一株枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物與應(yīng)用，尤其是涉及一株具有除草活 性的枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物大豆蛋白發(fā)酵液與應(yīng)用，屬于天然植物材料用于農(nóng)業(yè)植物 保護(hù)、防除農(nóng)作物雜草的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，種植業(yè)中對有害生物的生物防治主要針對植物病害和害蟲危害，而對雜草 的生物防治方法應(yīng)用較少。
[0003] 雜草危害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要問題之一，多年來的應(yīng)對方法以化學(xué)防治為主， 而隨著化學(xué)除草劑的長期和過度使用，其帶來的環(huán)境問題和對農(nóng)作物品質(zhì)的影響已經(jīng)日益 受到關(guān)注，尋求天然的植物源除草劑是解決這一問題的有效途徑。相關(guān)研宄表明，農(nóng)田和園 林生態(tài)系統(tǒng)中存在多種植物間的生化他感作用，某些植物殘體的分解產(chǎn)物也能抑制植物種 子萌發(fā)和生長，利用植物間的生化他感作用控制雜草是當(dāng)前雜草防治研宄的熱點。
[0004] 稗草是一種一年生草本植物，一般長在稻田里、沼澤、溝渠旁、低洼荒地，生長在稻 田時，它長在稻子和稻子的間隙里，和稻子一起爭養(yǎng)分，爭空間，稗子和稻子外形極為相似， 難以與稻子區(qū)分，因此稗子屬于惡性雜草。
[0005] 20世紀(jì)90年代初，美國Christians等發(fā)現(xiàn)了玉米蛋白粉對植物種子萌發(fā)時生 根的抑制作用，并將其作為無公害植物源除草劑應(yīng)用在草坪和有機(jī)農(nóng)業(yè)的雜草防治上；用 堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備的水解多肽比玉米蛋白粉具有更高的生根抑制活性，Liu 等從玉米蛋白粉水解物中分離出了高除草活性的多肽。之后更多相關(guān)研宄表明，包括大豆 蛋白在內(nèi)的多種天然蛋白材料的水解產(chǎn)物同樣具有除草活性。目前國內(nèi)外的相關(guān)研宄中， 雖然使用蛋白酶水解蛋白材料能提高其對雜草的抑制活性，但蛋白酶的酶促水解反應(yīng)對溫 度、pH等條件要求相對嚴(yán)格，在不良條件下存在蛋白酶易失活的問題，另外使用蛋白酶還存 在成本過高的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株枯草芽孢桿菌及其 代謝產(chǎn)物與應(yīng)用，利用枯草芽孢桿菌對大豆蛋白進(jìn)行純菌株發(fā)酵，從而提供一種具有除草 活性的大豆蛋白發(fā)酵液，成本較低。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是： 本發(fā)明之枯草芽孢桿菌，是枯草芽孢桿菌L-5 L-5)，該菌種于 2015年02月02日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所）保藏，菌種保藏號為CGMCC No: 10505。
[0008] 本發(fā)明中所述枯草芽孢桿菌L-5是通過以下方法分離得到的： (1)分離純化：稱取5. 0g醬油渣(醬油渣采集自湖南長沙本地醬油廠)，加入100毫升 無菌生理鹽水中，震蕩2小時后再用生理鹽水梯度稀釋；取稀釋倍數(shù)105~108的菌液各100 微升，將其分別均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)24小時，每個稀釋度各兩個重 復(fù)；挑取不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行反復(fù)劃線純化，直至菌落形態(tài)一致和顯微鏡鏡檢特征相 同； (2) 菌株的篩選：挑取已純化的菌株置于脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)，挑取有明顯 水解圈的菌落進(jìn)行單獨培養(yǎng)，并觀測其在脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的降解透明圈大 小，選取一株獲得最大降解透明圈（透明圈直徑達(dá)12毫米）的菌株，命名為L-5; (3) 菌株的鑒定：對菌株L-5進(jìn)行形態(tài)、生理、生化特征的測定，并進(jìn)行16SrDNA測序 分析；16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢桿菌達(dá) 到100%，結(jié)合菌株L-5形態(tài)學(xué)特征與生理生化實驗結(jié)果，將菌株L-5鑒定為枯草芽孢桿菌 即為枯草芽抱桿菌L-5。
[0009] 所述菌株L-5的特征：菌株L-5在LB固體培養(yǎng)基上形成的菌落表面粗糙，多褶皺， 不易挑起；呈不透明乳白色；菌體桿狀，革蘭氏染色為陽性；無莢膜、周生鞭毛。菌株L-5明 膠液化、淀粉水解、M.R、V.P、接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原實驗均表現(xiàn)為陽性，吲哚、硫化氫、 厭氧生長實驗均表現(xiàn)為陰性。16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢桿菌 (ifeciByssyki/is)，達(dá)到100%，結(jié)合菌株L-5形態(tài)學(xué)特征與生理生化實驗結(jié)果，將菌株 L-5鑒定為枯草芽孢桿菌
[0010] 本發(fā)明之枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物，即利用枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑，其制備方 法，具體包括以下實施步驟： (1) 將菌株枯草芽孢桿菌L-5在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-24小時，接種于 100mL/250ml種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨8-12克、酵母提取物3-5克、NaCl 8-12克、蒸餾水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2, 121°C滅菌20-30分鐘，接種后于30°C下培 養(yǎng)12-18小時至對數(shù)期； (2) 取對數(shù)期菌株種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4wt%，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：大 豆分離蛋白粉18-22克、NaC18-12克、蒸餾水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2,121 °C滅菌 20-30分鐘，冷卻后接種，然后在30°C、140-160rpm條件下震蕩培養(yǎng)72 - 120小時，培養(yǎng) 完成后用紗布過濾即獲得大豆蛋白發(fā)酵液。
[0011] 本發(fā)明之枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的應(yīng)用，即枯草芽孢桿菌L-5的大豆蛋白發(fā)酵 液，用于防除水田雜草。其大豆分離蛋白粉的發(fā)酵液對初萌稗草具有明顯生根抑制作用。發(fā) 酵72小時的大豆蛋白發(fā)酵液，在每升溶液含2. 0克大豆蛋白發(fā)酵液的濃度下，對初萌稗草 抑制率達(dá)到94. 8%，田間每畝施用質(zhì)量濃度2. 0克每升的溶液1. 5-3升，對稗草的防治效果 達(dá)89. 6%以上。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明利用純菌株發(fā)酵方法，制備具有除草活性的大豆蛋白發(fā)酵液，能提供一種制備 天然生物除草劑的方法，制備出的發(fā)酵液安全，環(huán)保，不產(chǎn)生毒副作用，具有重要生態(tài)意義。
[0013] 本發(fā)明使用枯草芽孢桿菌L-5對大豆分離蛋白進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液對稗草尤其是初 萌稗草的生根具有明顯抑制活性；發(fā)酵液對已成熟的作物根系則沒有影響，而且，使用降解 菌對大豆分離蛋白的發(fā)酵條件相對簡單，常溫條件下即可進(jìn)行。另外，相對于蛋白酶，使用 菌株發(fā)酵，成本較為低廉。因此，本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌L-5發(fā)酵大豆分離蛋白來除草， 相對于使用蛋白酶進(jìn)行水解，工藝更為簡單，成本更為低廉，更適宜大規(guī)模實際應(yīng)用。
[0014] 大豆蛋白是一種天然植物材料，幾乎不產(chǎn)生任何環(huán)境污染，來源豐富且含氮量高， 是農(nóng)作物有機(jī)肥來源之一，因此，利用本發(fā)明，可以將其作為天然的植物源除草劑且可以和 有機(jī)肥結(jié)合，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)雜草防治。
[0015] 因此，利用大豆蛋白發(fā)酵液作為天然除草劑應(yīng)用于雜草防治，特別適用于水稻田 中稗草的防治，可以減少化學(xué)除草劑的環(huán)境污染，改善有機(jī)種植產(chǎn)業(yè)，具有良好的經(jīng)濟(jì)，生 態(tài)和社會效益，前景廣闊。
【附圖說明】
[0016] 圖1為0. 5mg/mL濃度下不同發(fā)酵時間所得大豆蛋白發(fā)酵液對稗草的根抑制活性 影響圖。
[0017] 微生物保藏情況說明 枯草芽孢桿菌L-5很L-5)，該菌種于2015年02月02日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號中國科學(xué)院微生物研宄所）保藏，菌種保藏號為CGMCCNo:10505。
【具體實施方式】
[0018] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0019] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制