專利名稱：抗除草劑植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)，并且特別是涉及轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，與非轉(zhuǎn)基因的同樣的植物相比，上述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出充分的除草劑抵抗力或耐受性。本發(fā)明還涉及，特別是，涉及用于生產(chǎn)上述轉(zhuǎn)基因植物，或由上述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的核酸序列(和其表達(dá)產(chǎn)物)。
受到除草劑的作用時(shí)，對(duì)除草劑充分“耐受”的植物提供的劑量/應(yīng)答曲線與同樣受到除草劑作用的非轉(zhuǎn)基因植物提供的曲線相比，該曲線向右平移。這樣的劑量/應(yīng)答曲線在X-軸上繪制“劑量”，并在Y-軸上繪制“殺死百分率”，“除草效果”等等。耐受植物產(chǎn)生除草劑效應(yīng)需要的除草劑通常為非耐受性的同樣植物的至少兩倍。當(dāng)受到農(nóng)業(yè)界在用于商業(yè)目的農(nóng)作物生長(zhǎng)的田地中常用于殺死雜草的濃度和速率的除草劑作用時(shí)，充分“抵抗”除草劑的植物很少表現(xiàn)出，如果有的話，壞死的，裂解的，萎黃病的或其它的損傷。
充分抵抗或充分耐受以5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(5-enolpyruvyl shikimate phosphate synthetase)(在下文“EPSPS”)為作用位點(diǎn)的除草劑(在下文“草甘膦”)的植物是特別優(yōu)選的，其中N-膦酰基甲基甘氨酸(和其各種鹽)是上述除草劑的優(yōu)秀的例子。
根據(jù)對(duì)生長(zhǎng)有抗除草劑農(nóng)作物的田地施用除草劑的常規(guī)技術(shù)，除草劑可以在出現(xiàn)之前或之后施用。本發(fā)明提供了，特別是，用于生產(chǎn)這樣的除草劑耐受性或抗性植物的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，提供了含有SEQ ID NO.41中所描述序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了一種編碼EPSPS的多核苷酸，不包括編碼水稻和玉米EPSPS的cDNA，上述多核苷酸與一種序列互補(bǔ)，該序列在含有0.1％SDS的0.1強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液中65-70℃之間溫育，然后用含有0.1％SDS的0.1強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液在同樣溫度洗滌時(shí)，仍然與SEQ ID NO.41中所描述的序列雜交。但是，可以通過(guò)用組成SEQ IDNO.41序列內(nèi)的內(nèi)含子的核苷酸對(duì)植物基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選而得到根據(jù)本發(fā)明的編碼EPSPS的多核苷酸，并且本發(fā)明也包括可以從那種篩選得到的這樣的序列。
本發(fā)明包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(chloroplast transit peptide)以及編碼該肽3’的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(EPSPS)的區(qū)域，上述區(qū)域處于一種植物可操作啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控之下，前提為上述啟動(dòng)子與上述區(qū)域不是異源的，并且葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與上述合酶不是異源的。
“異源的”的意思是來(lái)自不同的來(lái)源，相應(yīng)地“非異源的”的意思是來(lái)自相同的來(lái)源-但是是在基因水平上而不是在生物或組織水平上。例如CaMV35S啟動(dòng)子對(duì)于矮牽牛屬植物的EPSPS編碼序列顯然是異源的，因?yàn)樯鲜鰡?dòng)子是源自病毒而上述序列-它所控制的表達(dá)-是源自植物。但是，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“異源的”還有更窄的意思。例如，當(dāng)涉及本發(fā)明時(shí)，“異源的”意思為矮牽牛屬植物的編碼EPSPS序列對(duì)于，例如，同樣源自矮牽牛屬植物的-但不是調(diào)控EPSPS基因表達(dá)的啟動(dòng)子是“異源的”。在這種意義上，源自矮牽牛屬植物EPSPS基因，然后用于調(diào)控同樣也源自該矮牽牛屬植物的EPSPS編碼序列的表達(dá)，的矮牽牛屬植物啟動(dòng)子對(duì)于上述編碼序列是“非異源的”。但是，“非異源的”并不意味著，啟動(dòng)子和編碼序列必須從一個(gè)和同一個(gè)(起源或祖先)多核苷酸獲得。對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)肽也是相同的情況。例如，源自向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)于同樣源自向日葵(相同的植物，組織或細(xì)胞)的EPSPS基因的編碼序列是“異源的”。源自向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列對(duì)于也源自向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶酶編碼序列是“非異源的”，即使兩序列的來(lái)源是不同的，可以存在于不同的細(xì)胞，組織或向日葵植物的多核苷酸。
一種優(yōu)選的多核苷酸形式在5’到3’的轉(zhuǎn)錄方向中包括以下組分(i)至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，其增強(qiáng)區(qū)域處于序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，上述序列為增強(qiáng)子從其中獲得的序列，并且上述增強(qiáng)子自身不作為啟動(dòng)子起作用，不論在內(nèi)源性地被包含的序列中，還是作為構(gòu)建體的一部分而異源存在時(shí)；(ii)源自水稻EPSPS基因的啟動(dòng)子；(iii)編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列；(iv)編碼水稻EPSPS的基因組序列；(v)轉(zhuǎn)錄終止子；其中水稻EPSPS編碼序列被改造，以便使一個(gè)第1位置被突變，從而該位置的殘基為Ile而不是Thr，以及使一個(gè)第2位置被突變，從而該位置的殘基為Ser而不是Pro，突變被引入到在野生型中含有以下保守序列GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS基因中從而使改造后的序列為GNAGIAMRSLTAAV。
增強(qiáng)區(qū)域優(yōu)選的包含一個(gè)序列，該序列的3’末端位于增強(qiáng)子所來(lái)自的序列的最接近的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的至少40個(gè)核苷酸。在上述多核苷酸的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，增強(qiáng)區(qū)域含有一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域的3’末端是上述最接近的起始位點(diǎn)上游至少60個(gè)核苷酸，在多核苷酸的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述增強(qiáng)區(qū)域含有一個(gè)序列，該序列的3’末端位于增強(qiáng)子所來(lái)自的序列的TATA共有序列(TATA consensus)的第一個(gè)核苷酸的上游至少10個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以含有兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，在該多核苷酸的一個(gè)特定實(shí)施方案中，這些轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子可以以頭尾相接的方式存在。
在本發(fā)明的多核苷酸的增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，如果存在一個(gè)以上增強(qiáng)子的話，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游大約100到大約1000個(gè)核苷酸，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游大約100到大約1000個(gè)核苷酸，如果上述區(qū)域含有內(nèi)含子的話。在本上述多核苷酸的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約150到大約1000個(gè)核苷酸；在一個(gè)更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約300到950個(gè)核苷酸。在仍然更優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約770和大約790個(gè)核苷酸。
在一個(gè)替代的發(fā)明多核苷酸中，增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約300到大約380個(gè)核苷酸；在該替代的多核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約320到大約350個(gè)核苷酸。
在根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸中，水稻EPSPS基因的啟動(dòng)子上游的區(qū)域可以含有至少一個(gè)增強(qiáng)子，該增強(qiáng)子源自位于玉米多泛素(polyubiquitin)或水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的序列。
因此上述多核苷酸可以在5’到3’的方向上含有一個(gè)第一增強(qiáng)子，該第一增強(qiáng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，該轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域源自位于水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的序列，以及含有一個(gè)第二增強(qiáng)子，該第二增強(qiáng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，該轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域源自水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列。
不論該多核苷酸中存在的各個(gè)增強(qiáng)子的身份(identity)和排列(juxtaposition)如何，組成水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的5’核苷酸都應(yīng)該是Kozack優(yōu)選的。技術(shù)人員將知道這意味著什么-無(wú)論如何這在下文的實(shí)施例中將進(jìn)而顯而易見(jiàn)。
本發(fā)明多核苷酸特別優(yōu)選的實(shí)施方案具有一個(gè)非翻譯區(qū)域，該區(qū)域含有一個(gè)作為內(nèi)含子的序列，該序列位于編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列的5’端。上述非翻譯區(qū)可以含有SEQ ID NO 48中所描述的序列。
本發(fā)明多核苷酸可以含有一個(gè)病毒源的翻譯增強(qiáng)子，該翻譯增強(qiáng)子位于編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列的5’端非翻譯區(qū)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白這樣的適當(dāng)翻譯增強(qiáng)子的身份-例如源自TMV的Omega和Omega prime序列，以及源自煙草蝕刻(etch)病毒的增強(qiáng)子，還明白這樣的翻譯增強(qiáng)子如何能被引入到上述多核苷酸，以便提高合乎需要的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可以進(jìn)而含有編碼一些蛋白的序列，這些蛋白能夠賦予含有該序列的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑。當(dāng)考慮到這樣的多核苷酸中賦予除草劑抗性的基因?yàn)镋PSPS以外的基因，如草甘膦氧化還原酶時(shí)，除草劑可以是草甘膦以外的除草劑，在這種情況下抗性賦予基因可以選自編碼以下蛋白的基因膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，羥苯基丙酮酸酯加雙氧酶(HPPD)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，細(xì)胞色素P450，乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPO)，二氫蝶酸(dihydropteroate)合酶，多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，過(guò)氧化物歧化酶(SOD)，溴苯腈腈水解酶(bromoxynil nitrilase)，八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)，可以從Alcaligenes eutrophus得到的tfdA基因的產(chǎn)物，以及上述蛋白的突變的或經(jīng)其它改造的變體。在上述多核苷酸提供多除草劑抗性的情況下，這樣的除草劑可以選自二硝基苯胺除草劑，三唑-嘧啶，尿嘧啶，苯脲，三酮，異噁唑，退熱冰(acetanilide)，噁二唑，triazinone，磺苯胺(slfonanilide)，酰胺，苯胺，RP201772，flurochloridone，norflurazone和triazolinone類的除草劑，并且出苗后除草劑(post emergence herbicide)選自草甘膦和它的鹽，glufosinate，黃草靈，噻草平，bialaphos，除草定，sethoxydim或其它環(huán)己二酮，麥草畏，fosamine，flupoxam，苯氧基丙酸，quizalofop或其它芳氧基苯氧基丙酸鹽，毒莠定fluometron，atrazine或其它三嗪，metribuzin，chlorimuron，chlorsulfuron，氟唑啶草(flumetsulam)，halosulfuron，sulfometron，滅草喹(imazaquin)，咪草煙(imazethapyr)，isoxaben，imazamox，metosulam，pyrithrobac，rimsulfuron，bensulfuron，nicosulfuron，氟黃胺草醚(fomesafen)，fluroglycofen，KIH 9201，ET751，carfentrazone，ZA1296，sulcotrione，對(duì)草快，敵草快，溴苯腈和fenoxaprop。
在上述多核苷酸含有編碼殺蟲蛋白的情況下，這種蛋白可以選自源自Bt的結(jié)晶毒素，包括分泌的Bt毒素；蛋白酶抑制劑，植物凝集素，奇異桿狀體(xenhorabdus)/光桿狀體(photorhabdus)毒素；賦予真菌抗性的基因可以選自那些編碼已知的AFPs，防御素(defensin)，幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶，Avr-Cf9的基因。特別優(yōu)選的殺蟲蛋白為cryIAc，cryIAb，cry3A，Vip1A，Vip1B，半胱氨酸(cystein)蛋白酶抑制劑，和雪花蓮(snowdrop)凝集素。在上述多核苷酸含有賦予細(xì)菌抗性的基因的情況下，這些基因可以選自那些編碼天蠶抗菌肽(cecropin)和techyplesin以及它們的類似物的基因。賦予病毒抗性的基因可以選自那些編碼已知能夠提供病毒抗性的病毒外殼蛋白，移動(dòng)蛋白(movement protein)，病毒復(fù)制酶和反義和核酶序列的基因；而賦予脅迫(stress)，鹽和干旱抗性的基因可以選自那些編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化物酶的基因，組成已知的CBF1調(diào)節(jié)序列的序列以及已知能提供海藻糖富集的基因。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列可以被修飾，以增強(qiáng)它所含有的蛋白編碼序列的表達(dá)，因?yàn)閙RNA不穩(wěn)定區(qū)域和/或多余的剪接區(qū)域可以被除去，或可以使用作物優(yōu)選的密碼子，以便這樣修飾后的多核苷酸的表達(dá)在植物中產(chǎn)生基本相似的蛋白，該蛋白的活性/功能和那些由未修飾的多核苷酸在特定生物中的表達(dá)所獲得蛋白的功能/活性基本相似，上述特定生物為未修飾的多核苷酸的蛋白編碼序列在其中是內(nèi)源的生物。修飾的多核苷酸和在上述植物中編碼基本相同蛋白的內(nèi)源含有的多核苷酸之間的同一性程度可以是，例如，為了防止修飾的和內(nèi)源序列之間的共抑制(co-suppression)。在這種情況下，序列間的同一性程度應(yīng)該優(yōu)選地小于70％。
本發(fā)明還進(jìn)而包括了含有本發(fā)明核苷酸的生物學(xué)或轉(zhuǎn)化載體。因此，“載體”的意思為，特別是，以下之一質(zhì)粒，病毒，粘?；蜣D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后以含有上述多核苷酸的細(xì)菌。
本發(fā)明還進(jìn)而包括了已經(jīng)用上述多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的植物材料，以及已經(jīng)用或者用含有一些蛋白編碼區(qū)域的多核苷酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的上述轉(zhuǎn)化的植物材料，其中上述蛋白能夠賦予含有它的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑。
本發(fā)明進(jìn)而包括從上一段描述的植物材料再生的，外觀正常的，可育的的全株植物(whole plant)，其子代及部分，其子代包含穩(wěn)定地整合到其染色體上并以孟德?tīng)柗绞竭z傳的本發(fā)明的多核苷酸或載體。
本發(fā)明進(jìn)而包括含有本發(fā)明的多核苷酸的，外觀正常的，可育的的全株植物(whole plant)，上述全株植物是通過(guò)將從轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的多核苷酸或載體的植物材料再生的植物與已經(jīng)用含有一些蛋白的編碼區(qū)域的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行雜交而得到的，上述蛋白能夠賦予含有它的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑；本發(fā)明還包括了得到的植物的后代，它們的種子和部分。
本發(fā)明的植物可以選自田野作物，水果和蔬菜如canola，向日葵，煙草，甜菜，棉花、玉米，小麥，大麥，水稻，高梁，西紅柿，芒果，桃，蘋果，梨，草莓，香蕉，瓜，馬鈴薯，胡蘿卜，萵苣，卷心菜，洋蔥，大豆(soya spp)，甘蔗，豌豆，蠶豆，白楊，葡萄，柑橘，紫花苜蓿，黑麥，燕麥，草皮和飼用牧草，亞麻和油菜和產(chǎn)堅(jiān)果的植物，至此它們并未被逐一指出；它們的后代，種子和部分。
這樣的植物中特別優(yōu)選的包括玉米，大豆，棉花甜菜和canola。
本發(fā)明進(jìn)而包括在田野中選擇性地控制野草的方法，上述田野中含有本發(fā)明的植物或它們的除草劑抗性后代和野草，該方法包括在田野中使用足以控制野草而基本上不影響上述植物的量的草甘膦類除草劑。根據(jù)該方法可以在使用草甘膦除草劑之前或之后對(duì)田野(從而對(duì)它所包含的植物)使用一種或多種除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺線蟲劑，殺菌劑和抗病毒劑。
本發(fā)明還進(jìn)而提供了充分耐受或充分抵抗草甘膦除草劑的植物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟(i)用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物物質(zhì)；(ii)篩選這樣轉(zhuǎn)化的材料；并(iii)從這樣篩選的材料中再生形態(tài)正常的可育的的全株植物。
上述轉(zhuǎn)化可能包括通過(guò)任何已知的方法將上述多核苷酸引入到上述材料，但特別通過(guò)(i)用包被了上述多核苷酸的顆粒對(duì)上述材料進(jìn)行生物彈道轟擊(boilistic bombardment)；(ii)用含有上述多核苷酸的溶液包被的硅碳化物纖維(silicon carbide fiber)對(duì)上述材料進(jìn)行穿刺；(iii)通過(guò)將上述多核苷酸或載體引入到Agrobacterium(農(nóng)桿菌)，并將這樣轉(zhuǎn)化的Agrobacterium與植物材料共溫育，從而該植物材料被轉(zhuǎn)化并隨后再生。植物的轉(zhuǎn)化，篩選和再生技術(shù)對(duì)于具體的植物種類可能需要進(jìn)行常規(guī)的改造，這對(duì)于技術(shù)人員是眾所周知的?？梢愿鶕?jù)其草甘膦抗性對(duì)這樣轉(zhuǎn)化的植物材料進(jìn)行篩選。
本發(fā)明進(jìn)而提供了本發(fā)明的多核苷酸或載體在生產(chǎn)充分耐受或充分抵抗草甘膦除草劑的植物組織和/或形態(tài)正常的可育的的全株植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還進(jìn)而包括了進(jìn)行轉(zhuǎn)化以表達(dá)感興趣的基因的生物材料的篩選方法，其中上述轉(zhuǎn)化的材料含有本發(fā)明的多核苷酸或載體，并且其中上述篩選包括將上述轉(zhuǎn)化的材料暴露于草甘膦或它的鹽，并篩選純活的材料。上述材料可能是植物來(lái)源的，并特別可能是源自單子葉植物，上述單子葉植物選自大麥，小麥，玉米，水稻，燕麥，黑麥，高梁，菠蘿，甘蔗，香蕉，洋蔥，蘆筍和韭菜。
本發(fā)明還包括了再生可育的的轉(zhuǎn)化植物以含有外源DNA的方法，該方法包括以下步驟(a)從上述待轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生可再生的組織；(b)用上述DNA轉(zhuǎn)化上述可再生組織，其中上述外源DNA含有可篩選的序列，其中上述序列的功能是在可再生組織中作為篩選機(jī)制。
(c)在步驟(b)之后1天到60天之間，將上述來(lái)自(b)的可再生組織置于能夠從上述組織生新芽(producing shoot)的培養(yǎng)基，其中上述培養(yǎng)基進(jìn)而含有一種化合物用于篩選含有上述可篩選DNA序列的可篩選組織，以允許對(duì)上述轉(zhuǎn)化的可再生組織的鑒定或篩選。
(d)從步驟(c)的篩選組織形成至少一個(gè)新芽后，將上述新芽轉(zhuǎn)移到能從上述新芽產(chǎn)生根以產(chǎn)生小植株的第二種培養(yǎng)基，其中上述第二種培養(yǎng)基供選地含有上述化合物；并(e)將上述幼苗培育成可繁殖的轉(zhuǎn)基因植物，其中上述外源DNA以孟德?tīng)柕姆绞奖贿z傳到后代植物中，其特征在于外源DNA是，或者包含于外源DNA的可篩選DNA序列含有，根據(jù)權(quán)利要求1到34中任何一項(xiàng)的多核苷酸，并且上述化合物是草甘膦或它的鹽。如上文所指出，上述植物可以是單子葉植物，更優(yōu)選地選自香蕉，小麥，水稻，玉米和大麥，并且上述可再生組織可能由胚源性愈傷組織，體細(xì)胞胚，未成熟胚等等組成。
從下文的描述結(jié)合相關(guān)的附圖和序列表，本發(fā)明將更為清晰。
序列表SEQ ID NO.1-40 PCR引物。
SEQ ID NO.41水稻基因組EPSPS序列(從ATG開(kāi)始)。
SEQ ID NO.42含有雙突變的水稻基因組EPSPS序列。
SEQ ID NO.43玉米多泛素(polyubiquitine)增強(qiáng)子。
SEQ ID NO.44水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子1SEQ ID NO.45水稻基因組G1 EPSPS(到ATG)SEQ ID NO.46水稻基因組G3 EPSPS(到ATG)SEQ ID NO.47水稻基因組G2 EPSPS+玉米Adh1內(nèi)含子SEQ ID NO.48玉米Adh1內(nèi)含子附1水稻EPSPS基因組示意圖。
圖2載體pCR4-OEPSPS(在載體pCR4-Blunt中的水稻dmEPSPS基因)。
圖3用于引入雙突變的策略的示意。
圖4載體pTCV 1001圖5載體pTCV 1001 OSEPSPS(在載體pTCV 1001中含有水稻dmEPSPS基因)圖6載體pTCV 1001 EPSPSPAC(在載體pTCV 1001中含有水稻dmEPSPS基因)圖7載體pBluSK+EPSPS(在載體pBluescript SK+中含有水稻dmEPSPS基因)圖8載體pPAC1圖9載體pTCVEPSPSPH


圖10載體pTCVEPSPSADH
圖11載體pBluSKEPSPSADH(含有包含Adh1內(nèi)含子的水稻dmEPSPS基因)
圖12載體pIGPD9
圖13關(guān)于使用“極小EPSPS啟動(dòng)子(minimal EPSPS promotor)”的示意14載體Zen8
圖15載體Zen19
圖16載體Zen21
圖17將Zen載體引入超二元載體通過(guò)在非異源啟動(dòng)子控制下過(guò)量表達(dá)突變的EPSPS產(chǎn)生對(duì)草甘膦處理耐受的植物。
在本說(shuō)明書全文中所使用的術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”指處于啟動(dòng)子上游的，不包括啟動(dòng)子自身，但增強(qiáng)和調(diào)節(jié)從啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄的序列。在本說(shuō)明書全文中所使用的術(shù)語(yǔ)“EPSPS啟動(dòng)子缺失”指EPSPS啟動(dòng)子以及構(gòu)成EPSPS的天然增強(qiáng)子至少一部分的核苷酸，即，處于EPSPS啟動(dòng)子上游的(5’)的源自EPSPS的序列。
關(guān)于植物材料的轉(zhuǎn)化，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到盡管在下文的實(shí)施例中具體指出了特定類型的目標(biāo)材料(例如，胚發(fā)生細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物或脫分化的未成熟胚)和特定的轉(zhuǎn)化方法(例如，用Agrobacterium或顆粒轟擊)，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施方案，并且這樣的目標(biāo)材料和方法可以互換使用。進(jìn)而，在本發(fā)明的本說(shuō)明書全文使用的術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”可以指分離的細(xì)胞，包括懸浮培養(yǎng)物以及完整的或部分完整的組織，如胚，子葉盤(scutella)，花粉粒，源自花粉粒的胚的細(xì)胞或源自植物器官的體細(xì)胞。類似地，盡管具體的實(shí)施例限于玉米，小麥和水稻，本發(fā)明同樣可以應(yīng)用于廣泛的可以用適當(dāng)?shù)闹参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的農(nóng)業(yè)作物和觀賞植物(amenityplant)。
常規(guī)的分子生物學(xué)方法是根據(jù)Sambrook et al(1989)“MolecularcloningA laboratory Manual，2ndEdn.Cold Spring Harbour Lab.Press進(jìn)行的。
實(shí)施例I產(chǎn)生水稻EPSPS的cDNA探針用反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)得到編碼水稻EPSPS的部分長(zhǎng)度的cDNA。用TRI-ZOLTM方法(Life Technologies)從兩個(gè)星期大的水稻植物(Oryza sativa L.indica var Koshihikari)分離總RNA。第一條鏈cDNA的合成是通過(guò)SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)用200ng的EPSPS簡(jiǎn)并反向10引物(EPSPS degeneratereverse 10 primer)(SEQ ID NO.1)和2μg總RNA根據(jù)所提供的步驟進(jìn)行的。通過(guò)PCR合成第二條鏈和cDNA的擴(kuò)增是利用EPSPS簡(jiǎn)并引物10和4(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和PCR小珠(Pharmacia)根據(jù)制造商的指示進(jìn)行的。所有的字母代碼都是標(biāo)準(zhǔn)縮寫(Eur.J.Biochem.(1985)15015)。SEQ ID NO.1EPSPS簡(jiǎn)并反向引物10 5′GCACARGCIGCAAGIGARAAIGCCATIGCCAT 3′SEQ ID NO.2EPSPS簡(jiǎn)并正向引物4 5′GCWGGAACWGCKATGCGICCRYTIACIGC 3′用TA Cloning kitTM根據(jù)供貨商的建議將上述產(chǎn)物克隆到載體pCR2.1(Invitrogen)中。從所篩選的菌落中回收質(zhì)粒，并通過(guò)基于計(jì)算機(jī)的同源性搜索方法(BLAST)對(duì)序列進(jìn)行分析，以確認(rèn)克隆得到的RT-PCR產(chǎn)物表現(xiàn)出和已知的植物EPSPS序列具有高同源性。
實(shí)施例2水稻EPSPS基因組序列的分離和水稻EPSPS基因的克隆含有全長(zhǎng)水稻EPSPS基因和5’上游區(qū)域的基因組DNA區(qū)域是從λEMBLSP6/T7基因組文庫(kù)分離得到的，其中上述基因組文庫(kù)構(gòu)建自5天的黃化水稻幼苗(Oryza sativa L.Indica var.IR36)(Clontech)。用32P標(biāo)記的水稻EPSPS cDNA探針(實(shí)施例1)通過(guò)制造商提供的步驟對(duì)1×106個(gè)斑塊形成單位(pfu)進(jìn)行篩選。將陽(yáng)性斑塊進(jìn)行隨后的雜交篩選循環(huán)，直至得到交叉雜交純度的斑塊。根據(jù)Sambrook et al.，1989描述的方法，從噬菌體純的儲(chǔ)存物制備λ-DNA。用同樣的32P標(biāo)記的水稻EPSPS cDNA作為探針，對(duì)得到的DNA進(jìn)行限制性水解和Southern印跡分析。用諸如Perfectly BluntTM(Novagen)的方法，在可應(yīng)用的情況下，對(duì)交叉雜交的限制性片段進(jìn)行平端化，并克隆到適當(dāng)?shù)妮d體如pSTBlue(Novaen)中。然后用ABI377PRISM自動(dòng)化DNA測(cè)序儀對(duì)上述DNA進(jìn)行測(cè)序。
圖1示標(biāo)記了一些限制性位點(diǎn)的水稻EPSPS基因的示意圖。
通過(guò)PCR得到了含有編碼區(qū)，EPSPS啟動(dòng)子，部分5’上游區(qū)域和其終止子的EPSPS基因的一個(gè)3.86kb的片段。聯(lián)合使用寡聚核苷酸引物OSGRA1(SEQ ID NO 3)和OSEPSPS3(SEQ ID NO 4)擴(kuò)增所需要的區(qū)域。OSEPSPS3含有另加的Sac1和Sma1限制性酶位點(diǎn)以便于該基因在后期的載體構(gòu)建中的亞克隆。這些引物的示意位置在
圖1中給出。SEQ ID NO.3OSGRA15′ATTTCTTCTTCTTCCTCCCTTCTCCGCCTC 3′SEQ ID NO.4OSEPSPS3 5′GAGCTCCCCGGGCGAGTGTTGTTGTGTTCTGTCTAATG 3′
用高保真的Pfu TurboTM聚合酶(Stratagen)以從λ制備物(上文所述)得到的DNA作為擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物克隆到pCRblunt 4-TOPOTM(Invitrogen)并測(cè)序以驗(yàn)證完整性。
實(shí)施例3在水稻EPSPS中將T突變成I和將P突變成S。
T到I和P到S的突變是通過(guò)引入兩個(gè)點(diǎn)突變進(jìn)行的。這些點(diǎn)突變是通過(guò)PCR利用含有所需要的突變的寡聚核苷酸引物被引入到水稻基因組EPSPS基因的。圖3示標(biāo)明所使用的引物的結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。進(jìn)行了兩次獨(dú)立的PCR反應(yīng)(都用λDNA作為模板)。
1)EcoRVEnd(SEQ ID NO.5)+OSMutBot(SEQ ID NO.6)2)OsMutTop(SEQ ID NO.7)+SalIEnd(SEQ ID NO.8)SEQ ID NO.5EcoRVEnd5′GCTTACGAAGGTATGATATCCTCCTACATGTCAGGC 3′SEQ ID NO.6OSMutBot5′GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3′SEQ ID NO.7OsMutTop5′GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3′SEQ ID NO.8SalIEnd 5′GGTGGGCATTCAGTGCCAAGGAAACAGTCGACATCCGCACCAAGTTGTTTCAACC 3′在新的PCR反應(yīng)中用兩個(gè)寡聚核苷酸SalIEnd和EcoRVEnd以等摩爾濃度的各個(gè)PCR產(chǎn)物作為模板將得到的PCR產(chǎn)物連接起來(lái)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)一小份反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，并克隆到pCR-BluntIITM(Invitrogen)中?；厥召|(zhì)粒DNA并測(cè)序以檢測(cè)雙突變的成功摻入。
含有雙突變的DNA片段被如下整合到水稻EPSPS基因組克隆(
圖1)中。用Eco RV和Sal I消化含有雙突變的克隆。對(duì)含有水稻EPSPS DNAPCR產(chǎn)物的質(zhì)粒進(jìn)行類似的消化，并通過(guò)Sambrook et al.，1989中描述的常規(guī)克隆方法將含有雙突變的Eco RV/Sal I片段連接到pCR4Blunt-TOPOTM中的EPSPS基因中，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的E.coli中。從得到的菌落中回收質(zhì)粒并測(cè)序以確認(rèn)雙突變的存在，并且無(wú)進(jìn)一步的改變。這種質(zhì)粒，pCR4-OSEPSPS，在圖2中顯示。
用Pst1和Not1從pCR4-Blunt-TOPOTM上切除含有雙突變的基因組水稻EPSPS基因(圖2)并連接到載體pTCV1001(圖4)，以得到pTCV10010SEPSPS(圖5)，并且該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到E.coli中進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，從λDNA(
圖1)上切除Pac1/EcoRV限制性片段并插入到pTCV1001OSEPSPS(圖5)以得到pTCV1001EPSPSPAC(圖6)。水稻dmEPSPS基因，現(xiàn)在含有從Pac1到Sac1(圖6)的序列，從pTCV1001EPSPSPAC(圖6)上作為Eag1/Sac1片段被切除下來(lái)，并被連接到類似消化的pBluescript SK+以制備pBlueSK+EPSPS(圖7)。進(jìn)而用Xba1/Pac1將水稻EPSPS上游區(qū)域和所需要的增強(qiáng)子裝配(如下文所述)和連接到pBluescript SK+載體。
實(shí)施例4單一增強(qiáng)的生成水稻EPSPS啟動(dòng)子融合
圖1示出了用于在水稻EPSPS基因的5’端生成一系列缺失的引物G1和G2的結(jié)合位點(diǎn)。用水稻EPSPSλDNA模板和Pfu TurboTM聚合酶(Stratagen)用供貨商提供的步驟，G1和G2引物(SEQ ID NO.9和10)與RQCR10引物(SEQ ID NO.11)聯(lián)合使用。
SEQ ID NO.9G1 5′CGCCTGCAGCTCGAGGTTGGTTGGTGAGAGTGAGACACC 3′SEQ ID NO.10G2 5′CGCCTGCAGCTCGAGGCCACACCAATCCAGCTGGTGTGG 3′SEQ ID NO.11RQCR10 5′GAACCTCAGTTATATCTCATCG 3′通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析得到的產(chǎn)物，并克隆到pCR-Blunt II-TOPOTM載體(Invitrogen)。測(cè)定得到的產(chǎn)物的序列以確認(rèn)在水稻基因組EPSPS克隆的序列中并無(wú)改變。基于在載體中的定向篩選進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的克隆，上述篩選是通過(guò)證實(shí)XhoI消化是否僅僅從載體中除去多連接位點(diǎn)區(qū)域，而不是除去全部插入序列而進(jìn)行的。
玉米多泛素和水稻肌動(dòng)蛋白基因以及它們相關(guān)的5’上游區(qū)域的序列發(fā)表在EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中(U29159和X16865)。設(shè)計(jì)引物以便僅僅擴(kuò)增上述基因的上游增強(qiáng)子區(qū)域。這樣通過(guò)引物SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13聯(lián)合Pfu TurboTM聚合酶，以玉米基因組DNA作為模板得到了玉米多泛素增強(qiáng)子(SEQ ID NO.43)。這兩種引物都含有Spe1限制性位點(diǎn)以便于該增強(qiáng)子的進(jìn)一步操作(但是，注意存在于玉米多泛素增強(qiáng)子中的XhoI位點(diǎn)被用作3’限制性位點(diǎn))。水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子(SEQ IDNO.44)是以類似的方式用引物(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)以水稻基因組DNA為模板得到的。這些引物分別含有Xba I和Pst 1限制性位點(diǎn)以便于該增強(qiáng)子的進(jìn)一步操作。
使用了以下寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO.12MPU5 - 5′GCGGCCGCACTAGTGGCCGGCCATCAGCGGCCAGCTTTTGTTC 3′SEQ ID NO.13MPU3 5′TTAACTAGTGAGGAGGCCGCCTGCCGTGC 3′SEQ ID NO.14RA5 5′CGCCTCTAGAGGCCGGCCGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3′SEQ ID NO.15RA3 5′CGCTGCAGTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3′在克隆到PCR Blunt-II-TOPO載體(Invitrogen)后對(duì)擴(kuò)增和克隆的序列進(jìn)行確認(rèn)。用Not1/Xho1(MPU)或Xba1/Pst1(RA)消化含有EPSPS 5’UTR缺失的pCR Blunt-II-TOPO載體。同樣用所需要的限制性酶將增強(qiáng)子從它相應(yīng)的pCR Blunt-II-TOPO載體上切除并連接到含有5’UTR EPSPS缺失的第一載體上。
實(shí)施例5雙增強(qiáng)的生成水稻EPSPS啟動(dòng)子融合為了進(jìn)一步增強(qiáng)從水稻EPSPS啟動(dòng)子開(kāi)始的表達(dá)，在水稻肌動(dòng)蛋白EPSPS融合物中整合了一個(gè)第二水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子。在為了達(dá)到此目的，首先制備了(如實(shí)施例4所描述)含有單一(第一)增強(qiáng)子的增強(qiáng)子/EPSPS融合物。用引物RAPST(SEQ ID NO 16)和RAPAC(SEQID NO 17)擴(kuò)增了第二個(gè)水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子。這些引物便于在增強(qiáng)子的5’末端引入PST1位點(diǎn)和在3’末端引入Pac1位點(diǎn)。
SEQ ID NO.16RAPST5′gcgctgcagGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3′SEQ ID NO.17RAPAC5′gcgttaattaaTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3′
經(jīng)過(guò)測(cè)序后，PCR產(chǎn)物(為Xho1∶Xho1)被引入到含有第一水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子∶G1 EPSPS基因融合物(實(shí)施例4)的構(gòu)建體。
實(shí)施例6將Adh1內(nèi)含子插入到水稻EPSPS基因的5’UTR將玉米Adh1內(nèi)含子1插入到所需要的EPSPS啟動(dòng)子缺失(例如，按照實(shí)施例4中的描述制備)是在生成具有所需要的增強(qiáng)子的融合構(gòu)建體之前進(jìn)行的。在這個(gè)特定的實(shí)施例中Adh1內(nèi)含子被引入到G2 EPSPS啟動(dòng)子缺失中。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以采用類似的方法將Adh1內(nèi)含子整合到其它EPSPS啟動(dòng)子缺失。通過(guò)PCR玉米Adh1內(nèi)含子被插入到上述構(gòu)建體中。上述Adh1內(nèi)含子是利用引物Adh5(SEQ ID NO.18)和Adh3(SEQ ID NO.19)從合適的來(lái)源，如玉米基因組DNA或一種載體如pPAC1(圖8)，擴(kuò)增得到的。SEQ ID NO.18Adh5 cccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctgSEQ ID NO.19Adh3 gacgccatggtcgccgccatccgcagctgcacgggtccaggaaagcaatc將得到的PCR產(chǎn)物變性，并和Adh5Pac(SEQ ID NO.20)一起用作引物，以載體pTCV1001EPSPSPAC(圖2)作為模板擴(kuò)增所需要的產(chǎn)物。SEQ ID NO.20Adh5Paccgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaac得到的PCR產(chǎn)物被克隆到PCR-BluntII(Invitrogen)中。從水稻基因組克隆(
圖1)上切除Pac1∶HindIII片段并插入到pTCV1001以生成pTCVEPSPSPH(圖9)。接著，如示意圖中所示(圖9)，含有Adh1內(nèi)含子的PacI/Nco1 PCR產(chǎn)物被插入到pTCVEPSPSPH中。在克隆的EPSPS基因中含有雙突變)的Pac1∶EcoRV片段被切除下來(lái)，并用源自pTCVEPSPSPH的含有Adh1內(nèi)含子序列(圖9)的Pac1/EcoRV片段替換。最后，將含有Adh1序列的完整EPSPS基因從pTCVEPSPSPH上作為Eag1/Sac1片段切除下來(lái)，并克隆到pBluescript SK+以得到pBluSKEPSPSADH(
圖11)。
實(shí)施例7.通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)诤杏衩譨dh1內(nèi)含子的構(gòu)建體中引入優(yōu)化的前ATG共有序列(Kozak)供選地，用QuickChange Site Directed Mutagenesis kit(Stratagene)在含有Adh1內(nèi)含子的構(gòu)建體上進(jìn)行定點(diǎn)突變。這是在與增強(qiáng)子EPSPS啟動(dòng)子融合序列融合之前，在pBluescript SK+(
圖1)中的Pac1/Sac1 EPSPS片段上進(jìn)行的。根據(jù)提供的方法用下面的寡聚核苷酸對(duì)KOZAK序列進(jìn)行優(yōu)化。
SEQ ID NO.21Oskozak 5′GGACCCGTGCAGCTGCGGTACCATGGCGGCGACCATGGC 3′SEQ ID NO.22OSkozakrev 5′GCCATGGTCGCCGCCATGGTACCGCAGCTGCACGGGTCC 3′在回收的質(zhì)粒上用KpnI對(duì)克隆子進(jìn)行限制性分析。正確改變的DNA的特征為比未改變的DNA增加了一個(gè)Kpn1限制位點(diǎn)。然后通過(guò)自動(dòng)化DNA測(cè)序鑒定上述序列?？梢杂脤?duì)各個(gè)載體適當(dāng)?shù)膯我幌拗菩悦肝稽c(diǎn)5’端的Sph1或Pac1和3’端的AvrII或EcoRV將改變后的DNA序列轉(zhuǎn)移到初始的構(gòu)建體中。
實(shí)施例8 EPSPS表達(dá)盒的完成，在5’到3’的方向上含有增強(qiáng)子區(qū)域，水稻EPSPS啟動(dòng)子上游區(qū)EPSPS啟動(dòng)子，EPSPS 5’UTR+(供選)玉米Adh1內(nèi)會(huì)子1，水稻EPSPS質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)域，水稻成熟EPSPS編碼區(qū)域和水稻EPSPS基因終止子區(qū)域。
用Xba1和Pac1(RA)或Not和Pac1(MPU)切除pCRBlunt-II-TOPO載體中所包含的單或雙增強(qiáng)的水稻EPSPS啟動(dòng)子融合序列(實(shí)施例4和5)，并插入到進(jìn)行類似消化的含有其余水稻EPSPS序列(圖7/11)的pBluescript SK+克隆中。這一最終克隆步驟得到了所需要的基因構(gòu)建體?？梢酝ㄟ^(guò)以上策略得到的構(gòu)建物(EPSPS表達(dá)盒)的實(shí)施例在以下的表1中給出。示意圖在
圖14-16中給出。
EPSPS克隆第一增第二增EPSPS啟動(dòng) 5′UTL 基因組編EPSPS強(qiáng)子 強(qiáng)子 子缺失 內(nèi)含子 碼區(qū)終止子ZEN6 RA無(wú)G1 否 是 是ZEN10MPU 無(wú)G1 否 是 是ZEN13RARAG3 否 是 是ZEN26RA無(wú)最小 RA 是 是DNA構(gòu)建體的供選的進(jìn)一步裝配最小EPSPS啟動(dòng)子的應(yīng)用水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和玉米多泛素啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)域都得到了很好的定義。在這些實(shí)施例中這些基因的含有“TATA”盒的天然啟動(dòng)子被EPSPS啟動(dòng)子的那些序列取代。在本實(shí)施例中EPSPS啟動(dòng)子被用于取代水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到類似的方法可以用于許多基因。通過(guò)PCR EPSPS啟動(dòng)子被引入到水稻肌動(dòng)蛋白基因。最初進(jìn)行了四次獨(dú)立的PCR反應(yīng)。以水稻基因組DNA為模板，引物RA5E(SEQ ID NO.23)和RA3E(SEQ ID NO.24)被用于擴(kuò)增水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子元件；以水稻基因組DNA為模板引物RA5I(SEQ ID NO.25)和RA3I(SEQ ID NO.26)被用于擴(kuò)增水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子；引物EPROM53(SEQ ID NO.27)和EPROM3(SEQ ID NO.28)被用于擴(kuò)增含有啟動(dòng)子的EPSPS區(qū)域；引物REPSPS5(SEQ ID NO.29)和REPSPS3(SEQ ID NO.30)被用于擴(kuò)增翻譯起始位點(diǎn)和EcoRV位點(diǎn)之間的水稻EPSPS基因(參見(jiàn)
圖1)。每個(gè)獨(dú)立的PCR產(chǎn)物通過(guò)相繼的PCR被依次連接，因?yàn)橛糜跀U(kuò)增一個(gè)區(qū)域的各個(gè)引物含有與下一區(qū)域的連接序列。此過(guò)程的圖解在
圖13中給出。(SEQ ID NO.23)RA5E5’tctctagactcagccgcctttcactac 3’(SEQ ID NO.24)RA3E5’aaacccgggtttggaagcggagggagGAAGGAGGAGATAAAG 3’(SEQ ID NO.25)RA5I5’ACCCTCCCCTCTCtaaatcgattggtgggaggggagag 3’(SEQ ID NO.26)RA3I 5’ggtctacctacaaaaaagctccgcacgagGGTACCGCCGCTGGTAC 3’(SEQ ID NO.27)EPROM53 5’CCTTCGCCTCCCCTCcttcctcctctatttcttc 3’(SEQ ID NO.28)EPROM3 5’gttggtgggaggggagagATTTAGCTAACCACC(SEQ ID NO.29)REPSPS5 5’GTTTTTTCGAGGCGTGCTCccatggcggcgaccatggcgtcc 3’(SEQ ID NO.30)REPSPS3 5’ggaggatatcataccttcgtaagc 3’最終得到的DNA片段，含有水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子，EPSPS啟動(dòng)子，水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，到Eco RV位點(diǎn)的水稻EPSPS基因，作為Xba1/EcoRV片段被引入到pBluSK+EPSPS(圖7)以得到，例如，ZEN26。然后，完整的表達(dá)盒可以作為Xma1片段被切除以進(jìn)一步亞克隆。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以使用不同長(zhǎng)度的EPSPS啟動(dòng)子，并且不同的組分，如玉米多泛素增強(qiáng)子和內(nèi)含子可以以類似的方式使用。
實(shí)施例10.用于植物轉(zhuǎn)化的DNA的制備上述方法描述了“EPSPS表達(dá)盒”的裝配，該表達(dá)盒在5’到3’的方向上含有增強(qiáng)子序列，水稻的EPSPS啟動(dòng)子，編碼水稻EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的區(qū)域，通過(guò)在特定區(qū)域的T到I和P到S改變而具有對(duì)草甘膦的抗性的編碼水稻成熟EPSPS酶的區(qū)域和水稻EPSPS基因終止子。
供選地，所需要的表達(dá)盒還含有藥物篩選標(biāo)記基因(例如氨芐青霉素抗性，卡那霉素抗性等等)，T-DNA左或右邊界區(qū)域和(供選地)和添加5’和/或3’到上述構(gòu)建體的腳手架附接區(qū)域(scaffoldattachment region)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到與以上描述類似的方法可以被用來(lái)得到這些另加的組分，并將它們克隆到所需要的位置。
實(shí)施例11.用含有超二元載體的Agrobacterium菌株轉(zhuǎn)化玉米品系，上述超二元載體在T-DNA的右和左邊界之間包含有EPSPS表達(dá)盒；對(duì)草甘膦抗性的植物細(xì)胞的篩選和再生Agrobacterium菌株的構(gòu)建用Xam1或Xba1/Sac1消化Bluescript質(zhì)粒DNA(例如ZEN7，8，17，19，21和22)，并將這樣得到的(～5.5-7kb)編碼EPSPS的片段連接到進(jìn)行類似限制性消化的pSB1的T-DNA右和左邊界之間的克隆位點(diǎn)。在，例如，使用pZEN 8的Xma1片段的情況下，上述連接產(chǎn)生質(zhì)粒pZEN8SB11(
圖16)。Komari et al(1996，Plant J.10165-174)描述了質(zhì)粒pSB11的構(gòu)建和其親本，pSB21，的構(gòu)建。通過(guò)同源重組的方法(
圖17)將pZEN8的T-DNA區(qū)域整合到超二元pSB1載體中(Saitoet al EP 672 752 A1)以產(chǎn)生質(zhì)粒pSB1ZEN8。為了獲得上述質(zhì)粒pSB1ZEN8，將質(zhì)粒pZEN8SB11轉(zhuǎn)化到E.coli菌株HB101中，然后，根據(jù)Ditta et al(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777347-7351)的三重雜交方法，與帶有pSB1的Agrobacterium LBA4404交配，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的Agrobacterium菌株，LBA4404(pSB1ZEN8)，根據(jù)對(duì)壯觀霉素的抗性對(duì)共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pSB1ZEN8的存在進(jìn)行篩選。根據(jù)Sal1限制性分析(
圖17)也確認(rèn)了pSB1ZEN8。類似地，從pZEN7，ZEN17，ZEN19，ZEN21和ZEN22的Xam1片段開(kāi)始構(gòu)建含有完全類似的構(gòu)建體pSB1ZEN7，pSB1ZEN17，pSB1ZEN19，pSB1ZEN21和pSB1ZEN22的LBA4404菌株。
替代地，利用與上面的描述類似的那些方法，將pZEN7，ZEN8等類似的片段同源重組到超二元載體pTOK162(
圖1 US 5591616中)的右和左邊界之間的位點(diǎn)，以產(chǎn)生類似的共整合質(zhì)粒，在Agrobacteriumi中是根據(jù)對(duì)卡那霉素和壯觀霉素的共同抗性對(duì)上述共整合質(zhì)粒進(jìn)行篩選。
含有輔助質(zhì)粒PAL4404(含有完全的vir區(qū)域)的Agrobacterium菌株可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(American Type CultureCollection)(ATCC 37349)得到?？梢允褂玫囊环N替代菌株是含有輔助質(zhì)粒的Agrobacterium EHA101(1986，Hood et al，J.Bacteriol.，168(3)1283-1290)，上述輔助質(zhì)粒含有源自強(qiáng)毒性菌株Agrobacterium tumefaciens A281的vir區(qū)域。
Agrobacterium懸浮液的制備
Agrobacterium菌株LBA4404(pSB1ZEN7)，LBA4404(pSB1ZEN8)等分別在含有‘PHI-L’的固體培養(yǎng)基的板上劃線，并在28℃黑暗培養(yǎng)3到10天。
PHI-L培養(yǎng)基如WO 98/32326的第26頁(yè)(實(shí)施例4)中所描述。用雙蒸水配制的PHI-L培養(yǎng)基含有25ml/l的儲(chǔ)存液A，25ml/l的儲(chǔ)存液B，450.9ml/l的儲(chǔ)存液C和50mg/l的壯觀霉素。儲(chǔ)存液是通過(guò)高壓蒸汽消毒或過(guò)濾而除菌的。儲(chǔ)存液A為60g/l K2HPO4和20g/lNaH2PO4，用KOH調(diào)節(jié)到pH7.0；儲(chǔ)存液B為6g/l MgSO4.7H2O，3g/l KCl，20g/l NH4Cl，0.2g/l CaCl2和50mg/l FeSO4.7H2O；儲(chǔ)存液C為5.56g/l的葡萄糖和16.67g/l的瓊脂(A-7049，Sigma Chemicals，St Louis，Mo，USA)。
替代地，Agrobacterium在含有如Ishida et al(1996，NatureBiotechnology，14，745-750)所描述的YP培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，5g/l NaCl，15g/l瓊脂pH6.8)，或，替代地，如Hei et al在US 5591616中所描述的培養(yǎng)基(AB培養(yǎng)基(Drlica andKado，1974；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 713677-3681))的平板上培養(yǎng)3-10天。但是，在各種情況下，應(yīng)該對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改造以提供合適的抗生素篩選(例如在使用Agrobacterium菌株LB4404(pSB1ZEN7)等的情況下，含有50mg/ml壯觀霉素，或在使用含有pTOK162衍生的超二元載體的Agrobacterium的情況下，含有50mg/ml壯觀霉素和50mg/ml卡那霉素)。
如上文所述制備的Agrobacterium平板在4℃儲(chǔ)存，并在制備后一個(gè)月內(nèi)使用。為了制備懸浮液將主平板上的一個(gè)單一菌落在一個(gè)平板上劃線，上述平板含有，pH6.8，5g/l酵母提取物(Difco)，10g/l蛋白胨(Difco)，5g/l NaCl，15g/l瓊脂(Difco)和50mg/l壯觀霉素(或者為對(duì)具體的Agrobacterium菌株合適的篩選條件)。將平板在28℃黑暗培養(yǎng)2天。
用于轉(zhuǎn)化植物材料的Agrobacterium懸浮液的制備與US 5591616中描述的方式類似。(用良好的微生物學(xué)實(shí)踐來(lái)避免對(duì)無(wú)菌培養(yǎng)基的污染)從平板上取出3×5mm全環(huán)的Agrobacterium，轉(zhuǎn)移到并懸浮于14mlFalcon試管中的5ml無(wú)菌AA液體培養(yǎng)基。在此處使用時(shí)，pH5.2的AA液體培養(yǎng)基含有Toriyama和Hinata(1985)在Plant Science 41，179-183中所定義的主要無(wú)機(jī)鹽，氨基酸和維生素，Murashige和Skoog培養(yǎng)基的次要無(wú)機(jī)鹽(Murashige and Skoog，1962 in Physiol.Plant15，473-497)，0.5g/l酪蛋白氨基酸(酪蛋白水解物)，1mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.2mg/l的激動(dòng)素，0.1mg/l赤霉素，0.2M葡萄糖，0.2M蔗糖和0.1mM乙酰丁香酮。
替代地，通過(guò)與WO 98/32326中描述的方式類似的方法制備用于轉(zhuǎn)化植物材料的Agrobacterium懸浮液。從平板上取出3×5mm全環(huán)的Agrobacterium，并轉(zhuǎn)移到并懸浮于5ml的如WO 98/32326第26頁(yè)的實(shí)施例4所描述的無(wú)菌PHI-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，或替代地懸浮于5ml的同樣在WO 98/32326第26頁(yè)的實(shí)施例4中描述的無(wú)菌PHI-I復(fù)合培養(yǎng)基中。在任一情況下加入5ml的100mM 3’-5’-二甲氧基-4’羥基乙酰苯酮。PHI-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH5.2含有4g/l的CHU(N6)基礎(chǔ)鹽(SigmaC-1416)，1.0ml/l Eriksson維生素混合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，68.5g/l蔗糖和68.5g/l葡萄糖。PHI-I復(fù)合培養(yǎng)基，也用KOH調(diào)到pH5.2，并過(guò)濾除菌，含有4.3g/l MS鹽(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1g/l維生素檢測(cè)酪蛋白氨基酸(Difco)，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，68.5g/l蔗糖和36g/l葡萄糖。
替代地，通過(guò)與Ishida et al(1996)Nature Biotechnology，14，745-750中描述的方式類似的方法制備用于轉(zhuǎn)化植物材料的Agrobacterium懸浮液。從平板上取出3×5mm全環(huán)的Agrobacterium，并轉(zhuǎn)移到和懸浮于5ml的LS-inf培養(yǎng)基中。LS-inf培養(yǎng)基(Linsmaierand Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)用KOH調(diào)到pH5.2，含有LS主要和次要無(wú)機(jī)鹽，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1g/l維生素檢測(cè)酪蛋白氨基酸(Difco)，1.5mg/ml 2，4-D，68.5g/l蔗糖和36g/l葡萄糖。
產(chǎn)生后，將農(nóng)桿菌懸浮液用旋渦混合器混合以得到均勻的懸浮液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)到0.5×109到2×109cfu/ml之間(優(yōu)選地較低)。1×109cfu/ml相應(yīng)于在550nm的OD(1厘米)為～0.72。
在無(wú)菌的2ml微量離心管中將Agrobacterium懸浮液等分成1ml的許多份并盡快使用。
用于轉(zhuǎn)化的玉米品系適于轉(zhuǎn)化的玉米品系包括但不限于A188，F(xiàn)1 P3732，F(xiàn)1(A188×B73Ht)，F(xiàn)1(B73Ht×A188)，F(xiàn)1(A188×BMS)。各種A188，BMS(黑墨西哥甜玉米)和B73Ht是從農(nóng)業(yè)，林業(yè)和漁業(yè)部(Ministry ofAgriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries)得到的。P3732是從IWATARAKUNOU KYODOKUMIAI得到的。合適的玉米品系也包括各種A188×近親繁殖系(例如在WO 98/32326的表8中的PHJ90×A188，PHN46×A188，PHPP×A188)以及源自不同的雜合體的優(yōu)良近親繁殖系(例如在WO 98/32326的表9中PHN46，PHP28和PHJ90)。
例如，不成熟胚是從“Hi-II”玉米產(chǎn)生的?！癏i-II”是近親繁殖系之間的雜交系(A188×B73)，上述近親繁殖系是通過(guò)Hi-II親本A和Hi-II親本B之間相互雜交得到的，Hi-II親本A和Hi-II親本B可以從Maize Genetic Cooperation Stock Center(玉米遺傳合作儲(chǔ)存中心)，University of Illinois at Champaign，Urbana，Illinois)。種子，從這些雜交得到的名為“Hi-II”的種子在溫室中或在田野中種植。得到的Hi-II植物自身授粉或與姊妹植物異花授粉。
不成熟胚的制備，感染和共培育玉米不成熟胚的轉(zhuǎn)化是通過(guò)將不成熟胚與上文所描述的合適的Agrobacterium重組菌株接觸而進(jìn)行的。不成熟胚是指不成熟種子的胚，上述種子處于授粉后正在成熟的階段，不成熟胚是完整的能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂以產(chǎn)生愈傷組織細(xì)胞的組織，上述愈傷組織細(xì)胞可以分化以產(chǎn)生全株植物的組織和器官。用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選材料也包括胚的子葉盤，它也能誘導(dǎo)產(chǎn)生脫分化的愈傷組織，上述愈傷組織具有再生成已轉(zhuǎn)化的正常可育的植物的能力。用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選材料因此也包括源自這樣脫分化不成熟合子胚或子葉盤的愈傷組織。
如Green and Phillips(1976，Crop.Sci.15417-421)所描述，從正在發(fā)育的穗中無(wú)菌分離不成熟的玉米胚，或替代地通過(guò)Neuffer et al(1982，“Growing Maize for genetic purposes”in Maizefor biological research，W.F.Sheridan ed.University Press，University of North Dakota，Grand Forks，North Dakota，USA)的方法。用無(wú)菌的鑷子在授粉后9-12天(優(yōu)選地11天)從雌穗穗上無(wú)菌分離1-2mm(優(yōu)選地1-1.2mm)長(zhǎng)的不成熟玉米胚。通常在用無(wú)菌去離子水洗滌并無(wú)菌取出不成熟胚之前用2.63％的次氯酸鈉對(duì)穗的表面滅菌。不成熟胚(優(yōu)選地為～100個(gè))被直接置入含有大約2ml用于制備農(nóng)桿菌懸浮液的同樣的培養(yǎng)基(其替代物在上文描述)的2ml微量離心管中。合上管帽并對(duì)其內(nèi)容物旋渦混合幾秒鐘。倒去培養(yǎng)基，加入2ml新鮮培養(yǎng)基并重復(fù)進(jìn)行旋渦混合。倒出所有的培養(yǎng)基，將洗滌后的不成熟胚留在管底。
制備了玉米的不成熟胚后，該方法的下一階段，感染步驟，是將它們與轉(zhuǎn)化的Agrobacterium菌株接觸。
在本方法的一個(gè)實(shí)施例中，感染步驟在含有N6培養(yǎng)基(1987，ChuC.C.Proc.Symp.Plant Tissue Culture，Science Ptess，Peking.Pp43-50)的主要無(wú)機(jī)鹽和維生素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，如WO 98/32326的實(shí)施例4中所描述。如上文所描述，在PHI-A培養(yǎng)基中制備的1.0ml的Agrobacterium懸浮液被加入到微量離心管的胚中，并旋渦混合約30秒。替代地，加入在PHI-I培養(yǎng)基或在LS-inf培養(yǎng)基中制備的1.0ml Agrobacterium懸浮液，也如上文所述。
放置5分鐘后，根據(jù)最初的Agrobacterium懸浮液是否在PHI-B培養(yǎng)基，或PHI-J培養(yǎng)基，或LS-AS培養(yǎng)基中制備，將Agrobacterium和胚的懸浮液分別倒出到含有1)PHI-B培養(yǎng)基或2)PHI-J培養(yǎng)基或3)LS-AS培養(yǎng)基中任何一種的Petri平板。用巴斯德吸管吸干農(nóng)桿菌懸浮液，移動(dòng)胚，使得它們的軸側(cè)朝向培養(yǎng)基，用封口膜密封平板并在23-25℃黑暗中共培育3天。PHI-B培養(yǎng)基，pH5.8，含有4g/l的CHU(N6)基礎(chǔ)鹽(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson維生素混合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸銀，30g/l蔗糖，100mM乙酰丁香酮和3g/l脫乙酰吉蘭糖膠。PHI-J培養(yǎng)基，也調(diào)到pH 5.8，含有4.3g/lMS鹽(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/l MES(Sigma)，10mM乙酰丁香酮和8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)。LS-AS培養(yǎng)基(Linsmaier andSkoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，用KOH調(diào)到pH5.8，含有LS主要和次要無(wú)機(jī)鹽，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，700mg/l L-脯氨酸，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml2，4-D，20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/l MES(Sigma)，100mM乙酰丁香酮和8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)。
制備不成熟胚之后，如上文所述，達(dá)到感染的一種替代方法是在脫分化的過(guò)程中或脫分化后感染它們，如US 5591616中所述。不成熟胚被置于LSD1.5固體培養(yǎng)基上，上述固體培養(yǎng)基含有LS無(wú)機(jī)鹽和維生素以及100mg/ml酪蛋白氨基酸，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，20g/l蔗糖和2.3g/l脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)。在25℃ 3星期后，將從子葉盤生出的愈傷組織收集到2ml的微量離心管中，并浸泡于如上文所述在AA培養(yǎng)基中制備的1ml Agrobacterium懸浮液中。靜置5分鐘后，將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100μM乙酰丁香酮的2N6固體培養(yǎng)基上，并在黑暗中25℃共培育3天。2N6固體培養(yǎng)基含有N6培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽和維生素(1 Chu C.C.Proc.Symp.Plant TissueCulture，Science Press，Peking.pp43-50)，含有1g/l酪蛋白氨基酸，2mg/l 2，4-D，30g/l蔗糖和2g/l脫乙酰吉蘭糖膠。
“轉(zhuǎn)化子的休眠和篩選”共培育后，胚被，供選地，轉(zhuǎn)移到含有PHI-C培養(yǎng)基的平板上，其上用封口膜覆蓋并在黑暗中培養(yǎng)3天，進(jìn)行篩選前的“休眠步驟”。PHI-C培養(yǎng)基，pH5.8，含有4g/l的CHU(N6)基礎(chǔ)鹽(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson維生素混合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸銀，30g/l蔗糖，0.5g/l MES，100mg/l羧芐青霉素和8g/l純瓊脂(SigmaA-7049)。如WO 98/32326中所描述，在整個(gè)轉(zhuǎn)化方法中包括這一休眠步驟是否合乎需要隨著玉米品系而有所不同，是實(shí)驗(yàn)的事情。
對(duì)于篩選步驟，大約20個(gè)胚被轉(zhuǎn)移到許多含有PHI-D篩選培養(yǎng)基或LSD1.5篩選培養(yǎng)基的新鮮平板的各個(gè)平板，用封口膜密封并在28℃黑暗中溫育。PHI-D篩選培養(yǎng)基，用KOH調(diào)節(jié)到pH5.8，含有4g/l的CHU(N6)基礎(chǔ)鹽(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson維生素混合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸銀，30g/l蔗糖，0.5g/l MES，100mg/l羧芐青霉素和8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)以及在0.1mM到20mM之間的組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦?；谆?-甘氨酸(Sigma P-9556)。LSD1.5篩選培養(yǎng)基，用KOH調(diào)到pH5.8，含有LS主要和次要無(wú)機(jī)鹽(Linsmaierand Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，700mg/l L-脯氨酸，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，20g/l蔗糖，0.5g/l MES(Sigma)，250mg/l氨中噻肟頭孢菌素(cefotaxime)和8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)，以及在0.1mM到20mM之間的組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸(Sigma P-9556)。
替代地，在篩選的起始材料是源自不成熟胚的愈傷組織的情況下，如WO 5591616中所描述，在LSD 1.5篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)之前這樣的愈傷組織被用含有250mg/ml氨中噻肟頭孢菌素的無(wú)菌水洗滌。
在大約2個(gè)月的時(shí)期內(nèi)，以2個(gè)星期的間隔，上述胚或從上述不成熟胚增殖的細(xì)胞簇被轉(zhuǎn)移到(如果需要的話用無(wú)菌鑷子)含有新鮮篩選培養(yǎng)基的平板上。除草劑抗性的愈傷組織通過(guò)在同一培養(yǎng)基上持續(xù)生長(zhǎng)而增大，直至所選出的愈傷組織的直徑超過(guò)約1.5cm。
適當(dāng)?shù)剡x擇篩選培養(yǎng)基中N-(膦?；谆?-甘氨酸的濃度，以便篩選出合乎需要數(shù)量的真正轉(zhuǎn)化子，并且優(yōu)選地其濃度在0.5-5mM之間。優(yōu)選地，用于篩選培養(yǎng)基的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸的濃度為頭兩個(gè)星期1mM，此后3mM。
轉(zhuǎn)化子的再生/轉(zhuǎn)化植物材料的增殖和分析根據(jù)，例如，Duncan et al(1985，Planta，165，322-332)，Kamoet al(1985，Bot.Gaz.146(3)，327-334)和/或West et al(1993，ThePlant Cell，5，1361-1369)和/或Shillito et al(1989，Bio/Technol.7，581-587)所描述的方法將篩選出的愈傷組織再生成正常的可繁殖植物。例如，選擇直徑1.5-2cm的愈傷組織并轉(zhuǎn)移到再生/成熟培養(yǎng)基，并在黑暗中溫育約1-3星期以允許體細(xì)胞胚成熟。適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基，PHI-E培養(yǎng)基(WO 98/32326)，用KOH調(diào)到pH5.6，含有4.3g/l MS鹽(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，0.1mg/ml硫胺.HCl，100mg/l肌醇，2mg/l甘氨酸，0.5mg/ml玉米素，1.0mg/ml吲哚乙酸，0.1mM脫落酸，100mg/l羧芐青霉素，60g/l蔗糖，8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)和，供選地，0.02mM到1mM之間的組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦?；谆?-甘氨酸(Sigma P-9556)。
然后愈傷組織被轉(zhuǎn)移到生根/再生培養(yǎng)基中，并在25℃生長(zhǎng)，生長(zhǎng)時(shí)的光照為16小時(shí)光照(270mE m-2s-1)和8小時(shí)黑暗，或連續(xù)光照(~250mE m-2s-1)直至長(zhǎng)出芽和根。適當(dāng)?shù)纳?再生培養(yǎng)基為下段所描述的LSZ培養(yǎng)基(供選地含有膦?；谆拾彼?或pH5.6的PHI-F培養(yǎng)基，其含有4.3g/l MS鹽(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，2mg/l甘氨酸，40g/l蔗糖和1.5g/l脫?；m糖膠。
替代地，篩選出的愈傷組織被直接轉(zhuǎn)移到LSZ培養(yǎng)基，用KOH調(diào)到pH5.8，含有LS主要和次要的無(wú)機(jī)鹽(Linsmaier and Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l脯氨酸，100mg/l 1肌醇，，5mg/ml玉米素，20g/l蔗糖，0.5mg/l MES，250mg/l羧芐青霉素，8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)和，供選地，0.02mM到1mM之間的組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦?；谆?-甘氨酸(Sigma P-9556)。在黑暗中培養(yǎng)一段時(shí)間后對(duì)平板進(jìn)行光照(連續(xù)的或光/天如上文所述)并再生小植株。
將小植株轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的玻璃試管中，玻璃試管中含有PHI-F培養(yǎng)基或半強(qiáng)度的LSF培養(yǎng)基，ph5.8，含有半強(qiáng)度的LS主要鹽(Linsmaierand Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，LS次要鹽，0.5mg/ml煙酸，0.5mg/ml維生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，20g/l蔗糖，0.5mg/l MES，8g/l純瓊脂(Sigma A-7049)并再生長(zhǎng)大約一個(gè)星期。然后將小植株轉(zhuǎn)移到一盆土壤中，在生長(zhǎng)室里(85％相對(duì)濕度，600ppmCO2和250mE m-2s-1)使其變得強(qiáng)壯，并在溫室的土壤混合物中生長(zhǎng)至成熟。
如上述得到的第一代(T0)自身繁殖得到第二代(T1)種子。替代地(并優(yōu)選地)第一代植物與另一種非轉(zhuǎn)基因的玉米近親繁殖系彼此相互雜交以得到第二代種子。預(yù)期這些雜交的后代(T1)1∶1分離出抗除草劑特性。播種T1種子，在溫室中或田野中生長(zhǎng)，通過(guò)觀察不同植株的存活，可繁殖性，以及在V2和V8生長(zhǎng)期之間，包括V2和V8期，(或替代地在發(fā)芽后7-21天)噴灑25/2000g/ha草甘膦(適當(dāng)配制并，供選地，作為鹽)處理后組織壞死的癥狀，對(duì)這一代以及其后的世代的抗性水平，草甘膦抗性的遺傳和分離進(jìn)行評(píng)估。這些評(píng)估是相對(duì)于易受影響的分離子或相對(duì)于類似的未轉(zhuǎn)化的玉米品系進(jìn)行的，上述玉米品系不含有本發(fā)明或類似發(fā)明的，能夠賦于草甘膦抗性的基因。選擇表現(xiàn)出草甘膦抗性的基因并重新自交或者與未轉(zhuǎn)基因的近親繁殖系回交。
在上述過(guò)程的所有階段，供選地將轉(zhuǎn)化愈傷組織，小植株，T0和T1植物物質(zhì)的組織樣品取樣并進(jìn)行以下分析1)Southern和PCR分析，以顯示轉(zhuǎn)基因的存在，拷貝數(shù)和完整性；2)Northern(或類似的)分析，以測(cè)量轉(zhuǎn)基因的mRNA的表達(dá)；3)SDS凝膠的定量Western分析，以測(cè)量EPSPS的表達(dá)水平；以及4)在有和無(wú)草甘膦存在時(shí)測(cè)量EPSPSP酶的活性水平，以更精確地評(píng)估多少EPSPS的表達(dá)是源自上述轉(zhuǎn)基因的。
這樣的分析方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在以下的實(shí)施例17-20中描述了通過(guò)PCR測(cè)定轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)，進(jìn)行Southern分析，在E.coli中克隆和表達(dá)成熟的水稻EPSPS，水稻EPSPS的純化，產(chǎn)生多克隆抗體以純化EPSPS，在愈傷組織和植物組織中對(duì)EPSPS水平的Western分析，以及在能夠區(qū)分對(duì)草甘膦敏感的內(nèi)源EPSPS和編碼EPSPS的轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性產(chǎn)物的草甘膦濃度下測(cè)量源自植物的抽提物的EPSPS水平的適當(dāng)方法。
實(shí)施例12通過(guò)用包被了含有EPSPS表達(dá)盒的DNA的顆粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米品系；對(duì)草甘膦抗性的植物和植物細(xì)胞的篩選和再生在進(jìn)一步的實(shí)施例中，源自不成熟玉米胚的松散的胚源性愈傷組織在固體培養(yǎng)基上發(fā)生，并通過(guò)生物彈道法(biolistically)轉(zhuǎn)化。與實(shí)施例11中描述的方法類似，然后根據(jù)在含有一定濃度的草甘膦培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率對(duì)轉(zhuǎn)化的愈傷組織進(jìn)行篩選。篩選抗性的愈傷組織并再生以提供T0小植株，T0小植株轉(zhuǎn)移到盆中，生長(zhǎng)至成熟，并在溫室中自交或雜交繁殖。然后生長(zhǎng)后代種子以提供下一代的植株，并如實(shí)施例11所述評(píng)估草甘膦抗性，分析轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。
從不成熟胚發(fā)生愈傷組織適于轉(zhuǎn)化的II型松散胚源性愈傷組織是源自，例如，A188×B73玉米。也可以使用替代的近親繁殖系如B73源的，以及玉米雜交系，包括，例如，在實(shí)施例11列出的那些。通常在授粉后11天，使用實(shí)施例11中所述的方法從雌穗上無(wú)菌分離1-2mm長(zhǎng)的不成熟玉米胚。
不成熟胚被置于平板，例如，基于N6培養(yǎng)基(Chu et al，1975Scientia Sinica，18，659-668)的平板，用KOH調(diào)到pH5.8，含有1mg/l2，4-D，2.9g/l L-脯氨酸，2mg/l L-賴氨酸，100mg/l酪蛋白水解物，N6主要鹽，N6次要鹽，N6維生素，2.6g/l脫羧基吉蘭糖膠(或2g/l“Gelgro”)和20g/l蔗糖。適當(dāng)?shù)奶娲囵B(yǎng)基包括，例如，類似的培養(yǎng)基但含有MS鹽(Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant，15，473-497)代替N6鹽。替代地，該培養(yǎng)基可以含有～10mg/l麥草畏以代替2，4-D。
不成熟胚在上述培養(yǎng)基上在黑暗中～25℃培養(yǎng)，以發(fā)生愈傷組織。利用本領(lǐng)域已知的方法，以及如WO 98/44140得實(shí)施例中所描述，通過(guò)對(duì)快速生長(zhǎng)的松散胚源性細(xì)胞的目測(cè)篩選而選擇II型愈傷組織材料。例如，通過(guò)選擇可能處于細(xì)胞簇表面的優(yōu)選細(xì)胞對(duì)合適的受體細(xì)胞進(jìn)行手工篩選，合適的受體細(xì)胞可以進(jìn)而通過(guò)它們的缺少分化，個(gè)體小和高細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)體積比進(jìn)行鑒別。懸浮培養(yǎng)物是從愈傷組織內(nèi)表現(xiàn)得最少分化，最柔軟和最松散的組織發(fā)生的。在不成熟胚的最初平板培養(yǎng)大約8-16天后，具有上述形態(tài)的組織被轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的平板。然后每14-21天取出上述組織的～10％，約達(dá)到1克的小塊進(jìn)行常規(guī)繼代培養(yǎng)(subculture)。在每個(gè)步驟只將含有所需要的II型或III型形態(tài)的材料進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的制備優(yōu)選地在上述愈傷組織發(fā)生后的6個(gè)月內(nèi)，在含有合適激素例如2，4-D和NAA的液體培養(yǎng)基中開(kāi)始分散懸浮培養(yǎng)，上述激素供選地以緩慢釋放膠囊處理的形式如，例如US 5550318的實(shí)施例1和實(shí)施例2所描述。供選地，通過(guò)不時(shí)地?fù)饺胄迈r激素補(bǔ)充以維持培養(yǎng)物中的激素水平。通過(guò)，例如，將約0.5g愈傷組織加入到含有10ml懸浮培養(yǎng)基的100ml的燒瓶中開(kāi)始懸浮培養(yǎng)。每7天，用無(wú)菌大頭移液管將1ml沉降細(xì)胞和4ml條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)基的新燒瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。不能通過(guò)移液管的末端的大的細(xì)胞聚集物在每次繼代培養(yǎng)步驟被排除在外。供選地，在每次繼代培養(yǎng)步驟懸浮培養(yǎng)物被通過(guò)合適的篩子(例如，~0.5-1mm的網(wǎng)孔)。6-12星期后培養(yǎng)物變得分散。適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮培養(yǎng)基包括，例如，調(diào)到pH6.0的，含有Murashige和Skoog(1962)主要和次要鹽(供選地進(jìn)行修正以含有較低水平的，1.55g/l的硝酸氨)，30g/l蔗糖，0.25g/l硫胺，10mg/l麥草畏，25mML-脯氨酸，200mg/l酪蛋白水解物，100mg/l肌醇，500mg/l硫酸鉀和400mg/l磷酸氫鉀的培養(yǎng)基。替代地，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基含有2，4-D和/或NAA代替麥草畏。
細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的冷凍保存供選地，用防凍劑和，例如，US 5550318的實(shí)施例2中所描述的方法將上文所描述得到的懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存。冷凍保存需要在1到兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)將冰冷的防凍劑逐步添加到同樣冰冷的預(yù)冷細(xì)胞中。將混合物保持冰的溫度，直到防凍劑的最終濃度等于細(xì)胞懸浮液的體積。防凍劑的最終濃度為，例如，10％的二甲亞砜，10％聚乙二醇(6000Mw)，0.23M L-脯氨酸和0.23M蔗糖。在冰冷的條件下平衡30分鐘后，將混合物分成～0.5ml的等分，轉(zhuǎn)移到2ml的微量離心管，并以0.5℃/min的速度緩慢冷卻到-8℃。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的冰核形成后，將樣品進(jìn)一步緩慢冷卻到-35℃，然后投入到液氮中。在需要使用時(shí)將冷凍的樣品融化如下首先將它們和它們的容器在～40℃水浴約2min，然后讓它們慢慢融化至完全。細(xì)胞和防凍劑的混合物被用移液器取出到鋪在BMS“進(jìn)料器”小室(BMS“feeder”cells)上的濾紙上，并置于25℃。一旦融化的組織開(kāi)始生長(zhǎng)，它就被轉(zhuǎn)移回到新鮮的固體培養(yǎng)基上，并且一旦形成后(established)(在1到2個(gè)星期內(nèi))被進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中。一旦重新建立在液體懸浮培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，上述細(xì)胞被用于轉(zhuǎn)化。
顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化含有XmaI EPSPS表達(dá)盒的質(zhì)粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN6i，ZEN10i等等)被純化，大量生產(chǎn)(例如，合適的HisB-，RecA-E.coli宿主菌株(例如，DH5αhisB)在基本5×A培養(yǎng)基(minimal 5×A medium)(每升中含有K2HPO452.5g，KH2PO422.5g，(NH4)2SO45g和檸檬酸鈉.2H2O 2.5g)中生長(zhǎng)到穩(wěn)態(tài)期后，利用上述細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x子交換層析或CsCl2梯度密度分離)并以無(wú)菌水中的濃縮溶液的形式提供(優(yōu)選地～1mg/ml)。DNA是以環(huán)狀質(zhì)粒DNA的形式提供的，或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表達(dá)盒的線性片段，在瓊脂糖凝膠電泳純化和電洗脫后使用。
合適的轟擊裝置為，例如，Biorad PDS 1000 Helium gun。小盤被放在用于阻擋Kapton彈射彈(Kapton macroprojectile)的阻擋屏之下5-6cm。以與Klein et al 1987，Nature，327，70-73中的描述類似的方式，DNA構(gòu)建體被沉淀到平均直徑～1.0μm的鎢或者金顆粒上。例如，1.25mg的鎢或者金顆粒相繼與~20-30mgDNA，1.1M CaCl2和8.7mM精胺混合，終體積為~0.6ml。混合物在0-4℃旋渦混合10min，進(jìn)行低速離心(～500g)5min，并將大部分上清倒去。將鎢顆粒懸浮于終體積～30ml。將1-10μl的一小份取到上述顆粒槍的彈射彈上。
源自II型和/或III型愈傷組織的懸浮培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中保持3-5個(gè)月(或，替代地，從冷凍保存物復(fù)蘇)，然后將新鮮的繼代培養(yǎng)物過(guò)濾通過(guò)~0.5-1mm的不銹鋼網(wǎng)孔。然后將從上述過(guò)濾回收的約0.5ml壓縮細(xì)胞體積的細(xì)胞移到5cm濾紙上，真空干燥，然后轉(zhuǎn)移到含有3層用懸浮培養(yǎng)基潤(rùn)濕的7cm濾紙的培養(yǎng)皿。每平板的懸浮細(xì)胞被集中到樣品盤中心，移去培養(yǎng)皿蓋并在28英寸汞柱的真空中轟擊兩次。0.1或1.0mm的擋板被供選地被置于阻擋板下面2.5cm以便減輕對(duì)被轟擊組織的損傷。轟擊后，從濾紙上移去植物細(xì)胞，將植物細(xì)胞重新懸浮到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中并培養(yǎng)2-21天。替代地，將轟擊的愈傷組織從一個(gè)平板轉(zhuǎn)移到另一平板，轉(zhuǎn)移到含有同樣固體培養(yǎng)基(例如含有8g/l的純化的瓊脂)的平板上，并同樣在～25C黑暗培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)化子的篩選轉(zhuǎn)化后，在液體或固體培養(yǎng)基中的未篩選的生長(zhǎng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到濾紙上并覆蓋在含有一定篩選濃度的(0.1-20mM)組織培養(yǎng)等級(jí)的N-(膦酰基甲基)甘氨酸(Sigma)的固體培養(yǎng)基上。合適的固體篩選培養(yǎng)基包括，用KOH調(diào)節(jié)到pH5.8或6.0，含有MS或N6鹽(例如上述用于愈傷組織發(fā)生的鹽或，含有適當(dāng)?shù)沫傊砑游铮鲜鲈谝后w懸浮中用于細(xì)胞生長(zhǎng)的鹽)和N-(膦?；谆?甘氨酸的培養(yǎng)基。合適的篩選培養(yǎng)基也包括，例如，實(shí)施例11中所描述的篩選培養(yǎng)基，但在此情況下，該培養(yǎng)基被改造以便不含有抗生素。表達(dá)抗性的EPSP合酶的轉(zhuǎn)化愈傷組織的篩選是基于它們?cè)趯?duì)類似制備的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抑制作用的濃度下能夠生長(zhǎng)。生長(zhǎng)團(tuán)塊在新鮮的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。優(yōu)選地，用于篩選培養(yǎng)基中的N-(膦?；谆?甘氨酸的濃度在篩選的前兩周為約1mM，并其后為約3mM。在6-18周后，假定的抗性愈傷組織被鑒定并篩選出來(lái)。
轉(zhuǎn)化子的再生/轉(zhuǎn)化植物材料的繁殖和分析根據(jù)，例如，Duncan et al(1985，Planta，165，322-332)，Kamoet al(1985，Bot.Gaz.146(3)，327-334)和/或West et al(1993，The Plant Cell，5，1361-1369)和/或Shillito et al(1989)Bio/Technol.7，581-587所描述的方法，將篩選的愈傷組織再生成正?？捎牡闹参?。
例如，通過(guò)將胚源性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.25mg/l 2，4-D，10mg/l6-苯甲基-氨基嘌呤和，供選地，0.02-1mM N-(膦?；谆?甘氨酸，調(diào)節(jié)到pH6.0的Murashige和Skoog培養(yǎng)基，對(duì)植物進(jìn)行有效的再生。~2周后，將組織轉(zhuǎn)移到類似的但缺少激素的培養(yǎng)基。供選地，通過(guò)更多次的轉(zhuǎn)移以及經(jīng)過(guò)更長(zhǎng)的達(dá)6-8周的時(shí)間逐步降低激素水平。在2-4周后發(fā)生的新芽被轉(zhuǎn)移到含有1％蔗糖并用2g/l Gelgro固化的MS培養(yǎng)基，它們?cè)诠袒呐囵B(yǎng)基生根。
用于再生的替代方法和培養(yǎng)基如在實(shí)施例11中，除了所用的培養(yǎng)基不含抗生素。
將植物生長(zhǎng)至成熟的方法，植物通過(guò)傳代進(jìn)一步繁殖的方法，對(duì)草甘膦抗性的遺傳的分析以及對(duì)EPSPS轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)的分析，如實(shí)施例11所描述。
實(shí)施例13.用包被在碳化硅須狀物上的含有EPSPS表達(dá)盒的DNA轉(zhuǎn)化玉米品系；對(duì)草甘膦抗性的植物和植物細(xì)胞的篩選和再生在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，玉米品系包括，例如，具有基因型A188×B73的雜交系被制備為細(xì)胞懸浮物，并基本上利用如Frame et al(1994，Plant J.6，941-948)所描述的方法，通過(guò)將細(xì)胞與包被了DNA的碳化硅須狀物接觸而轉(zhuǎn)化玉米品系。如前面的實(shí)施例所描述，根據(jù)這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化愈傷組織在含有一系列濃度草甘膦的培養(yǎng)基中的不同生長(zhǎng)率進(jìn)行篩選，上述愈傷組織被再生成小植株(T0)，該小植株生長(zhǎng)至成熟并自交或雜交繁殖以提供用于進(jìn)一步繁殖的后代種子(T1)。如前面的實(shí)施例所描述，評(píng)估植物和植物材料的草甘膦抗性并分析其轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。
從不成熟胚發(fā)生愈傷組織，細(xì)胞懸浮物的制備適于轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞懸浮液供選地被冷凍保存并以以如實(shí)施例2所描述的同樣的方式提供。
轉(zhuǎn)化含有Xma1 EPSPS表達(dá)盒(例如，pZEN7i，ZEN8I等等)的源自pIGPD9的DNA質(zhì)粒被純化，被收集成堆(例如，通過(guò)陰離子交換層析或CsCl2)并在無(wú)菌水中以濃縮溶液(優(yōu)選地～1mg/ml)提供。
含有XmaI EPSPS表達(dá)盒的質(zhì)粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN7i，ZEN8i等等)被純化，大量生產(chǎn)(例如，合適的HisB-，Rec A-E.coli宿主菌株(例如，DH5αhisB)在極限5×A培養(yǎng)基(minimal 5×A medium)(每升中含有K2HPO452.5g，KH2PO422.5g，(NH4)2SO45g和檸檬酸鈉.2H2O 2.5g)中生長(zhǎng)到穩(wěn)態(tài)期后，利用上述細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x子交換層析或CsCl2梯度密度分離)并以無(wú)菌水中的濃縮溶液的形式提供(優(yōu)選地～1mg/ml)。DNA是以環(huán)狀質(zhì)粒DNA的形式提供的，或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表達(dá)盒的線性片段，在瓊脂糖凝膠電泳純化和電洗脫后使用。
轉(zhuǎn)化完全如Frame et al 1994的描述進(jìn)行。替代地，對(duì)該方法進(jìn)行某些改造，如下文所述。
繼代培養(yǎng)培養(yǎng)后一天，允許細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞在搖瓶中沉降出來(lái)。倒出用過(guò)的培養(yǎng)基并瀝干，每4ml濃縮細(xì)胞體積加入12ml pH6.0的改造后含有6mM L-脯氨酸，20g/l蔗糖，2mg/l2，4-D，0.25M山梨醇和0.25M甘露醇的N6培養(yǎng)基(Chu et al 1975)。將燒瓶放回振蕩器(在125rpm旋轉(zhuǎn)振蕩并在26-28℃溫育)45min。此后用大開(kāi)口的移液器將1ml等分的細(xì)胞懸浮液取出到一系列的無(wú)菌微量離心管中。允許每管的細(xì)胞沉降后，除去0.6ml的用過(guò)的培養(yǎng)基，使得剩下的大部分內(nèi)容物為沉降的細(xì)胞。通過(guò)在1ml的如上文所述的改良N6培養(yǎng)基中旋渦混合懸浮50mg的碳化硅須狀物(Silar SC-9whiskers，Advanced Composite Materials Corp.Greer，SC.USA)。然后將40μl的這些懸浮的須狀物和25mg含有EPSPS表達(dá)盒的線性DNA或質(zhì)粒加入到各管沉降細(xì)胞。將上述管用手指振蕩2-3次，自動(dòng)混合機(jī)混合(mixomated)(在Mixomat dental amalgem mixer(Degussa，Ontario，Canada)上)1秒，然后往每個(gè)微量離心管中加入0.3ml N6培養(yǎng)基(如上文所述進(jìn)行改造)。然后懸浮細(xì)胞被涂布到(200μl/平板)覆蓋在固體N6培養(yǎng)基(和上文所述的N6培養(yǎng)基相同，但不含有山梨醇，甘露醇，并含有30g/l蔗糖和3g/l脫乙酰吉蘭糖膠)上的濾盤上。每個(gè)平板用Urgopore膠帶(Stelrico，Brussels)包裹并在26-28℃黑暗培養(yǎng)1個(gè)星期。
轉(zhuǎn)化子的篩選如實(shí)施例12中所描述篩選轉(zhuǎn)化子，或替代地，如Frame et al 1994中所描述，但用濃度在1到5mM之間的N-(膦酰基甲基)甘氨酸代替Frame et al的出版物中所指定的bialaphos。
轉(zhuǎn)化子的再生/轉(zhuǎn)化植物材料的繁殖和分析如實(shí)施例12所描述對(duì)植物進(jìn)行再生，增殖和繁殖。如實(shí)施例12所描述分析植物的草甘膦抗性和分析植物材料轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。
表2用碳化硅須狀物轉(zhuǎn)化后EPSPS轉(zhuǎn)基因在可再生愈傷組織中的表達(dá)本表出示了EPSPS酶測(cè)試(在100μM PEP中+/-100μM草甘膦)的結(jié)果；上述結(jié)果是基于對(duì)可再生A188×B73可再生玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化愈傷組織抽提物的酶學(xué)分析，上述轉(zhuǎn)化是用ZEN13DNA通過(guò)須狀物法進(jìn)行的。每個(gè)愈傷組織品系代表兩次重復(fù)測(cè)試的單一結(jié)果。計(jì)算了真正耐受(允許～8％的抑制)的酶活性的比率，上述比率表示為轉(zhuǎn)基因活性比內(nèi)源敏感活性(＞98％抑制+草甘膦)。在一些品系中突變體EPSPS的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，值得注意的品系是90921sw3-1，在這些品系中，考慮到耐受酶的Vmax相對(duì)于野生型降低了(約三分之一)，可以估計(jì)耐受酶的表達(dá)是3-10×正常水平的內(nèi)源EPSPS(由于以下事實(shí)使得這一計(jì)算更為復(fù)雜EPSPS活性的內(nèi)源性敏感水平非同尋常地低)。通過(guò)Western分析了同樣的抽提物(在這種情況下使用抗純化的Brassicanapsus EPSPS的多克隆抗體)，并且根據(jù)與純化的水稻EPSPS反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)EPSPS的量進(jìn)行定量。Western數(shù)據(jù)表達(dá)為相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織總EPSPS增加的倍數(shù)。與酶的數(shù)據(jù)非常一致，Western數(shù)據(jù)表明在，例如，品系90928sw3-1中EPSPS的高水平表達(dá)。結(jié)果DNA 測(cè)量的活性+ 無(wú)草甘磷時(shí)真正耐 Western品系# 構(gòu)建體 100μM草甘膦 的總活性 受/敏感分析(相對(duì)(nmol/min/mg) (nmole/min/ EPSPS活于對(duì)照的(真正耐受活性＝mg) 性的比 X倍)測(cè)量的×1.08) 率90921s15-1 ZEN13 2.87 17.041∶443.14 11.8490921ti1-1 ZEN13 1.66 10.891∶632.03 15.8890928tI2-1 ZEN13 2.61 20.041∶4.5 34.315.8690921sw3- ZEN13 11 13.221∶0.3 718.88 14.96實(shí)施例14用含有超二元載體的Agrobacterium菌株轉(zhuǎn)化水稻品系，上述超二元載體在T-DNA得到左和右邊界之間包含有EPSPS表達(dá)盒；草甘膦抗性的植物細(xì)胞和植物的篩選和再生在進(jìn)一步的實(shí)施例中，從合適的水稻品系(包括，例如，品種Koshihikari，Tsukinohikari和Asanohikari)的成熟種子上分離子葉盤，脫分化，并通過(guò)農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化這樣得到的愈傷組織。在篩選和再生后，得到轉(zhuǎn)基因的小植株(T0)，這些小植株長(zhǎng)到成熟并自交或雜交繁殖以提供進(jìn)一步繁殖的后代種子(T1)。如先前的實(shí)施例中所描述，評(píng)估植物和植物材料的草甘膦抗性并分析轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。作為下文描述的方法的替代使用了US5591616實(shí)施例1中的方法，適當(dāng)?shù)馗淖円员阌貌莞熟⒋娉泵顾赜糜诤Y選。
Agrobacterium菌株的構(gòu)建Agrobacterium懸浮液的制備如實(shí)施例11所描述，構(gòu)建了含有超二元載體的Agrobacterium菌株(用質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化Agrobacterium)，其中上述超二元載體在左和右邊界之間含有所需要的EPSPS表達(dá)盒。根據(jù)實(shí)施例11中描述的方法制備懸浮液。替代地，轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌株在含有適當(dāng)?shù)暮Y選抗生素(例如，在LBA4404(pSB1ZEN13等)的情況下為50mg/l壯觀霉素)的AB培養(yǎng)基(Chilton et al，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.71，3672-3676)上生長(zhǎng)3天，并用接種環(huán)從平板上刮取細(xì)菌以在AAN培養(yǎng)基(Hiei et al，1994，The Plant Journal，6(2)，271-282)中形成密度為1-5×109細(xì)胞/ml的懸浮液。
水稻栽培品種，從子葉盤制備愈傷組織水稻栽培品種為，例如Oryza sativa L.Tsukinohikari，Asanohikari和Koshihikari。
成熟種子被去殼，在70％乙醇中洗滌，然后在1.5％NaOCl中浸泡30min以表面滅菌。無(wú)菌水漂洗后，它們?cè)趐H5.8的2N6培養(yǎng)基上30℃黑暗培養(yǎng)3個(gè)星期，上述2N6培養(yǎng)基含有N6培養(yǎng)基的主要鹽，次要鹽和維生素(Chu 1978 in Proc，.Symp.Plant Tissue Culture.，PekingScience Press，pp43-50)，30g/l蔗糖，1g/l酪蛋白水解物，2mg/l 2，4-D和2g/l脫乙酰吉蘭糖膠。從種子子葉盤增生的愈傷組織在新鮮的2N6培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-7天。篩選生長(zhǎng)的愈傷組織(直徑1-2mm)，懸浮于2N6液體培養(yǎng)基中(無(wú)脫乙酰吉蘭糖膠)，并在燒瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為在黑暗中在旋轉(zhuǎn)振蕩器上125rpm，25C。每7天換一次培養(yǎng)基。換3-4次培養(yǎng)基后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞被用于轉(zhuǎn)化。
感染，轉(zhuǎn)化和篩選允許懸浮的水稻愈傷組織細(xì)胞從懸浮液中沉降下來(lái)，然后重懸浮于Agrobacterium懸浮液中，讓它們接觸幾分鐘后，再一次讓其沉降，不漂洗，涂布于2N6-AS培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)到pH5.2并含有10g/l D-葡萄糖和100μM乙酰丁香酮的2N6培養(yǎng)基)，并在黑暗中25℃培養(yǎng)3-5天。生長(zhǎng)的材料用溶于無(wú)菌水的250mg/l的氨中噻肟頭孢菌素充分漂洗，然后轉(zhuǎn)移到2N6-CH培養(yǎng)基(用KOH調(diào)節(jié)到pH5.8，并含有250mg/l氨中噻肟頭孢菌素和0.5-6mM組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦?；谆?甘氨酸的2N6培養(yǎng)基)，或替代地，2N6K-CH培養(yǎng)基(如Hiei et al 1994的描述改造后的2N6培養(yǎng)基，但含有0.5-6mM組織培養(yǎng)級(jí)的N-(膦?；谆?甘氨酸代替潮霉素)，并在黑暗中25℃培養(yǎng)3星期。增殖的集落在第二塊篩選培養(yǎng)基上進(jìn)一步繼代培養(yǎng)7-14天。
植物的再生和分析生長(zhǎng)的集落被涂布到pH5.8的再生培養(yǎng)基上，上述再生培養(yǎng)基含有半強(qiáng)度的N6主要鹽，N6次要鹽，N6氨基酸，AA培養(yǎng)基的維生素(Chilton et al 1974)1g/l的酪蛋白水解物，20g/l蔗糖，0.2mg/l萘乙酸，1mg/l激動(dòng)素，3g/l脫乙酰吉蘭糖膠和，供選地，0.04-0.1mMN-(膦酰基甲基)甘氨酸。這些平板在25℃溫育，并保持連續(xù)光照(～2000lux)。如實(shí)施例1中所描述，再生的植物最終被轉(zhuǎn)移到盆中并在溫室中成熟。
基本上如實(shí)施例11所描述植物增殖并育種(例如，轉(zhuǎn)基因植物自交)?；旧先鐚?shí)施例11所描述，分析植物的草甘膦抗性，并分析植物材料轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。
實(shí)施例15通過(guò)微粒轟擊用含有EPSPS表達(dá)盒的DNA轉(zhuǎn)化小麥品系；草甘膦抗性的植物和植物細(xì)胞的篩選和再生在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，從在含有激素(2，4-D)的培養(yǎng)基中溫育2天的合適的小麥品系(包括，例如，春小麥cv BobWhite，和Jagger)分離不成熟胚，并用DNA包被的顆粒通過(guò)轟擊轉(zhuǎn)化上述小麥品系。在一段時(shí)間的復(fù)蘇和愈傷組織的持續(xù)生長(zhǎng)后，通過(guò)含有固定水平的草甘膦和(系列稀釋的)遞減水平的2，4-D的一系列培養(yǎng)基對(duì)形成愈傷組織的胚進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以便誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成。再生篩選的材料，以便在同樣含有草甘膦的培養(yǎng)基上形成新芽。上述材料被轉(zhuǎn)移到生根的培養(yǎng)基，并如前面關(guān)于玉米的實(shí)施例中所描述，被再生成小植株(T0)，該小植株生長(zhǎng)至成熟并自交或雜交繁殖以提供用于進(jìn)一步繁殖的后代種子(T1)。如前面的實(shí)施例所描述，評(píng)估植物和植物材料的草甘膦抗性并分析其轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)。作為下文所描述方法的替代，使用了US 5631152的實(shí)施例1中所描述的方法。
不成熟胚的制備小麥植物品系(例如春小麥Triticum aestivum cv BobWhite)在溫室中生長(zhǎng)至成熟并在開(kāi)花后期11-15分離穎果。穎果在5％NaOCl中處理15分鐘以進(jìn)行表面殺菌，然后用無(wú)菌水反復(fù)清洗。無(wú)菌分離不成熟胚，將其置于覆蓋在A2培養(yǎng)基上的3平方cm的尼龍網(wǎng)(網(wǎng)孔大小為1.5mm)上。調(diào)節(jié)至pH5.8的A2培養(yǎng)基為4.32g/l Murashige和Skoog鹽，20g/l蔗糖，0.5g/l L-谷氨酰胺，2mg/l 2，4-D，100mg/l酪蛋白水解產(chǎn)物，2mg/l甘氨酸，100mg/l肌醇，0.5mg/l煙酸，0.1mg/l硫胺.HCl和2.5g/l脫乙酰吉蘭糖膠。胚被排列在2.5cm的小盤上，數(shù)量大約為50個(gè)。平板用lukepore膠帶密封并在25℃黑暗培養(yǎng)2天。在轟擊前4個(gè)小時(shí)，胚被轉(zhuǎn)移到含有新鮮的、補(bǔ)充了36.44g/l D-山梨糖醇和36.44g/l D-甘露糖醇的A2培養(yǎng)基的平板上。胚在平板間的轉(zhuǎn)移是通過(guò)它們所放置的尼龍網(wǎng)進(jìn)行的。在轟擊前，胚在這種滲透壓強(qiáng)度增加的培養(yǎng)基上25℃黑暗放置4小時(shí)。
顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化含有XmaI EPSPS表達(dá)盒的質(zhì)粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN6i，ZEN10i等等)被純化，大量生產(chǎn)(例如，合適的HisB-，RecA-E.coli宿主菌株(例如，DH5αhisB)在極限5×A培養(yǎng)基(minimal 5×A medium)(每升中含有K2HPO452.5g，KH2PO422.5g，(NH4)2SO45g和檸檬酸鈉.2H2O 2.5g)中生長(zhǎng)到穩(wěn)態(tài)期后，利用上述細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x子交換層析或CsCl2梯度密度分離)并以無(wú)菌水中的濃縮溶液的形式提供(優(yōu)選地～1mg/ml)。DNA是以環(huán)轉(zhuǎn)質(zhì)粒DNA的形式提供的，或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表達(dá)盒的線性片段，在瓊脂糖凝膠電泳純化和電洗脫后使用。
以與Klein et al 1987，Nature，327，70-73中的描述類似的方式制備顆粒并用DNA包被。DNA的顆粒的制備和顆粒槍的操作如實(shí)施例12所描述。替代地，具體操作如下。例如，微量離心管中的60mg的鎢或者金顆粒(1.0μM)用HPLC級(jí)的乙醇反復(fù)清洗，然后在無(wú)菌水中反復(fù)清洗。將顆粒重懸浮于1ml無(wú)菌水中并以50μl的等分分裝到微量離心管中。金顆粒儲(chǔ)存于4℃，鎢顆粒儲(chǔ)存于-20℃。往每個(gè)等分的顆粒(化凍后)中加入3mg DNA并將離心管在最高速旋渦混合。在維持近于持續(xù)混合的同時(shí)，加入50μl的2.5M CaCl2和20μl 0.1M精胺。進(jìn)而旋渦混合10分鐘后，在Eppendorf微量離心機(jī)上將樣品離心5秒，倒去上清并通過(guò)相繼添加HPLC級(jí)的乙醇洗滌顆粒。顆粒充分懸浮于60μl乙醇中，并將10μl的等分分裝到每個(gè)kapton膜宏載體(kaptonmembraen macrocarrier)上，以用于PDS1000顆粒槍。
通過(guò)在70％乙醇中浸泡并在空氣中干燥對(duì)PDS1000顆粒槍部件的表面進(jìn)行滅菌。如上文所述制備的，含有排列在～2.5cm小盤上的～50個(gè)胚的靶平板被放置在距離阻擋屏6cm的地方。用1100psi的擊穿小盤(rupture disc)進(jìn)行轟擊。每個(gè)平板轟擊一次或兩次。
用有孔膠帶(pore tape)密封轟擊后的平板，并在25℃黑暗中維持16h。用氦沖擊波將胚從培養(yǎng)基的表面上脫離下來(lái)，回收并在新鮮的補(bǔ)充有同樣的甘露醇和山梨醇的A2培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過(guò)夜。然后轟擊后的胚被轉(zhuǎn)移到新鮮的A2培養(yǎng)基平板上并在篩選前25℃黑暗培養(yǎng)1個(gè)星期。
轉(zhuǎn)化子的篩選和再生經(jīng)過(guò)此復(fù)蘇期后，形成愈傷組織的胚被從網(wǎng)上取下，并以20個(gè)外植體/平板的密度被轉(zhuǎn)移到A2 2P培養(yǎng)基(A2培養(yǎng)基，調(diào)到pH5.8，含有2mM N-(膦?；谆?甘氨酸)上。在A2 2P培養(yǎng)基上一星期后，將愈傷組織移到A1 2P(A2培養(yǎng)基，含有1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸)培養(yǎng)基上2星期，然后移到A0.5 2P(A2培養(yǎng)基，含有0.5mM N-(膦?；谆?甘氨酸)培養(yǎng)基上進(jìn)而2星期。供選地，將2星期的培養(yǎng)時(shí)間減少到1星期，和/或省略中間的在A1 2P培養(yǎng)基上培養(yǎng)的步驟。供選地，N-膦?；谆拾彼岬暮Y選濃度在0.5mM到10mM之間，盡管2mM是優(yōu)選的。通過(guò)培養(yǎng)基中遞減水平的2，4-D誘導(dǎo)上述愈傷組織的全部時(shí)間為2-10個(gè)星期，優(yōu)選地為3-6個(gè)星期并且最優(yōu)選地為~4星期。
為了促進(jìn)最大限度的新芽生長(zhǎng)以及為了阻止根的發(fā)展，上述愈傷組織被轉(zhuǎn)移到Z培養(yǎng)基。Z培養(yǎng)基是含有10mg/l玉米素(zeatin)代替2，4-D，并同樣含有0.1mM N-(膦?；谆?甘氨酸的A2培養(yǎng)基。供選地，N-(膦?；谆?甘氨酸在0.04-0.25mM的范圍內(nèi)。在進(jìn)行繼代培養(yǎng)之前再生的愈傷組織被保持在上述培養(yǎng)基中3星期，繼代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育良好的新芽被切除。由于單一的愈傷組織(代表一個(gè)單一的胚)可能只產(chǎn)生一個(gè)結(jié)果，整個(gè)愈傷組織被移開(kāi)到新鮮的平板并保留切除的新芽，以保證從同一個(gè)愈傷組織產(chǎn)生的多個(gè)克隆不會(huì)被當(dāng)作分別的結(jié)果。帶有僅部分發(fā)育的新芽或無(wú)可再生部分的愈傷組織被放回Z培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3星期。在此時(shí)期后不能再生的愈傷組織被拋棄。
新芽維持在Z培養(yǎng)基上直到形成4個(gè)或更多個(gè)良好發(fā)育的葉片(長(zhǎng)度延伸到～2cm)。然后將再生植物材料小心地轉(zhuǎn)移到含有0.5MS培養(yǎng)基的塑料盆中。0.5MS培養(yǎng)基，pH5.8，為2.16g/l Murashige和Skoog鹽，15g/l蔗糖，2.5g/l活性碳，2.5g/l吉蘭糖膠，1mg/l甘氨酸，50mg/l肌醇，0.25mg/l煙酸，0.25mg/l維生素B6.HCl，0.05mg/l硫胺.HCl和0.1mM N-(膦?；谆?甘氨酸(供選地0.0-0.25mM)。一旦植物生根后，它們被轉(zhuǎn)移到盆中的土壤并斷絕培養(yǎng)基供應(yīng)(weaned)，或轉(zhuǎn)移到含有0.5MS(無(wú)N-(膦?；谆?甘氨酸)和2.5g/l活性碳的玻璃沸騰管。優(yōu)選地在生根培養(yǎng)基中含有活性碳以吸附任何隨著小植株轉(zhuǎn)移的殘留的PGRs或篩選化學(xué)試劑，并創(chuàng)造一個(gè)黑暗的生根環(huán)境，從而避免生理上異常的綠色根。
愈傷組織誘導(dǎo)和再生的第一個(gè)星期在25℃黑暗中進(jìn)行。再生的第二個(gè)星期在25℃弱光下，隨后的星期為大約2500lux，16小時(shí)光照時(shí)間。
轉(zhuǎn)化植物材料的增殖、育種和分析產(chǎn)生T1和進(jìn)一步的后代的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并基本上如先前的實(shí)施例中所描述。對(duì)草甘膦抗性的遺傳以及轉(zhuǎn)基因的存在，完整性和表達(dá)的分析如先前的實(shí)施例所描述。
實(shí)施例16通過(guò)原生質(zhì)體的電穿孔用含有EPSPS表達(dá)盒的DNA轉(zhuǎn)化小麥品系；草甘膦抗性的植物和植物細(xì)胞的篩選和再生在進(jìn)一步的實(shí)施例中，含有EPSPS表達(dá)盒的以及與實(shí)施例12，13，15中所使用的質(zhì)?；蚓€性DNA相同的質(zhì)?；蚓€性DNA被用于直接轉(zhuǎn)化能夠再生成可繁殖植株的小麥品系的原生質(zhì)體(參見(jiàn)US 5231019)。分離的小麥原生質(zhì)體，優(yōu)選地源自葉片組織或培養(yǎng)細(xì)胞(參見(jiàn)Gamborg，O.L.and Wetter，L.R.Plant Tissue Culture Methods，1975，11-21)，在0.4M甘露醇中，pH5.8，被制備成～ca 2×106原生質(zhì)體/ml。往這種懸浮液中首先加入0.5ml溶于pH5.8的改造F培養(yǎng)基(Nature(1982)，296，72-74)的40％w/v分子量6000的聚乙二醇(PEG)，然后加入含有15mg所需要的質(zhì)?；蚓€性DNA以及50mg小牛胸腺DNA的65ml的水。上述混合物在一起26℃溫育30min，不時(shí)混合并隨后用F培養(yǎng)基稀釋(Nature(1982)，296，72-74)。通過(guò)低速離心機(jī)分離原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體加入到4ml的CC培養(yǎng)基(Potrykus，Harms，Lorz，(1979)Theor.Appl.Genet.，54，209-214)中并在黑暗中24C溫育。
替代地，除了用PEG處理之外，谷類原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是通過(guò)進(jìn)一步的熱激和/或電穿孔(Neumann，E.et al(1982)，the EMBO J.，7，841-845)步驟進(jìn)行的。因此，例如，小麥原生質(zhì)體在DNA和甘露醇的水溶液中溫育，加熱到45℃ 5min，然后冷卻到0℃超過(guò)10秒。然后加入聚乙烯乙二醇到終濃度~8％w/v。在溫和但徹底混合后，在電穿孔器中進(jìn)行處理。通過(guò)70％乙醇清洗并在無(wú)菌空氣中干燥對(duì)Dialog‘Porator’(Dialog，Dusseldorf，Germany)的小室進(jìn)行滅菌。用氯化錳將原生質(zhì)體(在0.4M甘露醇中~ca 2×106原生質(zhì)體/ml+DNA)懸浮液調(diào)節(jié)至測(cè)量電阻為~1.4k ohm。體積～0.4ml的樣品受到，以10秒的間隔，應(yīng)用電壓在1000和2000V之間的三次脈沖的作用。收集這樣轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體并稀釋回CC培養(yǎng)基。
那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些轉(zhuǎn)化方法的許多置換和變化是可能的，并且，例如，通過(guò)將執(zhí)行轉(zhuǎn)化時(shí)的溶液的pH值提高到9.5和/或增加鈣離子濃度可以改善轉(zhuǎn)化。
3-14天后，正在生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到含有在1到5mM之間(優(yōu)選地為2mM)的任一篩選濃度的組織培養(yǎng)級(jí)N-(膦酰基甲基)甘氨酸(Sigma)的培養(yǎng)基。這樣鑒定的細(xì)胞集落(表現(xiàn)為能夠在至少2倍于未轉(zhuǎn)化的對(duì)照所能夠耐受的草甘膦濃度下生長(zhǎng))被轉(zhuǎn)移到同樣含有一定篩選濃度范圍的草甘膦的新鮮瓊脂培養(yǎng)基并且，如實(shí)施例15所描述，平板之間的繼代培養(yǎng)含有相繼降低濃度的2，4-D?？梢苑治錾L(zhǎng)抗性的集落中重組DNA的存在(例如通過(guò)PCR等等)?？赡茉谝部赡懿辉谟鷤M織步驟實(shí)現(xiàn)很大程度的篩選。在任何一種情況下生長(zhǎng)的愈傷組織將用于進(jìn)行下一步。
然后生長(zhǎng)的愈傷組織被轉(zhuǎn)移到含有玉米素和N-(膦?；谆?甘氨酸的新芽再生培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基，完全如實(shí)施例15所描述。如本領(lǐng)域中所已知和如實(shí)施例15所描述，并使用了實(shí)施例11中所描述的分析方法，表達(dá)草甘膦抗性的EPSP合酶的可育的的植物被再生，篩選測(cè)試。
實(shí)施例17.檢測(cè)EPSPS活性和測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)的方法。在粗植物材料中檢測(cè)EPSPS活性的方法以及區(qū)分總EPSPS中對(duì)草甘膦抗性的部分的方法EPSPS酶檢測(cè)檢測(cè)通常是根據(jù)Padgette et al 1987(Arichiyes of Biochemistryand Biophysics，258(2)564-573)的放射化學(xué)方法以K+離子作為主要的陽(yáng)離子平衡離子進(jìn)行的。檢測(cè)體系的總體積為50μl，在50mMHepes(KOH)pH7.0中，在25℃，含有純化的酶或在Hepes pH 7.0中適當(dāng)稀釋的植物提取物(參見(jiàn)下文)，上述Hepes pH7.0含有10％甘油，和5mM DTT，14C PEP或者作為可變底物(對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)定)或固定在100或250μM，以及含有2或0.75mM的莽草酸3磷酸(K+鹽)，如所指出的那樣。供選地，為了粗植物抽提物的檢測(cè)，檢測(cè)體系還含有5mM KF和/或0.1M鉬酸銨。檢測(cè)隨著14C膦酰基烯醇基丙酮酸(環(huán)己胺+鹽)的加入而開(kāi)始，并在2-10分鐘后(2分鐘為優(yōu)選的)隨著加入50μl的一份1M乙酸和九份乙醇溶液而終止。終止后，20μl被負(fù)載到synchropak AX100(25cm×4.6mm)層析柱，并用0.28M磷酸鉀pH6.5的流動(dòng)相，以0.5ml/min的流速進(jìn)行35分鐘的平臺(tái)洗脫(isocraticelution)。在這種條件下PEP和EPSP的持留時(shí)間分別為～19和25分鐘。一個(gè)CP 525TR閃爍計(jì)數(shù)器被連接到AX 100層析柱的末端。與其配合的是0.5ml的流動(dòng)池，閃爍劑(Ultima Flo AP)的流速被設(shè)定為1ml min。PEP和EPSP的相對(duì)峰面積被積分，并測(cè)定標(biāo)記的PEP轉(zhuǎn)化為EPSP的轉(zhuǎn)化百分比。利用Erithacus Sofware Ltd.的Grafit 3.09b，以簡(jiǎn)單加權(quán)通過(guò)對(duì)雙曲線的最小方差擬合確定了表觀Km和Vmax值。通常用從Km/2-10Km的8-9個(gè)濃度的可變底物以及三次重復(fù)點(diǎn)確認(rèn)了Km值。除非特地注明，在分析中僅僅包括了＜30％的底物轉(zhuǎn)化為EPSP的數(shù)據(jù)點(diǎn)。
莽草酸-3-磷酸(S3P)的制備如下往含有0.05M莽草酸，0.0665M ATP(Na鹽)，10mM KF，5mM DTT，和0.05M MgCl2·6H2O的7ml 0.3MTAPS，pH8.5中加入75μl的77單位(μmol min-1)ml-1的莽草酸激酶溶液。在室溫24小時(shí)后，通過(guò)在95℃短時(shí)間加熱終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液用0.01M Tris Hcl pH9稀釋50倍，并在Dowex 1×8-400上用0-0.34M LiCl2梯度進(jìn)行離子交換層析。將S3P級(jí)分混合到一起，凍干，溶后溶解于7ml蒸餾水中。加入28ml 0.1M Ba(CH3COOH)和189ml無(wú)水乙醇。該溶液在4℃攪拌過(guò)夜收集得到的三鋇S3P，并在30ml的67％乙醇中洗滌。洗滌后的沉淀溶于～30ml蒸餾水中。通過(guò)加入K2SO4得到所需要的S3P的K+或TMA+鹽。應(yīng)當(dāng)非常小心，以便加入的過(guò)量的硫酸鹽為最少。除去BaSO4沉淀，將含有所需要的S3P鹽的上清凍干。稱重每種鹽，并通過(guò)質(zhì)子NMR分析。根據(jù)質(zhì)子NMR，這樣制備的S3P制備物純度＞90％(根據(jù)它們的重量以及31P NMR的積分)，僅含有痕量的硫酸鉀。
適用于EPSPS檢測(cè)的植物材料抽提物的制備用液氮冷凍的臼和杵將愈傷組織或小植株材料(0.5-1.0g)研磨成細(xì)微的冰凍粉末。將上述粉末加入到等體積的適當(dāng)?shù)念A(yù)冷抽提緩沖液中(例如，pH7.5的50mM Hepes/KOH緩沖液，含有1mM EDTA，3mM DTT，1.7mM“Pefabloc”(絲氨酸蛋白酶抑制劑)，1.5mM亮肽素，1.5mM抑肽素，10％v/v甘油和1％聚乙烯吡咯烷酮)，重懸浮，混合并在低溫離心機(jī)離心沉淀。上清用Sephadex G25的PD10層析柱置換成pH 7.5的含有1mM EDTA，3mM DTT，和10％v/v甘油的25mM Hepes/KOH緩沖液。用Bradford方法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)蛋白含量。抽提物的一部分被冷凍在液氮中；一部分立即檢測(cè)。
植物抽提物的EPSPS檢測(cè)通常與，如上文所述，0.1mM14C-PEP和0.75mM莽草酸-3-磷酸在有或無(wú)0.1mM N-(膦?；谆?甘氨酸的情況下進(jìn)行。在這樣的檢測(cè)條件下，抗性形式的EPSPS(見(jiàn)下文)估計(jì)能被抑制＜8.5％，而敏感的w/t形式基本上被完全抑制(＞98％)。因此，在存在草甘膦的情況下觀察到的活性水平(A)被認(rèn)為是代表了源自轉(zhuǎn)基因表達(dá)的抗性酶水平的～92％，而敏感w/t EPSPS的水平被認(rèn)為是在無(wú)草甘膦的條件下觀察到的總EPSPS活性水平減去A×～1.08的值。因?yàn)橥蛔凅w酶的Vmax估計(jì)僅僅為w/t酶的Vmax的大約三分之一(并因?yàn)閣/t和突變體形式的Km值估計(jì)都為20μM或更小)，突變體酶多肽的表達(dá)水平與內(nèi)源w/t EPSPS表達(dá)水平相比的比率被認(rèn)為是比根據(jù)它們相對(duì)觀察活性比率計(jì)算得到的比率高3倍。還利用Westerns(參見(jiàn)下文)估計(jì)了EPSPS多肽表達(dá)的總水平。
實(shí)施例18.編碼成熟水稻EPSPS的w/t和突變cDNA在E.coli中的克隆和表達(dá)。w/t和突變體水稻EPSPS的純化和特征鑒定w/t成熟水稻EPSPS的表達(dá)，純化和特征鑒定根據(jù)廠商的建議，利用BRL的Superscript RT，通過(guò)RT-PCR從分離自水稻品種Koshihikari的RNA擴(kuò)增水稻EPSPS cDNA。根據(jù)廠商提供的方法，利用Stratagene的Pfu turbo聚合酶進(jìn)行PCR。下面的寡聚核苷酸是用在擴(kuò)增反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄步驟中。SEQ.ID.NO.31Rice 3′oligo 5′GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3′SEQ.ID.NO.32Rice 5′oligo 5′GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3′利用Invitrogens Zero Blunt TOPO試劑盒將PCR產(chǎn)物克隆到pCRBlunt II。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)了插入序列，并確認(rèn)了除了起始的Met外，預(yù)期的開(kāi)放閱讀框相應(yīng)于預(yù)期的成熟葉綠體水稻EPSPS蛋白的開(kāi)放閱讀框。用Nde1和Xho1切除克隆和確認(rèn)的水稻epsps序列，并將該純化的片段克隆到類似消化的pET24a(Novagen)中。將重組克隆引入到BL21(DE3)，一種由Stratagene提供的密碼子優(yōu)化的E.coli的RP菌株。在將1mM IPTG添加到發(fā)酵培養(yǎng)基(補(bǔ)充了100μg/ml卡那霉素的LB)后，EPSPS蛋白在上述菌株中表達(dá)。正確預(yù)期分子量的重組蛋白的鑒定是通過(guò)i)根據(jù)細(xì)胞提取物考馬斯亮藍(lán)染色的SDS凝膠與pET24a空載體轉(zhuǎn)化的類似E.coli細(xì)胞提取物考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠并排比較，以及ii)利用預(yù)先純化的植物EPSPS蛋白制備的多克隆抗體進(jìn)行Western分析。成熟水稻EPSPS蛋白的純化在～4C如下進(jìn)行。用含有5mMDTT，2mM EDTA和20％v/v甘油的50ml 0.1M Hepes/KOH緩沖液，pH7.5，洗滌25g凈重的細(xì)胞。低速離心后，細(xì)胞沉淀重懸浮于50ml同樣的緩沖液中，但上述緩沖液同時(shí)還含有2mM‘Pefabloc’，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。細(xì)胞用玻璃勻漿器重懸浮至均勻，然后用ConstantSystems(Budbrooke Rd，Warwick，U.K.)Basic Z cell disrupter在10000psi破細(xì)胞。粗提取物在～30,000g離心1小時(shí)并拋棄沉淀。加入硫酸魚精蛋白(鮭精蛋白)至終濃度0.2％，混合并將溶液放置30min。在～30,000g離心30min除去沉淀的物質(zhì)。加入Aristar級(jí)的硫酸銨至終濃度40％飽和度，攪拌30min然后在27,000g離心30min。沉淀重懸浮于～10ml的用于細(xì)胞破裂的相同緩沖液。進(jìn)一步加入硫酸銨使得溶液達(dá)到～70％飽和度，將溶液攪拌30min并再次離心以得到沉淀，沉淀重懸浮于～15mlS200緩沖液(含有1mM DTT，1mM EDTA和20％v/v甘油的10mM Hepes/KOH(pH7.8))。將該產(chǎn)物過(guò)濾(0.45微米)，負(fù)載到預(yù)先用S200緩沖液平衡的含有Superdex 200的K26/60層析柱并層析。將根據(jù)EPSPS酶活性檢測(cè)的含EPSPS的級(jí)分被混合并負(fù)載到預(yù)先用S200緩沖液平衡的含有20mlHP Q-Sepharose的xk16層析柱，用S200緩沖液洗上述層析柱，并在同樣緩沖液中的0.0M到0.2MKCl線性梯度內(nèi)洗脫EPSPS。EPSPS在相應(yīng)于或低于0.1M的鹽濃度以一個(gè)單一峰洗脫下來(lái)。混合根據(jù)EPSPS酶活性檢測(cè)到的含EPSPS的級(jí)分并負(fù)載到用Superdex 75緩沖液(25mM Hepes/KOH(pH7.5)，含有2mMDTT，1mM EDTA和10％v/v甘油)平衡的Superdex 75的HiLoad xk26/60層析柱。從層析柱上洗脫下來(lái)的EPSPS比根據(jù)推測(cè)的二體的分子量預(yù)期的要遲一些，這可能是由于在低離子強(qiáng)度下蛋白與凝膠基質(zhì)的相互作用。根據(jù)酶活性鑒定的含EPSPS的級(jí)分被混合并負(fù)載到同樣用Superdex 75緩沖液平衡的1ml的MonoQ層析柱上。該層析柱用起始緩沖液洗滌，并且EPSPS在0.0到0.2M之間的15ml線性梯度以單一峰被洗脫下來(lái)。在這一純化步驟得到將近(＞90％純度)的EPSPS。供選地，EPSPS被置換到含有1.0M(Aristar)硫酸銨的Superdex75緩沖液，并負(fù)載到在同一緩沖液平衡的10ml苯基Sepharose層析柱。EPSPS在1.0到0.0M之間的硫酸銨線性遞減梯度的早期以單一峰被洗脫下來(lái)。
米稻EPSPS的草甘膦抗性突變體的克隆，表達(dá)，純化和特征鑒定用下面的設(shè)計(jì)來(lái)引入特定突變的引物對(duì)，以pCRBlunt中的水稻EPSPS cDNA為模板，進(jìn)一步進(jìn)行兩次PCR。SEQ ID NO 33rice 5′oligo 5′GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3′SEQ ID NO 34對(duì)RV反向的水稻突變體5′GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3′SEQ ID NO 35Rice 3′oligo 5′GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3′SEQ ID NO 36對(duì)sal正向的水稻突變體5′GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3′得到的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并將產(chǎn)物以等摩爾濃度置于管中，以作為另一次用rice 5’oligo和rice 3’oligo進(jìn)行的PCR循環(huán)的模板。用Invitrogens Zero Blunt TOPO試劑盒將合成的產(chǎn)物克隆到pCRBlunt II。確認(rèn)了插入的DNA序列，并確認(rèn)了預(yù)期的開(kāi)放閱讀框相應(yīng)于預(yù)期的成熟葉綠體水稻EPSPS蛋白的開(kāi)放閱讀框(除了起始的Met外)，還確認(rèn)了所需要的突變(EPSPS序列中特定位置的T到I和P到S的特定突變)被編碼。用Nde1和Xho1切除上述克隆和確認(rèn)的水稻epsps序列，并將該純化的片段克隆到類似消化的pET24a(Novagen)中。將重組克隆引入到BL21(DE3)，一種由Stratagene提供的密碼子優(yōu)化的E.coli的RP菌株。在將1mM IPTG添加到發(fā)酵培養(yǎng)基(補(bǔ)充了100μg/ml卡那霉素的LB)后，EPSPS蛋白在上述菌株中表達(dá)。正確預(yù)期分子量的重組蛋白的鑒定是通過(guò)i)根據(jù)細(xì)胞提取物考馬斯亮藍(lán)染色的SDS凝膠與pET24a空載體轉(zhuǎn)化的類似E.coli細(xì)胞提取物考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠并排比較，以及ii)利用預(yù)先純化的植物EPSPS蛋白制備的多克隆抗體進(jìn)行Western分析。上述突變體形式的水稻EPSPS蛋白的純化和特征鑒定以上述用于w/t水稻EPSPS的方法類似的方式進(jìn)行。
如上文所述，在存在2mM莽草酸-3-磷酸時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，這樣得到的突變體形式的水稻EPSPS的表觀Vmax為～10mol/min/mg，Km為22μMPEP。在40μM PEP時(shí)，草甘膦鉀鹽的IC50值為～0.6mM。突變體EPSPS的草甘膦鉀鹽的估計(jì)Ki值為～0.2mM。
實(shí)施例19.純化的水稻EPSPS的抗體的制備和Western分析的方法使用了在兔中產(chǎn)生多克隆抗血清的常規(guī)方法。兔為年輕的雌性新西蘭白(New Zealand Whites)。免疫過(guò)程包括施用4次劑量，每次～100mg，以一個(gè)月的間隔給藥。在磷酸鹽緩沖液中的每次劑量以乳濁液的形式與Freund’s完全佐劑(劑量1)或不完全佐劑(劑量2-4)一起給藥，并被注射到4個(gè)皮下位置。在劑量1給藥之前取前血(pre-bleed)。在第2次劑量后的14天取待測(cè)血(test bleed)以確認(rèn)免疫應(yīng)答。在第4次劑量后的14天取終血(term bleed)并用于實(shí)驗(yàn)。在第4次劑量后至少經(jīng)過(guò)6星期進(jìn)行第5次最后劑量注射，并且14天后進(jìn)行最后取血(也用于實(shí)驗(yàn))。
同時(shí)制備針對(duì)以下蛋白的抗體(i)純化的天然成熟w/t水稻EPSPS(實(shí)施例8)和(ii)SDS變性的水稻EPSPS多肽，該多肽是從12％SDS凝膠帶(考馬斯亮藍(lán)染色的并排條帶精確標(biāo)記的蛋白的正確位置)切除并洗脫而來(lái)的。
用12％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS凝膠電泳和Western印跡。電泳在100V的恒定電流下進(jìn)行90分鐘。凝膠在4℃以恒定30V的電壓被過(guò)夜印跡到硝酸纖維素膜。薄膜用含有0.1％Tween的5％Marvel磷酸鹽緩沖液(PBS-吐溫)封閉1或2小時(shí)，在PBS-吐溫中洗滌薄膜3次并將薄膜與1.3mg IgG/ml(通常相當(dāng)于為1∶4000到1∶20,000終血稀釋液)的水稻EPSPS-Rb1一抗溫育。上述抗體稀釋液在含有1％Marvel和0.05％Tween20的PBS(磷酸鹽緩沖液)中作用2小時(shí)。二抗，羊抗兔HRP(Sigma A6154)在含有0.05％Tween和1％Marvel的PBS中以1∶10,000或1∶20,000使用。與二抗的溫育持續(xù)1小時(shí)，然后將上述印跡在PBS(0.05％吐溫)中洗滌3次，通常將ECL底物施用1分鐘并將底片曝光10-60秒。陰性對(duì)照印跡用的是(1)預(yù)先免疫的血清稀釋液，根據(jù)計(jì)算該稀釋液的[IgG]的量與待測(cè)免疫血清的相同(IgG是從各種血清小份被進(jìn)行常規(guī)純化并被定量以便上述稀釋液可以被直接計(jì)算)(2)單獨(dú)抗Rreund’s佐劑的免疫血清。調(diào)整對(duì)照免疫血清中的IgG濃度以便對(duì)照的IgG濃度是合適的。為了進(jìn)行上述計(jì)算，對(duì)IgG進(jìn)行了純化，IgG的純化是通過(guò)將天然抗血清通過(guò)0.45μm注射過(guò)濾器過(guò)濾并通過(guò)1ml HiTrap蛋白G層析柱(Pharmacia catno17-0404)。用0.1M甘氨酸HCl pH2.9洗脫結(jié)合在柱子上的IgG并用PBS將IgG透析過(guò)夜。通過(guò)紫外檢測(cè)估計(jì)IgG的濃度。(在280nm波長(zhǎng)，1mg ml-1純IgG溶液在1cm光徑上的吸收值為1.35)。從IgG產(chǎn)量可以計(jì)算天然抗血清中IgG的濃度，并因此計(jì)算Western印跡中正確的稀釋倍數(shù)。
植物組織樣品的制備如，例如，實(shí)施例17所描述。替代地，對(duì)于Western分析使用了一種更簡(jiǎn)單的方法。100-200mg待分析的植物組織在等體積的緩沖液(類似實(shí)施例7中的緩沖液)中被快速勻漿(例如，用ultra turrax，小球攪拌器或玻璃勻漿器)，在低溫eppendorf離心機(jī)中離心5分鐘并將上清用于a)一小份用于用Bradford方法分析蛋白，以及b)大部分與Laemli SDS‘樣品緩沖液’以1∶1混合，加熱并儲(chǔ)存，準(zhǔn)備上樣到凝膠上。通常SDS平板凝膠在10個(gè)加樣孔中裝載10個(gè)蛋白樣品。通常這些樣品為1-10μg用于分析的植物材料的粗提物和0-20ng之間的純水稻EPSPS的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些情況下，用源自Brassica napus的純化的w/t EPSPS(用上文所描述的類似方法表達(dá)和純化)制備的抗體進(jìn)行Western。在這種情況下的抗體與水稻EPSPS(或與內(nèi)源植物小麥或玉米EPSPS)交叉反應(yīng)的強(qiáng)度弱于用抗水稻EPSPS抗體的情況，但是盡管如此，仍然提供了足夠強(qiáng)度的反應(yīng)，以用于得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量信息。
實(shí)施例20.從轉(zhuǎn)基因植物材料分離基因組DNA。PCR分析。DNA探針的制備和雜交。轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和完整性基因組DNA分離自植物，小植株和愈傷組織材料，上述分離利用，例如，Dellporta et al(1983)in Chromosome Structure and FunctionImpact of New Concepts，18’th Stadler Genetics Symposium.J.P.Gustafson and R.Appels，eds).New YorkPlenum Press)pp 263-282的方法，或替代地，可以使用DNAesy試劑盒(Qiagen)。用對(duì)水稻EPSPS基因組序列中的突變特異的寡聚核苷酸引物SEQ ID NO.37和38通過(guò)熒光PCR鑒定了含有突變水稻EPSPS轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因愈傷組織和植物分離子。在PCR中包含了插入雙鏈DNA的熒光染料SYBR綠，以便用ABI3377機(jī)器通過(guò)樣品中熒光的增強(qiáng)檢測(cè)含有突變水稻EPSPS基因的樣品。替代地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解引物可以被熒光標(biāo)記并且諸如分子信標(biāo)和‘Scorpions’這樣的技術(shù)也是可行的。SEQ.ID.NO.37RiceDM Fwd2-3A5′-gtg gaa cgc tgg aat tgc aat gca at-3′SEQ.ID.NO.38Univeral Reverse 5′-gtt gca ttt cca cca gca gca gt-3′在96孔光學(xué)板(optical plate)中制備的，并用光學(xué)蓋(opticallids)(PE Biosystems)密封常規(guī)PCR在25μl的總體積中包含如下成分5.0μl gDNA模板(Qiagen Dneasy prep)12.5μl 2X SYBR Green預(yù)混合物(premix)2.5μl 5pmol/μl正向引物儲(chǔ)存液2.5μl 5pmol/μl反向引物儲(chǔ)存液2.5μl ddH2O循環(huán)參數(shù)如下階段1 50C 2min階段2 95C 10min階段3 95C 15s60C 45s從反應(yīng)的階段3開(kāi)始每7秒記錄樣品中的熒光變化。
對(duì)于Southern印跡，每次限制性消化大約10用μgDNA。用合適的限制性酶(例如，Hind III)根據(jù)廠商的說(shuō)明(例如Promega)，消化基因組DNA。選擇既在突變體EPSPS序列內(nèi)部也在其外部切割的限制性酶。用TAE(0.04M tris-乙酸，1mM EDTA)0.8％瓊脂糖凝膠分離DNA。根據(jù)Sambrook et al.，1989給出的方法，用HyBond N+硝酸纖維印跡膜(Amershampharmacia)進(jìn)行Southern印跡。通過(guò)暴露在紫外燈下DNA被交聯(lián)到膜上。
通過(guò)在凝膠上純化限制性消化的質(zhì)粒DNA或通過(guò)PCR得到用于產(chǎn)生特異性探針的DNA片段。例如，一個(gè)700bp的含有水稻EPSPS基因內(nèi)含子1的片段，是用下面列出的引物通過(guò)PCR產(chǎn)生的。SEQ.ID.NO 39INT1/5 5’cccttcctcttgcgtgaattccatttc 3’SEQ.ID.NO.40INT1/3 5’gttgtgcccctaataaccagag 3’通過(guò)隨機(jī)引物方法，例如Ready-To-Go DNA標(biāo)記小珠(AmershamPharmacia)，用32P標(biāo)記上述探針，并用，例如，MicroSpin G-25柱子(Amersham Pharmacia)，純化上述探針。
DNA凝膠的印跡在65℃在5xSSC，0.5％SDS，2xDenhardt’s溶液，0.15mg/ml變性鮭魚精子中預(yù)先雜交至少1小時(shí)。然后上述印跡與變性的探針在65℃新鮮預(yù)雜交溶液中雜交16-24小時(shí)。干燥印跡的薄膜并通過(guò)放射性自顯影顯示結(jié)果。
Southern印跡表明轉(zhuǎn)基因在單一位點(diǎn)單一整合的結(jié)果，這是由探針只與單一特異大小的限制性片段雜交而揭示的，然后通過(guò)替代的探針與上述印跡的重新雜交確認(rèn)了上述結(jié)果。對(duì)照使用的是未轉(zhuǎn)化的材料。此外，可以用對(duì)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的其它區(qū)域(例如啟動(dòng)子，5’UTR內(nèi)含子或增強(qiáng)子序列的上游)特異的雜交探針進(jìn)一步探測(cè)上述印跡，以便確認(rèn)構(gòu)建體的完整性。此外，在使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的情況下，使用特定的探針以便表明是否存在任何延伸超二元載體的RB和LB以外的DNA。SEQ ID NO.41水稻EPSPS基因組(ATG-WT序列)atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctcgtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcggtggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggagatctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacgcggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgtgaaatcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgatgagatataactgaggttctggttttaatcacacactcatataaccaatttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcacgacggtatgatccactcaaaacaagtttcttaacgagtctggtgaggtctgttatgaaatttgtgtaaactaaggcaactttggaggtttcgcactgtaccaatgttatgtttgaacattttgcaagcagtgctttctcccaaaattatgcaattttgaggcccctctacatcattataattccccaatacattgctctttattcttaatagctttgatcgcgaaatttaacattttaattcttgagctgttattttgtagcatcagtttatcatgagccatgtttggtactaaatatacaatcccttgggtttatttgtttccaagcatgtcattaacttatcttaatgtggacaagaaactgatgcctgcttacattgctattatttcaagcgggtattgatcctttgacatgtgattgatcatttttttttctctggttattagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggatgttcactacatgcttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaagtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaactgcaatgcgaccattgacagcagccgtgactgctgctggtggaaatgcaacgtatgtttttttttttaatgtttatgaaaatatgtatggaattcatggggtatgttttatgacctttttctttaccatcagttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggttgtcgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaattggaggacttcctggtggcaaggttagttactcctaaactgcatcctttgtacttctgtatgcacctcaattctttgtcaaccttctgcatttataaggaacattctatgatgcaattcgaccttacactgcacagtaacttgaaatgtttcatgcttaatcaatatgccatattcctgccaagctcaagcgagcaatatttgtttgaatttggtaccatatttttgtatatttgggcattcctttttggtcttgatgtcttcttttgaattagcatttaactgaattacactcaacaggttaagctctctggttccatcagcagtcagtacttgagtgccttgctgatggctgctcctttggcccttggggatgtggagatcgaaatcattgacaaactaatctccattccttacgttgaaatgacattgagattgatggagcgttttggtgtgaaggcagagcattctgatagttgggacagattctatattaagggagggcagaagtacaagtaagcttctacctgccttactgagctgaattattcgggtgtttatgattaactccctaaactaaccctttttcttttctttggcattgacagatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgatgcctcaagcgcgagctatttcttggctggtgctgcaatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcaggtataactgtagtgcctgttttgacattctaccgtttagtcaagtttagtcagtagtcacatattcagaatatagcacaatctgtattatgccactgttaatcaaatacgcttgacctagagagtgctatataccctagcttaatcttcaaactaaacagttctcttgtggcttgctgtgctgttatgttccctgacctacatgttaatattacagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacaccagtgtaaccgtaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcctgatgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgctgatggtccaactgctatcagagatggtaaacattaaggcctattatacctgttctatcatactagcaattactgcttagcattgtgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaaatataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtttcagctatgaagtttgctgctggcaattttctgaacggtttcagctaaattgcatgtttgttcatcatacttatccattgtcttccacagtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaaggatggttgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcattcttcaagtagtttgttcataagttgaattctccttcaatgatgtttaaattcatcatcttcttttttggtgttgtgccagctgggagcatcggttgaagaaggtcctgactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatggccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttcgacgttctaagcactttcgtcaggaactgaactgagcttttaaaagagtgaggtctaggttctgttgtctgtctgtccatcatccatgtgttgactgttgagggaactcgtttcttcttttcttcacgagatgagtttttgtgtgcctgtaatactagtttgtagcaaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggtaaaatgagatctgtacactaaattcattcagactgttttggcataaagaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcactaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacgacagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtgttgtttgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaactcaatcatacataacaagcccaagcaacattagacagaacacaacaacactcgSEQ ID NO.42水稻EPSPS基因組(從ATG，包括雙突變)atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctcgtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcggtggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggagatctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacgcggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgtgaaatcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgatgagatataactgaggttctggttttaatcacacactcatataaccaatttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcacgacggtatgatccactcaaaacaagtttcttaacgagtctggtgaggtctgttatgaaatttgtgtaaactaaggcaactttggaggtttcgcactgtaccaatgttatgtttgaacattttgcaagcagtgctttctcccaaaattatgcaattttgaggctcctctacatcattataattccccaatacattgctctttattcttaatagctttgatcgcgaaatttaacattttaattcttgagctgttattttgtagcatcagtttatcatgagccatgtttggtactaaatatacaatcccttgggtttatttgtttccaagcatgtcattaacttatcttaatgtggacaagaaactgatgcctgcttacattgctattatttcaagcgggtattgatcctttgacatgtgattgaccatttttttttctctggttattagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggatgttcactacatgcttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaagtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaaTtgcaatgcgaTcattgacagcagccgtgactgctgctggtggaaatgcaacgtatgtttttttttttaatgtttatgaaaatatgtatggaattcatggggtatgttttatgacctttttctttaccatcagttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggttgtcgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaattggaggacttcctggtggcaaggttagttactcctaaactgcatcctttgtacttctgtatgcacctcaattctttgtcaaccttctgcatttataaggaacattctatgatgcaattcgaccttacactgcacagtaacttgaaatgtttcatgcttaatcaatatgccatattcctgccaagctcaagcgagcaatatttgtttgaatttggtaccatatttttgtatatttgggcattcctttttggtcttgatgtcttcttttgaattagcatttaactgaattacactcaacaggttaagctctctggttccatcagcagtcagtacttgagtgccttgctgatggctgctcctttggcccttggggatgtggagatcgaaatcattgacaaactaatctccattccttacgttgaaatgacattgagattgatggagcgttttggtgtgaaggcagagcattctgatagttgggacagattctatattaagggagggcagaagtacaagtaagcttctacctgccttactgagctgaattattcgggtgtttatgattaactccctaaactaaccctttttcttttctttggcattgacagatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgatgcctcaagcgcgagctatttcttggctggtgctgcaatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcaggcataactgtagtgcctgttttgacattctaccgtttagtcaagtttagtcagtagtcacatattcagaatatagcacaatctgtattatgccactgttaatcaaatacgcttgacctagagagtgctatataccctagcttaatcttcaaactaaacagttctcttgtggcttgctgtgctgttatgttccctgacctacatgttaatattacagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacaccagtgtaaccgtaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcctgatgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgctgatggtccaactgctatcagagatggtaaacattaaggcctattatacctgttctatcatactagcaattactgcttagcattgtgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaaatataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtttcagctatgaagtttgctgctggcaattttctgaacggtttcagctaaattgcatgtttgttcatcatacttatccattgtcttccacagtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaaggatggttgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcattcttcaagtagtttgttcataagttgaattctccttcaatgatgtttaaattcatcatcttcttttttggtgttgtgccagctgggagcatcggttgaagaaggtcctgactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatggccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttcgacgttctaagcactttcgtcaggaactgaactgagcttttaaaagagtgaggtctaggttctgttgtctgtctgtccatcatccatgtgttgactgttgagggaactcgtttcttcttttcttcacgagatgagtttttgtgtgcctgtaatactagtttgtagcaaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggtaaaatgagatctgtacactaaattcattcagactgttttggcataaagaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcactaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacgacagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtgttgtttgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaactcaatcatacataacaagcccaagcaacattagacagaacacaacaacactcgSEQ ID NO.43玉米多泛素增強(qiáng)子ttcagccttcgatgtggatgcaacagcttcacaggattccattaaatcgtagccattgtgtcaaagtttgctttgccaacgttatttatttatttatttagaaaaccagctttgaccagccgccctctttacgtttggcacaatttagctgaatccggcggcatggcaaggtagactgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatatttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctccttttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcgcggcatctctgtcgctgcctctggacccctSEQ ID NO.44水稻肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子gatatccctcagccgcctttcactatcttttttgcccgagtcattgtcatgtgaaccttggcatgtataatcggtgaattgcgtcgattttcctcttataggtgggccaatgaatccgtgtgatcgcgtctgattggctagagatatgtttcttccttgttggatgtattttcatacataatcatatgcatacaaatatttcattacactttatagaaatggtcagtaataaaccctatcactatgtctggtgtttcattttatttgcttttaaacgaaaattgacttcctgattcaatatttaaggatcgtcaacggtgtgcagttactaaattctggtttgtaggaactatagtaaactattcaagtcttcac北attgtgcactcacctctcgccacatcaccacagatgttattcacgtcttaaatttgaactacacatcatattgacacaatattttttttaaataagcgattaaaacctagcctctatgtcaacaatggtgtacataaccagcgaagtttagggagtaaaaaacatcgccttacacaaagttcgctttaaaaaataaagagtaaattttactttggaccacccttcaaccaatgtttcactttagaacgagtaattttattattgtcactttggaccaccctcaaatcttttttccatctacatccaatttatcatgtcaaagaaatggtctacatacagctaaggagatttatcgacgaatagtagctagcatactcgaggtcattcatatgcttgagaagagagtcgggatagtccaaaataaaacaaaggtaagattacctggtcaaaagtgaaaacatcagttaaaaggtggtataaagtaaaatatcggtaataaaaggtggcccaaagtgaaatttactcttttctactattataaaaattgaggatgtttttgtcggtactttgatacgtcatttttgtatgaattggtttttaagtttattcgcttttggaaatgcatatctgtatttgagtcgggttttaagttcgtttgcttttgtaaatacagagggatttgtataagaaatatctttaaaaaaacccatatgctaatttgacataatttttgagaaaaatatatattcaggcgaattctcacaatgaacaataataagattaaaatagctttcccccgttgcagcgcatgggtattttttctagtaaaaataaaagataaacttagactcaaaacatttacaaaaacaacccctaaagttcctaaagcccaaagtgctatccacgatccatagcaagcccagcccaacccaacccaacccaacccaccccagtccagccaactggacaatagtctccacacccccccactatcaccgtgagttgtccgcacgcaccgcacgtctcgcagccaaaaaaaaaaaaagaaagaaaaaaaagaaaaagaaaaaacagcaggtgggtccgggtcgtgggggccggaaacgcgaggaggatcgcgagcaSEQ ID NO.45水稻基因組G1 EPSPS(到ATG)gttggttggtgagagtgagacaccgacggaacggaaggagaaccacgccgcttggatttttcttttttaccttttcaaattttaatttaaaaaataaaaccattttaaaaacttatcttcaaatacaaatcttttaaaaacactaacacgtgacacacagcgggcacgtcacccaaacgggcgtgacaatattgttttgccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgttcatatattgaaaataaaatttaaaacaatttatattttttatctatatcattataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgcatgagtcggtttttaagtttgttcgcttttggaaatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaatacaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaaaaaactcgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataattttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccttcttcctcctctatttcttcttcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaatgSEQ ID NO.46水稻基因組G3 EPSPS(到ATG)ttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccttcttcctcctctatttcttcttcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaatgSEQ ID NO.47水稻基因組G2 EPSPS+玉米Adh1內(nèi)含子gccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgttcatatattgaaaataaaatttaaaacaatttatattttttatctatatcattataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgcatgagtcggtttttaagtttgttcgcttttggaaatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaatacaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaaaaaactcgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataattttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccttcttcctcctctatttcttcttcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctgactaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttcgtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgcagtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttcttttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaatctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccatccgacagtctggctgaacacatcatacgatattgagcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatcagtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggaggcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctcggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtccattcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatgatttagcttgactatgcgattgctttcctggacccgtgcagctgcggatgSEQ ID No.48玉米Adh1內(nèi)含子gtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctgactaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttcgtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgcagtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttcttttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaatctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccatccgacagtctggctgaacacatcatacgatattgagcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatcagtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggaggcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctcggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtccattcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatgatttagcttgactatgcgattgctttcctggacccgtgcag
序列表<110>Zeneca Ltd<120>抗除草劑植物<130>ppd50450<140><141><160>48<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<220><221>modified base<222>9，15，21，27<223>a is Inosine<400>1gcacargcag caagagaraa agccatagcc at32<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<220><221>modified_base<222>18，24，27<223>a is Inosine<400>2gcwggaacwg cmatgcgacc rytaacagc 29<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3atttcttctt cttcctccct tctccgcctc 30<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4gagctccccg ggcgagtgtt gttgtgttct gtctaatg 38<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5gcttacgaag gtatgatatc ctcctacatg tcaggc 36<210>6<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>6gcagtcacgg ctgctgtcaa tgatcgcatt gcaattccag cgttcc 46<210>7<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>7ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 46<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>8ggtgggcatt cagtgccaag gaaacagtcg acatccgcac caagttgttt 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權(quán)利要求
1.含有SEQ ID No.41.中所描述序列的一種分離的多核苷酸。
2.一種編碼EPSPS的多核苷酸，不包括編碼水稻和玉米EPSPS的cDNA，上述多核苷酸與一種序列互補(bǔ)，該序列在含有0.1％SDS的0.1強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液中65-70℃之間溫育，然后用含有0.1％SDS的0.1強(qiáng)度的檸檬酸鹽緩沖液在同樣溫度洗滌時(shí)，仍然與SEQ ID NO.41中所描述的序列雜交。
3.一種編碼EPSPS的多核苷酸，該多核苷酸可以通過(guò)用組成SEQID NO.41序列內(nèi)的內(nèi)含子的核苷酸篩選植物基因組DNA文庫(kù)而得到。
4.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及編碼該肽3’的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(EPSPS)的區(qū)域，上述區(qū)域處于一種植物可操作啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控之下，前提為上述啟動(dòng)子與上述區(qū)域不是異源的，并且葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與上述合酶不是異源的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的一種多核苷酸，在5’到3’的轉(zhuǎn)錄方向中包括以下組分(i)至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，其增強(qiáng)區(qū)處于序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，該序列為增強(qiáng)子從其所獲得的序列，并且上述增強(qiáng)子自身不作為啟動(dòng)子起作用，不論作為內(nèi)源所含有的序列中，還是作為構(gòu)建體的一部分而異源存在時(shí)；(ii)源自水稻EPSPS基因的啟動(dòng)子；(iii)編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列；(iv)編碼水稻EPSPS的基因組序列；(v)轉(zhuǎn)錄終止子；其中水稻EPSPS編碼序列被改造，以便使一個(gè)第1位置被突變，從而該位置的殘基為Ile而不是Thr，以及使一個(gè)第2位置被突變，從而該位置的殘基為Ser而不是Pro，突變被引入到在野生型酶中含有以下保守序列GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS基因中從而使改造后的序列為GNAGIAMRSLTAAV。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸，其中上述增強(qiáng)子包含一個(gè)序列，該序列的3’末端位于增強(qiáng)子所來(lái)自的序列的最接近的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的至少40個(gè)核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中任何一項(xiàng)的一種多核苷酸，其中增強(qiáng)子含有一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域的3’末端處于上述最接近的起始位點(diǎn)上游至少60個(gè)核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的一種多核苷酸，其中上述增強(qiáng)子含有一個(gè)序列，該序列的3’末端處于增強(qiáng)子所來(lái)自的序列的TATA共有序列的第一個(gè)核苷酸的上游至少10個(gè)核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的多核苷酸，含有第一或第二轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的多核苷酸，其中第一和第二增強(qiáng)子以串連的方式存在于多核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游大約100到大約1000個(gè)核苷酸，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游大約100到大約1000個(gè)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約150到大約1000個(gè)核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約300到950個(gè)核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約70和大約790個(gè)核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，可以處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約300到大約380個(gè)核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-13，和15中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中增強(qiáng)子的3’末端，或第一個(gè)增強(qiáng)子的3’末端，處于相應(yīng)于EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的上游，或者處于5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸的上游，大約320到大約350個(gè)核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中水稻EPSPS基因的啟動(dòng)子上游的區(qū)域含有至少一個(gè)增強(qiáng)子，該增強(qiáng)子源自從玉米多泛素或水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的多核苷酸，在5’到3’的方向上含有一個(gè)第一增強(qiáng)子，該第一增強(qiáng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，該轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域源自位于水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的序列，以及含有一個(gè)第二啟動(dòng)子，該第二啟動(dòng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，該轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域源自位于水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中組成水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的密碼子的5’核苷酸是Kozack優(yōu)選的。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列的5’端具有一個(gè)非翻譯區(qū)域，該區(qū)域含有一個(gè)作為內(nèi)含子的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的多核苷酸，其中非翻譯區(qū)含有一個(gè)內(nèi)含子，其中該內(nèi)含子是玉米ADHI內(nèi)含子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21或20中任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中非翻譯區(qū)含有SEQ ID NO 48中所描述的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的多核苷酸，其中非翻譯區(qū)包括一個(gè)內(nèi)含子，其中該內(nèi)含子是水稻內(nèi)含子1或玉米多泛素內(nèi)含子。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任何一項(xiàng)的多核苷酸，該多核苷酸含有一個(gè)病毒源的翻譯增強(qiáng)子，該翻譯增強(qiáng)子位于編碼水稻EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的水稻基因組序列的5’端的非翻譯區(qū)域。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任何一項(xiàng)的多核苷酸，該多核苷酸進(jìn)而含有編碼一些蛋白的區(qū)域，這些蛋白能夠賦予含有它的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的多核苷酸，其中除草劑可以是草甘膦以外的除草劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26任何一項(xiàng)的多核苷酸，其中賦于昆蟲抗性的區(qū)域編碼源自Bt的結(jié)晶毒素，包括分泌的Bt毒素；蛋白酶抑制劑，植物凝集素，奇異桿狀體/光桿狀體毒素；賦予真菌抗性的區(qū)域選自那些編碼已知的AFPs，防御素，幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶，Avr-Cf9的區(qū)域；賦予細(xì)菌抗性的區(qū)域選自那些編碼天蠶抗菌肽和techyplesin以及它們的類似物的區(qū)域；賦予病毒抗性的區(qū)域選自那些編碼已知能夠提供病毒抗性的病毒包被蛋白，移動(dòng)蛋白，病毒復(fù)制酶和反義和核酶序列的區(qū)域；而賦予脅迫，鹽和干旱抗性的區(qū)域選自那些編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化物酶的區(qū)域，組成已知的CBF1調(diào)節(jié)序列的序列以及已知能提供海藻糖富集的基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的多核苷酸，其中賦于昆蟲抗性的區(qū)域選自cryIAc，cryIAb，cry3A，VipA，Vip1B，半胱氨酸蛋白酶抑制劑和雪花蓮凝集素基因。
29.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的多核苷酸，該多核苷酸被修飾因?yàn)閙RNA不穩(wěn)定區(qū)域和/或多余的剪接區(qū)域被除去，或使用作物優(yōu)選的密碼子，以便這樣修飾后的多核苷酸的表達(dá)在植物中產(chǎn)生基本相似的蛋白，該蛋白的活性/功能和未修飾的多核苷酸在特定生物中的表達(dá)所獲得的功能/活性基本相似，上述特定生物為未修飾的多核苷酸蛋白編碼序列在其中是內(nèi)源的生物。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求的多核苷酸，其中修飾的多核苷酸和在上述植物中編碼基本相同蛋白的，且為內(nèi)源含有的多核苷酸之間的同一性程度是，防止修飾的和內(nèi)源序列之間的共抑制。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求的多核苷酸，其中上述同一性程度約小于70％。
32.一種含有任何前述權(quán)利要求的多核苷酸的載體。
33.一種已經(jīng)用權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸，或權(quán)利要求32的載體轉(zhuǎn)化的植物材料。
34.已經(jīng)用任何權(quán)利要求1-31的多核苷酸，或權(quán)利要求32的載體轉(zhuǎn)化的以及已經(jīng)用或者用含有一些蛋白編碼區(qū)域的多核苷酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的植物材料，其中上述蛋白能夠賦予含有它的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑。
35.已經(jīng)從根據(jù)權(quán)利要求33或34的材料再生的，外觀正常的，可育的的全株植物，它們的后代種子和部分。
36.含有權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸的外觀正常的，可育的的全株植物，上述全株植物是通過(guò)將從轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體的植物材料上再生的植物與已經(jīng)用含有一些蛋白的編碼區(qū)域的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行雜交而得到的，上述蛋白能夠賦予含有它的植物至少一種以下的合乎農(nóng)業(yè)需要的特征抗昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱、和除草劑；得到的植物的后代，它們的種子和部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36的植物，可以選自田野作物，水果和蔬菜如canola，向日葵，煙草，甜菜，棉花，玉米，小麥，大麥，水稻，高粱，西紅柿，芒果，桃，蘋果，梨，草莓，香蕉，瓜，馬鈴薯，胡蘿卜，萵苣，卷心菜，洋蔥，大豆(soya spp)，甘蔗，豌豆，蠶豆，白楊，葡萄，柑橘，紫花苜蓿，黑麥，燕麥，草皮和飼用牧草，亞麻和油菜和產(chǎn)堅(jiān)果的植物，至此它們并未被逐一指出；它們的后代，種子和部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中任何一項(xiàng)的玉米植物。
39.一種在田野中選擇性地控制野草的方法，上述田野中含有野草以及根據(jù)權(quán)利要求35-38中任何一項(xiàng)的植物或后代，該方法包括在田野中使用足以控制野草而基本上不影響上述植物的量的草甘膦類除草劑。
40.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，進(jìn)而包括在使用草甘膦除草劑之前或之后對(duì)田野(從而對(duì)它所包含的植物)使用一種或多種除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺線蟲劑，殺菌劑和抗病毒劑。
41.一種充分耐受或充分抵抗草甘膦除草劑的植物的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟(i)用權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體轉(zhuǎn)化植物物質(zhì)；(ii)篩選這樣轉(zhuǎn)化的物質(zhì)；并(iii)從這樣篩選的物質(zhì)中再生形態(tài)正常的可育的的全株。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中轉(zhuǎn)化包括通過(guò)以下方法將多核苷酸引入到上述材料(i)用包被了上述多核苷酸的顆粒對(duì)上述材料進(jìn)行生物彈道轟擊；或(ii)用含有上述多核苷酸的溶液包被的硅碳化物纖維(silicon carbide fiber)對(duì)上述材料進(jìn)行穿刺；(iii)通過(guò)將上述多核苷酸或載體引入到農(nóng)桿菌，并將這樣轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌與植物材料共溫育，從而該植物材料被轉(zhuǎn)化并隨后再生。
43.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中該轉(zhuǎn)化材料是通過(guò)其草甘膦抗性篩選的。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體在對(duì)草甘膦充分耐受或充分抗性的植物組織和/或外形正常的可育的的全株植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體在用于體外高通量篩選潛在除草劑的除草劑靶物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
46.進(jìn)行轉(zhuǎn)化以表達(dá)感興趣的基因的生物材料的生產(chǎn)方法，其中上述轉(zhuǎn)化材料含有根據(jù)權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體，其中上述篩選包括將上述轉(zhuǎn)化材料暴露于草甘膦或它的鹽，并篩選存活的材料。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求的一種方法，其中所述的生物材料是植物來(lái)源的。
48.根據(jù)前述權(quán)利要求的一種方法，其中所述的植物是單子葉植物。
49.根據(jù)前述權(quán)利要求的一種方法，其中所述的單子葉植物選自大麥，小麥，玉米，水稻，燕麥，黑麥，高梁，菠蘿，甘蔗，香蕉，洋蔥，蘆筍和韭菜。
50.一種再生一種可繁殖的轉(zhuǎn)化植物以含有外源DNA的方法，包括以下步驟(a)從上述待轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生可再生的組織；(b)用上述外源DNA轉(zhuǎn)化上述可再生組織，其中上述外源DNA含有可選樣的DNA序列，其中上述序列的功能是在可再生組織中作為選樣機(jī)制，(c)在步驟(b)之后1天到60天之間，將上述來(lái)自(b)的可再生組織置于能夠從上述組織生新芽的培養(yǎng)基，其中上述培養(yǎng)基進(jìn)而含有一種化合物用于篩選含有上述可選擇DNA序列的可選擇組織，以允許對(duì)上述轉(zhuǎn)化的可再生組織的鑒定或選擇，(d)從步驟(c)的篩選組織形成至少一個(gè)新芽后，將上述新芽轉(zhuǎn)移到能從上述新芽產(chǎn)生根以產(chǎn)生小植株的第二種培養(yǎng)基，其中上述第二種培養(yǎng)基供選地含有上述化合物；并(e)將上述小植株生長(zhǎng)成可繁殖的轉(zhuǎn)基因植物，其中上述外源DNA被以孟德?tīng)柕姆绞睫D(zhuǎn)移到后代植物中，其中在步驟(b)和步驟(c)之間有一個(gè)供選的步驟，該步驟為將上述轉(zhuǎn)化的物質(zhì)置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于上述外源DNA是，或者上述外源DNA所含有的可篩選DNA序列含有，根據(jù)權(quán)利要求1-31中任何一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求32的載體，并且上述化合物是草甘膦或它的鹽。
51.根據(jù)前述權(quán)利要求的一種方法，其中上述植物是選自香蕉，小麥，水稻，玉米和大麥的單子葉植物。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的一種方法，其中所述的可再生組織選自胚源性愈傷組織，體細(xì)胞胚，不成熟胚等。
全文摘要
本發(fā)明特別提供了一種分離的多核苷酸,該多核苷酸含有編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及編碼該肽3’的抗草甘膦的5一烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(EPSPS)的區(qū)域,上述區(qū)域處于一種植物可操作啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控之下,前提為上述啟動(dòng)子與上述區(qū)域不是異源的,并且葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與上述合酶不是異源的。
文檔編號(hào)C12N15/54GK1359423SQ00809798
公開(kāi)日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月29日
發(fā)明者T·R·豪克斯, S·A·J·瓦納, C·J·安德魯斯, S·巴喬, A·P·皮克里爾 申請(qǐng)人:辛甄塔有限公司