抗pmi蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及識別非抗生素類安全篩選標(biāo)記PMI(磷酸甘露糖異構(gòu)酶）的單克隆抗 體，該抗體可用于制備檢測轉(zhuǎn)基因植物中的PMI蛋白的試劑盒，屬于生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn)，隨之而來的問題就是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評價(jià)及測 定。在轉(zhuǎn)基因品種的培養(yǎng)和后期鑒定中，離不開針對轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記和報(bào)告基因，最常用 的篩選標(biāo)記包括抗生素抗性類篩選標(biāo)記基因和抗除草劑基因，這類抗性篩選標(biāo)記基因有可 能會通過基因漂移造成基因污染，對環(huán)境產(chǎn)生不利影響（魏偉，馬克平.如何面對基因流 和基因污染[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2002,4(4):10-15)。另外，含有該種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn) 基因食物有可能不會被人類的腸道系統(tǒng)吸收利用，還很有可能產(chǎn)生毒副作用。所以，為降 低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，減少對環(huán)境和生物的潛在危害，目前對轉(zhuǎn)基因植物的篩選已經(jīng)逐漸由利 用抗生素抗性篩選，過渡到以PMI為代表的非抗生素抗性篩選，最終實(shí)現(xiàn)更安全的無標(biāo)簽 (Marker-free)篩選鑒定體系。
[0003] 在糖類代謝中，PMI基因編碼的磷酸甘露糖異構(gòu)酶（phosphomannoseisomerase， PMI)催化甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣?6-磷酸，然后在磷酸果糖激酶的催化作用下生成 能進(jìn)入糖酵解途徑的果糖 -1，6_ 二磷酸（MilesJS，GuestJR.Nucleotidesequence andtranscriptionalstartpointofthephosphomannoseisomerasegene(manA)of Escherichiacoli[J]·Gene, 1984,32:41-48)。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有植物細(xì)胞除了肉桂和一 些豆類，都沒有PMI基因，但在細(xì)菌、酵母、動物以及人體中卻廣泛存在（MalcaI，EndoRM， LongMR.Mechanismofglucosecounteractionofinhibitionofrootelongation bygalactose,mannoseandglucosamine[J] ·Phytopathology, 1967, 57:272-278),目前 已從這些生物體中克隆到該基因，并獲得純化蛋白（ProudfootAEI，TurcattiG，Wells TNC,etal. .Purification,cDNAcloningandheterologousexpressionofhuman phosphomannoseisomerase[J] ·Eur.J.Biochem. ,1994,219:415-423.)〇
[0004] 自1998年首次報(bào)道了將PMI基因作為篩選標(biāo)記用于甜菜的轉(zhuǎn)基因以來（Joersbo M,DonaldsonI,KreibergJ,etal.Analysisofmannoseselectionusedfor transformationofsugarbeet[J].Mol.Breed·,1998,4:111_117)，PMI/甘露糖篩選體系 作為一種新型的安全篩選系統(tǒng)已被成功運(yùn)用于多種單子葉植物和雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化 中無論是篩選標(biāo)簽選擇、更替的過程，還是在后代選擇中通過同源重組將篩選標(biāo)簽從生物 體基因組"刪除"的過程中都需要對標(biāo)簽蛋白進(jìn)行跟蹤鑒定。此外，對這些標(biāo)簽蛋白進(jìn)行檢 測還可以監(jiān)測品種培育過程中對環(huán)境的影響，結(jié)合特異功能靶蛋白的鑒定，可以開展農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)中的種子純度鑒定，食品、藥品加工過程的非轉(zhuǎn)基因身份保持（IP)，從而實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因 植物從源頭到餐桌的全程監(jiān)控。
[0005] 基于外源蛋白的免疫學(xué)分析方法，采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn) 基因植物樣本快速、準(zhǔn)確、高效的檢測。其技術(shù)關(guān)鍵是制備具有高度特異性的抗體，直至目 前為止還沒有關(guān)于PMI抗體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種針對轉(zhuǎn)基因植物中常用篩選標(biāo)記基因PMI蛋白 的單克隆抗體雜交瘤的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種特異性好、親和力高的抗PMI單克隆抗體，該抗 體能特異結(jié)合PMI重組抗原和轉(zhuǎn)基因材料。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種將本抗體用于以水稻為代表的轉(zhuǎn)基因生物的檢 測方法。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用本抗體與PMI的結(jié)合能力，完成表達(dá)PMI蛋 白在轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因微生物、細(xì)胞或其他材料中的分選和富集方法。
[0010] 解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段
[0011] 本發(fā)明首先制備了兩株分泌抗PMI抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株的制 備方法包括以下步驟：
[0012] 1)按照公布的PMI編碼序列進(jìn)行分析，依據(jù)在細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)、抗原性、組成氨 基酸的親疏水性以及二級結(jié)構(gòu)，選擇適宜可溶表達(dá)又具有良好免疫原性的區(qū)域用于重組表 達(dá)，為促進(jìn)重組蛋白的可溶表達(dá)，改善其表達(dá)行為，且便于純化，在重組蛋白的N端和C端分 別融合有大腸桿菌果膠酶的PelB信號肽及組氨酸標(biāo)簽，經(jīng)基因合成后克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒載 體pET-pelB中進(jìn)行重組表達(dá)，分離純化表達(dá)產(chǎn)物的可溶部分進(jìn)行親和純化后作為免疫原， 免疫Balb/c小鼠。
[0013] 2)從免疫合格小鼠無菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B細(xì)胞，按常規(guī)方法，將B細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0株融合，然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩選方法進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取融 合細(xì)胞生長克隆；
[0014] 3)以重組PMI蛋白為抗原，應(yīng)用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學(xué)技術(shù) 篩選和鑒定后，獲得高效分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞系。
[0015] 上述技術(shù)方案中，步驟1)中，制備重組⑶S蛋白的方法可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)操作技術(shù)進(jìn)行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表 達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，重組蛋白的純化。具 體地，可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯， 2009年，科學(xué)出版社）。
[0016] 本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案制備得到的兩株雜交瘤細(xì)胞株及其抗體 60728-35和60728-44。其中60728-35的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQID No:2 和SEQIDNo:3 所示，60728-44 為SEQIDNo:4 和SEQIDNo:5 所示。兩株抗體均 為鼠源IgGl亞型單克隆抗體。
[0017] 本發(fā)明從上述雜交瘤細(xì)胞株制備了單克隆抗體，所述制備方法有以下兩種：
[0018] 1)在體外用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收獲培養(yǎng)上清經(jīng)免疫親和層析法分離 純化所需單克隆抗體；
[0019] 2)在動物腹腔內(nèi)接種上述雜交瘤細(xì)胞，收獲動物腹水后分離純化所需單克隆抗 體。本發(fā)明用腹水法制備的抗體經(jīng)ProteinA/G柱親和層析純化得到的PMI單抗，用ELISA 技術(shù)測定60728-35和60728-44分泌的抗體親和常數(shù)分別為1. 85X109和2. 46XΙΟ9。
[0020] 本發(fā)明的這兩株抗體可以共同或單一地對生物樣品中的ΡΜΙ蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢 測。可以應(yīng)用的免疫學(xué)檢測方法包括但不限于利用抗體直接和抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附 檢測（ELISA)、免疫印跡（WesternBlot)、流式細(xì)胞術(shù)（FACS)、免疫組織化學(xué)（IHC)檢測 或者免疫PCR檢測方法。在免疫學(xué)檢測中，該抗體可單獨(dú)或與通過化學(xué)鍵偶聯(lián)，靜電吸 附或者親疏水性吸附，而連接綴合物包括辣根過氧化物酶（HRP)，堿性磷酸酶（AP)，生物 素（Biotin)，異硫氰酸熒光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖等綴合物連接。免疫印記 (Westernblotting)實(shí)驗(yàn)顯示這兩株抗體均能特異識別重組的PMI蛋白以及天然水稻葉 片材料中的轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記基因PMI。
[0021] 本發(fā)明中的單克隆抗體，可以用作檢測試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測試劑盒的制備。 本發(fā)明的這兩株抗體還可以共同或單一地對含PMI蛋白的生物樣品進(jìn)行基于免疫學(xué)的生 物分離中。該基于免疫學(xué)的分離方法包括但不限于利用瓊脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式 細(xì)胞術(shù)完成生物分離方法或陽性細(xì)胞分選。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果
[0023] 本發(fā)明獲得的雜交瘤（60728-35和60728-44)分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，能識別重 組和天然PMI蛋白，具有極強(qiáng)特異性和敏感性。能用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測與篩查。
【附圖說明】：
[0024] 圖1 :在大腸桿菌中表達(dá)和純化的PMI重組蛋白。1為表達(dá)產(chǎn)物15mM咪唑洗脫的 結(jié)果，2為60mM咪唑洗脫的結(jié)果，3為300mM咪唑洗脫的結(jié)果。Marker為分子量蛋白，表達(dá) 產(chǎn)物的大小約為43kDa，使用12%SDS-PAGE凝膠。
[0025] 圖2 :單克隆抗體60728-35對重組蛋白和天然轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢 測結(jié)果，TP309為非轉(zhuǎn)基因材料，M2-B4和M3-3為轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白，菌蛋白為重組PMI 蛋白。
[0026] 圖3 :單克隆抗體60728-44對重組蛋白和天然轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢 測結(jié)果，TP309為非轉(zhuǎn)基因材料，M2-B4和M3-3為轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白，菌蛋白為重組PMI 蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合圖表和具體實(shí)施的方式對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對本發(fā)明的限制。
[0028] 實(shí)施例1重組PMI蛋白的制備
[0029] 一、基因克隆
[0030] PMI單克隆Genbank中NC_004088. 1的核酸序列，設(shè)計(jì)特異性上游引物PMI-F: TATGTACATATGCAAAAACTCATTAACTC特異性下游引物PMI-R:AGTGCTCGAGCTTGTTGTAAACACGC， 從淋巴細(xì)胞中的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增包括編碼第411位至第750氨基酸的基因片段。在PCR 的過程中在基因5'和3'端分別加入Ndel和Xhol酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 分離后回收，分別對回收的融合蛋白基因和用于表達(dá)的質(zhì)粒載體pET_30a進(jìn)行Ndel和Xhol 酶切，再次電泳回收，以T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取 平板上的克隆接種，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR顯示融合蛋白基因陽性的克隆進(jìn)行 測序分析，序列完全正確的克隆用于蛋白表達(dá)。
[0031] 二、蛋白表達(dá)和純化
[0032] 按1:100的比例將單菌落培養(yǎng)的過夜菌轉(zhuǎn)接至100mlLB培養(yǎng)基，加入終濃度為 50μg/ml的卡那霉素，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為(λ6~(λ8。加入(λlmol/L的IPTG，25°C 震蕩培養(yǎng)8h