專利名稱：除草劑抗性的棉花植物及生產(chǎn)和鑒定其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，植物材料和種子，其特征在于在棉花基因組的特定位置包含特定的轉(zhuǎn)化事件，特別是存在編碼賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的棉花植物將除草劑抗性表型和在缺乏雜草壓力的情況下等同于非轉(zhuǎn)化棉花株系的農(nóng)藝性狀、遺傳穩(wěn)定性和對不同遺傳背景的適應(yīng)性結(jié)合在一起。
在此，并入這里所引用的所有文獻為參考文獻。
背景技術(shù)：
植物中轉(zhuǎn)基因的表型表達不僅取決于基因本身的結(jié)構(gòu)還取決于基因在植物基因組中的位置。同時，轉(zhuǎn)基因在基因組中不同位置的存在將以不同的方式影響植物的整體表型。通過遺傳操作向植物中引入商業(yè)有意義的性狀并在農(nóng)業(yè)或工業(yè)水平上獲得成功，這一過程由于不同的因素而可能是漫長的。遺傳轉(zhuǎn)化植物的實際轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一系列篩選步驟的第一步，所述一系列篩選步驟包括廣范的遺傳鑒定、育種和大田試驗的評估。
棉花纖維是世界上一種最重要的紡織原料。每年全球收獲大約8千萬英畝的棉花。在美國，按照面積產(chǎn)量，棉花是第五大農(nóng)作物，2000年種植的棉花超過1500萬英畝。主要的棉花雜草物種是番薯屬(Ipomoea sp.)(牽?；?，莧屬(Amaranthus spp.)(莧)，莎草屬(Cyperus spp.)(nutsedge)，蒼耳屬(Xanthium spp.)(蒼耳)和高梁屬(Sorghum spp.)(約翰遜草)。在可以用于生長中的棉花田的闊葉除草劑引入前，種植者利用非選擇性除草劑直接萌后施用，施用同時注意不讓除草劑接觸生長中的作物。因為這種施用要求雜草和農(nóng)作物高度的差異，所以該種施用方法不總是可行的。特別是對于小的棉花，該種施用費時，并且潛在地傷害農(nóng)作物。
bar基因(Thompson等，1987，EMBO J 62519-2523；Deblock等，.1987，EMBO J.62513-2518)是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的基因，當它在植物中表達時，賦予了對除草劑化合物膦絲菌素(也稱為草銨膦(glufosinate))或雙丙氨酰膦(也參見例如美國專利5,646,024和5,561,236)及其鹽和旋光異構(gòu)體的抗性。膦絲菌素控制闊葉雜草，包括牽牛花，并且具有廣譜應(yīng)用。
通過許多方法，包括棉花外植體的農(nóng)桿菌感染(Firoozabady等，1987，Plant Molecular Biology 10105-116；Umbeck等，1987，Bio/Technology5263-266和WO 00/71733，US 5,004,863，和US 5,159,135中)，及通過微粒轟擊棉花分生組織實現(xiàn)的直接基因轉(zhuǎn)移(Finer和Mc Mullen，1990，PlantCell Reports，5586-589；McCabe和Martinell，1993，Bio/Technology11596-598，WO92/15675，EP0 531 506)已經(jīng)獲得了棉花的成功遺傳轉(zhuǎn)化。已經(jīng)報道了利用Hansen等(1994，Proc.Nat.Acad.Sci.917603-7607)，Veluthambi等(1989，Journal of Bacteriology 1713696-3703)和WO00/71733所述方法可以增加農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率。
也已經(jīng)描述了用于棉花植物再生的不同方法(WO 89/05344，US5,244,802，US 5,583,036，WO 89/12102，WO98/15622，和WO97/12512)。
然而，前述文獻均未教導或提示本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，或者其種子、細胞或組織，它們包含穩(wěn)定整合進其基因組的包含除草劑抗性基因的表達盒子，該除草劑抗性基因含有bar基因編碼序列(如本文實施例1.1所述)，其中所述轉(zhuǎn)基因棉花棉物、其種子、細胞或組織不僅具有除草劑抗性，而且在缺乏雜草壓力的情況下與非轉(zhuǎn)基因等株系(isoline)具有實質(zhì)上等同的農(nóng)藝性狀。在雜草壓力和適當?shù)腖ibertyTM處理的情況下，該植物比非轉(zhuǎn)基因植物具有更優(yōu)良的農(nóng)藝表型。
在本發(fā)明的一個實施方式中，棉花植物或其種子、細胞或組織包含pGSV71表達盒子(如本文實施例1.1，表1所述)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，棉花植物或其種子、細胞或組織包含原種事件(elite event)EE-GH1。
在本發(fā)明另一個實施方式中，轉(zhuǎn)基因棉花植物或其種子、細胞或組織(i)在其基因組中包含事件EE-GH1；或(ii)包含事件EE-GH1，但條件是用于此事件的bar基因被替換成能在嚴格條件下與bar基因互補序列雜交的核酸序列。
更具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，其種子、細胞或組織，它們的基因組DNA可通過如下事實來表征當用分別指向EE-GH1的5’或3’側(cè)翼區(qū)和外源DNA的兩個引物，在如這里所述的PCR鑒定方法中分析所述基因組DNA時，可以產(chǎn)生針對EE-GH1的特異片段。優(yōu)選地，引物分別指向SEQ ID NO1內(nèi)的5’側(cè)翼區(qū)域和外源DNA；最優(yōu)選地，引物分別含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的核苷酸序列，并且產(chǎn)生250至290bp，優(yōu)選約269bp的DNA片段。
在ATCC已經(jīng)保藏了包含本發(fā)明原種事件的標準種子(referenceseed)，保藏號為PTA-3343。因此，本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式是包含原種事件EE-GH1的種子，該種子保藏在ATCC，保藏號為PTA-3343，該種子可以長成抗草銨膦的棉花植物。ATCC保藏號PTA-3343的種子是由約50％非轉(zhuǎn)基因核和50％轉(zhuǎn)基因核(對轉(zhuǎn)基因而言為半合子)組成的種批，其包含本發(fā)明的原種事件，該種子可以長成抗草銨膦的植物。如這里所述，可以播種種子，并且用PPT或LibertyTM處理生長的植物以獲得100％的包含本發(fā)明原種事件的草銨膦抗性植物。本發(fā)明進一步涉及來源于包含本發(fā)明原種事件的植物的細胞、組織、子代及后裔，其中所述植物由保藏在ATCC，具有保藏號PTA-3343的種子長成。本發(fā)明進一步涉及通過對包含本發(fā)明原種事件的棉花植物進行繁殖和/或育種可獲得的植物，其中所述棉花植物由保藏在ATCC，具有保藏號PTA-3343的種子長成。
本發(fā)明進一步涉及包含外源DNA序列，優(yōu)選地如這里所述的除草劑抗性基因的植物、種子、細胞或組織，所述外源DNA序列在包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4的植物DNA序列，更優(yōu)選地包含SEQ ID NO5的DNA序列或者在嚴格條件下與如下序列雜交的序列的區(qū)域中整合進入染色體DNA，其中所述如下序列是與包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO4和/或SEQID NO5的植物DNA序列的序列互補的序列。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花植物細胞的方法，該方法包括將重組DNA分子插入棉花細胞、組織或愈傷組織的染色體DNA區(qū)域，該染色體DNA區(qū)域包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4的植物DNA序列，或者包含能在嚴格條件下與如下序列雜交的序列，所述如下序列是與包含SEQID NO1和/或SEQ ID NO4的植物DNA序列的序列互補的序列。
本發(fā)明還涉及鑒定包含原種事件EE-GH1的轉(zhuǎn)基因植物或者其細胞或組織的方法，該方法以鑒定轉(zhuǎn)基因植物、細胞或組織中這種DNA序列編碼的特征DNA序列或氨基酸的存在為基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，這種特征DNA序列是15bp，優(yōu)選20bp，最優(yōu)選30bp或更長的序列，其包含事件的插入位點，即一部分外源DNA和與之鄰接的一部分棉花基因組(5’或3’側(cè)翼區(qū))，從而允許插入事件的特異鑒定。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，公開了DNA序列，其包含事件的插入位點及足夠長度的棉花基因組DNA和外源DNA(轉(zhuǎn)基因)多核苷酸，以致于可以用作EE-GH1檢測的引物或探針。優(yōu)選地，這種序列在插入位點的兩側(cè)分別包含EE-GH1的棉花基因組DNA的至少9個核苷酸和相似數(shù)目的外源DNA(轉(zhuǎn)基因)核苷酸。最優(yōu)選地，這種DNA序列包含在SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中與插入位點鄰接的棉花基因組DNA的至少9個核苷酸和相似數(shù)目的外源DNA核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，鑒定包含原種事件EE-GH1的轉(zhuǎn)基因植物或者其細胞或組織的方法包括利用聚合酶鏈式反應(yīng)，用至少兩個引物擴增生物樣品中存在的核酸序列，所述引物之一識別EE-GH1的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的植物DNA，另一個引物識別外源DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地，利用分別識別EE-GH1的植物5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，最優(yōu)選地SEQ ID NO1的植物DNA序列內(nèi)的序列和外源DNA內(nèi)的序列的引物分析基因組DNA。特別優(yōu)選地，根據(jù)這里所述的PCR鑒定方法分析基因組DNA，由此，識別5’側(cè)翼區(qū)中的序列的引物包含SEQ ID NO2的核苷酸序列。特別地，識別5’側(cè)翼區(qū)中的序列的引物包含SEQ ID NO2的核苷酸序列而識別外源DNA中的序列的引物包含SEQ ID NO3的核苷酸序列，由此，擴增的片段優(yōu)選是250至290bp，更優(yōu)選地是260至270bp，最優(yōu)選地是約269bp。
因此，本發(fā)明涉及根據(jù)上述EE-GH1鑒定方法可以鑒定的轉(zhuǎn)基因植物，其細胞或組織。
本發(fā)明涉及鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的方法，該方法以特異識別EE-GH1的5’和/或3’側(cè)翼序列的引物或探針為基礎(chǔ)。在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，這些方法以識別SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4中的序列的引物或探針為基礎(chǔ)，更特別地以包含SEQ ID NO2的序列的引物或探針為基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，這種方法以識別EE-GH1的特征序列的引物或探針為基礎(chǔ)，所述特征序列是包含事件插入位點的DNA序列，該序列包括足夠數(shù)量的5’或3’側(cè)翼DNA核苷酸和隨之的外源DNA核苷酸以致于可以用于事件的診斷。最特別地，這種方法以包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中足夠數(shù)量的5’或3’側(cè)翼DNA核苷酸和隨之的外源DNA核苷酸的序列為基礎(chǔ)。這種方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于Lyamichev等(1999，Nature Biotechn 17292-296)所述的方法。
本發(fā)明還涉及這里所述的EE-GH1的特異側(cè)翼序列，其可以用于開發(fā)生物樣品中EE-GH1的特異鑒定方法。更具體地，本發(fā)明涉及EE-GH1的5’和/或3’側(cè)翼區(qū)，其可以用于特異引物和探針的開發(fā)；并涉及從EE-GH1的5’和/或3’側(cè)翼序列及與其鄰接的插入位點開發(fā)的特異引物和探針。本發(fā)明還涉及基于這種特異引物或探針的使用來鑒定生物樣品中EE-GH1的存在的方法。
因此，本發(fā)明也涉及用于鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的試劑盒，該試劑盒包含至少一個特異識別EE-GH1的5’或3’側(cè)翼區(qū)的引物或探針。
優(yōu)選地，為了用在PCR鑒定方法中，本發(fā)明的試劑盒除了包含特異識別EE-GH1的5’或3’側(cè)翼區(qū)的引物外，還包含特異識別EE-GHI的外源DNA中的序列的第二引物。優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒包含兩個(或更多個)特異引物，其中一個引物識別EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，更優(yōu)選SEQID NO1的植物DNA區(qū)內(nèi)的序列，而另一個引物識別外源DNA內(nèi)的序列。特別優(yōu)選地，識別5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)植物DNA序列的引物包含SEQ ID NO2的核苷酸序列。特別地，識別5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)植物DNA序列的引物包含SEQ IDNO2的核苷酸序列而識別外源DNA的引物包含這里所述的SEQ ID NO1的核苷酸序列。
根據(jù)另一實施方式，本發(fā)明涉及用于鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少一個特異引物或者探針，該特異引物或探針具有與在嚴格條件下能和EE-GH1的特異或特征區(qū)雜交的序列相應(yīng)(或者互補)的序列。優(yōu)選地，探針序列相應(yīng)于包含一部分外源DNA和與之鄰接的EE-GH1的一部分5’或3’側(cè)翼區(qū)(植物DNA)的特異區(qū)域。最優(yōu)選地，特異探針包含(或者互補于)能在嚴格條件下與SEQ IDNO1或SEQ ID NO4內(nèi)跨越插入位點的15到30個核苷酸的序列雜交的序列，所述插入位點位于外源DNA的5’或3’區(qū)。特別優(yōu)選地，特異探針包含(或者互補于)能在嚴格條件下與SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中具有鄰接插入位點的9個植物DNA核苷酸和相似數(shù)目的外源DNA核苷酸的序列雜交的序列。根據(jù)一個特定的實施方式，這種引物包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中具有鄰接插入位點的9個植物DNA核苷酸和相似數(shù)目的外源DNA核苷酸的序列。
本發(fā)明包括的方法和試劑盒可以用于不同的目的，例如，但不限于鑒定植物、植物材料或產(chǎn)品，如，但不限于包含或來源于植物材料的食品或飼料產(chǎn)品(新鮮或加工的)中的EE-GH1。此外或者可替代地，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用于鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，從而使轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料分離；此外或者可替代地，本發(fā)明方法和試劑盒可以用于檢測包含EE-GH1的植物材料的質(zhì)量(即純材料的百分率)。
本發(fā)明還涉及在將原種事件EE-GH1引入不同品種中后跟蹤基因組中包含原種事件EE-GH1的植物的方法。
應(yīng)理解，可以通過這里引用的從屬權(quán)利要求描述本發(fā)明特定的實施方式。
附圖簡述可以結(jié)合并入此處的附圖作為參考，以理解通過舉例方式給出的下面的詳細描述，這些例子不意味著將本發(fā)明限制于所述的特定實施方式，其中

圖1利用EE-GH1 PCR鑒定方法對原種事件EE-GH1和其它事件的PCR分析。凝膠上樣順序泳道1分子量標準參照物(100bp梯)，泳道2來源于包含轉(zhuǎn)基因事件EE-GH1的棉花植物的DNA樣品，泳道3來源于包含另一個轉(zhuǎn)基因事件的棉花植物的DNA樣品，泳道4來源于野生型棉花的DNA，泳道5野生型+1拷貝BamHI消化的pGSV71(陽性對照)，泳道6陰性對照(沒有模板)，泳道8分子量標準參照物(100bp梯)。
優(yōu)選實施方式的詳述這里所用術(shù)語“基因”指包含幾個可操作連接的DNA片斷，如啟動子區(qū)、5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼區(qū)(其可以編碼或不編碼蛋白質(zhì))和包含聚腺苷酸化位點的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的任何DNA序列。通常在植物細胞中，5’UTR、編碼區(qū)和3’UTR轉(zhuǎn)錄為RNA，對于蛋白質(zhì)編碼基因而言，編碼區(qū)的RNA被翻譯為蛋白質(zhì)?；蚩梢园硗獾腄NA片段如，內(nèi)含子。如這里所用的基因座是植物基因組中給定基因的位置。
當術(shù)語“嵌合”指基因或DNA序列時，用于指包含至少兩個功能相關(guān)DNA片段(如啟動子、5’UTR、編碼區(qū)、3’UTR、內(nèi)含子)的基因或DNA序列，所述功能相關(guān)DNA片段在天然情況下不相關(guān)聯(lián)和/或來源于例如不同來源。與植物物種相對而言的“外源”基因或DNA序列被用于表示該基因或DNA序列不是在該植物物種中天然存在的，或者不是在該植物物種的所述基因座中天然存在的基因或DNA序列。這里術(shù)語“外源DNA”指通過轉(zhuǎn)化已經(jīng)摻入了植物基因組的DNA序列。這里所用的“轉(zhuǎn)化DNA”指用于轉(zhuǎn)化過程的重組DNA分子。轉(zhuǎn)化DNA通常包含至少一個“目的基因”(例如嵌合基因)，所述目的基因具有賦予被轉(zhuǎn)化的植物一種或多種特異特征的能力。術(shù)語“重組DNA分子”用于舉例說明并因此可包括分離的核酸分子，該分離的核酸分子可以是DNA并可以通過重組或其它方法獲得。
這里所用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指摻入植物基因組中的目的基因(或外源DNA的整體)?！稗D(zhuǎn)基因植物”指在所有細胞的基因組中都包含至少一個轉(zhuǎn)基因的植物。
優(yōu)選地，本發(fā)明植物中存在的外源DNA將包含除草劑抗性基因，更具體地是35S-bar基因作為目的基因。
這里所用的“除草劑抗性”基因指能賦予植物對除草劑的抗性的基因。除草劑抗性基因的例子是包含位于組成型啟動子控制下的編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的序列的基因，該酶可以解除膦絲菌素的毒性。更具體地，在本發(fā)明原種事件中，除草劑抗性基因包含花椰菜花葉病毒35S啟動子(Odell等，(1985)，Nature 313810-812)控制下的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)雙丙氨酰膦抗性基因(bar)的編碼序列(Thompson等.(1987)EMBO J 62519-2523)，這里也稱為“35S-bar”。35S-bar基因的表達賦予了對除草劑化合物膦絲菌素或雙丙氨酰膦或草銨膦或者更一般地谷氨酰胺合成酶抑制劑或者其鹽或旋光異構(gòu)體的抗性，該抗性這里通常稱為“草銨膦抗性”。
在“嚴格條件”下雜交意指Sambrook等(1989)(Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY)所述的常規(guī)雜交條件，該雜交條件例如可以包括下列步驟1)在濾膜上固定植物基因組DNA片斷，2)在42℃，50％甲酰胺、5XSSPE、2XDenhardt’試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時，或者在68℃，在6X SSC、2X Denhardt’試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時，3)加入標記的雜交探針，4)溫育16到24小時，5)在室溫，在1X SSC、0.1％SDS中洗濾膜20分鐘，6)在68℃，在0.2X SSC、0.1％SDS中洗濾膜3次，每次20分鐘，和7)在-70℃，用增感屏以濾膜曝光X射線膠片24到48小時。
植物基因組中重組DNA分子的摻入通常通過細胞、組織或愈傷組織的轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)(或由其它基因操作來實現(xiàn))。摻入的具體位點既可以是隨機的也可以是預先確定的位置(如果利用定向整合的方法)。
通過重組DNA或“轉(zhuǎn)化DNA”轉(zhuǎn)化植物細胞或組織而引入植物基因組中的DNA此后稱為“外源DNA”，其可以包含一個或多個“轉(zhuǎn)基因”。因此，外源DNA既可以包括重組DNA也可以包括新引入的重新排列的植物DNA。然而，本發(fā)明上下文中術(shù)語“植物DNA”指在相應(yīng)野生型植物的相同基因座中通常存在的植物DNA。
可以通過重組DNA分子在植物基因組中的摻入位點的位置和構(gòu)型來表征外源DNA。重組DNA分子在植物基因組中的插入位點也稱為“插入位點”或“靶位點”。重組DNA插入植物基因組中可能會涉及稱為“靶位點缺失”的植物DNA缺失。這里所用的“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”指至少20bp，優(yōu)選至少50bp，及多達5000bp的植物基因組序列，其位于外源DNA的緊上游并且鄰接外源DNA，或者其位于外源DNA的緊下游并且鄰接外源DNA。引起外源DNA隨機整合的轉(zhuǎn)化方法將產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，所述側(cè)翼區(qū)對每個轉(zhuǎn)化體都是特征性和獨特的。當通過傳統(tǒng)雜交方法(crossing)將轉(zhuǎn)基因植物中存在的重組DNA引入不同植物中時，重組DNA在植物基因組中的插入位點和它的側(cè)翼區(qū)通常將不會改變(除了由于突變或交換和轉(zhuǎn)座子引起的偶然改變外)。這里所用的“插入?yún)^(qū)”指對應(yīng)于至少40bp，優(yōu)選至少100bp，及多達10000bp以上的區(qū)域的區(qū)，其中，所述區(qū)域在(未轉(zhuǎn)化的)植物基因組中被包含外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列包圍(并且包含插入位點和可能的靶位點缺失)。考慮到由于物種內(nèi)突變引起的小差異，在該物種的具體植物中，插入?yún)^(qū)將保留同包含外源DNA的上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列至少85％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％的序列同一性。
目的基因的表達指基因賦予植物一種或多種表型性狀(例如，除草劑抗性)的事實，其中所述性狀的賦予旨在通過轉(zhuǎn)化期間所用的重組DNA分子——轉(zhuǎn)化DNA的引入(基于部分或所有目的基因的結(jié)構(gòu)和功能)來實現(xiàn)。
“事件”(也稱為轉(zhuǎn)化事件)定義為作為基因工程結(jié)果的(人工)基因座，其攜帶有包含至少一個目的基因拷貝的外源DNA。通過轉(zhuǎn)基因的表達可以在表型上表征事件。在遺傳水平上，事件是植物遺傳組成的一部分。在分子水平上，可以通過限制性圖譜(例如，通過Southern印跡測定)和/或通過外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼序列和/或包含轉(zhuǎn)基因的外源DNA的分子構(gòu)型來表征事件。通常，當用轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物細胞、組織或愈傷組織時，可產(chǎn)生大量事件，每個事件都是獨特的。
這里所用的“原種事件”是根據(jù)轉(zhuǎn)基因的表型表達和穩(wěn)定性，從通過用相同的轉(zhuǎn)化DNA進行轉(zhuǎn)化或與此轉(zhuǎn)化所導致的植物進行回交而獲得的一組事件中選出的事件，該事件將對包含它(即，選定的轉(zhuǎn)化事件)的植物的農(nóng)藝性狀不產(chǎn)生負面的影響。因此，原種事件的篩選標準是下面的一個或多個，優(yōu)選地為兩個或多個，有利地為下面的所有標準a)植物中外源DNA的存在不損害植物的其它期望特征，例如與農(nóng)藝性狀或商業(yè)價值有關(guān)的特征；b)事件可以通過十分明確的分子構(gòu)型來表征，而且所述分子構(gòu)型能穩(wěn)定遺傳，并且可以針對該分子構(gòu)型開發(fā)出適當?shù)脑\斷手段以實現(xiàn)事件身份的控制；c)在事件以純合子形式存在的情況下，目的基因顯示出適當?shù)那曳€(wěn)定的空間和時間表型表達，這種表型表達在一系列環(huán)境中均可以達到商業(yè)上可接受的水平，其中所述環(huán)境為帶有該事件的植物于正常的農(nóng)業(yè)應(yīng)用中所可能接觸到的一系列環(huán)境。
優(yōu)選外源DNA與植物基因組中的如下位置相關(guān)，所述植物基因組位置允許外源DNA漸滲進入期望的商業(yè)遺傳背景。
通過原種事件在不同相關(guān)遺傳背景中的漸滲現(xiàn)象和所觀察到的事件對上述一個、兩個或所有標準(例如上述a)，b)和c))的滿足情況可以確認作為原種事件的事件狀態(tài)。
因此，“原種事件”指滿足上述標準的包含外源DNA的基因座。植物、植物材料或子代如種子在其基因組中可以包含一個或多個原種事件。因此，當涉及在其基因組中包含原種事件EE-GH1的植物、種子細胞或組織時，意指植物、種子細胞或組織包含這里所述的外源DNA(包含35S-bar基因)，該外源DNA通過這里所述的整合位點整合在基因組中。
可以基于原種事件特異的基因組特征開發(fā)用于鑒定原種事件或包含原種事件的植物或植物材料或包含含有原種事件的植物材料的產(chǎn)品的手段，所述特異基因組特征是例如包含外源DNA的基因組區(qū)的特異限制性圖譜、分子量標準參照物或外源DNA的側(cè)翼區(qū)序列。
一旦測序了外源DNA的一個或兩個側(cè)翼區(qū)，就可以通過分子生物學技術(shù)，研制特異識別樣品核酸(DNA或RNA)中的這個(這些)序列的引物和探針。例如可以開發(fā)PCR方法以鑒定生物樣品(如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品)中的原種事件。這種PCR以至少兩個特異性“引物”為基礎(chǔ)，其中一個引物識別原種事件的5’或3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個引物識別外源DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地，引物有15至35個核苷酸的序列，在優(yōu)化的PCR條件下，該引物分別“特異識別”原種事件的5’或3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列和外源DNA內(nèi)的序列，以致從包含原種事件的核酸樣品可以擴增出特異性片段(“整合片段”)。這意味著在優(yōu)化的PCR條件下僅僅擴增定向整合片段，而不擴增植物基因組或外源DNA中(該大小的)其它序列。
優(yōu)選地，整合片段有50至500個核苷酸長，最優(yōu)選地100至350個核苷酸長。優(yōu)選地，特異性引物分別具有與原種事件的5’或3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列和原種事件的外源DNA內(nèi)序列有80％至100％同一性的序列，前提是錯配仍舊允許在優(yōu)化的PCR條件下實現(xiàn)原種事件的特異鑒定。然而，可允許的錯配范圍可以容易地實驗測定，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
因為用于原種事件的引物序列和它們識別的基因組序列是獨特的，所以將僅僅在包含原種事件(核酸)的生物樣品中出現(xiàn)整合片段的擴增。優(yōu)選地，當利用PCR鑒定未知樣品中EE-GH1的存在時，包括如下一套對照引物在內(nèi)，所述對照引物可以擴增包含事件的植物物種的“持家基因”內(nèi)的片段。持家基因是在大多數(shù)細胞類型中表達的基因，其與所有細胞共有的基本代謝活動有關(guān)。優(yōu)選地，從持家基因擴增的片段是比擴增的整合片段大的片段。根據(jù)待分析的樣品的不同，可以包括其它對照。
在現(xiàn)有技術(shù)中已描述了標準的PCR方法，參見如＇PCR ApplicationsManual″(Roche Molecular Biochemicals，第二版，1999)。在“PCR鑒定方法”中詳述了每個原種事件的最佳PCR條件，包括特異性引物的序列。然而，可以理解，為適應(yīng)具體的實驗室條件，可能需要調(diào)整PCR鑒定方法中的多個參數(shù)，并且可以稍微修改這些參數(shù)以獲得相似的結(jié)果。例如，針對不同的DNA制備方法的應(yīng)用，可能需要調(diào)整例如所用引物及聚合酶的量和退火條件。相似地，其它引物的選擇也可能為PCR鑒定方法規(guī)定其它的最適條件。然而，這些調(diào)整對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且在目前的PCR應(yīng)用指南如上述指南中詳述了這些調(diào)整。
可替代地，可以利用特異性引物擴增整合片段，該整合片段可以用作鑒定生物樣品中EE-GH1的“特異性探針”。在允許探針與生物樣品核酸中的對應(yīng)片段雜交的條件下，用探針接觸生物樣品的核酸，將引起核酸/探針雜交體的形成。可以檢測該雜交體的形成(例如，標記核酸或探針)，由該雜交體的形成指示EE-GH1的存在?，F(xiàn)有技術(shù)中已描述了(在固相載體上或溶液中)基于與特異性探針的雜交的這種鑒定方法。優(yōu)選地，特異性探針是在優(yōu)化的條件下能特異地與包含原種事件的部分5’或3’側(cè)翼區(qū)以及與之鄰接的部分外源DNA的區(qū)域(此后也稱為事件的“特異區(qū)域”)雜交的序列。根據(jù)所用的方法，這種特異性探針可以包含15至30bp或50至500bp，優(yōu)選100至350bp的序列，所述序列在嚴格條件下能與特異區(qū)域的核苷酸序列(或這種序列的互補序列)雜交。優(yōu)選地，特異性探針將包含與原種事件特異區(qū)域相同(或互補)的約15到約100個連續(xù)核苷酸的序列。最優(yōu)選地，這種探針包含至少9個與3’或5’側(cè)翼區(qū)相同(或互補)的核苷酸和相似數(shù)目的與之鄰接的外源DNA中的核苷酸。最優(yōu)選地，這種探針包含至少9個與SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的3’或5’側(cè)翼區(qū)相同(或互補)的核苷酸和相似數(shù)目的在SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中與之鄰接的外源DNA核苷酸。
這里所用的“限制性圖譜”指用一個或一組特定限制性酶切割植物基因組DNA(和/或包含于其內(nèi)的外源DNA)，并且與探針在標準嚴格條件下雜交后獲得的一組Southern印跡圖，其中所述探針與外源DNA具有序列相似性。這里所用的標準嚴格條件指本文所述的雜交條件或指Sambrook等.(1989)(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbour Laboratory Press，NY)所述的常規(guī)雜交條件，該雜交條件例如可以包括下列步驟1)在濾膜上固定植物基因組DNA片斷，2)在42℃，50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhardt’試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時，或者在68℃，在6X SSC，2X Denhardt試劑和0.1％SDS中預雜交濾膜1到2小時，3)加入標記的雜交探針，4)溫育16到24小時，5)在室溫，在1X SSC，0.1％SDS中洗濾膜20分鐘，6)在68℃，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗濾膜3次，每次20分鐘，和7)在-70℃，用增感屏以濾膜曝光X射線膠片24到48小時。
由于在外源DNA摻入前植物基因組中存在(內(nèi)源)限制性位點，故外源DNA的插入將改變該基因組的特異限制性圖譜。因此，可以通過一個或多個特異限制性譜鑒定特定的轉(zhuǎn)化體或源于其的子代。
可替代地，可以根據(jù)PCR鑒定方法，通過實驗鑒定包含原種事件的植物或植物材料。所述PCR是特異識別原種事件的PCR。實質(zhì)上，可以開發(fā)一套PCR引物，其識別a)原種事件3’或5’側(cè)翼序列內(nèi)的序列和b)外源DNA內(nèi)的序列，其中引物擴增優(yōu)選100至300個核苷酸的片段(整合片段)。優(yōu)選地，包括一套可以擴增該植物物種“持家基因”內(nèi)的片段(優(yōu)選比擴增的整合片段大的片段)的對照引物。在“PCR鑒定方法”中詳述了最適PCR條件，包括特異性引物的序列。
本發(fā)明也設(shè)想到鑒定包含原種事件EE-GH1的植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的其它方法。這些方法包括基于用特異性探針檢測原種事件的側(cè)翼序列和外源DNA序列的所有方法。更具體地，設(shè)想了基于芯片的技術(shù)，如Hacia等.1996 (Nat Genet 14(4)441-447)和Shoemaker等.1996(Nat Genet 14(4)450-456)所述的方法。這些方法通過利用固定的探針陣列或通過用寡核苷酸給基因加尾，隨后通過雜交進行篩選，允許以高密度陣列形式分離靶分子。作為備選方案，設(shè)想到third wave檢測方法，如Lyamichev等.(1999，上引文)描述的方法。
通過現(xiàn)有技術(shù)中描述的經(jīng)典蛋白質(zhì)檢測方法，如基于蛋白質(zhì)的層析或電磁特性或基于特異單克隆抗體的檢測的那些方法(如在“Guide to proteinpurification”，Murray P.Deutscher編者中所述)可以完成原種事件的外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)的鑒定。
這里所用“試劑盒”指用于實施本發(fā)明方法，更具體地，用于生物樣品中原種事件EE-GH1鑒定的一套試劑。更特別地，本發(fā)明試劑盒優(yōu)選的實施方式包含至少一個或兩個上述特異性引物。任選地，試劑盒可以進一步包含這里所述的PCR鑒定方法中的任何其它試劑。
可替代地，根據(jù)本發(fā)明另一個實施方式，試劑盒可以包含上述特異性探針，所述探針可以與生物樣品的核酸特異性雜交以鑒定其中存在的EE-GH1。任選地，該試劑盒可以進一步包含利用特異性探針鑒定生物樣品中EE-GH1時用到的其它任何試劑(例如，但不限于雜交緩沖液，標記物)。
可以利用本發(fā)明試劑盒，并且可以具體地調(diào)整其成分，以實現(xiàn)質(zhì)量控制(例如種批的純度)或植物材料或者包含或源于植物材料的材料(如，但不限于食品或飼料產(chǎn)品)中原種事件的檢測。
本發(fā)明涉及棉花中原種事件EE-GH1的開發(fā)，涉及包含該事件的植物及從這些植物獲得的子代及源于該事件的植物細胞或者植物材料。如實施例1中所述，通過用pGSV71轉(zhuǎn)化獲得了包含原種事件EE-GH1的植物。
根據(jù)本文實施例4中所述的EE-GH1的PCR鑒定方法可以鑒定包含EE-GH1的棉花植物或植物材料。簡而言之，用特異識別EE-GH1之5’或3’側(cè)翼序列內(nèi)的序列的引物，特別是具有SEQ ID NO2的序列的引物和識別外源DNA內(nèi)的序列的引物，特別是具有SEQ ID NO3的序列的引物，通過PCR擴增棉花基因組DNA。利用內(nèi)源棉花DNA引物作為對照。如果植物材料產(chǎn)生250至290bp，優(yōu)選約269bp的片段，則可以確定該棉花植物含有原種事件EE-GH1。
含有EE-GH1的植物可以通過其草銨膦抗性來表征，在本發(fā)明上下文中，草銨膦抗性包括植物對除草劑LibertyTM的抗性。可以用不同方式檢測對LibertyTM的抗性。當希望鑒定抗性和敏感性植物，但是不想殺死敏感性植物時，本文所述的葉片涂抹方法是最有用的?？商娲兀梢酝ㄟ^LibertyTM噴霧施用檢測抗性。為了得到最好結(jié)果，應(yīng)該在V3和V4葉期(leaf stage)之間進行噴霧處理。通過用至少200g活性組分/公頃(g.a.i./ha)，優(yōu)選400g.a.i./ha，和可能地多達1600g.a.i./ha(4X正常大田比率)進行植物噴霧而不殺死植物的事實來表征抗性植物。撒施應(yīng)該以28-34盎司LibertyTM的比率進行。最好利用扇形霧噴嘴，以每英畝20加侖水體積施用，同時注意不要直接噴霧至植物的輪生體內(nèi)以避免葉片上表面活性劑灼燒。除草劑的作用應(yīng)該在48小時內(nèi)出現(xiàn)，并且在5-7天內(nèi)清楚可見。
此外，可以通過植物細胞中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在來表征含有EE-GH1的植物，其中可以通過PAT測定法測定所述膦絲菌素乙烯轉(zhuǎn)移酶的存在(De Block等，1987，上引文)。
例如，可以通過保藏在ATCC，保藏號為PTA-3343的種子獲得含有EE-GH1的植物，所述種子含有50％的對原種事件而言為半合子的核?？梢赃M一步繁殖這種植物以將本發(fā)明原種事件引入相同植物物種的其它品種中。從這些植物獲得的選定的種子將包含穩(wěn)定摻入它們基因組的原種事件。本發(fā)明還涉及包含EE-GH1、來源于ATCC保藏號PTA-3343的植物。這里的術(shù)語“來源于”表示植物是相關(guān)的，即它們都是通過雜交來自相同轉(zhuǎn)化體的子代(直接的子代或兩代或更多代后的子代)。
在無雜草壓力和不使用LibertyTM進行雜草控制的情況下，也可以通過植物所具有的與美國商業(yè)棉花品種可比較的農(nóng)藝特征來表征含有EE-GH1的植物。已經(jīng)觀察到在本文所述的棉花植物基因組插入?yún)^(qū)中存在外源DNA可以賦予包含這種事件的植物特別有意義的表型和分子特征。更具體地，外源DNA在這些植物基因組的該特定區(qū)域中的存在可以使植物顯示出目的基因的穩(wěn)定表型表達，而又不顯著地損害植物的任何期望農(nóng)藝性狀。由此，證明與包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4的植物DNA的序列對應(yīng)的插入?yún)^(qū)域，更優(yōu)選與SEQ ID NO5相應(yīng)序列對應(yīng)的插入?yún)^(qū)域，最優(yōu)選與其中的EE-GH1插入位點相對應(yīng)的插入?yún)^(qū)域特別適于目的基因的引入。更特別地，EE-GH1的插入?yún)^(qū)域(對應(yīng)于SEQ ID NO5內(nèi)至少40bp的棉花基因組DNA序列，或在嚴格條件下與SEQ ID NO5的互補序列雜交的至少40bp序列)特別適于包含除草劑抗性基因的外源DNA的引入，在該區(qū)域的引入可以確保這些基因能在植物中表達而不損害農(nóng)藝性狀。
通過定向插入方法可以在插入?yún)^(qū)域特異地插入重組DNA分子。這種方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且包括，例如利用重組酶如，但不限于來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重組酶(公開的PCT申請WO 99/25821)、來源于大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體P1的CRE重組酶(公開的PCT申請WO 99/25840)、來源于Saccharomyces rouxii的pSR1的重組酶(Araki等.1985，J Mol Biol 182191-203)、噬菌體Mu的Gin/gix系統(tǒng)(Maeser和Kahlmann，1991，Mol Gen Genetics 230170-176)或者λ噬菌體重組系統(tǒng)(如美國專利4,673,640中所述)的同源重組。
這里所用的“序列同一性”當涉及核苷酸序列(DNA或RNA)時指具有相同核苷酸的位置的數(shù)目除以兩個序列中較短序列的核苷酸數(shù)目。利用20個核苷酸的視窗大小、4個核苷酸的字長及空位罰分4，通過Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983，Proc Nat Acad Sci USA80726)進行兩個核苷酸序列的比對?？梢岳缋肳isconsin包的程序(來源于Genetics Computer Group，Inc)方便地進行計算機輔助的分析和序列數(shù)據(jù)的解釋，包括上述的序列比對。當序列具有至少約75％，特別是至少約80％，更特別是至少約85％，十分特別是約90％，尤其是約95％，更尤其是約100％序列同一性，且非常尤其是當序列相同時，該序列被稱為“基本相似”。當說RNA序列與DNA序列基本相似或有一定程度的序列同一性時，很清楚的是，將DNA序列中的胸腺嘧啶(T)與RNA序列中的尿嘧啶(U)視為等同。這里所用的“互補于”指核苷酸序列中A和T(U)，及G和C核苷酸間的互補性。
這里所用的“生物樣品”是植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品。術(shù)語“植物”意指包括處于任何成熟階段的棉花(如，但不限于陸地棉(Gossypium hirsutum))植物組織，及取自或源于任何這種植物的細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉片、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。這里所用的“植物材料”指從植物獲得或源于植物的材料。包含植物材料的產(chǎn)品涉及用植物材料生產(chǎn)或者可能被植物材料污染的食品，飼料或其它產(chǎn)品?？梢岳斫?，在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選檢測這種生物樣品中EE-GH1特異性核酸的存在，意即樣品中核酸的存在。因此，這里提到的鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的方法優(yōu)選涉及對生物樣品中包含原種事件的核酸的鑒定。
這里所用的“包含”被解釋為規(guī)定了所提到的特征、整數(shù)、步驟或成分的存在，但是不排除一個或多個特征，整數(shù)、步驟或成分或其組合的存在或添加。因此，例如包含數(shù)個核苷酸或氨基酸的核酸或蛋白質(zhì)可以包含比實際提到的更多的核苷酸或氨基酸，即處于更大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含功能或結(jié)構(gòu)明確的DNA序列的嵌合基因也可以包含另外的DNA序列，等等。
下面的實施例描述了含有原種事件EE-GH1的棉花植物的產(chǎn)生和特征，及用于生物樣品中原種事件EE-GH1鑒定的工具的開發(fā)。
除非另有敘述，否則根據(jù)Sambrook等.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY和Ausubel等，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA第1和2卷中所述的標準方法實施所有重組DNA技術(shù)。在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK出版的，R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子工作的標準材料和方法。
在說明書和實施例中，涉及到下列序列SEQ ID NO1含有5’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID NO2引物GHI06SEQ ID NO3引物GHI05SEQ ID NO4含有3’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID NO5插入?yún)^(qū)域SEQ ID NO6質(zhì)粒pGSV71SEQ ID NO7質(zhì)粒pRVA44SEQ ID NO8 引物MDB327SEQ ID NO9引物MLD015SEQ ID NO10 引物MLD016SEQ ID NO11 引物MDB612SEQ ID NO12 物MDB053SEQ ID NO13 引物MDB356SEQ ID NO14 引物DPA017SEQ ID NO15 引物MLD019SEQ ID NO16 包含靶位點缺失的序列SEQ ID NO17 引物GHI01SEQ ID NO18 引物GHI02實施例實施例1用除草劑抗性基因轉(zhuǎn)化棉花1.1包含組成型啟動子控制下的bar基因的嵌合DNA的構(gòu)建按照標準方法構(gòu)建質(zhì)粒pGSV71，表1中給出了質(zhì)粒pGSV71的遺傳元件的順序(SEQ ID NO6)
表1pGSV71中遺傳元件的核苷酸位置

1.2.陸地棉(Gossypium hirsutum)的轉(zhuǎn)化利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(US 5,986,181)，用pGSV71轉(zhuǎn)化Coker312植物的棉花組織，并且在適當培養(yǎng)基中再生成植物。
轉(zhuǎn)移選擇性再生培養(yǎng)基上出現(xiàn)的小植物到新的萌發(fā)培養(yǎng)基上(所有培養(yǎng)基都無激素)。然后轉(zhuǎn)移幼苗到生長室或溫室中。
除了幼苗再生外，在所有其它階段在膦絲菌素(PPT)上進行篩選，而幼苗再生為加速生長是在缺乏PPT的情況下進行的。這產(chǎn)生了一組初級的轉(zhuǎn)化體(T0代植物)。
實施例2事件的開發(fā)2.1.帶有事件性狀的株系的開發(fā)將T0小苗轉(zhuǎn)移到溫室土壤，用PAT ELISA(Steffens BiotechnischeAnalysen GmbH，Ebringen，Germany)篩選植物的PAT酶的存在并篩選植物的草銨膦抗性。
在溫室中生長T1到T3植物，以2X的比率(通過噴霧56盎司/ha)檢測LibertyTM抗性。利用Deblock等.1987(EMBO J.62513-2518)所述的Pat測定法檢測陽性植物的bar基因表達。
通過Southern印跡分析檢查外源DNA的存在和拷貝數(shù)。根據(jù)Doyle等(1987，Phytochem.Bull.1911)的CETAB方法從1g葉片組織分離總基因組DNA，并且用EcoRI限制酶消化總基因組DNA。
如下的探針用于Southern分析“bar”探針質(zhì)粒pDE110(WO 92/09696)的474bp KpnI-BglI消化物“35S”探針質(zhì)粒pRVA44(SEQ ID NO7)的892bp NcoI-MunI消化物此外，與非轉(zhuǎn)基因的等基因系比較評估了T2植物總的表型特征。在以后的子代中，與野生型比較，篩選了如下株系，所述株系在存在半合子或純合子形式的轉(zhuǎn)基因的情況下未觀察到表型或農(nóng)藝性狀受到負面影響。
在大田中生長T4材料，根據(jù)不同程序，在大田條件下檢測LibertyTM抗性。
在之后的子代中，比較植物和商業(yè)品種的產(chǎn)量、纖維質(zhì)量和植物圖譜數(shù)據(jù)。評估農(nóng)藝特征，如植物高度、節(jié)高、棉鈴保留、直立、茁壯長勢、纖維長度、纖維強度和棉絨產(chǎn)量。
確定了一個事件有等同或好于相應(yīng)審核標準(check)的表現(xiàn)，并且確定了對于該事件而言產(chǎn)量取決于背景而不是轉(zhuǎn)基因的存在。
2.2.原種事件的篩選該篩選方法產(chǎn)生了一個原種事件，該原種事件顯示了35S-bar基因的最佳表達，即對草銨膦的抗性，而對農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量沒有損害。該原種事件命名為EE-GH1。
2.3.在具有不同遺傳背景和位于不同區(qū)域的棉花品種中檢測EE-GH1
將選定的事件引入不同商業(yè)遺傳背景中，包括FM989，F(xiàn)M832，F(xiàn)M958和FM966，并且比較4個不同場所的大田試驗結(jié)果。利用不同的處理(1x3-5葉期，4x，3-5葉期，1x+1x，3-5葉期，4x+4x，3-5葉期，0作為對照)，用1600g.a.i./ha噴霧植物。
原種事件的出苗率和活力評定非常好。
不管施用除草劑時植物發(fā)育的速率和階段如何，在施用后，從來沒有觀察到可見的因除草劑施用引起的損害。除草劑施用對植物的形態(tài)學和生長習性均沒有有害的影響。
而且，在多種遺傳背景中，事件具有正常的葉、花和棉鈴形態(tài)學，優(yōu)良的能育性，并且未顯示出疾病或異常的昆蟲敏感性。在向多種遺傳背景的漸滲過程中，經(jīng)過4代沒有觀察到異常的問題或反常。
2.4.基因座的遺傳分析經(jīng)過幾代在子代植物中，通過分子和表型分析檢查EE-GH1事件的插入的遺傳穩(wěn)定性。
對于EE-GH1事件，比較了T1、T2和T3代植物的Southern印跡分析。發(fā)現(xiàn)獲得的印跡圖在不同代中是相同的。這證明EE-GH1中外源DNA的分子構(gòu)型是穩(wěn)定的。
在至少隨后3代中，EE-GH1事件作為單基因座顯示了轉(zhuǎn)基因的孟德爾分離，表明該插入是穩(wěn)定的。
實施例3原種事件EE-GH1的表征3.1.基因座的深入分子和遺傳分析在鑒定EE-GH1事件為獲得了最佳的轉(zhuǎn)基因表達和整體農(nóng)藝性狀的事件之后，在分子水平上詳細分析轉(zhuǎn)基因的基因座。這包括轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)的測序。
利用Liu等.(1995，Plant .J.8(3)457-463)所述的TAIL-PCR方法，檢測EE-GH1事件中插入的轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼區(qū)域的序列。
a)5’側(cè)翼區(qū)的檢測所用引物是

其中，N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T利用MDB327-GHI05擴增的片段是用于測序的約1200bp(5’側(cè)翼SEQ ID NO1)。在bp1和bp677間的序列包含植物DNA，而bp678和bp850間的序列對應(yīng)于pGSV71DNA。
b)3’側(cè)翼區(qū)的檢測所用引物是

其中，N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T利用MDB612-DPA017擴增的片段是約400bp，測定了其完整的序列(SEQ ID NO4)。核苷酸第1位和179位間的序列對應(yīng)于T-DNA，而核苷酸第180位和426位間的序列對應(yīng)于植物DNA。
c)靶位點缺失的鑒定利用對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的引物，以野生型陸地棉(Gossypiumhirsutum)作為模板，鑒定轉(zhuǎn)基因的插入位點。
利用下面的引物序列(5’→3’) 5’側(cè)翼中位置3’側(cè)翼中位置(SEQ ID NO1) (SEQ ID NO4)TTg.CAC.CAT.CTA.gCT.CAC.TC 815→795 -----GHI06(SEQ ID NO2)CAA.gAT.gCg.AgC.AAC.TAMLD019 -----285→266T.gT(SEQ ID NO15)這產(chǎn)生了200bp的片段(SEQ ID NO16)，其中bp85到122對應(yīng)于靶位點缺失。
因此，所測序的插入?yún)^(qū)(SEQ ID NO5)包含1-677 5’側(cè)翼區(qū) SEQ ID NO1的bp1到677678-714靶位點缺失SEQ ID NO16的bp85到122715-9163’側(cè)翼區(qū) SEQ ID NO4的bp180到4263.2基因座的遺傳分析經(jīng)過幾代在子代植物中進行分子和表型分析從而檢測了插入的遺傳穩(wěn)定性。比較了T0、T1和T2代EE-GH1棉花植物的草銨膦抗性植物的Southern印跡分析，發(fā)現(xiàn)它們是相同的。這證明在含有EE-GH1的植物中轉(zhuǎn)基因的分子構(gòu)型是穩(wěn)定的。
在至少隨后3代中，EE-GH1事件作為單基因座顯示了轉(zhuǎn)基因的孟德爾分離，表明該插入是穩(wěn)定的。
在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，鑒定EE-GH1為原種事件。
實施例4用于事件身份控制的診斷工具的開發(fā)已開發(fā)EE-GH1原種事件PCR鑒定方法以鑒定植物、植物材料或生物樣品中EE-GH1的存在。
EE-GH1原種事件聚合酶鏈式反應(yīng)鑒定方法在試圖篩選未知樣品以前必須利用所有適當對照進行試行實驗。本方法可能需要針對實驗室間可能存在差異的成分進行優(yōu)化(所述成分為模板DNA制備，Taq DNA聚合酶，引物的質(zhì)量，dNTP，熱循環(huán)儀等)。
內(nèi)源序列的擴增在該方法中起了重要作用。人們必須獲得能擴增已知轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板中等摩爾量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因序列的PCR和熱循環(huán)條件。如果通過瓊脂糖凝膠電泳判定，沒有擴增出靶內(nèi)源片段或擴增出的靶序列不具有相同的溴乙錠染色強度，則可能需要進行PCR條件的優(yōu)化。
模板DNA根據(jù)Doyle和Doyle(1987，Phytochem.Bull.1911)所述的CTAB方法制備模板DNA。當利用通過其它方法制備的DNA時，應(yīng)該利用不同量模板進行試行實驗。通常50ng基因組模板DNA產(chǎn)生最好的結(jié)果。
指定陽性和陰性對照下面的陽性和陰性對照應(yīng)該包括在PCR運行中-母混合物對照(DNA陰性對照)。這是沒有向反應(yīng)中添加DNA的PCR。當觀察到預期結(jié)果，即沒有PCR產(chǎn)物時，表明靶DNA沒有污染此PCR混合物。
-DNA陽性對照(已知含有轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。該陽性對照的成功擴增證明PCR是在允許靶序列擴增的條件下進行的。
-野生型DNA對照。這是所提供的模板DNA是從非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA的PCR。當觀察到預期結(jié)果，即沒有轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的擴增，但是有內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴增時，表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測的轉(zhuǎn)基因背景擴增。
引物利用下面特異識別轉(zhuǎn)基因和EE-GH1側(cè)翼序列的引物

靶向內(nèi)源序列的引物總是被包含在PCR混合物中。這些引物在未知樣品和DNA陽性對照中起到內(nèi)對照的作用。內(nèi)源引物對的陽性結(jié)果證明在基因組DNA制品中有充足DNA，該DNA質(zhì)量足以用于產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
所用的內(nèi)源引物是GHI015’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’(SEQ ID NO17)(醇脫氫酶基因Acc.NOAF036569，1070→1090)GHI025’-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3’(SEQ ID NO18)(醇脫氫酶基因Acc.NOAF036569，1515→1495)擴增的片段PCR反應(yīng)中預期的擴增片段是對于引物對GHI01-GHI02445bp(內(nèi)源對照)對于引物對GHI05-GHI06269bp(EE-GH1原種事件)PCR條件50μl反應(yīng)的PCR混合物包含5μl模板DNA
5μl 10x擴增緩沖液(與Taq聚合酶一起提供)1μl 10mM dNTP0.5μl GHI01(10pmoles/μl)0.5μl GHI02(10pmoles/μl)1μl GHI05(10pmoles/μl)1μlGHI06 (10pmoles/μl)0.2μl Taq DNA聚合酶(5單位/μl)加水到50μl下面是獲得最佳結(jié)果的熱循環(huán)模式95℃，4分鐘接著 95℃，1分鐘57℃，1分鐘72℃，2分鐘5個循環(huán)接著 92℃，30秒57℃，30秒72℃，1分鐘25個循環(huán)接著 72℃，5分鐘瓊脂糖凝膠分析在1.5％瓊脂糖凝膠上(Tris-硼酸鹽緩沖液)上樣適當分子量標準參照物(例如，100bp序列梯PHARMACIA)和10至20μl PCR樣品。
結(jié)果的確認除了1)DNA陽性對照顯示預期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因片段和內(nèi)源片段)，2)DNA陰性對照為PCR擴增陰性(沒有片段)和3)野生型DNA對照顯示預期的結(jié)果(內(nèi)源片段擴增)外，不應(yīng)該接受來源于單次PCR運行和單一PCR混合物的有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品的數(shù)據(jù)。
顯示出預期大小的可見量轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明用于制備該基因組模板DNA的相應(yīng)植物遺傳了EE-GH1原種事件。沒有顯示出可見量轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物但顯示了可見量內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明用于制備該基因組模板DNA的相應(yīng)植物不含有原種事件。沒有顯示可見量內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的泳道表明該基因組DNA的質(zhì)和/或量不允許PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。這些植物不能被計算在內(nèi)。應(yīng)該重復基因組DNA的制備并且必須利用適當對照進行新的PCR運行。
應(yīng)用區(qū)別PCR方法來鑒定EE-GH1根據(jù)上述方法檢測來源于包含不同轉(zhuǎn)基因事件的棉花植物的葉片材料(樣品1到4)。來源于野生型棉花的樣品作為陰性對照。
在圖1中示例了PCR分析的結(jié)果。樣品1被辨別出包含原種事件EE-GH1。所用其它受試株系不包含該原種事件。
實施例5EE-GH1向優(yōu)選品種中的漸滲通過重復回交將原種事件EE-GH1引入下面商業(yè)棉花品種FM5013，F(xiàn)M5015，F(xiàn)M5017，F(xiàn)M989，F(xiàn)M832，F(xiàn)M966和FM958中。
觀察到轉(zhuǎn)基因的表達通過草銨膦抗性測定滿足了商業(yè)可接受的水平，并觀察到原種事件向這些品種中的漸滲未顯著影響這些品種的任何期望表型和農(nóng)藝特征(無連鎖拖累(linkage drag))。這證實了事件EE-GH1作為原種事件的狀態(tài)。
如下面權(quán)利要求中所用，除非清楚地另外指明，所用的術(shù)語“植物”意在包括任何成熟階段的植物組織及取自或來源于任何這種植物的細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
在2001年4月26日，在ATCC(10801 Universlty Blvd.，Manassas，VA20110-2209)保藏了包含原種事件EE-GH1的標準種子，ATCC保藏號為PTA-3343。
如下面權(quán)利要求中所用，除非清楚地另外指明，所用的術(shù)語“植物”意在包括任何成熟階段的植物組織及取自或來源于任何這種植物的細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
本方面的上述描述意在示例而非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到所述實施方式中的各種變化或修改。可以進行這些變化或修改而不背離本發(fā)明的精神或范圍。
序 列 表<110>拜爾生物科學公司<120>除草劑抗性的棉花植物及生產(chǎn)和鑒定其的方法<130>EE-GH1<150>US 09/921,922<151>2001-08-06<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>850<212>DNA<213>人工序列包含5’側(cè)翼區(qū)的序列<400>1aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac 60aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca 120ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca 180ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc 240tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc 300tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa 360agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa 420gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa 480ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga 540tagcctttgc accatctagc tcactcttgg ttgttttcaa aacatcatcc gtttcttgga 600ccacaatttt gagcttttca ttttctattt tgaggataat agtttattcc ctcaaggaac 660tattcaactg agcttaacag tactcggccg tcgaccgcgg tacccggaat tccaatccca 720caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg tattcaacac 780cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata cgatgactgg 840ggttgtacaa850<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列引物GHI06<400>2ttgcaccatc tagctcactc20
<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列引物GHI05<400>3ggaccgttat acacaacgta g 21<210>4<211>426<212>DNA<213>人工序列包含3′側(cè)翼區(qū)的序列<400>4gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa 60ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaag atcctctaga120gtcgacctgc aggcatgcaa gcttagatcc atggagccat ttacaattga atatatcctc180caaatattta aaaagaatat caccattatc cgaatcttct ttaaaatctg ttagaacacg240gtttggaata gtggtagtaa aagtaacata gttgctcgca tcttgatcta cattaaactt300tcttcatcac tccaagtgat tgtaaatgac ttctatttct tcttagtatt agcacattct360aattttaagt gaaacaatcc cttacattca taacattgaa tatccttcta tcatctcaca420gcacga 426<210>5<211>961<212>DNA<213>陸地棉(Gossypium hirsutum)插入?yún)^(qū)<400>5aaaggggatg agattgaatg ttaccttatc aacaaaagga gttgtagctc atggaacaac 60aatagtcttt tccacggaaa cctagatgat gtttctccaa tgcttgataa atctttaaca120ttgtcatcat aagttgcaac ctcatgtttc acacaagcat caatcaaatg ttgatcttca180ttactaaaat gtgcttgatc cttccttaca caaatctacc tatgttgtgg tattttgttc240tattcatcat tctaacaagt tttgcaattg agttgaactt cttccaatct cgtatcagcc300tataatagtg gggtctaata tgtccatttt tcccacaata atgacatata atctttctaa360agcttttatt ctctgcctta tgatgaaaag aacccaaatc tttaacttta acaaaaataa420gatgagcgat aggttcttca cctttattga tgtaaccaag tcctctatgg catggttcaa480ttctcattga agccaaaatt tcatgaaact tctcacattg gcctctaaac ttcttcaaga540tagcctttgc accatctagc tcactcttgg ttgttttcaa aacatcatcc gtttcttgga600ccacaatttt gagcttttca ttttctattt tgaggataat agtttattcc ctcaaggaac660tattcaactg agcttaaatc tcaatttttt ttaacatatg actataagta tcctccaaat720
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<213>人工序列引物DPA017<400>14gattagagtc ccgcaattat ac 22<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列引物MLD019<400>15caagatgcga gcaactatgt20<210>16<211>200<212>DNA<213>人工序列包含靶位點缺失的序列<400>16tcttggacca caattttgag cttttcattt tctattttga ggataatagt ttattccctc 60aaggaactat tcaactgagc ttaatatctc aatttttttt aacatatgac tataagtatc120ctccaaatat ttaaaaagaa tatcaccatt atccgaatct tctttaaaat ctgttagaac180acggtttgga atagtggtag200<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列引物GHI01<400>17aacctaggct gctgaaggag c 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列引物GHI02<400>18caactcctcc agtcatctcc g 2權(quán)利要求
1.在基因組中包含事件EE-GH1的轉(zhuǎn)基因棉花植物或其種子、細胞或組織。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花植物或其種子、細胞或組織，當利用分別包含SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的核苷酸序列的兩個引物，采用EE-GH1原種事件鑒定方法進行分析時，其基因組DNA產(chǎn)生250至290bp的DNA片段。
3.如權(quán)利要求2所述的棉花植物或其種子、細胞或組織，其中所述DNA片段是約269bp的片段。
4.通過對生長自保藏在ATCC、保藏號為PTA-3343的種子的棉花植物進行繁殖和/或育種所獲得的棉花植物或其種子、細胞或組織。
5.作為保藏在ATCC、保藏號PTA-3343的種子的子代的棉花植物、其種子、細胞或組織。
6.鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的方法，該方法包括用特異識別SEQ ID NO3中EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)或SEQ ID NO4中EE-GH1的3’側(cè)翼區(qū)的引物或探針檢測EE-GH1特異區(qū)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，所述方法包括利用聚合酶鏈式反應(yīng)，用至少兩個引物從所述生物樣品中存在的核酸擴增100至350bp的DNA片段，其中一個引物識別EE-GH1的5’或3’側(cè)翼區(qū)，另一個引物識別EE-GH1的外源DNA內(nèi)的序列。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述一個引物識別SEQ ID NO3的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，而所述另一引物識別EE-GH1的外源DNA內(nèi)的序列。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述識別EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的引物包含SEQ ID NO2的序列。
10.如權(quán)利要求6到9任一項所述的方法，其中所述識別外源DNA內(nèi)序列的引物包含SEQ ID NO1的序列。
11.鑒定生物樣品中EE-GH1的方法，該方法包括用在嚴格條件下能與SEQ ID NO3中EE-GH1的5’側(cè)翼序列或SEQ ID NO4中EE-GH1的3’側(cè)翼序列內(nèi)的序列雜交的特異引物或探針檢測EE-GH1特異區(qū)。
12.鑒定包含原種事件EE-GH1的轉(zhuǎn)基因植物或其細胞或組織的方法，該方法包括根據(jù)PCR鑒定法，利用兩個分別具有SEQ ID NO1和SEQID NO2的核苷酸序列的引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)來確定基因組DNA是否可以用于擴增250至290bp的DNA片段。
13.鑒定生物樣品中原種事件EE-GH1的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個PCR引物或探針，所述PCR引物或探針識別SEQ ID NO3中EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列或SEQ ID NO4中EE-GH1的3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列。
14.如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述至少一個PCR引物識別SEQ ID NO3中植物DNA內(nèi)的序列。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述識別SEQ ID NO3中植物DNA內(nèi)的序列的引物包含SEQ ID NO2的序列。
16.如權(quán)利要求13到15所述的試劑盒，其還包含識別EE-GH1的外源DNA內(nèi)序列的至少第二PCR引物或探針。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述識別EE-GH1的外源DNA內(nèi)序列的引物包含SEQ ID NO1的序列。
18.驗證種子純度的方法，該方法包括在種子樣品中，用特異識別SEQ ID NO3中EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列或SEQ ID NO4中EE-GH1的3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的特異性引物或探針檢測EE-GH1特異的DNA序列。
19.篩選存在EE-GH1的種子的方法，該方法包括在種批樣品中，用特異識別SEQ ID NO3中EE-GH1的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列或SEQ ID NO4中EE-GH1的3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的特異性引物或探針檢測EE-GH1特異的DNA序列。
20.保藏在ATCC、保藏號為PTA-3343的種子。
21.包含原種事件EE-GH1的棉花種子，保藏在ATCC、保藏號為PTA-3343并包含所述事件的標準種子。
22.來源于權(quán)利要求21的種子并包含原種事件EE-GH1的棉花植物、其細胞或組織或植物材料。
23.轉(zhuǎn)基因棉花植物、種子、細胞或組織，其基因組DNA包含在含有至少40bp如下序列的區(qū)域整合進入染色體DNA的轉(zhuǎn)基因，所述序列在嚴格條件下能與SEQ ID NO5的序列的互補序列雜交。
24.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花植物或棉花植物的細胞或組織的方法，所述方法包括向?qū)?yīng)于至少40bp如下序列的棉花染色體DNA區(qū)域中引入重組DNA分子，其中所述序列在嚴格條件下能與SEQ ID NO5的序列的互補序列雜交；和，任選地，從轉(zhuǎn)化的棉花細胞或組織再生棉花植物。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述重組DNA分子包含除草劑抗性基因。
26.通過權(quán)利要求24或25所述的方法獲得的棉花植物或其細胞或組織。
27.轉(zhuǎn)基因棉花植物或其種子、細胞或組織，其i)在基因組中包含事件EE-GH1；或ii)包含事件EE-GH1，但前提是用在事件中的bar基因被在嚴格條件下能與bar基因的互補序列雜交的核酸序列置換。
28.可以利用一套引物從棉花核酸樣品擴增的DNA分子，其中第一引物包含與SEQ ID NO1或SEQ ID NO4內(nèi)序列互補的15到30個核苷酸的序列，第二引物包含與所述玉米核酸樣品中存在的外源DNA互補的序列。
29.如權(quán)利要求28所述的DNA分子，其可以利用一套引物從棉花核酸樣品擴增產(chǎn)生，其中第一引物包含SEQ ID NO2，第二引物包含SEQ IDNO3。
30.包含權(quán)利要求28或29的DNA的檢測試劑盒。
31.從玉米組織分離的DNA分子，其包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO4的序列。
32.一種DNA分子，其包含與如下序列相同或互補的序列，該序列具有位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO4中所含插入位點的兩側(cè)并與所述插入位點鄰近的植物DNA和外源DNA的9個核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、植物材料和種子，其特征在于在棉花基因組的特定位置包含特定轉(zhuǎn)化事件，特別是存在編碼賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的棉花植物將除草劑抗性表型和最佳農(nóng)藝性狀結(jié)合在一起。
文檔編號C07K14/415GK1551920SQ02817381
公開日2004年12月1日 申請日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月6日
發(fā)明者L·特落林德爾, J·格溫, M·德博克勒爾, ┛死斬, L 特落林德爾 申請人:拜爾生物科學公司