-34(+) CATGCAYFujiwara和Beachy,1994SIF -215(+)ATGGTA Zhou等.,1992SEF1 -392(+)ATATTTAWW Lessard等.,1991SEF4 -276(+)RTTTTTRLessard等.,1991MYB-P -349(+)CCAACC Grotewold等.,1994SBF1 -150(+)TTAA Lawton等.,991CarG -103(-)CC(A/T)6GGShiraishi等.,1993
對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域序列的進(jìn)一步分析可以檢測(cè)到其他調(diào)控基元的存在。其中兩個(gè)是CarG框(-329TGAAAATACC-320(SEQ ID NO12408TGAAAATACC2417)和-300GGTTTCAACT-291(SEQ ID NO12437GGTTTCAACT2446)),盡管不如第一個(gè)與共同序列相似,但也起相同作用。起作用的CarG框的例子,盡管與共同序列不同,由擬南芥屬中AP3基因啟動(dòng)子的三個(gè)CarG框中的兩個(gè)(CCTTTCATGG和CCATTTTTAG)代表(Tilly JJ等,Development 1251647-1657,1998)。我們鑒定的其他的基元是-290GTCAAAA-284(SEQ ID NO12447GTCAAAA2453),在基因Zml3和LAT52中存在(Zou JT等,Am.J.Bot.81552-561,1994),基元-127ACGTCA-122(SEQ ID NO12610ACGTCA2615)位于基因Bp19(Zou JT等,Am.J.Bot.81552-561,1994),和重復(fù)三次的元件C(A)6/8(位于-507(SEQ ID NO 2230-2236),-288(SEQ ID NO 2449-2457)和-247(SEQ ID NO 2490-2496))在基因OlnB4和OlnB19的啟動(dòng)子上(HongHP等,Plant Mol.Biol.34549-555,1997)。
END1啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的不同的基元可以按照它們所在基因類型的功能分組。基元SEF1,SEF4,E-框,RY,和元件-300以它們存在于編碼種子儲(chǔ)備蛋白的基因啟動(dòng)子中而表征。
基元GATA,GT1,I-框和ASF-1存在于受光調(diào)控其表達(dá)的基因上。有些框識(shí)別與Myb動(dòng)物蛋白同源的因子MYB-P,MYB-PH3和MYB-ST1,存在于涉及phenylpropanoids生物合成路線的基因中。G-框基元存在于多數(shù)由不同環(huán)境和生理因子調(diào)控的植物基因中。菜豆(phaseolusvulgaris)的防御基因chs15中已經(jīng)描述過(guò)SBF1。 Rootmotif1已被鑒定存在于玉米根的兩個(gè)基因rolD和poxI的啟動(dòng)子序列中。元件GTCAAAA,ACGTCA和C(A)6/8存在于歐洲油菜的花藥特異基因如Bp19中(Zou JT等,Am.J.Bot.81552-561,1994;Hong HP等,PlantMol.Biol.34549-555,1997)。上述所有基元均列于SEQ ID NO1。
最后,基元CArG是一個(gè)由MADS結(jié)構(gòu)域識(shí)別的DNA共有序列,該結(jié)構(gòu)域表征花器官發(fā)育涉及的植物同源異型基因(Huang H等,Nuc.Acids Res.214769-4776,1993;Shiraisi H等,PlantJ.4385-398,1993),基因APETALA-1(AP1;Mandel MA等,Nature360273-277,1992),APETALA-3(AP3,Jack T等,Cell68683-697,1992),PISTILLATA(PI,Goto K等,GenesDev.81548-1560,1994)和AGAMOUS(AG,Ranofsky MF等,Narute34635-39,1990)是擬南芥屬中調(diào)控花器官身份的同源異型基因。這些基因?qū)儆谄湫蛄兄邪琈ADS結(jié)構(gòu)域的蛋白家族。MAD結(jié)構(gòu)域由56個(gè)氨基酸組成,涉及到MADS基因自身或與其他的MADS基因的二聚體化,以及這些二聚體與DNA的結(jié)合(Shore P and Sharrocks AD,E.J.Biochem.2291-13,1995)。
B型同源異型基因(擬南芥中的AP3和PI-)控制花瓣和雄蕊的發(fā)育,而C型(擬南芥中的AG)控制雄蕊和心皮的生成。END1基因在雄蕊中表達(dá),因而可以成為B型與C型MADS基因的靶基因。END1啟動(dòng)子區(qū)域存在上述推定的CArG框支持這個(gè)假說(shuō)。Huang H等(Nuc.Acids Res.214769-4776,1993)與Shiraisi H等(PlantJ.4385-398,1993)確定AG基因應(yīng)該需要鄰接CarG框的共有序列來(lái)結(jié)合DNA。AG中MADS結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA的共有序列鑒定為根據(jù)Shiraisi H等(Plant J.4385-398,1993)的5’-TT(A/T/G)CC(A/T)6GG(A/T/C)AA-3’和根據(jù)Huang H等(Nuc.Acids Res.214769-4776,1993)的TT(A/T)CC(A/T)(A/t)2(T/A)NNGG(-G)(A/t)2。在END1啟動(dòng)子位置-103處鄰接CarG框的序列與由先前作者闡述的AGAMOUS基因MADS結(jié)構(gòu)域識(shí)別的序列相吻合,除兩個(gè)核苷酸例外。這個(gè)事實(shí)支持END1基因能夠成為花同源異型基因的直接作用靶點(diǎn)的假設(shè),尤其是它會(huì)是AGAMOUS基因的作用靶點(diǎn)。
為了確定從END1克隆的啟動(dòng)子序列是否調(diào)控基因在花藥中特異性的表達(dá),以及它能否在豌豆(P.sativum)以外的植物中起作用,我們把啟動(dòng)子融合到基因E-葡糖醛酸糖苷酶(uidA,GUS-內(nèi)含子)的編碼序列來(lái)轉(zhuǎn)化煙草植株(Nicotiana tabacum),擬南芥和番茄(Lycopersicom sculentum)〔實(shí)施例1〕。采用質(zhì)粒pBI101pBI101-F3和pBI101-F1.5完成了兩種不同的構(gòu)建物(圖4)。第一個(gè)構(gòu)建物包含從核苷酸-2736至-6(SEQ ID NO1,1到2731)的核苷酸序列,第二個(gè)包含從-1531至-6(SEQ ID NO1,1206到2731)的殘基的序列。在最初的嘗試中檢測(cè)后一個(gè)構(gòu)建物標(biāo)記克隆片段中組成啟動(dòng)子區(qū)域的序列。采用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58菌株將兩種構(gòu)建物引入到擬南芥,采用根癌土壤桿菌LBA4404菌株將構(gòu)建物pBI101-F3引入到煙草和番茄。上述所有的植物又用對(duì)照的pBI101來(lái)轉(zhuǎn)化,然后在不同的組織中分析報(bào)告基因的表達(dá)。
上述實(shí)施例的轉(zhuǎn)化結(jié)果說(shuō)明從END1基因中分離得到的啟動(dòng)子序列起到充分的作用,因?yàn)樗谕愣挂酝庵参锏幕ㄋ幹姓{(diào)控基因以特異性的方式異源表達(dá)。而且,該啟動(dòng)子位于-1531和-6之間核苷酸序列的這種能力已被描述過(guò)。另一方面,基本保持有在花藥中調(diào)控特異表達(dá)的能力的最小核苷酸序列可用相似的實(shí)驗(yàn)定義。如此以來(lái),它們組成了本發(fā)明所有核苷酸序列的一部分,無(wú)論是具有END1啟動(dòng)子區(qū)域的全部序列或是基本保持有在花藥中調(diào)控特異表達(dá)的能力的核苷酸序列的任何片段。另一方面,從豌豆END1基因啟動(dòng)子序列開(kāi)始,基于分子生物學(xué)技術(shù)普通知識(shí),可以從其他植物種類中獲得與END1同源的兩個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。所有與本發(fā)明中所述的一個(gè)序列同源,并基本保持有在花藥中調(diào)控特異表達(dá)的能力的核苷酸序列構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
這些調(diào)控序列可用于開(kāi)發(fā)還含有目的基因編碼序列DNA構(gòu)建物,該DNA構(gòu)建物又可整合入重組表達(dá)載體。為了做到這一點(diǎn),本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)都可以應(yīng)用(Sambrook et al,“Molecular cloning,aLaboratory Manual”,2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.AND.,1989 Vol 1-3),其中一些在本發(fā)明中展示。上述重組載體允許表達(dá)不同的肽,多肽,蛋白質(zhì)或RNA編碼序列,如本發(fā)明發(fā)明背景所述,它們表達(dá)后會(huì)對(duì)所在的組織有毒從而誘導(dǎo)該組織缺損并由此導(dǎo)致植株雄性不育。這些基因的實(shí)例公布于歐洲專利申請(qǐng)EP412006,其可以和本發(fā)明發(fā)明背景所述的那些一起引作參考。另一方面,這些構(gòu)建物可以包含其他在花藥中調(diào)控特異表達(dá)的元件,這取決于所用的重組載體,要轉(zhuǎn)化的植物等。所有可能的合作為共同支配者(commondominator)的本發(fā)明核苷酸序列的上述DNA構(gòu)建物,和它們?cè)谏a(chǎn)雄性不育植物中的應(yīng)用組成本發(fā)明的一部分。
所以,本發(fā)明提供DNA構(gòu)建物,它包括本發(fā)明的核苷酸序列和目的肽,多肽,蛋白質(zhì),活性或RNA的編碼序列。在具體的實(shí)施方案中,所述DNA構(gòu)建物包括在本發(fā)明核苷酸序列調(diào)控下促進(jìn)植株不育的活性編碼序列。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中,所述DNA構(gòu)建物包括具有回復(fù)或恢復(fù)植物育性的活性的編碼序列,如在本發(fā)明核苷酸序列的調(diào)控下具有抑制促植株不育活性的活性編碼序列。所述DNA構(gòu)建物也可以包含操作性連接于例如轉(zhuǎn)錄終止序列的某些調(diào)控元件而實(shí)現(xiàn)花藥特異表達(dá),這取決于所用的重組載體,轉(zhuǎn)化的植株等。
本發(fā)明的核苷酸序列,或本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建物,可以插入合適的載體。因此,本發(fā)明也涉及載體如表達(dá)載體,含本發(fā)明所述的核苷酸序列和所述DNA構(gòu)建物。選擇載體取決于后來(lái)所要引入的宿主細(xì)胞。以實(shí)施例中的方法,所述DNA序列所引入的載體可以是質(zhì)?;虍?dāng)引入宿主細(xì)胞后會(huì)整合到所述細(xì)胞的基因組中并隨同所整合的染色體一起復(fù)制的載體。為了獲得所述載體,可以應(yīng)用本領(lǐng)域周知的常規(guī)方法〔Sambrook等,1989,前面已引用〕。
本發(fā)明也提供細(xì)胞,其含有本發(fā)明的核苷酸序列,或含所述核苷酸序列的DNA構(gòu)建物或上文提及的載體??梢赞D(zhuǎn)化本發(fā)明核苷酸序列的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞,優(yōu)選真核細(xì)胞如植物組織細(xì)胞。轉(zhuǎn)化植物組織細(xì)胞同樣可用常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。關(guān)于基因轉(zhuǎn)移到植物的綜述包括載體,DNA轉(zhuǎn)移的方法等,可見(jiàn)Marta lzquierdo,Ed.Piramide(1999)的書“Ingenieria genetica and transferencia genica”,具體到第九章,第283-316頁(yè),標(biāo)題為“Transferencia genica a plantas”。
本發(fā)明的核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化植物并獲得轉(zhuǎn)化的植物。在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛描述植物轉(zhuǎn)化。眾所周知,可采用多種系統(tǒng)例如質(zhì)粒載體,脂質(zhì)體,電穿孔,微量注射,擴(kuò)散,基因槍,磷酸鈣共沉淀,使用病毒載體等。在本發(fā)明中,采用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化植物作為許多技術(shù)可能性的實(shí)施例被描述,其所有都組成本發(fā)明的部分。從這個(gè)意義上說(shuō),在實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化煙草植株(N.tabacum),番茄(L.sculentum)和擬南芥作為植物轉(zhuǎn)化的例子被描述。
本發(fā)明的核苷酸序列可用來(lái)在植物中調(diào)控目的肽,多肽,蛋白質(zhì),活性或RNA序列在花藥中特異表達(dá)。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明的核苷酸序列可用來(lái)生產(chǎn)雄性不育的植物(雄性不育),也就是說(shuō)雄性不育植物,這包括采用本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物,所述的DNA構(gòu)建物包含促進(jìn)植株不育活性的編碼序列例如在本發(fā)明核苷酸序列控制下的細(xì)胞毒性基因序列,如編碼核糖核酸酶活性的基因,從而使得包含于所述構(gòu)建物中的編碼序列的表達(dá)從花藥發(fā)育的最初階段引發(fā)其完全缺損,阻止其中花粉的生成并以100%效率生產(chǎn)雄性不育植株。所得雄性不育植物可通過(guò)包括在允許其發(fā)育和成熟的條件下培育的方法用于產(chǎn)生雜種種子。
本發(fā)明也提供了一種恢復(fù)雄性不育植物育性的方法,包括用所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述雄性不育植物從而獲得可育植物,所述的DNA構(gòu)建物包括在本發(fā)明核苷酸序列的調(diào)控下具有回復(fù)或恢復(fù)植株育性活性的編碼序列。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中,雄性不育是因?yàn)楸磉_(dá)芽孢桿菌RNA酶而恢復(fù)育性是因?yàn)楸磉_(dá)具有回復(fù)或恢復(fù)植株育性活性的編碼序列如表達(dá)barstar,這種活性可以抑制由芽孢桿菌RNA酶引起的花藥缺損活性。
對(duì)本發(fā)明核苷酸序列的轉(zhuǎn)化敏感的植株可以是單子葉植物或雙子葉植物,如具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的單子葉植物或雙子葉植物如谷類,園藝植物如煙草,番茄,瓜,西瓜,黃瓜等。
在另外一個(gè)具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供含有整合到其基因組中的本發(fā)明核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,也包括含至少一種所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物組成本發(fā)明的附加目的,可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)獲得,如應(yīng)用常規(guī)反義mRNA技術(shù)和/或過(guò)量表達(dá)(正義沉默)或其他,如采用二元載體或其他當(dāng)前不同的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用的載體。構(gòu)成本發(fā)明部分的轉(zhuǎn)基因植株實(shí)例包括單子葉植物和雙子葉植物。
本發(fā)明的核苷酸序列用于獲得雄性不育植物和生產(chǎn)雜種種子方面,因?yàn)槿缜八?,它調(diào)控形成花粉囊的組織中編碼產(chǎn)生細(xì)胞缺損的特定的酶基因的表達(dá)。這個(gè)系統(tǒng),聯(lián)合其他相似系統(tǒng),產(chǎn)生那些激發(fā)細(xì)胞缺損的酶的抑制物而恢復(fù)育性,將對(duì)基于生產(chǎn)雜種種子(雜種優(yōu)勢(shì))的基因改良計(jì)劃有很大的用途。帶著同樣的目的,以前試過(guò)不同的啟動(dòng)子,但是通過(guò)它們沒(méi)有獲得具有100%的不育植物群體(Zhan Xet al.,Sex.Plant Reprod.935-43,1996;Roberts MR等,Sex.Plant Reprod.8299-307,1995)。這種現(xiàn)象是因?yàn)樵诨ǚ蹖?shí)際上已經(jīng)成熟的發(fā)育后期階段激活上述啟動(dòng)子,所以進(jìn)行細(xì)胞缺損的組織(絨氈層)不再是花粉達(dá)到完全成熟所必需的。這種方法學(xué)的嚴(yán)重問(wèn)題是最后作為結(jié)果得到雜交與非雜交種子混和的群體。本發(fā)明的核苷酸序列替代所述的啟動(dòng)子,因?yàn)楫?dāng)雄蕊原基細(xì)胞開(kāi)始分化的時(shí)候它被激活。在這個(gè)早期階段,蛋白酶或核酸酶將通過(guò)破壞早期階段生發(fā)形成花粉囊組織的細(xì)胞系來(lái)阻礙花藥正常的發(fā)育。END1表達(dá)的組織是對(duì)花藥提供支持和結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu))的組織,從而很難想像沒(méi)有上述組織花藥可以產(chǎn)生花粉。從這種意義上說(shuō),實(shí)施例2描述以100%效率生產(chǎn)擬南芥雄性不育植株??梢院侠淼钠谕景l(fā)明的核苷酸序列(具體為END1啟動(dòng)子)能夠在不同的雙子葉和單子葉植物中保持活性,恰如在上述的幾種植物中已鑒定C類型的MADS基因(與AGAMOUS同源)可激活如雙子葉植物中的啟動(dòng)子,所以可以期待本發(fā)明核苷酸序列將對(duì)生產(chǎn)具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的雙子葉和單子葉植物雄性不育有用。實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因植物擬南芥,煙草(Nicotiana tabacum)和番茄(Lycopersicim sculentum)中END1啟動(dòng)子的功能研究1.1-設(shè)計(jì)pBI101-F3和pBI101-F1.5構(gòu)建物從pBluescript-KS(+)質(zhì)??寺〉腄NA基因組片段中以TB1,TB2和TB3寡聚物采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到END1基因啟動(dòng)子區(qū)域(表2)。TB1引入限制性位點(diǎn)BamHI,而TB2和TB3引入SalI限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增兩個(gè)片段其中2731bp的一個(gè)包含幾乎全部分離得到的啟動(dòng)子區(qū)域(-2736/-6),1526bp的另外一個(gè)鄰近基因的編碼區(qū)域(圖1中-1531/-6)(SEQ ID NO 4)。上述兩個(gè)片段均不含有編碼序列。兩個(gè)片段均在質(zhì)粒載體PCR2,1.中克隆(Clar,J.M.(1998)Nuc.Acids.Res.169677-9686;Mead,D.,et al(1991)Bio Technolgy9657-663)。然后用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI將克隆的插入片段釋放出來(lái),再克隆到質(zhì)粒pBI101中調(diào)控E-葡萄糖苷酶基因uidA(GUS-內(nèi)含子)的表達(dá)(Vancanneyt G等,Mol.Gen.Genet.220245-250,1990)。在步驟的最后,得到兩個(gè)不同的構(gòu)建物pBI101-F3和pBI101-F1.5。第一個(gè)包含2731bp的片段,第二個(gè)包含1526bp的片段(圖4)。引物 序列(5’o 3’) DNA模板TB1 GAGAGCCTAGGAAGGTTATGTTGTGAGCF3克隆TB2 GACTCGAGGTCGACTTCAACCTTATTAGT F3克隆GTB3 GACTCGAGGTCGACAACCAGTGTGCATAT F3克隆ATC表2.PCR擴(kuò)增采用的引物1.2.-擬南芥,煙草,番茄植物的轉(zhuǎn)化為了獲得煙草的轉(zhuǎn)基因植株,應(yīng)用了兩個(gè)煙草載培種Samsun和Pettit Habane SRI。采用Horsch et al所述(Science,223496-498,1984)經(jīng)Fisher和Guiltinan修改(Plant Mol.Biol.Reporter 132780289,1995)的方法,用葉盤與根癌土壤桿菌(LBA4404菌株)在MSS培養(yǎng)基(Marashige and Skoog培養(yǎng)基4.4g/L,蔗糖2%,Mes 100mg/L,phytagel 3.5g/L,pH5.9)中24℃黑暗共培養(yǎng)三天來(lái)實(shí)施轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)以后,葉盤轉(zhuǎn)移到有再生和篩選培養(yǎng)基(MSS培養(yǎng)基加入IAA 0.2mg/L,6-BAP 2.2mg/L,羧芐青霉素400mg/L和卡那霉素100mg/L)的盤中,出現(xiàn)的葉芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MSS培養(yǎng)基加入IAA 0.2mg/L,羧芐青霉素200mg/L和卡那霉素100mg/L)。再生植株轉(zhuǎn)移到盛有(1∶1)泥炭蛭石的罐子中,保存直到它們產(chǎn)出種子。在整個(gè)過(guò)程中培養(yǎng)條件是光照12小時(shí),溫度24℃。
用Columbia栽培種生產(chǎn)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)化方法按照Bechtold et al所述(C R Acad.Sci.Paris,Life Sci.,3161194-1199,1993)通過(guò)真空滲透和篩選抗卡那霉素的植株實(shí)現(xiàn)。采用根癌土壤桿菌C58菌株。抗卡那霉素的植株轉(zhuǎn)移到泥煤∶珍珠巖∶蛭石(1∶1∶1)的罐子于培養(yǎng)箱在22℃長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)直到最后收集到種子。
為了獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株,采用已知為VC82b的生長(zhǎng)變種按照Ellul等,的方法(Teor.Appl.Genet.In press,2001)用從萌發(fā)種子(12天)起的雙子葉植物作為起始材料,在卡那霉素培養(yǎng)基中以nptII基因作標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化體。1.3.-組織化學(xué)分析(GUS)轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)基因植株的第一代采用組織化學(xué)分析E-葡萄糖苷酶的活性。采用兩次5分鐘真空脈沖在0.5nM鐵氰化物,0.5nM亞鐵氰化物,0.1%的Triton X-100和2mM X-葡糖酸酸的0.1MPH7.0的磷酸緩沖液中滲透被研究的組織,在該溶液中37℃培養(yǎng)16小時(shí)。然后,采用50°,70°,90°乙醇連續(xù)沖洗脫色。藍(lán)色的鑒定為GUS陽(yáng)性帶。固定顯現(xiàn)藍(lán)色的組織,在脫水之前包埋于石蠟中(Canas LA et al.,PlantJ.6597-604,1994),以此通過(guò)切片鑒定具體何種類型的細(xì)胞表現(xiàn)E-葡萄糖苷酶活性。采用MZ8鏡頭(Leica)拍攝未經(jīng)處理的組織,石蠟中的組織切片采用光學(xué)顯微鏡Eclipse600(Nikon)拍攝。1.4.分析擬南芥轉(zhuǎn)基因植株采用組織化學(xué)檢測(cè)抗卡那霉素第一代轉(zhuǎn)化植株組織的E-葡萄糖苷酶活性來(lái)研究基因uidA(GUS-內(nèi)含子)的表達(dá)。檢測(cè)的器官有花,葉,莖,根和發(fā)芽的苗。
我們分析了26株轉(zhuǎn)化了pBI101-F3構(gòu)建物的植株,其中24株表現(xiàn)出特異的E-葡萄糖苷酶活性,剩下的兩株在任何被檢測(cè)組織中都沒(méi)有表現(xiàn)活性(圖5)。對(duì)于pBI101-F1.5構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的19株抗卡那霉素植株,只有兩株缺少GUS活性。剩下的17株特異地在花藥中觀察到藍(lán)色。表現(xiàn)GUS活性的花藥組織同表達(dá)豌豆END1基因的一樣上皮,藥隔,中層和內(nèi)皮。雄蕊花絲,中央維管柱,營(yíng)養(yǎng)組織(絨氈層),花粉母細(xì)胞和成熟的花粉在任何情況下均無(wú)GUS活性。pBI101質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植株(陰性對(duì)照)在任何分析的組織中沒(méi)有表現(xiàn)GUS活性。
用一種或另一種構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植株間,GUS活性沒(méi)有觀察到不同。然而,我們觀察到無(wú)論采用何種構(gòu)建物,同一植株的花的著色濃度有變化,因?yàn)槲覀円呀?jīng)區(qū)別了在特定階段不表現(xiàn)GUS活性的花與在同一階段確實(shí)表現(xiàn)GUS活性的花??赡?,這個(gè)現(xiàn)象是因?yàn)榻M織間滲透的檢測(cè)試劑量的不同。兩種構(gòu)建物取得相似的結(jié)果顯示所有活性必須的調(diào)控片段包含在殘基-1531和-6之間,盡管需要更多的研究來(lái)確定保持有啟動(dòng)子活性的最小片段。1.5.-分析轉(zhuǎn)基因煙草植物(Nicotana tabacum)進(jìn)行關(guān)于pBI101-F3構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的第一代植物中uidA基因表達(dá)的研究。檢測(cè)的器官有花,葉,莖和根。
我們分析了12株抗卡那霉素的煙草,其中10株在它們的花藥中表現(xiàn)出GUS活性,而兩株在任何被檢測(cè)組織中都沒(méi)有表現(xiàn)出活性(圖6)。從相同植株中我們發(fā)現(xiàn)和在擬南芥植株中觀察到的同樣的植株間藍(lán)色色帶的變化。如同預(yù)期,pBI101質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植株(陰性對(duì)照)在任何組織中沒(méi)有表現(xiàn)E-葡萄糖苷酶活性。1.6.-分析轉(zhuǎn)基因番茄(Lycopersicom sculentum)分析了10株不同的抗卡那霉素植株,其中一半在分析花藥中uidA基因的表達(dá)時(shí)顯示陽(yáng)性。研究pBI101-F3構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的第一代植株中所述基因的表達(dá)。檢測(cè)的組織有花,葉,莖和根。恰如前面的情況,結(jié)果實(shí)際上是一致的,觀察到GUS基因只在花藥形成花粉囊的組織中表達(dá)(圖7)。實(shí)施例2采用END1啟動(dòng)子調(diào)控的芽孢桿菌RNA酶基因來(lái)生產(chǎn)擬南芥的雄性不育植株2.1.-設(shè)計(jì)pBI101-pEND1-芽孢桿菌RNA酶/barstar構(gòu)建物pBI101-F3構(gòu)建物包括END1啟動(dòng)子的2731bp片段和GUS基因,被BamHI和SacI限制性內(nèi)切酶消化得到GUS片段。采用QuiaexII系統(tǒng)(Quiagen)從瓊脂糖凝膠上分離對(duì)應(yīng)于帶BamHI和SacI末端(termini)的pBI101-pEND1質(zhì)粒的片段。芽孢桿菌RNA酶/barstar片段(Mariani et al.Nature,347737-741,1990;Mariani etal.,Nature 357384-387,1992),克隆在質(zhì)粒pBluescriptKS(+)的BamHI位點(diǎn),采用以下寡聚物擴(kuò)增T75’TAATACGACTCACTATAGGG3’,eInhi II5’GCGAGCTCTTAAGAAAGTATGATGGTGATG3’用第一個(gè)在芽孢桿菌RNA酶基因的ATG水平保持住BamHI的拼接位點(diǎn),而用第二個(gè)在barstar基因的終止密碼子水平產(chǎn)生SacI拼接位點(diǎn)。PCR反應(yīng)的片段產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(Promega)上。最后,用BamHI和SacI釋放出克隆的芽孢桿菌RNA酶/barstar插入片段(918bp),并連接到帶有BamHI和SacI的末端pBI101-pEND1質(zhì)粒上。2.2.-結(jié)果和評(píng)價(jià)得到的結(jié)果表示在圖8中。以pEND1-芽孢桿菌RNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植株顯示它們花的心皮是如何不育的,如何不能如同對(duì)照植株發(fā)生的那樣形成相應(yīng)的長(zhǎng)角果。另一方面,轉(zhuǎn)基因植株顯示花絲沒(méi)有伸長(zhǎng),其末端出現(xiàn)一些非常初級(jí)的結(jié)構(gòu)而不是花藥。得到的所有抗卡那霉素的17株轉(zhuǎn)基因植株顯示其花藥完全被缺損從而具有100%的雄性不育。
采用掃描電子鏡(SEM)進(jìn)行的研究表明(圖9),所述的結(jié)構(gòu)中存在的細(xì)胞類型與花藥上皮中存在的并不對(duì)應(yīng),只檢測(cè)形成花絲的類型或存在于花絲連接花藥的地帶的類型。以石蠟結(jié)構(gòu)切片并以Alcianblue和Safranin染色來(lái)檢測(cè)涉及花粉發(fā)育的細(xì)胞系來(lái)完成這些研究。在圖10中,我們發(fā)現(xiàn)花藥母細(xì)胞是多么小的一組,在花絲末端的結(jié)構(gòu)內(nèi)部中觀察到的可能是外部絨氈層(紅色)。與正常產(chǎn)生未轉(zhuǎn)化花藥的過(guò)程相比,這些細(xì)胞看起來(lái)已經(jīng)停止了它們的發(fā)育。
如前面所解釋的,應(yīng)用芽孢桿菌RNA酶/barstar系統(tǒng)成功的生產(chǎn)了雄性不育植株,因?yàn)橥ㄟ^(guò)采用特異性的啟動(dòng)子(一般是絨氈層的)它被導(dǎo)向植株的花藥。這個(gè)系統(tǒng)主要的缺點(diǎn)在于使用所述的啟動(dòng)子,它在花藥發(fā)育和涉及為形成花粉的細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)的組織(絨氈層)中起作用太晚。這種作用導(dǎo)致植株的一些花中生產(chǎn)一定量的花粉,引起了該系統(tǒng)的逃逸,相應(yīng)于效率損失(<59%)。采用END1基因的啟動(dòng)子,這些問(wèn)題就不存在了,因?yàn)槿齻€(gè)原因-在非常早期的發(fā)育階段進(jìn)行芽孢桿菌RNA酶(RNase)的表達(dá),導(dǎo)致將要形成花粉囊的組織上皮,內(nèi)皮,藥隔,中層等的細(xì)胞系完全的缺損。
-只在花絲的底部形成花絲,但從不會(huì)伸長(zhǎng)到達(dá)心皮的柱頭。
-盡管將要形成外部絨氈層和花粉母細(xì)胞的細(xì)胞系沒(méi)有經(jīng)歷芽孢桿菌RNA酶的影響,因?yàn)樗鼈儾皇荅ND1啟動(dòng)子的目標(biāo),然而它們?cè)谠缙诎l(fā)育階段停止因?yàn)樗鼈儧](méi)有花藥剩余組織的支持,而這也是成熟花粉釋放(裂開(kāi))過(guò)程所需的基本支持。
序列表序列表<110>CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS<120>調(diào)控基因花藥特異性的表達(dá)的序列及其在生產(chǎn)雄性不育植物和雜種種子中的應(yīng)用<130>花藥中表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2766<212>ADN<213>豌豆<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)..(2736)<220><221>TATA_信號(hào)<222>(2474)..(2479)<220><221>TATA_信號(hào)<222>(2681)..(2688)<220><221>CAAT_信號(hào)<222>(2336)..(2339)<220><221>CAAT_信號(hào)<222>()..(2394)<220><221>CAAT_信號(hào)<222>()..(2675)<220><221>C_區(qū)域<222>(2408)..(2417)<220><221>C_區(qū)域<222>(2437)..(2446)<220><221>C_區(qū)域<222>補(bǔ)足((2625)..(2634))<220><221>GC_信號(hào)<222>(2447)..(2453)<220><221>等位基因<222>(2610)..(2615)<220><221>STS<222>(2230)..(2236)<220><221>STS<222>(2449)..(2457)<220><221>STS<222>(2490)..(2496)<220><221>基因<222>(2737)..(2766)<400>SEQ ID NO 1gacttcaacc ttattagtga atggacaata aaggttataa gctcctttac tgtgaaagcc 60caccagtaac atcaccttgc ttatatcatt cagcttcttt ctagtaacat ttggaacgtg 120tttataacag aaaaaaaccc aaaaactctg aaaagactca cacttttctt atctccagtc 180cacctctcaa aaggaacaat ttccttcagc ttcttggttg gacacctgtt gagcacatat 240gctgcagtgg caacagtttc tccccacaaa gtgttaggaa gcttcttctc cttcagcatg 300ttccttgtca tatcaagcaa agttcggttt tcaacaagac cattatgttg aggagtatat 360ggatcagtca cttcatgctc aattccattc tctttacaga acttcttgaa ctctgtagag 420ttatactcac ctccaccatc agttctgaga atcttcagaa gtctgaccac tttatttctc 480agccttgatt atgaatttct taaattcagc aaacacctcg tgtttgaatt ttataaggga 540tacccatgtc atccttgtga actcatccat aaatgacata aagtattatt ccctcctagt 600gaaaggtttg taatgggcca cacacataag aatgcactac tcctaaagca tgttttgctc 660tttgagctac ttttgatgaa aatggcagtc ttggttgctt ccctttcatg cacacattac 720atgacttttt tggtttctta attgtaggaa ttccacgtac cagtttcttt gaattcaaat 780tccctaagct cctaaagttc aaatgaccaa atcttttgtt ccacaactca ctttccttca 840caacacttgt tgcgctaagg cattcagagt ctgcagtttt aacattcgcc ttgaatgttt 900tactccttcc atgttctgac tccataatca acttctgata acagtcatac agcttcaaaa 960gaatgtcatt catggtaact ggaaatccct tttcaattaa ttgacctaca ctcatcagat 1020tgctcttcat gccaagaacg taccaagacg ttctgaatta atgcagattt tctattattc 1080ataatcactc taacattccc cattccttta gcatttagtt acttatcatc agcacatcta 1140atcttggttt tcttcctaga gtcaaaatca accagccatt tcttatttcc agtatgatgg 1200tttgaacaac cagtgtccat atatcaccag tcttctatag acgcactatc ataactagaa 1260gccattaata gcacatgttc atcatggtgc tcagatcctt agaatgttca attgctacaa 1320cgatgtaatc aaactgatga gtaagagatc taagtacctt ctcaatgata ctttcctcat 1380aaagagtttc tccatgcgac ttcatctcat ttgtgatcag aatcactcta gagatgtagt 1440cagataactt ctcattgttc ttcatgctta gattctcata ctgctcacgt agagactgaa 1500gtttcacctt ctacactgat gcatcactat cgtagcacca caccagtctg tctcacacaa 1560ccttttccgt cattgaatca acgattttct taaacacgtt cacatccaca cactgatgga 1620tgtagaacaa cgcattctga tccttcttcc tcatatcaca ctgagcattt ctttgcgcat 1680ccgttgcatt ttctagaagt gaagcataaa cttcgttgat gagatcaaga acatcttgag 1740caccaaataa cacacacatc tgaatcatcc aacgattcca gttgttgtcg tcgaacaatg 1800gnagcntggt gcacagattc acaacgatat attataantt ttgttttatg aaatttaaga 1860acaaatttcc attattctta aaatgtttac acactgatgt agactgcaaa 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2760accagg2766<210>2<211>910<212>ADN<213>豌豆<220><221>CDS<222>(17)..(70 6)<400>SEQ ID NO 2tcgatatcta cctaag atg aca aaa cca ggt tac att aat gct gct ttt cgt 52Met Thr Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Ala Ala Phe Arg1 5 10tca tct ttc aac ggc gaa cgt tac tta ttc atc gat gat aag tat gtg100Ser Ser Phe Asn Gly Glu Arg Tyr Leu Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Val15 20 25ttg gta gat tat gca ccg gga acc cgc gac gat aag ctc tta aac ggg148Leu Val Asp Tyr Ala Pro Gly Thr Arg Asp Asp Lys Leu Leu Asn Gly30 35 40cct ctt cct ctt cct gct ggg ttt aaa tca ctt gat ggt aca gta ttt196Pro Leu Pro Leu Pro Ala Gly Phe Lys Ser Leu Asp Gly Thr Val Phe45 50 55 60gga acc tac gga gtt gac tgt gcc ttt gac acc gat aac gac gaa gca244Gly Thr Tyr Gly Val Asp Cys Ala Phe Asp Thr Asp Asn Asp Glu Ala65 70 75ttc atc ttt tat gag aac ttt act gct ctc ata aac tat gct cca cat292Phe Ile Phe Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Leu Ile Asn Tyr Ala Pro His80 85 90act tac aat gac aaa atc atc tcg ggt ccg aag aaa atc tcg gac atg340Thr Tyr Asn Asp Lys Ile Ile Ser Gly Pro Lys Lys Ile Ser Asp Met95 100 105ttt cct ttt ttc aaa gga acc gtg ttt gaa aac ggg att gac gct gca388Phe Pro Phe Phe Lys Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Ile Asp Ala Ala110 115 120ttc agg tca act aag gag aaa gaa gtt tat tta ttc aaa gga gac ttg436Phe Arg Ser Thr Lys Glu Lys Glu Val Tyr Leu Phe Lys Gly Asp Leu125 130 135 140tat gct cgt ata gac tat gga aaa aac tat ctg gtt caa agt atc aag484Tyr Ala Arg Ile Asp Tyr Gly Lys Asn Tyr Leu Val Gln Ser Ile Lys145 150 155aac att agc act ggg ttc cct tgt ttc act gga acc gtc ttt gaa aat532Asn Ile Ser Thr Gly Phe Pro Cys Phe Thr Gly Thr Val Phe Glu Asn160 165 170gga gtg gat gct gct ttt gct tct cac agg acc aat gaa gca tac ttt580Gly Val Asp Ala Ala Phe Ala Ser His Arg Thr Asn Glu Ala Tyr Phe175 180 185ttc aaa gga gat tac tat gca ctt gtc aag att agc ccg ggc gga ata628Phe Lys Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Val Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ile190 195 200gat gac tat att atc ggt ggt gtg aag ccc att ctt gag aat tgg cct676Asp Asp Tyr Ile Ile Gly Gly Val Lys Pro Ile Leu Glu Asn Trp Pro205 210 215 220tct ctt cgt ggt ata ata cct cag aaa agt taaatgtggc tctctgtgtg 726Ser Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gln Lys Ser225 230tgtgtgatat catcagtcaa gtatggtatt aagaataaag actattgttg tcgttgttgt 786gtgtttcttt ttcatgttgt ttctagttct taatgtttgc ttatgttgtt catgtgaact 846atgtaatgac atgcactgtg tacgcgcaga gtgaaaataa tatattactg tgtatgttga 906ttac 910<210>3<211>230<212>PRT<213>豌豆<400>SEQ ID NO 3Met Thr Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Ala Ala Phe Arg Ser Ser Phe Asn1 5 10 15Gly Glu Arg Tyr Leu Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Val Leu Val Asp Tyr20 25 30Ala Pro Gly Thr Arg Asp Asp Lys Leu Leu Asn Gly Pro Leu Pro Leu35 40 45Pro Ala Gly Phe Lys Ser Leu Asp Gly Thr Val Phe Gly Thr Tyr Gly50 55 60Val Asp Cys Ala Phe Asp Thr Asp Asn Asp Glu Ala Phe Ile Phe Tyr65 70 75 80Glu Asn Phe Thr Ala Leu Ile Asn Tyr Ala Pro His Thr Tyr Asn Asp85 90 95Lys Ile Ile Ser Gly Pro Lys Lys Ile Ser Asp Met Phe Pro Phe Phe100 105 110Lys Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Ile Asp Ala Ala Phe Arg Ser Thr115 120 125Lys Glu Lys Glu Val Tyr Leu Phe Lys Gly Asp Leu Tyr Ala Arg Ile130 135 140Asp Tyr Gly Lys Asn Tyr Leu Val Gln Ser Ile Lys Asn Ile Ser Thr145 150 155 160Gly Phe Pro Cys Phe Thr Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Val Asp Ala165 170 175Ala Phe Ala Ser His Arg Thr Asn Glu Ala Tyr Phe Phe Lys Gly Asp180 185 190Tyr Tyr Ala Leu Val Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ile Asp Asp Tyr Ile195 200 205Ile Gly Gly Val Lys Pro Ile Leu Glu Asn Trp Pro Ser Leu Arg Gly210 215 220Ile Ile Pro Gln Lys Ser225 230<210>4<211>1561<212>ADN<213>豌豆<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)..(1561)<400>SEQ ID NO 4acaaccagtg tccatatatc accagtcttc tatagacgca ctatcataac tagaagccat 60taatagcaca tgttcatcat ggtgctcaga tccttagaat gttcaattgc tacaacgatg 120taatcaaact gatgagtaag agatctaagt accttctcaa tgatactttc ctcataaaga 180gtttctccat gcgacttcat ctcatttgtg atcagaatca ctctagagat gtagtcagat 240aacttctcat tgttcttcat gcttagattc tcatactgct cacgtagaga ctgaagtttc 300accttctaca ctgatgcatc actatcgtag caccacacca gtctgtctca cacaaccttt 360tccgtcattg aatcaacgat tttcttaaac acgttcacat 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1260tacgacgata taaatttaaa ccagcaaaaa attgaagcag ttaagcgaac caactcatgg 1320tatgtggata tatttatctt tgtcgtttat atcggattcg aatctctata atgatgaaaa 1380attaatatca aactttaaat aagaacgtca tttatagagc cattttggga aacacatatt 1440tcatgtacac gtgattcgca aatttccaat aactctatat atagccctcc tcagtttcat 1500gcatttgctc acaacataac cttccttgaa ttcgatatct acctaagatg acaaaaccag 1560g 156權(quán)利要求
1.調(diào)控基因在花藥中特異性表達(dá)的核苷酸序列,選自a)含SEQ ID NO 1中所示核苷酸序列的核苷酸序列;b)保留調(diào)控在花藥中特異表達(dá)的能力的任何所述SEQ ID NO 1的片段;和c)與a)和b)中定義的核苷酸序列基本類似的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的調(diào)控核苷酸序列,其含有SEQ ID NO 4中所示的核苷酸序列。
3.DNA構(gòu)建物,其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列,和編碼肽,多肽,蛋白質(zhì),活性或RNA的核苷酸序列。
4.重組載體,其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列,或根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物。
5.轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列,或根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物,或根據(jù)權(quán)利要求4的重組載體。
6.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,其含有插入其基因組中的,根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列,或根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物,或根據(jù)權(quán)利要求4的重組載體。
7.轉(zhuǎn)基因植物,其至少含有根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物,至少包含含根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,其中所述編碼核苷酸序列編碼這樣的肽,多肽,蛋白質(zhì),活性或RNA,它們具有細(xì)胞毒性,且它們的表達(dá)誘導(dǎo)花藥的缺損,并且所述編碼序列由根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列調(diào)控。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物,其選自單子葉植物和雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)雜種種子中的用途。
11.生產(chǎn)雄性不育植物的方法,包括用根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物,所述的DNA構(gòu)建物包含植物不育促進(jìn)者活性的編碼序列,該序列受根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列調(diào)控,使得所述編碼序列的所述表達(dá)產(chǎn)生花藥的缺損。
12.恢復(fù)雄性不育植物育性的方法,包括用根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化雄性不育植物,所述構(gòu)建物包含編碼具有抑制花藥缺損活性而回復(fù)或恢復(fù)可育性的活性的序列,該序列由根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的核苷酸序列調(diào)控。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在花藥中特異性地表達(dá)目的核苷酸序列的調(diào)控序列,例如,其表達(dá)受所述調(diào)控序列控制的序列引起花藥在其發(fā)育早期階段被完全缺損,并可以獲得用于生產(chǎn)雜種種子的雄性不育植株。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1427893SQ01808867
公開(kāi)日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者M·D·岡梅茲吉米尼茲, L·A·卡納斯克萊門特, F·馬杜諾阿爾比, J·P·比爾特蘭伯特 申請(qǐng)人:科學(xué)研究高級(jí)委員會(huì), 新生物技術(shù)股份有限公司
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