專利名稱：單子葉植物啟動子及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動子，特別是一種單子葉植物啟動子，以及所述啟動子的制備 方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子是指在組成型啟動子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段 的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型啟動 子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯葉 脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。單子葉植物基因中常見的啟動子 有Ubi 啟動子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin 啟動子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟云力子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。其中，Ubi 啟云力子以其啟云力 效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目前，已經(jīng)從很多泛素基因中分 離得到啟動子序列，如玉米基因組中的Ubi-I啟動子、水稻泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素 啟動子、向日葵泛素UbBl啟動子、煙草泛素Ubi. U4啟動子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動子、番茄 泛素Ubil-I啟動子，大麥泛素Mubl啟動子。其中，玉米泛素Ubi-I啟動子已經(jīng)被廣泛地應(yīng) 用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中。水稻泛素RUBQ2啟動子在水稻和甘蔗中也有較多的 應(yīng)用。Actin啟動子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成型 啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是對鄰近科屬植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究力圖通過其他單子葉植物尋找Actin啟動子，并成功 在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)找到Actin啟動子。Actin啟動子對基因表達(dá)具有強(qiáng)調(diào) 控作用，在單子葉植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。Adh-I啟動子調(diào) 控ADHfelcohol dehydrogenase)基因，對植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。 Adh-I啟動子對單子葉植物如谷類植物中的水稻、燕麥和大麥，以及對少部分雙子葉植物如 煙草等基因的調(diào)控功能比CaMV (花椰菜花葉病毒CaMV) 35S啟動子提高10-50倍。Adh-I啟 動子主要應(yīng)用于單子葉植物，對大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào)控效果卻極為有限。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替(CaMV) 35S啟動子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基 因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動子，用其代替(CaMV) 35S啟動子，在轉(zhuǎn)基因煙草 中也取得了很好的表達(dá)效果Naomi S S, Ichiro Μ. Constitutive Promoters Availablefor transgene expressioninstead of CaMV35S RNA promoter Arabidopsis promoters oftryptophan synthase protein subunit and phytochrome. Plantbiotechnology,2002, 19(1) :19-26。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星科等，是非常重要的農(nóng)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗證了許多單子葉植物的啟動子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)啟動子、番茄E8啟動 子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動子等高效啟動子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作 用。本發(fā)明的發(fā)明者們通過對水稻基因組和轉(zhuǎn)錄組的深入研究，提供了一種新的單子 葉植物啟動子——非共生血紅素啟動子RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2)，生物信息學(xué) 方法預(yù)測該啟動子能在多種組織，特別是愈傷組織和根組織中高表達(dá)，上述啟動子能夠用 于調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)，同時為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新 的工具和選擇。表1、生物信息學(xué)預(yù)測RHB2驅(qū)動基因表的圖式

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種單子葉植物啟動子，以調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述單子葉植物啟動子的重組載體。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有上述單子葉植物啟動子的重組載體的重組 細(xì)胞。本發(fā)明提供的單子葉植物啟動子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中序列表中序列1的具體堿基序列長度為1357個堿基。本發(fā)明所述單子葉植物啟動子來源于水稻，具體為水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)本發(fā)明提供的如序列表中序列1所示的單子葉植物啟動子稱為非共生血紅素啟 動子(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))，簡稱為 RHB2 啟動子(RHB2 (N0N-SYMBI0TIC HEMOGLOBIN 2))。本發(fā)明提供的單子葉植物啟動子——RHB2啟動子可以是下述核苷酸序列之一1)與序列表中序列1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；2)對序列表中序列1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代或缺失或添 加修飾的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上相似性，且具有相同功能的 核苷酸序列。所述2)的對序列表中序列1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代或缺 失或添加修飾的核苷酸序列，包括但不限于分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’ 端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不 超過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的 取代或缺失或添加修飾的核苷酸序列。所述對序列表中序列1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代或缺失或 添加修飾的核苷酸序列，具有與序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活 性。在本發(fā)明中，用于確定序列相似性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個優(yōu)選例子 是 BLAST 和 BLAST 2. 0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默 認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST 2. 0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列相似性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST 分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上相似性的核 苷酸序列包括與序列表中序列1所示的核苷酸序列基本同一的多核苷酸序列，且多核苷 酸序列與本發(fā)明序列表中序列1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性，優(yōu)選95%或 96%或97%或98%或99%的同源性，或更高同源性。在本發(fā)明中，所述與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核 苷酸序列，具有與序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。本發(fā)明提供的一種含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子的重組載體，是將上述單 子葉植物啟動子——即序列表中序列1所示的核苷酸序列插入到克隆載體或表達(dá)載體 而得到的，其中所述克隆載體包括但不限于PMD18-T，pUC9，所述表達(dá)載體包括但不限于
5pCambial300, PROMOTER。所述含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子的重組載體稱為pPr0m0ter+RHB2 (RHB2 (N ON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體。本發(fā)明提供的一種含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子的重組載體的重組細(xì)胞，是 將含有上述單子葉植物啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到的，所述宿主細(xì)胞為大腸 桿菌或者農(nóng)桿菌。本發(fā)明還涉及一種單子葉植物愈傷組織，并且所述愈傷組織轉(zhuǎn)化為本發(fā)明所述的
啟動子。本發(fā)明提供的一種制備本發(fā)明所述啟動子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)序列表中序列1所示的核苷酸序列，設(shè)計下列PCR擴(kuò)增引物對上游引物Fl :CGGGATCCGTTGACTTCGGTGCAGGATGA,其中下劃線部分代表BamHl酶切 位點；下游引物Rl :CGAAGCTTGGCTGCTTCGATTTGATTCCT,其中下劃線部分代表 HindIII 酶 切位點；2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計的PCR引物對進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計 相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對。本發(fā)明還涉及一種調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的方法，所述方法包括用本發(fā) 明所述單子葉植物啟動子轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子的重 組細(xì)胞。所述單子葉植物的愈傷組織為水稻愈傷組織，具體為水稻日本晴愈傷組織。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達(dá)單元的植株。本發(fā)明還涉及所述單子葉植物啟動子在單子葉植物中調(diào)控目的基因表達(dá)的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用本發(fā)明所述啟動子調(diào)控的目的基因是GUS。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體是水稻日本晴種。為實現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動子聯(lián)用。發(fā)明具有下列優(yōu)點和有益效果采用上述方案，找到了新的單子葉植物啟動子，用 于調(diào)控單子葉植物目的基因表達(dá)，同時為研究單子葉植物基因表達(dá)提供新的工具和選擇， 本發(fā)明的發(fā)明者們通過生物信息學(xué)研究獲得單子葉植物啟動子，并采用生物學(xué)實驗驗證了 所述啟動子RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BTN 2))的功能。所述啟動子能夠在水稻
6中調(diào)控GUS基因表達(dá)。能夠調(diào)控植物高效率表達(dá)具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良水稻的 分子育種研究具有重大意義。


圖1為本發(fā)明之單子葉植物啟動子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))的 PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果。圖2為用于構(gòu)建pPromoter質(zhì)粒的pCAMBIA_1301質(zhì)粒示意圖。圖3為構(gòu)建的pPromoter質(zhì)粒示意圖。圖4是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的⑶S染色結(jié)果。圖4中，由帶有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))序列的重組農(nóng)桿菌 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，由不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組 農(nóng)桿菌pPromoter質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對照，右)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖5是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻根組織的⑶S染色結(jié)果。 圖5中，由帶有本發(fā)明所述單子葉植物啟動子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))序列的重組農(nóng)桿菌 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))轉(zhuǎn)化的水稻根組織(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，由不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組農(nóng) 桿菌pPromoter質(zhì)粒的水稻根組織(對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中未注明的具體技術(shù)或條件，均為常規(guī)技術(shù)或條件，或按照本領(lǐng)域內(nèi) 的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗 指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商 者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例A、單子葉植物啟動子片段的PCR擴(kuò)增使用新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN目錄號DP320_02)，根據(jù)該啟動子 在栽培水稻日本晴變種gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計一對PCR特異性擴(kuò)增引物，即上游引物Fl CGGGATCCAGTTCGCAAGCAAACGGCACGG，其中下劃線部分代表 BamHl 酶 切位點；下游引物Rl :AAGCTTGCAGACGACGAGAG,其中下劃線部分代表HindIII酶切位點；以自行提取的水稻日本晴變種的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa,DRR100B) 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增的PCR體系見表2 ；表2基因啟動子擴(kuò)增的PCR體系
組成_體積(μ )
基因組DNA 0. 2 dNTPs (2. 5 mM) 2 IOX Ex Buffer (含鎂離子) 2.5 引物 Π (50 μ Μ) 1 引物 Rl (50 μ Μ) 1 Ex taq 0. 2 ddH20_補(bǔ)滿至總體積25 μ 1PCR擴(kuò)增程序為94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，進(jìn)行35個反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小為1357bp的條帶(如圖1)， 用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)進(jìn)行純化回收，即得PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物；B、pMD18-T+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體的構(gòu)建B1、將上述步驟A得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD 18_T質(zhì)粒，TaKaRa， D103A)，其中，Τ/Α克隆的連接條件如下Τ/Α 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I 5μ 1PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 20ng，ddH20補(bǔ)齊至 10 μ 1于16°C在PCR儀中連接8h 以上，得到含有RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))啟動子的重組載體，即 pMD18-T+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載 體；B2、將上述步驟 Bl 得到的 pMD18-T+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重 組載體按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆》(第三版)所示氯化鈣法制備 的感受態(tài)細(xì)胞DH5a 100 μ 1，冰上融化后，加入10 μ 1上述步驟Bl所得的含有 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體的連接產(chǎn)物，輕輕攪勻， 冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的SOC培養(yǎng)基，37 °C 220rpm 復(fù)蘇45min，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板，37 °C倒置培養(yǎng)16h_24h ；獲得含有 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體的重組大腸桿菌，命名為 pMD18-T+RHB2-DH5a ；B3、對步驟 Bl 獲得的 pMD18-T+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重組載 體中的 RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))進(jìn)行測序驗證；
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C、pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體的構(gòu)建Cl、按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號DP103_03)的操 作手冊，從上述步驟B2獲得的重組大腸桿菌pMD18-T+RHB2-DH5a中，提取 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體，經(jīng)過常規(guī)純化后，用相 應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行酶切，回收相應(yīng)的啟動子插入片段，并分別與 pPromoter質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶切后回收的載體大片段進(jìn)行連接，得連接產(chǎn)物；將 所得連接產(chǎn)物 pPromoter+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體轉(zhuǎn)化《分子 克隆》(第三版)所示氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞，待轉(zhuǎn)化子長出菌落后，挑取單克隆進(jìn)行 PCR檢測和酶切鑒定；其中，pPromoter質(zhì)粒的構(gòu)建如下將常規(guī)的pCAMBIA-1301 (kan抗性)用Pstl和 Ncol酶切，這一步的目的是將其原有的報告基因GUS前的35S啟動子切除，因此酶切后可以 看見大小兩條帶，小帶約lkb，多為原有35S啟動子，膠回收較大的條帶(大約IOkb以上)， 接頭 pPromoter-AD-U (GAAGCTTGCGGCAAC)與 pPromoter-AD-L (CATGGTTGCCGCAAGCTTCTGCA) 退火，具體方法是將其1 1摩爾比混合于水中，放置于1.5ml tube中，將其密封好，置于 1-2L沸水中冷卻至室溫；加入少量接頭，與載體混合，連接過夜，轉(zhuǎn)化，篩選克隆，挑選PCR 陽性結(jié)果(用載體通用引物做顯示已經(jīng)成功切除35S啟動子的克隆)(參見圖3)；所述pPromot er質(zhì)粒中的多克隆位點和⑶S序列如序列表中序列2所示，篩選轉(zhuǎn) 化子所用的引物 5，-GCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3’ 5’ -GAGTCGTCGGTTCTGTAAC-3，；C2、pPromoter+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體的構(gòu)建根據(jù)常規(guī)的限制性內(nèi)切酶操作說明，按照下列條件分別對上述步驟Bl所得的 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體，以及步驟 Cl 所構(gòu)建的 pPromoter 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，其中，重組載體pMD18_T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))以及pPromoter質(zhì)粒的酶切條件如下酶切體系50 μ 1無菌水34. 8 μ 110*buffer H5 μ 1EcoRI0. 1 μ 1 (10U)PstI0. 1 μ 1 (IOU)pMD18-T+RHB210 μ 1(< IOOOng)或 pPromoter 質(zhì)粒 10 μ 1 ( < 1000ng)；按照常規(guī)方法，分別回收經(jīng)酶切的pPromoter質(zhì)粒以及重組載體 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))中的啟動子 RHB2 片段，根據(jù) T4 連接 酶(TaKaRa，D2011A)操作說明，按照如下條件進(jìn)行連接連接體系10 μ 110Χ T4buffer1 μ 1pPromoter 質(zhì)粒1 μ 1 (20ng)啟動子片段10 20ng無菌水補(bǔ)齊至9. 5 μ 1T41igase(TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1
T4buffer冰上融化，載體加入量20ng，加入IOng步驟A所得經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn) 物——RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2)，于16°C在節(jié)能型智能恒溫槽中連接8h以上， 得到 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))質(zhì)粒；D、重組農(nóng)桿菌 EHA105-RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))細(xì)胞的制備將上述步驟C2 構(gòu)建的 pPromoter+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2)) 質(zhì)粒以及作為對照的PPromoter質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化按照(《分子克隆實驗指南》，第三版， 科學(xué)出版社)所述氯化鈣方法制備的農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下將 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105于超低溫冰箱中取出，置于冰上解凍，融化后，加入5μ 1質(zhì) 粒(即 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重組載體)，輕輕混勻， 冰浴lOmin，放入液氮中冷凍5min，37°C解凍5min，加入800 μ 1常溫的LB液體培養(yǎng)基， 28 0C 160rpm復(fù)蘇3h，8000rpm離心30s，吸去上清，留下200 μ 1吹勻，涂布于常規(guī)的加有 kan-rif (卡那霉素-利福平)雙抗的平板上，28°C倒置培養(yǎng)2_3天，得到含有pPromoter +RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重組載體的重組農(nóng)桿菌，命名為重組農(nóng)桿菌 EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))；同樣按相同方法得到含有 pPromoter 質(zhì)粒的對照重組農(nóng)桿菌，命名為重組農(nóng)桿菌EHA105-pPromoter ；E、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化按照如下步驟誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并分別用重組農(nóng)桿菌 EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))和 EHA105-pPromoter 轉(zhuǎn)化所述愈傷 組織1)水稻日本晴變種種子去殼，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5%的次氯 酸鈉消毒30min，期間劇烈搖動，消毒后用滅菌水清洗5次；將消毒后的種子置于表2所示 的N6D培養(yǎng)基上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養(yǎng)3 4周，直至長出愈傷組織；2)選取活躍生長的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑1 3mm)，在表3所示的N6D培 養(yǎng)基上29. 5°C光照培養(yǎng)3天，得繼代培養(yǎng)的愈傷組織；3)分別挑取上述步驟D所構(gòu)建的重組農(nóng)桿菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))單菌落和EHA105-pPromoter)，于表6所示的添加有抗生素(50mg/l Kan, 10mg/l Rif)的YM液體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度28°C ；分別刮取上述重組農(nóng)桿菌 置于30ml表5所示的添加有30 μ 1 AS的AAM培養(yǎng)基中(0D600 = 0. 05-0. 1)，溫和重懸農(nóng) 桿菌細(xì)胞；4)將步驟2)的繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于滅菌培養(yǎng)皿中；將步驟3)制備的農(nóng)桿菌 懸液倒入培養(yǎng)皿中，將愈傷組織浸入其中15min ；5)倒掉農(nóng)桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于表4所示的 N6-AS培養(yǎng)基上放一張滅菌濾紙，加Iml表5所示的含AS的AAM培養(yǎng)基，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至 濾紙上，密封培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)48 60h，使愈傷組織受感染；6)將上述受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動清洗，直至上清 液變澄清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無菌水中以殺死農(nóng)桿菌細(xì) 胞；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉(zhuǎn)移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/lCarb的表4所示的N6-AS培養(yǎng)基上；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3 4 周，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；
F、水稻愈傷組織中的⑶S的表達(dá)為檢測經(jīng)過步驟E中的6)所轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達(dá)情況，通 過常規(guī)方法對分別用重組農(nóng)桿菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))和EHA105-pPromoter轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織進(jìn)行染色，其中⑶S染色液的配方為 (Iml) 610 μ 1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc ；分別將用重組農(nóng)桿菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))和 EHA105-pPromoter轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織浸泡在⑶S染色液中，37 V保溫至出現(xiàn)藍(lán)色， 拍照記錄，結(jié)果如圖5所示，經(jīng)含有啟動子的pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))重組載體的重組農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(圖4左)經(jīng)染色后呈 現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動子的pPromoter質(zhì)粒重組農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化(作為對照，如圖4右)。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述單子葉植物啟動子 RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))對 GUS 基因表達(dá)具有調(diào)控作用。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。表3N6D培養(yǎng)基
N6Hiacro 母液(20X) Fe2EDTA 貯存液(100X) Nemicro 母液(1000X) N6維生素貯存液(1000X) 肌醇(500X)
2, 4-D 貯存液(lmg/ml) 脯氨酸(Proline) 水解酪蛋白(CH) 庶糖(sucrose) 植物凝膠(Phytagel)
50 ml 10 ml 1 ml
1ml
2ml
2ml
2. 88 g 0. 30 g 30 g
3g
25 ml 5 ml 0. 5 ml 0. 5 ml 1 ml 1 ml 1.44 g 0. 15 g 15 g 1.5 g
100 ml 20 ml 2 ml 2 ml 4 ml 4 ml 5. 76 g 0. 6 g 60 g 6 g(用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，封口后按常規(guī)方法滅菌，121°C下滅菌20分鐘)表4N6-AS共培養(yǎng)基
11 表5AAM培養(yǎng)基 (加IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5.2，按常規(guī)方法滅菌，121°C下滅菌20分鐘)表6YM 液體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif)

權(quán)利要求
一種單子葉植物啟動子，其特征在于所述單子葉植物啟動子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的單子葉植物啟動子，其特征在于所述單子葉植物啟動子是下述 核苷酸序列之一A、與序列表中序列1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；B、對序列表中序列1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代或缺失或添加修 飾的核苷酸序列；C、與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的核苷 酸序列。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述的單子葉植物啟動子的重組載體，其特征在于是將上 述單子葉植物啟動子插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到的重組載體pPromoter+RHB〗，即 RHB2 (N0N-SYMBI0TICHEM0GL0BI 2)重組載體，其中所述克隆載體包括但不限于pMD18_T， pUC9，所述表達(dá)載體包括但不限于pCambial300，pPromoter。
4.一種含有如權(quán)利要求3所述重組載體的重組細(xì)胞，其特征在于是將含有所述單子葉 植物啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或者農(nóng)桿菌。
5.如權(quán)利要求1所述的單子葉植物啟動子在培育單子葉轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求1所述的單子葉植物啟動子的制備方法，其特征在于包含如下步驟1)根據(jù)序列表中序列1所示的核苷酸序列，設(shè)計下列PCR擴(kuò)增引物對上游引物Fl :CGGGATCCAGTTCGCAAGCAAACGGCACGG，其中下劃線部分代表BamHl酶切位占.下游引物Rl AAGCTTGGCTGCTTCGATTTGATTCCT，其中下劃線部分代表HindIII酶切位占.2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計的PCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)
全文摘要
本發(fā)明提供一種單子葉植物啟動子及其制備方法和用途。該啟動子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本發(fā)明的啟動子可以調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)，尤其能夠在水稻中調(diào)控GUS基因表達(dá)，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá)具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良水稻的分子育種研究具有重大意義。
文檔編號C12N15/63GK101892229SQ20101021913
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者徐訊, 王文, 董楊 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所