一種特異性抑制ctgf基因表達的小干擾rna及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體地說涉及一種特異性抑制CTGF基因表達的小 干擾RNA及其應用。
【背景技術】
[0002] RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術是指是指在進化過程中高度保守的、由雙 鏈RNA(double_strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，RNA分子通 過破壞特定的mRNA，以抑制某種基因表達的生物學過程。該技術具有以下幾點優(yōu)勢：1高效 性;2特異性;3位置效應;4高穩(wěn)定性;5可傳播性;6濃度時間依賴性。由于使用RNAi技術可以 特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術迅速成為基因功能研究和基因治療研究領 域最受關注的研究工具之一，已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療 領域。
[0003] 惡性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素細胞的一種惡性腫瘤， 好發(fā)于皮膚，惡性程度高，治療難度大。雖然黑素瘤僅占全部皮膚腫瘤的4%，但卻占皮膚腫 瘤死亡人數(shù)的80%，是皮膚腫瘤中死亡率最高的一種惡性腫瘤。美國國家癌癥研究所(NCI) 的數(shù)據(jù)顯示，在2003-2007年間，患病人數(shù)為每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估計有 68130個患者被診斷患有黑色素瘤，其中8700個患者將因此喪生（http:// www.cancer.gov/)。惡性黑色素瘤的發(fā)生率在全世界范圍內正在不斷地上升，包括以前發(fā) 病率低的地區(qū)，它已成為一種嚴重威脅人們健康的惡性疾病。在中國黑色素瘤患者有逐年 增高的趨勢。北京市八城區(qū)統(tǒng)計資料顯示，2000年MM發(fā)病率為0.2例/10萬，到了2004年已達 1例/10萬。根據(jù)中國臨床腫瘤協(xié)會(CSC0)黑色素瘤專家委員會發(fā)表的《中國黑色素瘤診治 指南（2011版）》，我國每年新發(fā)病例約2萬例，已經成為了嚴重危及我國人民健康的疾病之 〇
[0004] 結締組織生長因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF)是一種新發(fā)現(xiàn)可 刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積生長因子，是高度保守CCN(CTGF、Cen〇/cyr61和Nov縮寫） 多肽家族中成員。CTGF蛋白為肝素結合型，含349個氨基酸，富含半胱氨酸，其分子量約為36 ~38kD，可由成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞合成分泌。成年哺乳動物心、腦、腎、肺、肝 胎盤中均有表達。人類CTGF基因定位于染色體6q23<a，包括5個外顯子，4個內含子。起始位 點為ATG，其Y端包含三個ATTTA位點。CTGF蛋白38個保守半胱氨酸殘基分成兩個節(jié)段，其中 22個在N末端區(qū)，16個在C末端區(qū)，4個主要蛋白結構區(qū)為胰島素樣生長因子結合蛋白區(qū)、von Wille-brand因子C型重復、血小板反應蛋白（thrombospondin)I型重復以及生長因子半胱 氨酸群，這些區(qū)域都由獨立外顯因子編碼。CTGF廣泛表達于人類多種組織器官中，在病理情 況下，其過度表達與某些增生性或纖維化疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，如膠質瘤、胰腺癌、甲狀 腺癌、乳腺癌，胃癌、硬皮病、腎纖維化、肝硬化、肺纖維化、動脈粥樣硬化等。CTGF擁有多種 生物學功能，可以調節(jié)腫瘤細胞增殖、分化、有絲分裂、粘附、凋亡、胞外基質產生、生長抑制 和多細胞類型的迀移，因而可以在發(fā)育、損傷愈合和疾病中發(fā)揮重要作用。同時該基因在黑 素瘤的惡化過程中起重要的驅動作用。下調CTGF的表達，可以有效抑制腫瘤細胞的迀移和 侵襲能力。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠特異性抑制CTGF基因表達的小干擾RNA(siRNA) 及其應用。
[0006] 本發(fā)明根據(jù)RNAi發(fā)生原理，設計并合成了針對CTGF基因的小干擾RNA，其GC含量為 47.37%，且正義鏈和反義鏈的長度均為19nt。
[0007] 進一步地，本發(fā)明的小干擾RNA雙連體分子的正義鏈和反義鏈序列分別為：
[0008] 正義鏈：5 ' -CGCUGUACUACAGGAAGAUdTdT-3 '，（SEQIDN0 · 1)
[0009] 反義鏈：5'-TdTdGCGACAUGAUGUCCUUCUA-3'（SEQIDN0.2)。
[0010] 本發(fā)明提供的上述小干擾RNA，能夠特異性下調細胞或生物體中CTGF基因的表達 量。
[0011] 進一步地，本發(fā)明的小干擾RNA作用于CTGF基因的靶序列為：5'_ CGCTGTACTACAGGAAGAT-3'（SEQIDN0.3)。
[0012] 本發(fā)明提供一種表達載體，其包括與至少一個表達控制序列可操作地連接的編碼 本發(fā)明上述小干擾RNA的一個或多個核酸。
[0013] 一種含有上述小干擾RNA的藥物屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 進一步地，所述的藥物為抑制腫瘤的藥物。所述的腫瘤為黑色素瘤、膠質瘤、胰腺 癌、甲狀腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0015] 進一步地，所述的藥物為調節(jié)細胞或器官纖維化的藥物。
[0016] -種可表達上述小干擾RNA的細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 本發(fā)明提供了上述小干擾RNA在制備調節(jié)細胞或生物體中的CTGF基因表達藥物中 的用途。
[0018] 本發(fā)明提供了上述小干擾RNA在制備抑制腫瘤細胞迀移和侵襲的藥物中的用途。
[0019] 優(yōu)選地，所述腫瘤細胞為黑色素瘤細胞、膠質瘤、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0020] 本發(fā)明提供了上述小干擾RNA在制備在調節(jié)細胞或器官纖維化藥物中的應用。
[0021 ]本發(fā)明提供了上述小干擾RNA在制備治療疾病的藥物中的用途，所述的疾病為黑 色素瘤、膠質瘤、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0022]有效的靶向治療是目前國內外不斷尋找的輔助治療方法，本發(fā)明提供的靶向針對CTGF基因的siRNA轉染黑色素瘤細胞后，發(fā)現(xiàn)siRNA能夠顯著下調CTGF基因的表達，有效抑 制腫瘤細胞的迀移和侵襲能力，對于開發(fā)新的抗腫瘤基因藥物和腫瘤藥物的治療效果具有 重要指導作用，可用于開發(fā)制備抗腫瘤藥物，將會取得巨大的社會效益和經濟價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為siRNA對A375細胞CTGF基因表達的敲低效果。其中1:未轉染siRNA的A375細 胞;2:轉染陰性對照序列的A375細胞;3:轉染siRNA的A375細胞。
[0024]圖2為A375細胞中CTGF基因mRNA敲低水平的電泳檢測結果，其中泳道1:分子量標 記；泳道2 :轉染siRNA的A375細胞；泳道3 :轉染陰性對照序列的A375細胞；泳道4:未轉染 siRNA的A375細胞。。
[0025] 圖3為A375細胞CTGF蛋白敲低水平的Westernblot檢測，其中泳道1:未轉染siRNA的A375細胞;泳道2:轉染陰性對照序列的A375細胞;泳道3:轉染siRNA的A375細胞。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0027]若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028]實施例1特異性靶向CTGF基因的siRNA的設計合成及轉染黑色素瘤細