專利名稱：：用于植物中基因表達(dá)的種子特異性7Sα啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及種子特異性基因表達(dá)。種子為人類和牲畜提供食用蛋白的重要來源。但植物和種子的蛋白營養(yǎng)通常不全面。例如，很多種子蛋白缺少一或多種必需氨基酸。這種缺陷可通過遺傳手段修飾天然或非天然蛋白以使它們具有營養(yǎng)更全面的氨基酸組成(或其它一些所需特征)并在轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)該修飾的蛋白來得以克服?；蛘?，可將一個或多個基因?qū)胫参镆哉{(diào)控其代謝途徑并修飾游離氨基酸的含量。這些方法可用于生產(chǎn)顯示重要的農(nóng)業(yè)性狀、營養(yǎng)特性和藥用特性的農(nóng)作物。盡管目前已有多種分子工具，但由于基因工程蛋白的積累量不足，致使對種子的遺傳修飾仍常常受到限制。多種細(xì)胞內(nèi)過程可能影響總蛋白的積累，所述過程包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白裝配和折疊、甲基化、磷酸化、轉(zhuǎn)運、以及蛋白酶解。對一或多種這樣的過程進行干預(yù)可增加遺傳工程改造的種子中所產(chǎn)生的蛋白的量。引入基因可以對植物生長和發(fā)育帶來有害影響。在這種環(huán)境下，基因的表達(dá)必需限制在所希望的靶組織中。例如，可能必需以種子特異性方式表達(dá)一種氨基酸下調(diào)基因，以便避免可能影響產(chǎn)量或其它農(nóng)藝性狀?；虻膯幼硬糠衷诳刂苹虮磉_(dá)方面起關(guān)鍵作用。沿啟動子區(qū)，可集合轉(zhuǎn)錄元件并啟動轉(zhuǎn)錄。在啟動子位置發(fā)生的轉(zhuǎn)錄起始可通過多種途徑調(diào)節(jié)。例如，在有特定化合物存在的情況下誘導(dǎo)啟動子，僅在特定組織中表達(dá)基因，或?qū)φ麄€植物進行的組成型表達(dá)。因此，可將編碼序列與具有不同調(diào)節(jié)特性的啟動子可操作連接，以此修飾編碼序列的轉(zhuǎn)錄。發(fā)明簡述本發(fā)明包括能產(chǎn)生種子特異性轉(zhuǎn)錄的啟動子，和修飾、制備并應(yīng)用該啟動子的方法。本發(fā)明還提供含有高表達(dá)啟動子的組合物、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、和種子，以及它們的制備方法和應(yīng)用方法。本發(fā)明包括并提供一種轉(zhuǎn)化的植物，它含有一種核酸分子，所述分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供了一種轉(zhuǎn)化的植物，它含有一種核酸分子，所述分子沿5’-3’方向包含具有與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈的核酸序列有約90％以上同一性的核酸序列的啟動子，該啟動子與一種結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供了一種轉(zhuǎn)化大豆植物的方法，所述方法包括提供一種核酸分子并用所述核酸分子來轉(zhuǎn)化所述植物，其中所述核酸分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連。本發(fā)明包括并提供了一種轉(zhuǎn)化大豆植物的方法，所述方法包括提供一種核酸分子，其沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其約90％以上互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明提供了一種在種子中表達(dá)結(jié)構(gòu)核酸序列的方法，所述方法包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化的植物，它包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸分子可操作相連，所述轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子，所述結(jié)構(gòu)核酸分子在種子中轉(zhuǎn)錄；并分離所述種子。本發(fā)明提供了一種獲得種子的方法，所述種子的一種結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物增加，所述方法包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化的植物，它包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸分子可操作相連，所述轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子，所述結(jié)構(gòu)核酸分子在種子中轉(zhuǎn)錄；從所述轉(zhuǎn)化的植物分離所述種子。本發(fā)明提供了一種獲得粗粉(meal)的方法，所述粗粉的一種結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物增加，所述方法包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化的植物，它包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸分子可操作相連，所述轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子，所述結(jié)構(gòu)核酸分子在種子中轉(zhuǎn)錄；制備包含所述轉(zhuǎn)化的植物或其一部分的粗粉。本發(fā)明提供了一種獲得原料(feedstock)的方法，所述原料中一種結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物增加，所述方法包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化的植物，它包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈的核酸序列雜交的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸分子可操作相連，所述轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子，所述結(jié)構(gòu)核酸分子在種子中轉(zhuǎn)錄；制備包含所述轉(zhuǎn)化的植物或其一部分的粗粉。本發(fā)明提供了一種獲得油的方法，所述油的一種結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物增加，所述方法包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化的植物，它包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈的核酸序列雜交的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸分子可操作相連，所述轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生種子，所述結(jié)構(gòu)核酸分子在種子中轉(zhuǎn)錄；分離所述油。本發(fā)明包括并提供了一種基本純的核酸分子，該核酸分子包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列。本發(fā)明包括并提供了一種載體，該載體包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列。本發(fā)明包括并提供了一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含一種載體，該載體包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列。本發(fā)明包括并提供了一種能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸分子特異性雜交的核酸分子。本發(fā)明包括并提供了一種載體，該載體包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸分子特異性雜交的核酸分子。本發(fā)明包括并提供了一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含一種載體，該載體包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸分子特異性雜交的核酸分子。本發(fā)明包括并提供了一種基本純的核酸序列，該核酸序列與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列有約90％以上的同一性。本發(fā)明包括并提供了一種核酸片段，該片段包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列的至少20個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括并提供了一種核酸片段，該片段包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列的至少30個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括并提供了一種核酸片段，該片段包含選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列的至少50個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括并提供了從轉(zhuǎn)化的植物的一或多種種子中制備得到的油，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供了從轉(zhuǎn)化的植物的一或多種種子中制備得到的油，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其約90％以上的互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供了由轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的種子，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供了由轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的種子，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其約90％以上的互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供了包含轉(zhuǎn)化的植物或其一部分的原料，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供了包含轉(zhuǎn)化的植物或其一部分的原料，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其約90％以上的互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供了包含來自經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的植物材料的粗粉，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供了包含來自經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的植物材料的粗粉，其包含一種核酸分子，該分子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其約90％以上的互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供了裝種子的容器(acontainerofseeds)，其中至少約25％的種子沿5’-3’方向包含具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其約90％以上的互補鏈，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNOs11，12，13或14或其互補鏈雜交，的核酸序列的啟動子，其與結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連，所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)核酸序列是異源的。圖1顯示兩種7SαcDNA序列的對比排列。圖2顯示p-GEM-T1T的序列。圖2a是載體pMON55548的質(zhì)粒圖譜。圖3是載體pMON8677的質(zhì)粒圖譜。圖3a是載體pMON55546的質(zhì)粒圖譜。圖4是pMON55547的質(zhì)粒圖譜。圖5是載體pMON55554的質(zhì)粒圖譜。圖6是載體pMON55542的質(zhì)粒圖譜。圖7是7Sα啟動子和tARC5啟動子的比較。圖8是載體pMON55553的質(zhì)粒圖譜。圖9是載體pMON55541的質(zhì)粒圖譜。序列簡述SEQIDNO1是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO2是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO3是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO4是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO5是用于擴增大豆GIcA基因的銜接子引物(HindIII-PstI)。SEQIDNO6是用于擴增大豆GIcA基因的7Sα初級引物(primaryprimer)。SEQIDNO7是用于擴增大豆GIcA基因的7Sα嵌套(BglII/NcoI)引物。SEQIDNO8是設(shè)計用于擴增大豆GIcA基因的引物區(qū)的7Sα引物(NcoI/BglII)。SEQIDNO9是7Sα基因銜接子引物。SEQIDNO10是7Sα基因特異性引物。SEQIDNO11是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO12是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO13是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。SEQIDNO14是大豆(GlycinemaxL.)的7Sα啟動子序列。定義以下定義有助于理解發(fā)明詳述。術(shù)語“編碼序列”，“結(jié)構(gòu)序列”以及“結(jié)構(gòu)核酸序列”是指一種包含有序排列的核酸的物理結(jié)構(gòu)。所述核酸以一組核酸三聯(lián)體的形式排列，其中每一個三聯(lián)體形成一個密碼子。每一密碼子編碼一種具體的氨基酸。因此，編碼序列、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)核酸序列編碼一系列氨基酸，這些氨基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。編碼序列，結(jié)構(gòu)序列，和結(jié)構(gòu)核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結(jié)構(gòu)中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。術(shù)語“DNA序列”，“核酸序列”和“核酸分子”是指一種包含有序排列的核酸的物理結(jié)構(gòu)。所述DNA序列或核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結(jié)構(gòu)中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。術(shù)語“表達(dá)”是指基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA，并翻譯該mRNA以產(chǎn)生相應(yīng)的基因產(chǎn)物(即，肽，多肽，或蛋白)。術(shù)語“反義RNA的表達(dá)”是指對DNA進行轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生第一種RNA分子，后者能與第二種RNA分子雜交。RNA-RNA雜合體的形成可抑制第二種RNA分子翻譯出基因產(chǎn)物?！巴葱浴笔侵竷蓚€或多個核酸序列或氨基酸序列之間以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。同源性還指不同的核酸或蛋白之間相似的功能特性的概念。術(shù)語“異源”是指兩個或更多個不同來源的核酸序列或蛋白序列之間的關(guān)系。例如，啟動子如果在自然界通常的情況中不與編碼序列組合在一起，那么該啟動子相對于該編碼序列是異源的。此外，一個具體序列可以相對于它插入至其中的細(xì)胞或生物為“異源”的(即，并非該具體細(xì)胞或生物所天然具有的)?！半s交”是指一條核酸鏈與一條互補鏈通過堿基配對來相連的能力。當(dāng)兩條核酸鏈中的互補核酸序列在適當(dāng)條件下彼此相遇，就可發(fā)生雜交。術(shù)語“可操作相連”是指兩個或更多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性空間排列。例如，啟動子區(qū)相對于核酸序列的位置可以使該核酸序列在該啟動子區(qū)的指導(dǎo)下進行轉(zhuǎn)錄。此時，該啟動子區(qū)與該核酸序列“可操作相連”。術(shù)語“啟動子”或“啟動子區(qū)”是指通常發(fā)現(xiàn)于編碼序列上游(5’)的、能指導(dǎo)該核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA的一種核酸序列。啟動子或啟動子區(qū)通常提供RNA聚合酶的識別位點以及轉(zhuǎn)錄的合適起始所需的其它因子。本文中，啟動子或啟動子區(qū)包括通過插入或缺失調(diào)節(jié)區(qū)，對啟動子進行隨機或定點誘變等方式而進行改變的啟動子。啟動子的活性或強度如下測量將其在細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的RNA的量，或積累的蛋白的量，與已經(jīng)評估過轉(zhuǎn)錄活性的啟動子進行比較。術(shù)語“重組載體”是指諸如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自我復(fù)制序列、噬菌體、線性或環(huán)狀單鏈，或線性或環(huán)狀雙鏈DNA或RNA核苷酸序列等任何物質(zhì)。重組載體可以來自任何來源，它能進行基因組整合或自我復(fù)制?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(5’)、內(nèi)部或下游(3’)的核苷酸序列。編碼序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)通常受到調(diào)節(jié)序列存在與否的影響。術(shù)語“充分同源(substantiallyhomologous)”是指，根據(jù)本文所述BestFit程序(版本10；geneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)以默認(rèn)參數(shù)測定，序列同一性至少約90％的兩個序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指核酸引入受體宿主的過程。術(shù)語“宿主”是指細(xì)菌細(xì)胞，真菌，動物或動物細(xì)胞，植物或種子，或任何植物部分或組織，其包括植物細(xì)胞，原生質(zhì)體，愈傷組織，根，塊莖，種子，莖，葉，幼苗，胚和花粉。本文中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指一種植物，其中所引入的核酸已經(jīng)穩(wěn)定引入該植物的基因組，例如，核基因組或質(zhì)體基因組中。本文中術(shù)語“基本純”是指一種分子，它與自然狀態(tài)下通常與它相伴的基本上所有其它分子分開。更優(yōu)選基本純的分子是制劑中的優(yōu)勢種類?；炯兊姆肿涌梢允羌s60％以上，優(yōu)選約75％以上，更優(yōu)選約90％以上，最優(yōu)選約95％以上與天然混合物中其它分子(除了溶劑以外)脫離。術(shù)語“基本純”并不想涵蓋處于天然狀態(tài)的分子。優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明提供能在種子中轉(zhuǎn)錄異源結(jié)構(gòu)核酸序列的啟動子，以及修飾、制備和應(yīng)用該啟動子的方法。本發(fā)明還提供含有該種子特異性啟動子的組合物，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和植物，以及它們的制備和應(yīng)用方法。核酸分子本發(fā)明提供一種核酸分子，它與具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列的核酸分子雜交。本發(fā)明還包括是所述核酸分子片段的核酸分子。核酸雜交是DNA操作領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)。一對具體核酸的雜交特性可指示它們的相似性或同一性?？捎玫蛧?yán)謹(jǐn)度條件選出與靶核酸序列同一性較低的核酸序列。可在如下條件下實施，約0.15M-約0.9M氯化鈉，溫度約20℃-約55℃?？捎酶邍?yán)謹(jǐn)度條件選出與已公開的核酸序列同一性較高的核酸序列(Sambrook等，1989)(注意所有參考文獻(xiàn)都全文引入本文作參考)。高嚴(yán)謹(jǐn)度條件通常包括在約2X-約10XSSC(由含有3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉的20XSSC原液，pH7.0用蒸餾水稀釋而成)，約2.5X-約5XDenhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X原液用蒸餾水稀釋而成)，約10mg/mL-約100mg/mL魚精DNA，以及約0.02％(w/v)-約0.1％(w/v)SDS中進行核酸雜交，于大約50℃-大約70℃保溫數(shù)小時到過夜。優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)度條件為6XSSC，5XDenhardt溶液，100mg/mL魚精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保溫數(shù)小時。雜交之后通常進行數(shù)個洗滌步驟。洗滌組合物通常包含約0.5X-約10XSSC，以及0.01％(w/v)-約0.5％(w/v)SDS，約20℃-約70℃保溫15分鐘。優(yōu)選地，當(dāng)在0.1XSSC中65℃洗滌至少一次以后，核酸片段仍保持雜交。核酸分子優(yōu)選在低或高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列雜交。最優(yōu)選，核酸分子在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列雜交。核酸分子實例包括具有核酸序列SEQIDNOs11，12，13或14，其互補鏈，或其任何片段的啟動子。在另一實施方案中，核酸分子包含與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈，或其任何片段的核酸序列有約85％以上同一性的核酸序列，更優(yōu)選約86，約87，約88，約89，約90，約91，約92，約93，約94，約95，約96，約97，約98，或約99％以上同一性。序列同一性百分比優(yōu)選用序列分析軟件包TM(版本10；geneticComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)的“BestFit”或“Gap”程序來確定?！癎ap”是利用Needleman和Wunsch的算法(NeedlemanandWunsch，1970)來找出兩個序列的對比排列，它使匹配數(shù)最大并使缺口(gap)數(shù)最小?！癇estFit”是對兩個序列之間的最相似片段進行最佳對比排列，它還插入缺口以便使匹配數(shù)最大，它利用Smith和Waterman的局部同源性算法(SmithandWaterman，1981；Smith等，1983)。同一性百分比最優(yōu)選用“BestFit”程序使用默認(rèn)參數(shù)來確定。本發(fā)明還提供了在低或高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與具有選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列的核酸分子，或核酸分片段雜交的核酸分子片段，與選自SEQIDNOs11，12，13或14，或其互補鏈的核酸序列有約80，約85，約90，或約99％以上序列同一性的核酸分子片段，或上述任一種分子的片段。在一實施方案中，所述片段是本發(fā)明核酸分子中約3000-約1000，約1800-約150，約1500-約500，約1300-約250，約1000-約200，約800-約150，約500-約100，約300-約75，約100-約50，約50-約25，或，約20-約10個連續(xù)核苷酸。在另一實施方案中，所述片段是本發(fā)明核酸序列中約20，約30，約40，約50，約60，約70，約80，約90，約100，約150，約200，約250，約500，或約750個連續(xù)核苷酸。啟動子在一個優(yōu)選實施方案中，本文所公開的任何一種核酸分子可以是啟動子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，啟動子是7Sα啟動子。在一個實施方案中，啟動子具有組織或器官特異性，優(yōu)選種子特異性。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，啟動子在胚乳或胚中優(yōu)先表達(dá)與其相連的結(jié)構(gòu)基因。在一個方面，如果mRNA在一種組織或器官中的表達(dá)水平比在另一種組織或器官中的表達(dá)水平高出至少10倍，優(yōu)選至少約100倍或至少約1,000倍，則認(rèn)為該啟動子是特異于該組織或器官的。mRNA的水平可以在單個時間點測量，也可以在多個時間點測量，從而倍數(shù)增加可以是平均倍數(shù)增加，或者是從實驗測量值外推得到的值。由于這是水平的比較，因此可以使用任何測量mRNA的方法。在一個優(yōu)選方面，進行比較的組織或器官是種子或帶有葉片或葉片組織的種子組織。在另一個優(yōu)選方面，對多個組織或器官進行比較。優(yōu)選的多重比較是將種子或種子組織與選自下組的二、三、四或更多組織或器官進行比較花組織，花原端，花粉，葉，胚，苗，葉原基，苗端，根，根尖，維管組織和子葉。本文中植物器官的例子是，種子，葉，根等，組織的例子是葉原基，苗端，維管組織等。啟動子的活性或強度可用mRNA的量或該RNA所特別產(chǎn)生的蛋白積累量相對于mRNA或蛋白的總量來定量。所述啟動子優(yōu)選表達(dá)可操作連接的核酸序列，其水平占總mRNA的約2.5％以上；更優(yōu)選占約5，約6，約7，約8，或約9％以上；還更優(yōu)選占約10，約11，約12，約13，約14，約15，約16，約17，約18，或約19％以上；最優(yōu)選占約20％以上。或者，啟動子的活性或強度可表示為已鑒定特征的啟動子(其轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)過評估)的相對量。例如，可將目標(biāo)啟動子與報道序列(例如，GUS)可操作相連，并將其引入特定類型的細(xì)胞。用類似方法制備已知啟動子，將其引入相同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(cortext)中。通過比較相對于已知啟動子而言的報告基因表達(dá)量，可確定目標(biāo)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境優(yōu)選大豆。結(jié)構(gòu)核酸序列本發(fā)明的啟動子可與相對于該啟動子的核酸序列而言異源的第二種核酸序列可操作相連。該第二種核酸序列通常是希望提高轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列。優(yōu)選該第二種核酸序列編碼一種適于摻入人或動物膳食之中或者提供其它一些農(nóng)業(yè)重要性狀的多肽。適當(dāng)?shù)牡诙N核酸序列包括，但不限于，編碼下列蛋白的那些種子貯藏蛋白，脂肪酸途徑的酶，維生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或淀粉分支酶。優(yōu)選的種子貯藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(美國專利4,886,878，4,885,357，5,215,912，5,589,616，5,508,468，5,939,599，5,633,436和5,990,384；WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064和WO99/40209)，7S蛋白(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅果蛋白(美國專利5,850,024)，不含苯丙氨酸(phenylalaninefree)的蛋白(WO96/17064)，清蛋白(albumin)(WO97/35023)，β-伴大豆球蛋白(conglycinin)(WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5,885,801)arcelin種子貯藏蛋白(美國專利5,270,200)凝集素(美國專利6,110,891)和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選的脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482，5,530,186，5,945,585，5,639,790，5,807,893，5,955,650，5,955,329，5,759,829，5,147,792，5,304,481，5,298,421，5,344,771和5,760,206)，和去飽和酶(美國專利5,689,050、5,663,068、5,614,393、5,856,157、6,117,677、6,043,411、6,194,167、5,705,391、5,663,068、5,552,306、6,075,183、6,051,754、5,689,050、5,789,220、5,057,419、5,654,402、5,659,645、6,100,091、5,760,206、6,172,106、5,952,544、5,866,789、5,443,974和5,093,249)。優(yōu)選的維生素E生物合成途徑酶包括tyrA，slr173，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，AANT1，slr1737，和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體(Kridl等，SeedSci.Res.1209219(1991)；Keegstra，Cell56(2)247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9112760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.1381309-1316(1992)；Cyanobasehttp//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norrisetal.，PlantPhysicol1171317-1323(1998)；BartleyandScolnik，PlantPhysicol1041469-1470(1994)，Smith等，PlantJ.1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily，等，PlantPhysicol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等，J.DNARes.7(1)31-63(2000))。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合酶(美國專利5,965,727，WO97/26366，WO99/11800，WO99/49058)色氨酸脫羧酶(WO99/06581)和蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421、5,942,660和WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(WO99/02656和WO98/55601)，二氫二吡啶甲酸(dihydrodipicolinate)合酶(美國專利5,367,110)，賴氨酸酮戊二酸還原酶(WO98/42831)和天冬氨酸激酶(美國專利5,367,110、5,858,749和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括美國專利6,232,122和6,147,279，以及WO97/22703中提到的那些?；蛘?，可通過設(shè)計啟動子和第二種核酸序列來下調(diào)特定的核酸序列。這通常通過將啟動子與反義取向的第二種核酸序列相連來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉這類反義技術(shù)。任何核酸序列可以通過這種方式進行負(fù)調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將認(rèn)識到，本發(fā)明的啟動子還可以被設(shè)計成通過共抑制表型來下調(diào)具體的核酸序列。用全長和部分長度的cDNA序列對內(nèi)源基因進行的共抑制作用已有文獻(xiàn)(Napoli等ThePlantCell2279-289(1990))。另外，具體核酸序列的表達(dá)也可以通過所述核酸序列的非編碼區(qū)來下調(diào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易分離基因組DNA，其包含側(cè)接該核酸序列編碼區(qū)的序列，或該編碼區(qū)的內(nèi)含子，并應(yīng)用該非編碼區(qū)實施反義作用或共抑制作用。這種調(diào)節(jié)作用的目標(biāo)包括含有較少量的必需氨基酸、但在特定組織中以相對較高的水平表達(dá)的多肽。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都能在種子中大量表達(dá)，但在營養(yǎng)方面欠缺必需氨基酸。這種反義方法也可以用于有效除去植物性食品中的其它不想要的蛋白，如拒食劑(例如，凝集素)，清蛋白，和變應(yīng)原，或者使參與所需化合物(如必需氨基酸)的降解的分解代謝酶下調(diào)。修飾的結(jié)構(gòu)核酸序列本發(fā)明的啟動子還可與異源的修飾型結(jié)構(gòu)核酸序列相連?？梢詫Y(jié)構(gòu)核酸序列進行修飾，以便提供各種所需特性。例如，可以對結(jié)構(gòu)核酸序列進行修飾以增加必需氨基酸的含量，促進對氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后修飾(例如，磷酸化位點)，將翻譯出的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運至細(xì)胞的內(nèi)側(cè)或外側(cè)的空間中，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信號基序，等等。在一優(yōu)選實施方案中，結(jié)構(gòu)核酸序列被強化，使得能編碼如下的多肽，該多肽中至少1種，更優(yōu)選約2，約3，或約4種選自下組的必需氨基酸的含量增加組氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸。必要時，也可以添加非必需氨基酸以強化多肽的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)性。特別適于這類強化作用的結(jié)構(gòu)核酸序列包括，編碼表達(dá)水平相對較高和/或必需氨基酸的含量特別低的天然多肽的那些。實例如種子貯藏蛋白，如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。其它合適的目標(biāo)包括arcelin，菜豆蛋白，凝集素，玉米醇溶蛋白和清蛋白。結(jié)構(gòu)核酸序列中的密碼子應(yīng)用特點由于遺傳密碼的簡并性，可以用不同的核苷酸密碼子編碼給定的氨基酸。宿主細(xì)胞常常表現(xiàn)出優(yōu)選的密碼子應(yīng)用模式。優(yōu)選結(jié)構(gòu)核酸序列經(jīng)過構(gòu)建能利用具體宿主細(xì)胞的密碼子應(yīng)用模式。這通常能增強該結(jié)構(gòu)核酸序列在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)?？蓪ι鲜鋈我环N核酸或氨基酸序列進行修飾，以反映容納它們的宿主細(xì)胞或生物優(yōu)選的密碼子應(yīng)用特性。在植物中修飾結(jié)構(gòu)核酸序列，使密碼子應(yīng)用最優(yōu)化的方法可參見美國專利5,689,052。對結(jié)構(gòu)核酸序列的其它修飾上述結(jié)構(gòu)核酸序列中的其它變化可編碼出與改造前的蛋白相比等效或具有更優(yōu)秀特征的蛋白。突變包括對基序序列進行缺失，插入，截短，取代，融合，改組等。對結(jié)構(gòu)核酸序列的突變可通過特定方式或隨機方式引入，這兩種方式都是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。定點誘變技術(shù)有很多種，它們通常利用寡核苷酸將突變引入結(jié)構(gòu)核酸序列中的特定位置。實例包括單鏈拯救(Kunkel等，1985)，唯一位點的消除(Deng和Nickloff，1992)，切口(nick)保護(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。隨機或非特異性突變可通過化學(xué)試劑產(chǎn)生(綜述參見，Singer和Kusmierek，1982)，如亞硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通過生物學(xué)方法產(chǎn)生，如由突變株傳代(Greener等，1997)。其它產(chǎn)生上述改變的方法可參見Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；FritsEckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)。修飾可以在氨基酸序列中導(dǎo)致保守或非保守的改變。保守改變不改變蛋白的最終氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白包含約5-約500個保守改變，更優(yōu)選約10-約300個保守改變，還更優(yōu)選約25-約150個保守改變，最優(yōu)選約5-約25個保守改變或約1-約5個保守改變。非保守改變包括能導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變的那些添加、缺失和取代。在一優(yōu)選實施方案中，所述蛋白具有約5-約500非保守氨基酸改變，更優(yōu)選約10-約300個非保守氨基酸改變，還更優(yōu)選約25-約150個非保守氨基酸改變，最優(yōu)選約5-約25個非保守氨基酸改變或約1-約5個非保守改變?？梢詫Ρ景l(fā)明的蛋白序列以及編碼它們的核酸序列進行修飾但保留所述分子的所需特性。以下是關(guān)于對蛋白的氨基酸序列進行改變來產(chǎn)生等效，或者可能更優(yōu)良的第二代分子的討論。氨基酸改變可以通過改變結(jié)構(gòu)核酸序列的密碼子來實現(xiàn)，密碼子參見表1。表1氨基酸的密碼子簡并性可以在不明顯損失所需活性的前題下，將蛋白序列中特定的氨基酸取代為其它氨基酸。從這一點上來看，可以在所公開的肽序列或蛋白序列，或它們的相應(yīng)核酸序列中進行多種改變而不明顯損失生物活性。在制造這類改變時，可考慮氨基酸親水性指數(shù)。氨基酸的親水性指數(shù)在賦于蛋白質(zhì)以交互式生物功能方面的重要性已為領(lǐng)域內(nèi)廣泛理解(Kyte和Doolittle，1982)?？梢越邮艿氖?，氨基酸的相對親水性決定所得蛋白的二級結(jié)構(gòu)，而后者又限定了該蛋白與其它分子，如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等的相互作用。每種氨基酸基于其疏水性和荷電特性而分配了親水性指數(shù)。具體是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域已知，特定氨基酸可以被具有相似親水性指數(shù)或得分(score)的其它氨基酸取代，所得蛋白質(zhì)仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在制造這類改變時，親水性指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代為優(yōu)選，在±1以內(nèi)的為更優(yōu)選，在±0.5以內(nèi)的為最優(yōu)選。本領(lǐng)域也能理解，可以在親水性的基礎(chǔ)上有效地進行相似氨基酸的取代。美國專利4,554,101(Hopp，T.P.，1985年11月19日授權(quán))稱，一種蛋白質(zhì)上受其鄰接氨基酸的親水性控制的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。氨基酸的親水值如下精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)?？衫斫猓环N氨基酸可以被具有相似的親水得分值的另一種氨基酸取代，所得蛋白質(zhì)仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在制造這類改變時，親水性指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代為優(yōu)選，在±1以內(nèi)的為更優(yōu)選，在±0.5以內(nèi)的為最優(yōu)選。綜上所述，氨基酸取代因此是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小，等等。涉及上述多種特性的取代實例為本領(lǐng)域眾所周知，它們包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸。對于不能預(yù)計有利的那些改變，如果能使所得的蛋白質(zhì)與原始未經(jīng)改造的多肽相比，瘤胃抗性增強和/或?qū)Φ鞍琢呀庑越到庾饔玫目剐栽鰪?，則也可以使用?；蛘?，可以生成能改進代謝酶的動力學(xué)的改變。在一個優(yōu)選方面，被修飾的蛋白選自種子貯藏蛋白，脂肪酸途徑酶，維生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶。重組載體上述任何啟動子和結(jié)構(gòu)核酸序列都可提供在重組載體中。重組載體通常按5’至3’方向包含能指導(dǎo)結(jié)構(gòu)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，以及結(jié)構(gòu)核酸序列。適當(dāng)?shù)膯幼雍徒Y(jié)構(gòu)核酸序列包括本文中公開的那些。重組載體還可根據(jù)需要而包含3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)位(transit)及靶向核酸序列，選擇標(biāo)記，增強子，和操縱子。制備重組載體的方式為本領(lǐng)域已知。制備特別適于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。對這些類型的載體已有綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。用于在高等植物中進行核酸表達(dá)的典型載體為本領(lǐng)域已知，包括來自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用于植物轉(zhuǎn)化的重組載體，包括pCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體，也已有記載(Fromm等，1985)。在一個實施方案中，將多個7Sα啟動子與任意組合的結(jié)構(gòu)基因可操作連接在單構(gòu)建體中。在一個優(yōu)選實施方案中，將SEQIDNOs11，12，13和14中1，2，3，4，5，或6或更多個的任意組合與結(jié)構(gòu)基因的任意組合可操作連接在單構(gòu)建體中。重組載體中的附加啟動子重組載體中還可提供一個或更多個附加啟動子。這些啟動子可以，例如，但不限于，與上述任何結(jié)構(gòu)核酸序列可操作相連?；蛘?，所述啟動子可與其它核酸序列，如編碼轉(zhuǎn)位肽、選擇標(biāo)記蛋白的那些序列、或反義序列，可操作相連。這些附加啟動子可根據(jù)載體所要插入的細(xì)胞的類型來選擇。在細(xì)菌、酵母和植物中具有功能的啟動子為本領(lǐng)域已知。附加的啟動子還可以根據(jù)它們的調(diào)節(jié)特性來選擇。這些特性的實例包括對轉(zhuǎn)錄活性、誘導(dǎo)能力、組織特異性、以及發(fā)育階段特異性的強化作用。已有文獻(xiàn)描述了植物中的誘導(dǎo)型啟動子，病毒來源的或合成的啟動子，組成型啟動子，時間調(diào)節(jié)型啟動子，以及空間調(diào)節(jié)型啟動子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。常用的組成型啟動子包括CaMV35S啟動子(Odell，J.T.等，1985)，增強型CaMV35S啟動子，玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子。有用的誘導(dǎo)型啟動子包括由水楊酸或聚丙烯酸誘導(dǎo)的啟動子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由于應(yīng)用安全劑而誘導(dǎo)的啟動子(安全劑如取代的苯磺酰胺除草劑；Hershey，H.P.andStoner，T.D.，1991)，熱休克啟動子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，來源于菠菜亞硝酸根還原酶結(jié)構(gòu)核酸序列的硝酸根誘導(dǎo)型啟動子(Back等，1991)，激素誘導(dǎo)型啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，與RuBP羧化酶和LHCP家族的小亞單位結(jié)合的光誘導(dǎo)型啟動子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum，R.L.等，1991；Weisshaar，B.等，1991；Lam，E.andChua，N.H.，1990；Castresana，C.等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。有用的組織特異性或器官特異性啟動子的實例包括β-伴大豆球蛋白7Sα’啟動子(Doyle，J.J.等，1986；SlightonandBeachy，1987)，和其它種子-特異性啟動子(Knutzon，D.S.等，1992；Bustos，M.M.等，1991；LamandChua，1991；Stayton等，1991)?？捎糜谠诜N子質(zhì)體中優(yōu)先表達(dá)的植物功能性啟動子，包括來自植物貯藏蛋白的啟動子，以及來自與含油種子中脂肪酸生物合成有關(guān)的蛋白的啟動子。這類啟動子的實例包括下列結(jié)構(gòu)核酸序列的5’調(diào)節(jié)區(qū)napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制劑，ACP，硬脂酰-ACP去飽和酶，和油質(zhì)蛋白。對種子-特異性調(diào)節(jié)作用的描述可參見EP0255378。另一例種子特異性啟動子是凝集素啟動子。大豆種子中的凝集素蛋白由單結(jié)構(gòu)核酸序列(Lel)編碼，該序列僅在種子成熟期表達(dá)。凝集素結(jié)構(gòu)核酸序列和種子特異性啟動子已被鑒定出，并用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的種子特異性表達(dá)(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。重組載體中特別優(yōu)選的附加啟動子包括攜帶在根癌土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子；增強型CaMV35S啟動子；玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞單位的光誘導(dǎo)型啟動子；煙草EIF4A啟動子(Mandel等，1995)；谷物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脫氫酶1(Vogel等，1989)；谷物光收獲復(fù)合物(Simpson，1986)；谷物熱休克蛋白(Odell等，1985)；擬南芥殼多糖酶啟動子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂轉(zhuǎn)移蛋白)啟動子(Pyee等，1995)；矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(VanTunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白啟動子(Christensen等，1992)；以及水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990)。附加啟動子優(yōu)選具有種子選擇性，組織選擇性，為組成型或誘導(dǎo)型。最優(yōu)選的啟動子為胭脂氨酸合成酶(nos)，章魚氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增強型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄參花葉病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，煙草RB7，小麥POX1，煙草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的啟動子。帶有附加的結(jié)構(gòu)核酸序列的重組載體重組載體還可包含一或多個附加的結(jié)構(gòu)核酸序列。這些附加結(jié)構(gòu)核酸序列通常為適于在重組載體中使用的任何序列。這樣的結(jié)構(gòu)核酸序列包括，但不限于，上述任一種結(jié)構(gòu)核酸序列及其修飾形式。附加結(jié)構(gòu)核酸序列還可與上述任一種啟動子可操作相連。所述一或多個結(jié)構(gòu)核酸序列可分別與不同(separate)啟動子可操作相連。或者，多個結(jié)構(gòu)核酸序列可與單個啟動子可操作相連(即，單操縱子)。所述附加結(jié)構(gòu)核酸序列包括，但不限于，編碼下列蛋白的那些種子貯藏蛋白，脂肪酸途徑的酶，維生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或淀粉分支酶。優(yōu)選的種子貯藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(美國專利4,886,878，4,885,357，5,215,912，5,589,616，5,508,468，5,939,599，5,633,436和5,990,384；WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064和WO99/40209)，7S蛋白(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅果蛋白(美國專利5,850,024)，不含苯丙氨酸的蛋白(WO96/17064)，清蛋白(WO97/35023)，β-伴大豆球蛋白(WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5,885,801)arcelin種子貯藏蛋白(美國專利5,270,200)凝集素(美國專利6,110,891)和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選的脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482，5,530,186，5,945,585，5,639,790，5,807,893，5,955,650，5,955,329，5,759,829，5,147,792，5,304,481，5,298,421，5,344,771和5,760,206)，和去飽和酶(美國專利5,689,050、5,663,068、5,614,393、5,856,157、6,117,677、6,043,411、6,194,167、5,705,391、5,663,068、5,552,306、6,075,183、6,051,754、5,689,050、5,789,220、5,057,419、5,654,402、5,659,645、6,100,091、5,760,206、6,172,106、5,952,544、5,866,789、5,443,974和5,093,249)。優(yōu)選的維生素E生物合成途徑酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，AANT1，slr1737，和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體(Kridl等，SeedSci.Res.1209219(1991)；Keegstra，Cell56(2)247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9112760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.1381309-1316(1992)；Cyanobasehttp//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norrisetal.，PlantPhysicol1171317-1323(1998)；BartleyandScolnik，PlantPhysicol1041469-1470(1994)，Smith等，PlantJ.1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily，等，PlantPhysicol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等，J.DNARes.7(1)31-63(2000))。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合酶(美國專利5,965,727，WO97/26366，WO99/11800，WO99/49058)色氨酸脫羧酶(WO99/06581)和蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421、5,942,660和WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(WO99/02656和WO98/55601)和天冬氨酸激酶(美國專利5,367,110、5,858,749和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括美國專利6,232,122和6,147,279，以及WO97/22703中提到的那些?；蛘?，可將第二種結(jié)構(gòu)核酸序列設(shè)計成能下調(diào)特定的核酸序列。這通常通過將第二種結(jié)構(gòu)氨基酸按照反義方向與啟動子可操作相連來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉這類反義技術(shù)。任何核酸序列都可能以這種方式進行負(fù)調(diào)節(jié)。優(yōu)選的目標(biāo)核酸序列包含低含量的必需氨基酸、但在特定組織中以相對較高水平表達(dá)。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都在種子中大量表達(dá)，但在營養(yǎng)方面缺少必需氨基酸。這種反義方法也可用于有效除去植物來源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食劑(例如，凝集素)，清蛋白，和變應(yīng)原，或者使參與所需化合物(如必需氨基酸)的降解的分解代謝酶下調(diào)。選擇標(biāo)記載體或構(gòu)建體還可包含選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記可用于篩選出包含外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細(xì)胞。選擇標(biāo)記的實例包括，但不限于neo基因(Potrykus等，1985)，它編碼卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素，RptII，G418，hpt等進行篩選；bar基因，它編碼bialaphos抗性；突變的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988)，aadA(Jones等，1987)，它編碼草甘膦(glyphosate)抗性；腈水解酶基因，它賦予對溴苯腈(bromoxynil)的抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它賦予對咪唑啉酮(imidazolinone)或磺脲(sulphonylurea)的抗性(歐洲專利申請154,204，1985)，ALS(D’Halluin等，1992)，以及氨甲喋呤(methotrexate)抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。選擇標(biāo)記優(yōu)選為GUS，綠色熒光蛋白(GFP)，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)，螢光素酶(LUX)，抗生素抗性編碼序列，或除草劑(例如，草甘膦)抗性編碼序列。選擇標(biāo)記最優(yōu)選卡那霉素，潮霉素，或除草劑抗性標(biāo)記。載體或構(gòu)建體還可以包括篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記可用于監(jiān)控表達(dá)。篩選標(biāo)記的其它實例包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(Jefferson，1987)；一種R-座基因，它編碼一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷(紅色)的產(chǎn)生(Dellaporta等，1988)；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(例如，PADAC，一種顯色的頭孢菌素)；螢光素酶基因(Ow等，1986)；xy1E基因(Zukowsky等，1983)，它編碼一種兒茶酚雙加氧酶，此酶可轉(zhuǎn)化顯色型兒茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它編碼一種能將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(dopaquinone，進一步縮合為黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使顯色性α-半乳糖底物發(fā)生轉(zhuǎn)變。術(shù)語“選擇或篩選標(biāo)記基因”還包括編碼可分泌的標(biāo)記的基因，所述可分泌的標(biāo)記是指其分泌可作為鑒定或篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段的那些。實例包括編碼可通過抗體相互作用予以鑒定的分泌型抗原的標(biāo)記物，或甚至可通過催化檢測的分泌型酶。分泌型蛋白可分為數(shù)類，包括可通過(例如，ELISA)檢測的小分子可擴散型蛋白，可在胞外溶液中檢測到的小分子活性酶(例如，α-淀粉酶，β-內(nèi)酰胺酶，膦絲菌素轉(zhuǎn)移酶)，或者插入或陷落在細(xì)胞壁中的蛋白(如包含前導(dǎo)序列的蛋白，如發(fā)現(xiàn)于延伸的表達(dá)單元中的蛋白，或煙草PR-S)。其它可能的選擇和/或篩選標(biāo)記基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。重組載體中的其它元件各種具有順式作用的非翻譯5’和3’調(diào)節(jié)序列也可以包括在重組核酸載體中。任何這類調(diào)節(jié)序列可在重組載體中伴有其它調(diào)節(jié)序列?？赏ㄟ^設(shè)計或改變這類組合來產(chǎn)生所需的調(diào)節(jié)特征。3’非翻譯區(qū)通常提供轉(zhuǎn)錄終止信號，聚腺苷酸化信號，后者在植物中能導(dǎo)致腺苷酸添加在mRNA的3’末端。這可通過下述序列的3’區(qū)實現(xiàn)胭脂氨酸合成酶(nos)編碼序列，大豆7Sα’貯藏蛋白編碼序列，Arcelin-5編碼序列，清蛋白編碼序列，以及豌豆ssRUBISCOE9編碼序列。位于距聚腺苷酸化位點數(shù)百個堿基對的下游處的核酸序列通?？山K止轉(zhuǎn)錄。這些區(qū)是轉(zhuǎn)錄的mRNA進行有效聚腺苷酸化所必需的。重組載體中還可摻入翻譯增強子。因此，重組載體優(yōu)選包含一或多個5’非翻譯前導(dǎo)序列，以便增強核酸序列的表達(dá)。這類增強子序列預(yù)計能增強或改變所得mRNA的翻譯效力。優(yōu)選的5’核酸序列包括dSSU5’，PetHSP705’，和GmHSP17.95’(美國專利5,362,865)。重組載體還可包含編碼轉(zhuǎn)位肽的核酸序列。這種肽可用于將蛋白引到胞外空間，質(zhì)體，或細(xì)胞內(nèi)側(cè)或外側(cè)的其它空間中(參見，例如EP0218571，美國專利4,940,835，5,88,624，5,610,041，5,618,988和6,107,060)。重組載體中的結(jié)構(gòu)核酸序列可包含內(nèi)含子。這些內(nèi)含子可以與結(jié)構(gòu)核酸序列有不同來源。優(yōu)選的內(nèi)含子包括水稻肌動蛋白內(nèi)含子和谷物HSP70內(nèi)含子。融合蛋白上述任一種結(jié)構(gòu)核酸序列及其修飾形式可與附加的核酸序列相連，以編碼融合蛋白。所述附加的核酸序列優(yōu)選編碼至少一個氨基酸，肽，或蛋白。有多種可能的融合組合。例如，融合蛋白可提供便于檢測該融合蛋白的“標(biāo)記”表位，如GST，GFP，F(xiàn)LAG，或polyHIS。這類融合優(yōu)選編碼約1-約50個氨基酸，更優(yōu)選約5-約30個附加的氨基酸，還更優(yōu)選約5-約20個氨基酸。或者，所述融合可提供調(diào)節(jié)功能、酶活性、細(xì)胞信號傳遞功能、或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運功能。例如，可添加編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的序列，以便將融合蛋白引向種子內(nèi)部的葉綠體。這類融合配對物優(yōu)選編碼約1-約1000個附加的氨基酸，更優(yōu)選約5-約500個附加的氨基酸，還更優(yōu)選約10-約250個氨基酸。序列分析本發(fā)明中，序列相似性或同一性優(yōu)選用序列AnalysisSoftwarePackage(Version10；geneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)中的“BestFit”或“Gap”程序來確定?！癎ap”程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)尋找兩個序列之間能使匹配數(shù)最大而使缺口數(shù)最小的對比排列?！癇estFit”程序是對兩個序列之間相似性的最佳節(jié)段進行最佳對比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通過插入缺口，使匹配數(shù)最大化，可找出最佳對比排列。上述序列AnalysisSoftwarePackage還包含數(shù)個另外的序列分析工具，它們可用于鑒定本發(fā)明核苷酸和氨基酸序列的同源性。例如，“BLAST”程序(Altschul等，1990)在特定的數(shù)據(jù)庫(例如，NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的數(shù)據(jù)庫)中搜索與查詢(query)序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；seealsoPearsonandLipman，1988；Pearson等，1990)對查詢序列與一組相同類型的序列(核酸或蛋白)之間的相似性進行Pearson和Lipman搜索；“TfastA”對查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson和Lipman搜索(它先翻譯出所有6個讀碼框中的核苷酸序列，然后進行比較)；“FastX”對核苷酸查詢序列與一組蛋白序列之間的相似性進行Pearson和Lipman搜索，它考慮了移碼效應(yīng)；“TfastX”對蛋白查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson和Lipman搜索，它考慮了移碼效應(yīng)(它先對核酸序列的兩條鏈都進行翻譯，然后進行比較)。探針和引物本發(fā)明中，可制備并利用能與互補核酸序列特異性雜交的短核酸序列。這些短核酸分子可作為探針用于鑒定給定的樣品中互補核酸序列的存在。因此，通過構(gòu)建與特定核酸序列的一小部分互補的核酸探針，可檢測和評估該核酸序列的存在?；蛘撸捎蒙鲜龆毯怂嵝蛄凶鳛楣押塑账嵋?，利用PCR技術(shù)使互補核酸序列擴增或突變。這些引物還可促進對相關(guān)互補核酸序列的擴增(例如來自其它物種的相關(guān)核酸序列)。短核酸序列可用作引物，尤其是作為PCR引物。PCR探針是在與另一核酸所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中能啟動聚合酶活性的核酸分子。確定PCR引物的結(jié)構(gòu)的各種方法以及PCR技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。例如，可用諸如Primer3(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等計算機搜索程序來鑒定潛在的PCR引物。本文公開的任何核酸序列都可以用作引物或探針。這些探針或引物的應(yīng)用，可以大大促進，對包含本文公開的啟動子和結(jié)構(gòu)核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物的鑒定。所述探針或引物還可以用于篩選cDNA或基因組文庫中，與本文公開的啟動子和結(jié)構(gòu)核酸序列相關(guān)或共享同源性的其它核酸序列。引物或探針通常與將要被鑒定、擴增、或突變的核酸序列的一部分互補，引物或探針的長度應(yīng)足以與其互補體形成穩(wěn)定的序列特異性雙鏈分子。引物或探針的長度優(yōu)選為約10-約200個核苷酸，更優(yōu)選為約10-約100個核苷酸，還更優(yōu)選為約10-約50個核苷酸，最優(yōu)選為約14-約30個核苷酸。引物或探針可以，例如，但不限于，直接化學(xué)合成，通過PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)制備，或通過從較大的核酸分子中切出特異性核酸片段而制備。轉(zhuǎn)基因植物和經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，它們按照5’至3’方向包含啟動子以及與其可操作相連的異源結(jié)構(gòu)核酸序列。其它核酸序列也可與上述啟動子和結(jié)構(gòu)核酸序列一起引入植物或宿主細(xì)胞中。所述其它序列可包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)位或靶向序列，選擇標(biāo)記，增強子，和操縱子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸序列包括重組載體，結(jié)構(gòu)核酸序列，啟動子，及其它調(diào)節(jié)元件，都已在上文中描述。制備這樣的重組載體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，制備特別適于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。這些載體已有相關(guān)綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)?？捎糜谠诩?xì)胞和高等植物中表達(dá)的典型載體是本領(lǐng)域已知的，如衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)根瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用于植物轉(zhuǎn)化的重組載體也已有描述(Fromm等，1985)。這類重組載體的元件包括，但不限于上文所述。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞一般可以是與本發(fā)明相容的任何細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主植物或細(xì)胞可以來源于單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于，canola，兩節(jié)薺屬(crambe)，玉米(maize)，白芥(mustard)，蓖麻子，芝麻，棉籽，亞麻子(linseed)，大豆，擬南芥屬(Arabidopsis)，菜豆屬(Phaseolus)，花生，苜蓿(alfalfa)，小麥，稻，燕麥，高梁，油菜籽(rapeseed)，黑麥，tritordeum，millet，羊茅(fescue)，多年生麥草(perennialryegrass)，甘蔗，紅莓苔子(cranberry)，番木瓜(papaya)，香蕉，紅花，油棕(oilpalm)，亞麻(flax)，香瓜(muskmelon)，蘋果，黃瓜，石斛(dendrobium)，劍蘭(gladiolus)，菊花(chrysanthemum)，百合科(liliacea)，棉花，桉(eucalyptus)，向日葵，蕓苔(Brassicacampestris)，歐洲油菜(Brassicanapus)，turfgrass，甜菜(sugarbeet)，咖啡和薯蕷(dioscorea)(Christou，InParticleBornbardnmeforgeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit，AcademicPress，SanDiego，California(1996))，其中優(yōu)選canola，玉米，蕓苔，歐洲油菜，油菜籽，大豆，紅花，小麥，稻和向日葵，更優(yōu)選canola，油菜籽，玉米，蕓苔，歐洲油菜，大豆，向日葵，紅花，油棕和花生。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述植物或細(xì)胞是canola或者來源于canola。在另一特別優(yōu)選實施方案中，所述植物或細(xì)胞是歐洲油菜或者來源于歐洲油菜。在另一特別優(yōu)選實施方案中，所述植物或細(xì)胞是大豆或者來源于大豆。大豆細(xì)胞或植物優(yōu)選大豆優(yōu)良細(xì)胞品系?！皟?yōu)良品系”是經(jīng)過育種和篩選而得到的具有出色的農(nóng)藝表現(xiàn)的任何品系。優(yōu)良品系的實例有面向農(nóng)民或大豆種植者出售的品系，如HARTZTM品種H4994，HARTZTM品種H5218，HARTZTM品種H5350，HARTZTM品種H5545，HARTZTM品種H5050，HARTZTM品種H5454，HARTZTM品種H5233，HARTZTM品種H5488，HARTZTM品種HLA572，HARTZTM品種H6200，HARTZTM品種H6104，HARTZTM品種H6255，HARTZTM品種H6586，HARTZTM品種H6191，HARTZTM品種H7440，HARTZTM品種H4452RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4994RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4988RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5000RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5147RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5247RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5350RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5545RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5855RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5088RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5164RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5361RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5566RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5181RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5889RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5999RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6013RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6255RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6454RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6686RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7152RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7550RoundupReadyTM，HARTZTM品種H8001RoundupReadyTM(HARTZSEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(AsgrowSeeds，DesMoines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品種CX445(DeKalb，Illinois)。本發(fā)明還涉及制備轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述植物包含按照5’至3’方向排列的啟動子以及與其可操作相連的異源結(jié)構(gòu)核酸序列。還可將其它序列與啟動子和結(jié)構(gòu)核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’聚腺苷酸化信號，其它非翻譯序列，轉(zhuǎn)位或靶向序列，選擇標(biāo)記，增強子，以及操縱子。優(yōu)選的重組載體，結(jié)構(gòu)核酸序列，啟動子，和其它調(diào)節(jié)元件，包括但不限于本文中公開的那些。所述方法通常包括選擇適當(dāng)?shù)闹参铮弥亟M載體轉(zhuǎn)化該植物，和獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞等步驟。有多種方法可將核酸引入植物。適當(dāng)?shù)姆椒ò?xì)菌感染(例如土壤桿菌)，二元細(xì)菌人工染色體載體，核酸的直接運送(例如經(jīng)由PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，干燥(desiccation)/抑制作用-介導(dǎo)的核酸攝入，電穿孔，用碳化(carbide)硅纖維進行的攪拌，以及對核酸包被的粒子進行加速，等等(見Potrykus等，1991的綜述)。將核酸引入細(xì)胞的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些方法通常被歸類為4類(1)化學(xué)方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如顯微注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受體-介導(dǎo)的機制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)?；蛘撸梢灾苯訉⒑怂嵋牖ǚ?，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以將核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。從轉(zhuǎn)化植物的原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物的方法為本領(lǐng)域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，通常在能選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并誘導(dǎo)植物苗枝再生的選擇培養(yǎng)基存在的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體(Fraley等，1983)。這些苗枝通常在2-4個月內(nèi)獲得。然后將苗枝轉(zhuǎn)移至合適的根-誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中包含選擇試劑以及阻止細(xì)菌生長的抗生素。大多數(shù)苗枝將發(fā)育出根。然后將它們移植到土壤或其它基質(zhì)中，以使根繼續(xù)發(fā)育。以上概述的方法常常根據(jù)所用具體植物株系的不同而有變動。優(yōu)選再生的轉(zhuǎn)基因植物能自花授粉，從而提供純合型轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，可將所述再生轉(zhuǎn)基因植物的花粉與非-轉(zhuǎn)基因植物雜交，優(yōu)選與農(nóng)藝上重要的物種的近交系雜交。反過來，可用非-轉(zhuǎn)基因植物的花粉對所述再生轉(zhuǎn)基因植物授粉。轉(zhuǎn)基因植物可將編碼增強型基因表達(dá)的核酸序列傳給它的后代。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選為編碼增強型基因表達(dá)的核酸的純合型，能通過有性繁殖將該序列傳遞給它的所有后代。后代可以從轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的種子發(fā)育而成。這些另外的植物然后可通過自花授粉產(chǎn)生真正的植物育種系?？蓪@些植物的后代進行評估，例如，評估其基因表達(dá)?；虮磉_(dá)可通過多種常用方法來檢測，如western印跡，northern印跡，免疫沉淀，和ELISA。本發(fā)明的植物或制劑可以用于多種方法中，所述方法例如而非限制于獲得表達(dá)結(jié)構(gòu)核酸分子的種子，獲得增加了結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物的種子，獲得增加了結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物的粗粉，獲得增加了結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物的原料，以及獲得增加了結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物的油。在所述方法中用到的植物可以進行加工?？梢詫⒅参锘蛑参锏囊徊糠峙c其它植物部分分隔或分離。為此目的而優(yōu)選的植物部分是種子?？梢岳斫?，即使是與其它植物部分分隔或分離后，所分離或分隔出的植物部分仍可能混有其它植物部分。在一個優(yōu)選方面，所分隔的植物部分占所分隔的物質(zhì)的約50％(w/w)以上，更優(yōu)選約75％(w/w)以上，還更優(yōu)選約90％(w/w)以上。本發(fā)明中由所述方法產(chǎn)生的植物或植物部分可以用已知技術(shù)加工成產(chǎn)物。優(yōu)選的產(chǎn)物是粗粉，原料和油。飼料(feed)，粗粉，蛋白和油制品本發(fā)明的任何植物或其部分可以經(jīng)過加工制成飼料，粗粉，蛋白或油制品。為此目的的一個特別優(yōu)選的植物部分是種子。在一個優(yōu)選實施方案中，飼料，粗粉，蛋白或油制品是設(shè)計用于反芻動物的。制備飼料，粗粉，蛋白和油制品的方法是已知的。參見，例如，美國專利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白制品是高蛋白制品。這種高蛋白制品優(yōu)選蛋白含量約5％w/v以上，更優(yōu)選約10％w/v，還更優(yōu)選約15％w/v。在優(yōu)選的油制品中，油制品可以是高油制品，其中來源于本發(fā)明植物或其一部分的油的含量為約5％w/v以上，更優(yōu)選約10％w/v以上，還更優(yōu)選約15％w/v以上。在一個優(yōu)選實施方案中，油制品是液體，體積超過約1升，約5升，約10升，或約50升。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物制備的油或者是通過本發(fā)明的方法制備的油。所述油可以是任何所得產(chǎn)物的次要或主要組分。而且，所述油可以與其它多種油混合。在一個優(yōu)選實施方案中，從本發(fā)明的植物制備的油或者是通過本發(fā)明的方法制備的油，在任何產(chǎn)物的油組分中占體積或重量的約0.5以上，約1以上，約5以上，約10以上，約25以上，約50以上，約75以上，或約90％以上。在另一實施方案中，所述油制品可以是混合物，并且可以在該混合物總體積中占約10以上，約25以上，約35以上，約50以上，或約75％以上。由本發(fā)明的植物制備的油可以與一或多種有機溶劑或石油蒸餾物混合。種子容器可以將植物的種子放置在容器中。本文中，容器是指任何能夠容納所述種子的物體。容器優(yōu)選包含約500，約1,000，約5,000，或約25,000個以上的種子，其中至少約10，約25，約50，約75或約100％的種子來自本發(fā)明的植物。育種計劃本發(fā)明的植物可以是育種計劃的一部分或者是從該計劃中產(chǎn)生的。對育種方法的選擇取決于植物繁殖的模式，待改進的性狀的遺傳率，市場上所用的品種的類型(例如，F(xiàn)1雜交品種，純系品種，等)。選出用于培育本發(fā)明植物的非限制性方法如下。育種計劃可以利用對任何雜交后代的標(biāo)記物輔助性選擇來強化。還應(yīng)理解，任何商業(yè)和非商業(yè)品種可以在一個育種計劃中應(yīng)用。因素包括，例如，應(yīng)急活力(emergencevigor)，營養(yǎng)勢，逆境耐性，疾病抗性，分支，開花，種子set，種子大小，種子密度，站立能力(standability)，以及脫粒能力(threshability)等通常決定了上述選擇。對于高度可遺傳的性狀而言，選擇在單一地區(qū)進化而成的較高等的單個植株是有效的，而對于具有低遺傳率的特性而言，選擇應(yīng)該基于從相關(guān)植物家族的重復(fù)評價中得出的平均值。群體選擇方法常常包括譜系選擇，改良的譜系選擇，混合選擇和輪回選擇。在一個優(yōu)選實施方案中，采取回交或輪回育種計劃。遺傳的復(fù)雜性影響了對育種方法的選擇。回交育種可用于將高度可遺傳性狀的一或多個有利(favorable)基因轉(zhuǎn)移到所需的品種中。該方法已經(jīng)廣泛用于培育抗病品種。各種輪回選擇技術(shù)已用于從量上改進受多個基因控制的遺傳特性。輪回選擇中自花授粉作物中的應(yīng)用取決于授粉是否簡便(ease)，每次授粉得到成功雜種的頻率，以及每次成功雜交的雜種后代的數(shù)目?？梢詫τN品系進行測試，并將它們與適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)在代表商業(yè)目標(biāo)地區(qū)的環(huán)境中比較兩代或更多代。最好的品系將有可能成為新的商業(yè)化品種；那些仍然在性狀上有特性缺陷的品系可作為親本，用于產(chǎn)生新的群體，以備進一步選擇。鑒定優(yōu)勢(superior)植物的一種方法是，觀察它相對于其它實驗植物以及相對于廣泛培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)品種的表現(xiàn)。如果一次觀察得不出結(jié)論，可以進行多次觀察，以便較好地評估其遺傳價值。培育者可以選擇并雜交兩種或更多種親本品系，然后反復(fù)自交和選擇，產(chǎn)生很多新遺傳組合。新品種的開發(fā)必需有變種的開發(fā)和選擇，這些變種的雜交以及優(yōu)勢雜交種的選擇。雜種的種子可以通過，用手工操作使選出的雄性能育親本雜交，或通過利用雄性不育體系，來產(chǎn)生。在雜種中選擇特定的單基因特性，如莢果的顏色，花的顏色，種子的產(chǎn)量，短柔毛的顏色，或?qū)Τ輨┑目剐?，它們可指示該種子確實是真正的雜種。關(guān)于親本品系的其它信息，以及雜種的表型，影響了培育者關(guān)于是否繼續(xù)用該具體雜種進行雜交的決定。譜系選擇和輪回選擇育種方法可用于從培育群體中開發(fā)品種。育種計劃將來自兩或多個品種或者各種廣泛來源的所需特性組合成育種庫(pool)，在該庫中，通過自交并選擇所需表型來開發(fā)品種?？梢栽u價多個新品種，以便確定哪一個新品種具有商業(yè)潛力。譜系育種常用于改良自花授粉的作物。使兩個具有有利的互補特性的親本雜交，產(chǎn)生F1。通過一或多個F1的自交產(chǎn)生F2群體。從最佳家族選出最佳個體單株。在F4代中開始反復(fù)測試各個家族，改善對低遺傳率特性進行選擇的有效性。在育種的更先進階段(即F6和F7代)，測試最佳品系或者表型相似品系的混合體，以便能選出可能作為新品種的品系?；亟挥N已用于將簡單遺傳的高度可遺傳性狀轉(zhuǎn)移到所需純合子品種或近交系(inbredline)中，后者是回歸親本。需要轉(zhuǎn)移的性狀的來源可稱為供體親本。預(yù)計所得植物具有回歸親本(例如，載培品種(cultivar))的特征，以及供體親本的所需性狀。最初的雜交后，選出具有供體親本表型的個體，反復(fù)與回歸親本雜交(回交)。所得植物預(yù)計具有回歸親本(例如，載培品種)的特征，以及供體親本的所需特性。單-種子世代(descent)方法在嚴(yán)格意義上是指，種植分離群體，每一植株收獲一個種子的樣品，用該一種子(one-seed)樣品培育下一代。當(dāng)該群體從F2代發(fā)展到所需的培育階段時，對衍生出品系的那些植物追蹤到不同的F2代個體。群體中植物的數(shù)量代代遞減，原因是一些種子不能發(fā)芽，或者一些植物不能產(chǎn)生哪怕是一粒種子。結(jié)果，并非該群體中最初采樣的所有F2代植物在傳代結(jié)束時都有相應(yīng)子代。在多-種子方法中，培育者常常從群體中的每一植株收獲一或多個莢果，使它們脫粒，共同形成一個混合群(bulk)。用該混合群的一部分培育下一代，將另外的部分儲備起來。該方法被稱為改良的單-種子世代技術(shù)或莢-群(pod-bulk)技術(shù)。多-種子方法已用于減少收獲所需勞動。用機器使莢果脫粒要比單-種子方法中用手工取出每個種子快得多。多-種子方法還使得有可能在每一次近交時培育群體中相同數(shù)量的種子。對其它常用于不同特性和作物的育種方法的描述可參見多篇參考書之一(例如，F(xiàn)ehr，PrinciplesofCultivarDevelopmentVol.1，pp.2-3(1987))。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物還可利用無融合生殖來繁殖。無融合生殖是植物繁殖的遺傳控制方法，該方法中的胚是在沒有卵與精子結(jié)合的情況下形成的。無融合生殖有三種基本類型(1)無孢子生殖，其中的胚由源自核的胚囊中染色體未減少的卵發(fā)育而成，(2)二倍性孢子形成，其中的胚由源自大孢子母細(xì)胞的胚囊中未縮小的卵發(fā)育而成，和(3)不定胚生殖，其中的胚直接由體細(xì)胞發(fā)育而成。在無融合生殖的大多數(shù)形式中，極核假受精或受精產(chǎn)生胚乳是種子活力所必需的。在無孢子生殖中，可以用滋養(yǎng)品種作為種子中胚乳形成的花粉源。所述滋養(yǎng)品種并不影響無孢子無融合生殖品種的遺傳(因為該品種的未縮小(unreduced)的卵是通過孤雌生殖發(fā)育而成的)，卻為胚乳的產(chǎn)生提供了可能。無融合生殖具有經(jīng)濟重要性，尤其是在轉(zhuǎn)基因植物中，因為它使得任何基因型(無論是否雜合)都可以被真正地培育出來。因此，有了無融合生殖以后，雜合型轉(zhuǎn)基因植物可以在反復(fù)的生命周期中維持它們的遺傳忠實性。制備無融合生殖植物的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，美國專利5,811,636。其它生物可將本發(fā)明核酸序列引入任何細(xì)胞或生物，如哺乳動物細(xì)胞，哺乳動物，魚的細(xì)胞，魚，鳥的細(xì)胞，鳥，藻類的細(xì)胞，藻類，真菌的細(xì)胞，真菌，或細(xì)菌的細(xì)胞。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化體包括真菌細(xì)胞如曲霉屬細(xì)胞，酵母，哺乳動物(尤其牛和豬)，昆蟲，細(xì)菌和藻類。優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿菌和根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。轉(zhuǎn)化這類細(xì)胞或生物的方法是本領(lǐng)域已知的(EP0238023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；BeckerandGuarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；BennettandLaSure，1991)。從這類生物體產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，1990；JaraiandBuxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；GethingandSambrook，1992；PuigandGilbert，1994；WangandTsou，1993；Robinson等，1994；EnderlinandOgrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；andJulius等，1983)。實施例提供以下實施例，不應(yīng)以任何方式將它們解釋為限制本發(fā)明的范圍。實施例1-制備大豆(GlycinemaxL.)7Sα啟動子的克隆用UniversalGenomeWalkerKit(ClontechLaboratories，Inc.，PaloAlto，California)，按照說明書，從大豆基因組DNA(AsgrowA3244)獲得7Sα啟動子。該過程由兩個PCR擴增組成，每一擴增反應(yīng)利用了一種銜接子引物和一種基因-特異性引物。為了鑒定適合作為模板DNA的具有最小同源性的區(qū)域，將7Sα和7Sα’(GlcX(7Sα’)和GIcA(7Sα))基因的編碼區(qū)序列對比排列，鑒定出兩個非同源區(qū)(圖1)?；谒b定的非同源區(qū)，制備以下基因特異性引物在初步PCR擴增中，使用GlcA-GW-初級3’末端(互補于圖1中的下劃線序列)5’-CTTCTGATGAGGTGGGCGTGGGAATGGGAA-3’[SEQIDNO6]在第二步PCR擴增中，使用GIcA-GW-巢式(在該引物5’末端添加了克隆位點BglII和NcoI)3’末端(互補于圖1中的粗體序列)5’-CCATGGAGATCTATCTTGTTCTCATCCTCATCCTCATC-3’[SEQIDNO7]該方法中用到以下銜接子引物5’末端初級(Primary)APIseq5’-GTATACGACTCACTATAGGGC-3’[SEQIDNO9]AP5(在該引物5’末端添加了克隆位點HindIII和PstI)巢式5’末端5’-AAGCTTCTGCAGGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’[SEQIDNO5]該過程中分離出三個克隆，并對它們測序。序列比對表明，所有這三個克隆代表了相同的7Sα基因，其中克隆8A最長。這些克隆分別為8A(2.3Kb)，7C(1.5Kb)和9C(1.3Kb)。這些初始克隆包含與7Sα基因(β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的亞單位之一)編碼區(qū)的一部分以及啟動子相連的序列。為了證實8A克隆是7Sα基因，將8A克隆的3’序列與公開的cDNA序列(GenBank登錄號X17698)進行比對。該比對證實，所述PCR產(chǎn)物與7Sα而不是7Sα’基因的上游區(qū)同源。然后對7C，8A，和9C進行亞克隆，以便提供僅含有7Sα基因的5’UTR區(qū)和啟動子的小片段。以7C，8A，和9C這幾個克隆為模板，進行上述PCR擴增反應(yīng)。AP5引物是銜接子引物，基因特異性引物是5’-CCATGGAGATCTAAGGAGGTTGCAACGAGCGTGGCAT-3’[SEQIDNO10]。這種基因特異性引物被設(shè)計成，可以將BglII和NcoI限制位點引入3’末端，從而有利于后續(xù)克隆。所得克隆用標(biāo)準(zhǔn)方法測序，并再克隆到新的pGEM-Teasy載體(Promega，Madison，WI，U.S.；美國專利4,766,072)中，產(chǎn)生以下載體p-GEM-T1A.1.7Kb插入子源自初始克隆8A，p-GEM-T2A.1.3Kb插入子源自初始克隆7C，和p-GEM-T3A.1.1Kb插入子源自初始克隆9C。用p-GEM-T1A，p-GEM-T2A，和p-GEM-T3A的核苷酸序列預(yù)測相應(yīng)的氨基酸序列。然后，將預(yù)測的氨基酸序列與7Sα基因產(chǎn)物(GIcA)(GenBank登錄號X17698和SWISS-PROT登錄號P13916)的蛋白翻譯序列進行比對，以便鑒定出起始密碼子。序列比對采用GCG軟件(GeneticsComputerGroup，OxfordMolecularGroup，Inc.)的序列比對功能進行。然后，用1A，2A，和3A克隆作模板進行另一次PCR反應(yīng)，其中使用AP5作銜接子引物，使用以下序列作為基因特異性引物5’-CCATGGAGATCTAGTATCTTAATTATTTATTAAGGTAT-3’[SEQIDNO8]另外，在該引物的5’末端添加NcoI和BglII位點(用斜體表示)。將該反應(yīng)的PCR產(chǎn)物純化，并再次克隆到pGEM-Teasy載體中，得到p-GEM-T1T，1724個堿基對的插入子源自克隆1A；p-GEM-T“new”2A，1135個堿基對的插入子源自克隆2A；p-GEM-T“new”3A，918個堿基對的插入子源自克隆3A。p-GEM-T1T的序列見圖2。實施例2該實施例表明，新克隆的7Sα變體的啟動子活性在瞬時轉(zhuǎn)化的大豆子葉中得到證實。將實施例1的三個克隆(1T，新2A，和新3A)通過凝膠電泳純化(QIAquickkit，產(chǎn)品目錄編號28704，QiagenCompany，Valencia，California)，再克隆到pMON8677(圖3)中原來由e35S啟動子占據(jù)的位置，在GUS報告基因的上游。所得質(zhì)粒圖譜見圖2a的pMON55548(1T)，圖3a的pMON55546(新2A)和圖4的pMON55547(新3A)。用其中兩個質(zhì)粒pMON55546和pMON55548進行大豆子葉的瞬時試驗。在大豆植株(AsgrowA3244)開花的25-28天后，收獲其種子，在添加了50mM谷氨酰胺，111mM麥芽糖，125mM棉籽糖，125mM甘露醇和3g/l純瓊脂的GAMBORG培養(yǎng)基(G5893，SigmaCompany，St.Louis，Missouri)，pH5.6中25℃滲透處理過夜。得到125個子葉，將它們都切為兩半，用來自pMON55546和pMON55548的7Sα啟動子構(gòu)建體的純化超螺旋DNA進行轟擊，采用的是粒子槍技術(shù)(Maliga等，1995，“MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual，”ColdSpringHarborLaboratoryPress，第47頁)。試驗中還包括另一種受分離的(separate)e35S驅(qū)動的螢光素酶構(gòu)建體作為低表達(dá)對照，它與上述每一種啟動子構(gòu)建體的摩爾比為1∶1。經(jīng)過轟擊的組織隨后在25℃孵育48小時。用1ml提取緩沖液從6份經(jīng)過轟擊的大豆子葉中提取蛋白，所述提取液中包含0.1M磷酸鉀(pH7.8)，10mMDTT，1mMEDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制劑(1片/50ml，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)。用100μl等份試樣的蛋白提取物按照Promega的“Steady-Glo”方案(目錄號E2510，PromegaCorporationMadison，WI)進行螢光素酶試驗。用50μl等份試樣的蛋白提取物進行標(biāo)準(zhǔn)的GUS試驗，但試驗方案略有調(diào)整(Maliga等，1995，“MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第29頁)。每份樣品分析雙份，取平均值進行數(shù)據(jù)分析。將GUS活性用螢光素酶活性校準(zhǔn)，結(jié)果表明，7Sα啟動子的所有變體都在大豆子葉組織中具有功能。實施例3-生成包含7Sα啟動子的大豆植物將pMON55548中的表達(dá)盒(7Sα-1T-GUS-NOS-3′)亞克隆，得到載體pMON55554，它是一種土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體，能證實7Sα啟動子在大豆植物中的效力(圖5)。pMON55554中還包含一種草甘膦抗性選擇標(biāo)記(CP4)。將該載體引入ABI根瘤土壤桿菌菌株中，用所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞感染大豆(AsgrowA3244)的子葉。作為對照，用截短的Arcelin5啟動子替代7Sα-1T，得到pMON55542(圖6)。將該載體引入ABI根瘤土壤桿菌菌株中，用所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞感染大豆(AsgrowA3244)的子葉。從受到根瘤土壤桿菌感染的組織再生得到植物，選出草甘膦抗性植物，從中得到成熟的種子，分析它們的GUS活性。為了分析GUS活性，將來自每一轉(zhuǎn)基因事件(品系)的8個種子分別磨碎。約20mg磨碎的種子組織用200μl提取緩沖液進行提取，所述提取液含有0.1M磷酸鉀(pH7.8)，10mMDTT，1mMEDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制劑(1片/50ml，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)。提取物的蛋白含量用Bio-RadProteinAssay(Bio-Rad，#61234A)測定，GUS活性用略經(jīng)調(diào)整的標(biāo)準(zhǔn)GUS試驗方案測定(Maliga等，1995，“MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第29頁)。將GUS活性用蛋白濃度校準(zhǔn)。每份樣品分析雙份，取平均值進行數(shù)據(jù)分析。如果一個事件(品系)的8個種子無一測出GUS活性，就將該事件排除。在顯示GUS活性的每一事件中，選出具有最強活性的種子，對其重復(fù)GUS活性試驗，結(jié)果見圖7。pMON55554的28個陽性事件以及pMON55542的11個陽性事件表明，7Sα啟動子最起碼與截短的Arcelin5啟動子效力一樣(圖7)。實施例4制備含有7Sα啟動子或Arcelin5啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物(Arabidopsis)受pMON55553(圖8)中的7Sα1T啟動子驅(qū)動或者受pMON55541(圖9)中的tArc5驅(qū)動而進行的GUS表達(dá)，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中進行檢查。pMON55553(7Sα1T-GUS-NOS)GUS和pMON55541(tArc5-GUS-NOS)GUS的表達(dá)在1周齡幼苗以及在成熟植株中檢查。表達(dá)pMON55553質(zhì)粒的植株和幼苗顯示，當(dāng)使用7Sα1T啟動子時，GUS不出現(xiàn)在根或成熟的葉中。在下胚軸和子葉中發(fā)現(xiàn)活性，這是由胚發(fā)育期間合成的殘留GUS所致。表達(dá)pMON55541的植株和幼苗顯示，當(dāng)使用tArc5啟動子時，除了在下胚軸和子葉中檢測到GUS信號以外，GUS還出現(xiàn)在根或成熟的葉中。這些信息表明，7Sα啟動子比tArc5啟動子具有改善的種子特異性。參考文獻(xiàn)Ainley等，PlantMol.Biol.，14949，1990.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Inc.，1995.BartleyandScolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470，1994.Back等，PlantMol.Biol.，179，1991.Bauer等，Gene，3773，1985.BeckerandGuarente，InAbelsonandSimon(eds.)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsEnzynlol.，Vol.194，pp.182-187，AcademicPress，Inc.，NewYork.BennettandLaSure(eds.)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，CA，1991.Bergeron等，TIBS，19124-128，1994.Bustos等，EMBOJ.，101469-1479，1991.Castresana等，EMBOJ.，71929-1936，1988.Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980.Cerda-Olnedo等，J.Mol.Biol.，33705-719，1968.Chau等，Science，244174-181.1989.Christensen等，PlantMol.Biol.，18675，689，1992.Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.Costa等MethodsMol.Biol.，5731-44，1996.Craik，BioTechniques，312-19，1985.Craig，Science，2601902-1903，1993.Curiel等，Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.Cyanobase，http//www.kazusa.or.jp/cyanobase.Dellaporta等，StadlerSymposium，11263-282，1988.Demolder等，J.Biotechnology，32179-189，1994.DengandNickloff，Anal.Biochem.，20081，1992.D′Halluin等，Bio/Technology10309-314，1992.Doyle等，J.Biol.Chem.，2619228-9238，1986.EglitisandAnderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988.EnderlinandOgrydziak，Yeast，1067-79，1994.Feinbaum等，Mol.Gen.Genet.，226449-456，1991.Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，804803，1983.FritsEckstein等，NucleicAcidsResearch，106487-6497，1982.Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985.Fromm等，Bio/Technology，8833，1990.Fuller等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438，1989.Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)11478-11482，1993.GethingandSambrook，Nature，35533-45，1992.Glick等，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)la.，1993.GrahamandVanderEb，Virology，54(2)536-539，1973.Greener等，Mol.Biotechnol.，7189-195，1997.Hartl等，TIBS，1920-25，1994.HersheyandStoner，PlantMol.Biol.，17679-690，1991.Hess，InternRev.Cytol.，107367，1987.Hinchee等，Bio/Technology，6915-922，1988.Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，751920，1978.Horsch等，Science，2271229-1231，1985.Ikatu等，Bio/Technol.，8241-242，1990.JaraiandBuxton，CurrentGenetics，262238-2244，1994.Jefferson(I)，PlantMol.Biol，Rep.，5387-405，1987.Jefferson(II)等，EMBOJ.，63901-3907，1987.JohnstonandTang，MethodsCellBiol.，43(A)353-365，1994.Jones等，Science，266789-793，1994.Jones等，Mol.Gen.Genet.，1987.Julius等，Cell，32839-852，1983.Julius等，Cell，371075-10-89，1984.Kares等，PlantMol.Biol.，15905，1990.Katz等，J.Gen.Microbiol.，1292703-2714，1983.Keegstra，Cell，56(2)247-253，1989.Keller等，EMBOL.，81309-1314，1989.Knutzon等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，892624-2628，1992.Kridl等，SeedSci.Res.，1209，1991.Kudla等，EMBO，91355-1364，1990.Kuhlemeier等，Seeds，1471，1989.Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82488-492，1985.KyteandDoolittle，J.Mol.Biol.，157105-132，1982.LamandChua，J.Biol.Chem.，26617131-17135，1990.LamandChua，Science，248471，1991.LipmanandPearson，Science，2271435-1441，1985.Lindstrom等，DevelopmentalGenetics，11160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caaacgcggtgttctctttggaaagcaaccatatcagcatatcacac660tatctagtctcttggatcacgcatgcgcaaccaaaagacaacacataaagtatcctttcg720aaagcaatgtccaagtccatcaaataaaattgagacaaaatgcaacctcaccccacttca780ctatccatggctgatcaagatcgccgcgtccatgtaggtctaaatgccatgcacatcaac840acgtactcaacatgcagcccaaattgctcaccatcgctcaacacatttcttgttaatttc900taagtacactgcctatgcgactctaactcgatcacaaccatcttccgtcacatcaatttt960gttcaattcaacacccgtcaacttgcatgccaccccatgcatgcaagttaacaagagcta1020tatctcttctatgactataaatgcccgcaatctcggtccaggttttcatcatcgagaact1080agttcaatatcctagtataccttaataaataatttaagatactatgatgagagcacggtt1140cccattactgttgctgggacttgttttcctggcttcagtttctgtctcatttggcattgc1200ttactgggaaaaagagaaccccaaacacaacaagtgtctccagagttgcaatagcgagag1260agactcgtacaggaaccaagcatgccacgctcgttgcaacctccttagatctccatgg1318<210>2<211>1724<212>DNA<213>大豆<400>2aagcttctgcagggtcgacggcccgggctggtctgtcttttcaatttttttggccacata60ttattcgggttctgtgaccttttcaaaatgactgctattacctcctgaccttgctattac120atcttgaccatcactaggcatttaaaagtattagtcatagtcacatattactacaaagcg180agattgatctctctaatctaatgggtgggaaaacacttataatatatgattcaagaaaag240aaagtaaataaaacaattttattatataaagactattaggataaaaaaaaccttaaaagt300gcttggatttggaccagacttgaattttaatttaatgatattataatatgtgaatatatt360tttgagacaattgtaaatttcagataaaaaaataatgtaattaaaattgtaataactata420tcgtatacctaattaattattaaatgtgacaaaaaagatatacatcaaaacttaatgttt480catgacttttttttttaatgtgtgtcctaaatagaaattaaaaataaaaattattatatc540caaatgaaaaaaacatttaatacgtattatttaagaaataacaatatatttatattttaa600tatgtattcacatgtaaatttaaaaacaaaaacaaaatttctcttttattgattaattaa660aataattttataactacatttattttctattattatcaattttcttctgtttttttattt720ggcatatatacctagacaagtcaaaaaatgactattctttaataatcaatcattattctc780acatattgttcgaactacgagttagtaagtgtcaattgcaccttagtgttttgataggcc840tccatttgccgctcattaattaatttgataacagccgtaccgatcaattacttatgcttc900ttccatcgtaattatatgcatgtcggttcttttaatcttggtactctcgaatgccaccac960aacactgactagtctcttggatcatgagaaaaagccaaagaacaaaaaagacaacataaa1020gagtatcctttgcaaaaaaatgtctaagttcataaaatacaaacaaaaacgcaatcacac1080acagtggacccaaaagccatgcacaacaacacgtactcaccaaggtgcaatcgtgctgcc1140caaaaacattcaccaactcaatccatgatgagcccacacatttgttgtttgtaaccaaat1200ctaaaacgcggtgttctctttggaaagcaaccatatcagcatatcacactatctagtctc1260ttggatcatgcatgcgcaaccaaaagacaacacataaagtatcctttcgaaagcaatgtc1320caagtccatcaaataaaattgagacaaaatgcaacctcaccccacttcactatccatggc1380tgatcaagatcgccgcgtccatgtaggtctaaatgccatgcacatcaacacgtactcaac1440atgcagcccaaattgctcaccatcgctcaacacatttcttgttaatttctaagtacactg1500cctatgcgactctaactcgatcacaaccatcttccgtcacatcaattttgttcaattcaa1560cacccgtcaacttgcatgccaccccatgcatgcaagttaacaagagctatatctcttcta1620tgactataaatacccgcaatctcggtccaggttttcatcatcgagaactagttcaatatc1680ctagtataccttaataaataatttaagatactagatctccatgg1724<210>3<211>1135<212>DNA<213>大豆<400>3aagcttctgcagggtcgacggcccgggctggtaaaaacaaaaacaaaatttctcttttat60tgattaattaaaataattttataactacatttattttctattattatcaattttcttctg120tttttttatttggcatatatacctagacaagtcaaaaaatgactattctttaataatcaa180tcattattcttacatattgttcgaactacgagttatgaagtgtcaattgcaccttagtgt240tttgataggcctccatttgccgctcattaattaatttgataacagccgtaccgatcaatt300cattatgcttcttccatcgtaattatatgcatgtcggttcttttaatcttggtactctca360aatgccaccacaacactgactagtctcttggatcatgagaaaaagccaaagaacaaaaaa420gacaacataaagagtatcctttgcaaaaaaatgtctaagttcataaaatacaaacaaaaa480cgcaatcacacacagtggacccaaaagccatgcacaacaacgcgtactcaccaaggtgca540atcgtgctgcccaaaaacattcaccaactcaatccatgatgagcccacacatttgttgtt600tgtaaccaaatctcaaacgcggtgttctctttggaaagcaaccatatcagcatatcacac660tatctagtctcttggatcacgcatgcgcaaccaaaagacaacacataaagtatcctttcg720aaagcaatgtccaagtccatcaaataaaattgagacaaaatgcaacctcaccccacttca780ctatccatggctgatcaagatcgccgcgtccatgtaggtctaaatgccatgcacatcaac840acgtactcaacatgcagcccaaattgctcaccatcgctcaacacatttcttgttaatttc900taagtacactgcctatgcgactctaactcgatcacaaccatcttccgtcacatcaatttt960gttcaattcaacacccgtcaacttgcatgccaccccatgcatgcaagttaacaagagcta1020tatctcttctatgactataaatgcccgcaatctcggtccaggttttcatcatcgagaact1080agttcaatatcctagtataccttaataaataatttaagatactagatctccatgg1135<210>4<211>918<212>DNA<213>大豆<400>4aagcttctgcagggtcgacggcccgggctggtcctccatttgccgctcattaattaattt60gataacagccgtaccgatcaattacttatgcttcttccatcgtaattatatgcatgtcgg120ttcttttaatcttggtactctcgaatgccaccacaacactgactagtctcttggatcatg180agaaaaagccaaagaacaaaaaagacaacataaagagtatcctttgcaaaaaaatgtcta240agttcataaaatacaaacaaaaacgcaatcacacacagtggacccaaaagccatgcacaa300caacacgtactcaccaaggtgcaatcgtgctgcccaaaaacattcaccaactcaatccat360gatgagcccacacatttgttgtttgtaaccaaatctcaaacgcggtgttctctttggaaa420gcaaccatatcagcatatcacactatctagtctcttggatcatgcatgcgcaaccaaaag480acaacacataaagtatcctttcgaaagcaatgtccaagtccatcaaataaaattgagaca540aaatgcaacctcaccccacttcactatccatggctgatcaagatcgccgcgtccatgtag600gtctaaatgccatgcacatcaacacgtactcaacatgcagcccaaattgctcaccatcgc660tcaacacatttcttgttaatttctaagtacactgcctatgcgactctaactcgatcacaa720ccatcttccgtcacatcaattttgttcaattcaacacccgtcaacttgcatgccacccca780tgcatgcaagttaacaagagctatatctcttctatgactataaatacccgcaatctcggt840ccaggttttcatcatcgagaactagttcaatatcctagtataccttaataaataatttaa900gatactagatctccatgg918<210>5<211>32<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<400>5aagcttctgcagggtcgacggcccgggctggt32<210>6<211>30<212>DNA<213>合成的構(gòu)建體<400>6cttctgatgaggtgggcgtgggaatgggaa30<210>7<211>3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