本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是一種雜食性植物病原線(xiàn)蟲(chóng)，主要侵染作物根系,使根部腫大、畸形、呈雞爪狀,根組織變黑腐爛,也有的根上產(chǎn)生球狀根結(jié),侵染后植株表現(xiàn)為缺水癥狀，中午萎蔫，早晚初期尚能恢復(fù)，到后期植株不能正常生長(zhǎng)，甚至死亡。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是我國(guó)糧食、蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物的重大病原物之一，目前根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)成為了北方保護(hù)地蔬菜毀滅性病害，也是南方露地栽培果蔬的主要病害。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)通常沒(méi)有明顯的專(zhuān)性寄主，能夠侵染的植物超過(guò)2000種。全國(guó)各種根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生面積超過(guò)2000萬(wàn)畝，受害最嚴(yán)重的有煙草、香蕉及蔬菜類(lèi)的茄科(如番茄、茄子、辣椒)、葫蘆科(如各種瓜類(lèi))等作物。給作物生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。特別是煙草，我國(guó)是煙草種植和消費(fèi)大國(guó)，也是最重要的經(jīng)濟(jì)植物之一，煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)在四川、重慶、河南、云南、廣西、湖南、湖北及山東等地發(fā)生嚴(yán)重，且有繼續(xù)加重的趨勢(shì)。

長(zhǎng)期以來(lái)，煙草等作物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)防治一般以阿維菌素、噻唑磷等農(nóng)藥為主，但使用阿維菌素、噻唑磷等一般都會(huì)對(duì)煙草的根系造成一定的損傷，且效果不理想；微生物農(nóng)藥防治根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，可有效減輕線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)生，且可抑制線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的病菌，改善根部微生態(tài)環(huán)境，刺激作物生長(zhǎng)；在微生物防治逐漸成為植物病害防治研究熱點(diǎn)的今天，研究開(kāi)發(fā)和利用微生物農(nóng)藥來(lái)防治煙草等作物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害無(wú)疑是最佳出路。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑，以解決上述問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑，每克所述菌劑含有1×10^10～12芽孢桿菌活孢子；

所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC NO.1.2010。

堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)的形態(tài)學(xué)和生理性質(zhì)特征為：菌體細(xì)胞桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，兩端鈍圓，無(wú)莢膜，周生鞭毛，芽孢卵圓形，近中生，孢囊無(wú)明顯膨大。NA培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24h，菌落直徑1～2mm，挑起有粘絲，菌落為微黃白色，圓形或近圓形，中間環(huán)狀，不透明，表面褶皺，稍有光澤；培養(yǎng)48h后，菌落呈中間心環(huán)狀凸起，呈火山口狀。常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗(yàn)呈陽(yáng)性，在7％的NaCl中生長(zhǎng)，pH5.7生長(zhǎng)。

堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，具有極強(qiáng)的抗逆性,可以用于防治煙草、香蕉和番茄等作物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病，且對(duì)人畜安全、環(huán)境相容性好、有害生物不易產(chǎn)生抗藥性、無(wú)污染、微毒無(wú)殘留。

可選的，所述菌劑的劑型為可濕性粉劑。

如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：

將預(yù)先制備好的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液經(jīng)濃縮、干燥并制劑得到所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑。

可選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化鈣3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡劑1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。

可選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液的制備方法包括：

A)、在固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌，30℃～37℃培養(yǎng)72h～120h得到菌種Ⅰ；

B)、取菌種Ⅰ的單菌落接入固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，30℃～37℃培養(yǎng)72h～120h得到菌種Ⅱ；

C)、用無(wú)水沖洗菌種Ⅱ，按照0.05％～0.5％的體積比向液體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中接入菌種Ⅱ孢子懸浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培養(yǎng)18h～30h，得到堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液；

可選的，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化鈉5±1g/L，pH＝7.1～7.5。

可選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液接種量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.05％～1％；

發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃～35℃，通氣比為(05.～1)：1，轉(zhuǎn)速150～200r/min，發(fā)酵40～48小時(shí)。

如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑在防治根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)中的應(yīng)用。

可選的，如上所述的應(yīng)用，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑與其他藥劑混合使用；

所述藥劑包括微生物菌劑和/或殺線(xiàn)藥劑。

可選的，所述其他微生物菌劑的主要成分包括厚孢輪枝菌、淡紫擬青霉、枯草孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌。

可選的，所述殺線(xiàn)藥劑包括阿維菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、滅線(xiàn)磷。

可選的，如上所述的應(yīng)用，所述根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的宿主包括煙草、香蕉、番茄、蘋(píng)果、梨、山楂、柑桔、棗、茄子、辣椒、黃瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫蘆、大豆、玉米、花生。

可選的，如上所述的應(yīng)用，當(dāng)所述宿主為煙草時(shí)，施用堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的方法為穴施；

可選的，所述穴施在煙草移栽時(shí)進(jìn)行。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明提供了一種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑及其制備方法與應(yīng)用。

每克所述菌劑含有1×10^10～12芽孢桿菌活孢子；

所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC NO.1.2010。

優(yōu)選的，所述菌劑的劑型為可濕性粉劑。

可濕性粉劑是我國(guó)目前農(nóng)用微生物殺菌劑的主要?jiǎng)┬汀?yōu)選的，本發(fā)明提供的菌劑還可制備成粉劑、水分散粒劑、懸浮劑和顆粒劑等劑型進(jìn)行使用。

如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：

將預(yù)先制備好的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，將得到的發(fā)酵液經(jīng)濃縮、干燥并經(jīng)氣流粉碎得到所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑。

優(yōu)選的，所述濃縮為選用陶瓷膜過(guò)濾濃縮；

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述陶瓷膜孔徑為0.01μm～0.1μm，。

優(yōu)選的，所述干燥為離心式噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度120℃～220℃，出風(fēng)溫度60℃～90℃；

優(yōu)選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有酵母粉25±4g/L，玉米淀粉20±5g/L，葡萄糖10±2g/L，氯化鈣3±0.5g/L，豆粕粉10±5g/L，消泡劑1.4±0.2g/L，pH＝8.1～8.3。

優(yōu)選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液的制備方法包括：

A)、在固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌，30℃～37℃培養(yǎng)72h～120h得到菌種Ⅰ；

B)、取菌種Ⅰ的單菌落接入固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，30℃～37℃培養(yǎng)72h～120h得到菌種Ⅱ；

C)、用無(wú)菌水沖洗菌種Ⅱ，按照0.05％～0.5％的體積比向液體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中接入菌種Ⅱ孢子懸浮液，30℃～37℃、150r/min～250r/min培養(yǎng)18h～30h，得到堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液；

其中，所述菌種Ⅱ能在4℃以下保存三個(gè)月。

優(yōu)選的，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有蛋白胨10±2g/L、牛肉膏3±0.5g/L、氯化鈉5±1g/L，pH＝7.1～7.5。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中還需要加入15±3g/L的瓊脂。

優(yōu)選的，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液中孢子數(shù)為(0.3～0.9)×10⁹個(gè)。

優(yōu)選的，如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的制備方法，所述堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液接種量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.05％～1％；

發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃～36℃，通氣比為(0.5～1)：1，轉(zhuǎn)速150～200r/min，發(fā)酵40～48小時(shí)。

如上所述的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑在防治根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)中的應(yīng)用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明說(shuō)明中記載的內(nèi)容推斷，本發(fā)明的菌劑還可以與常見(jiàn)的其他微生物菌劑和/或殺線(xiàn)藥劑混合使用。

優(yōu)選的，所述其他微生物菌劑的主要成分包括厚孢輪枝菌、淡紫擬青霉、枯草孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌。

優(yōu)選的，所述殺線(xiàn)藥劑包括阿維菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺、氨基寡糖素、克百威、丁硫克百威、滅線(xiàn)磷。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的宿主包括煙草、香蕉、番茄、蘋(píng)果、梨、山楂、柑桔、棗、茄子、辣椒、黃瓜、西瓜、哈蜜瓜、西葫蘆、大豆、玉米、花生。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，當(dāng)所述宿主為煙草時(shí)，施用堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌劑的方法為穴施；

除穴施外，還可采用溝施、撒施。

優(yōu)選的，所述穴施在煙草移栽時(shí)進(jìn)行。

進(jìn)一步優(yōu)選的，將1×10¹⁰活芽孢/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌可濕性粉劑與干細(xì)土按1：100混勻做成備用藥粉，每株煙草用藥粉40～60克。

實(shí)施例1

1.1、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌種子液的獲得

1.1.1、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌菌種活化：用接種環(huán)挑取三環(huán)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌凍干菌種于250ml三角瓶中，采用固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18h。

1.1.2、劃線(xiàn)法固體平板培養(yǎng)

在固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上35℃培養(yǎng)100h，長(zhǎng)出單菌落。

1.1.3、試管斜面培養(yǎng)：固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基試管斜面，挑取上述單菌落接于試管斜面，35℃培養(yǎng)100h，直到孢子散落。

從上述試管斜面中選用較好的菌種，用無(wú)菌水將試管斜面種子沖洗，接于裝有液體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的750mL三角瓶中，于35℃、搖床轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)24h，菌體含量達(dá)到0.6×10⁹個(gè)/mL左右時(shí)，即可作為種子液。

上述固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化鈉5克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，PH值7.3；

液體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化鈉5克，蒸餾水1000ml，PH值7.3。

1.2、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基：按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，含有酵母粉2.5％，玉米淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，氯化鈣0.3％，豆粕粉1.0％，消泡劑0.14％，其余為水，調(diào)節(jié)PH 8.1～8.3。

50升全自動(dòng)控制不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行消毒：用蒸汽121℃消毒1小時(shí)。

向發(fā)酵罐裝料：裝料系數(shù)為0.6，加入酵母粉750g，玉米淀粉600g，葡萄糖300g，氯化鈣90g，豆粕粉300g，消泡劑42g，用水配置，溶解后得到30L發(fā)酵培養(yǎng)基，通入蒸汽，于121℃消毒1.0小時(shí)，查無(wú)雜菌。

發(fā)酵最佳參數(shù)：發(fā)酵溫度30℃～36℃，初始PH值為8.1～8.3，通氣量為1︰1，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，接種量為1％，發(fā)酵44小時(shí)，孢子量為2×10⁹/mL時(shí)，即到終點(diǎn)，得26.5公斤的發(fā)酵液。

1.3、發(fā)酵液的濃縮：

將26.5kg的發(fā)酵液裝入膜分離裝置的料液槽，采用孔徑為0.1μm的陶瓷膜，膜面積為0.25㎡，開(kāi)啟循環(huán)泵進(jìn)行分離，循環(huán)3小時(shí)后得到7.0kg濃縮液。

1.4、濃縮液噴霧干燥：

采用脫水量為3kg/h的離心式噴霧干燥塔，進(jìn)風(fēng)溫度140℃，出風(fēng)溫度70℃，將7.0kg堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，經(jīng)三小時(shí)得375g堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌母粉，經(jīng)檢測(cè)孢子量為1.2×10¹¹活孢子/克的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌母藥。

實(shí)施例2

堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌對(duì)煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogyne incongnita Chitwood)的室內(nèi)活性測(cè)定

從發(fā)病比較嚴(yán)重的煙草根部挑取煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的蟲(chóng)癭，放置于培養(yǎng)皿內(nèi)的尼龍網(wǎng)膜上，加適量無(wú)菌水，置于(25±1)℃培養(yǎng)箱孵化培養(yǎng)，48h后收集二齡幼蟲(chóng)配制成線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液，每1mL懸浮液中含有約200頭的二齡幼蟲(chóng)，備用。

選用2.5×10⁹活孢子/克厚孢輪枝菌(verticillium chlamydosporium)母藥為對(duì)照藥。生產(chǎn)廠家：云南陸良酶制劑有限責(zé)任公司。

將1×10¹¹活孢子/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌母藥和2.5×10⁹活孢子/克厚孢輪枝菌母藥分別用無(wú)菌水溶解，制成1.00×10⁴mg/L濃度母液，備用。

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌母液稀釋成200、100、50、25、12.5mg/L，厚孢輪枝菌母液稀釋成200、100、50、25、12.5mg/L不同濃度試驗(yàn)藥液待用。

采用直接觸殺法進(jìn)行測(cè)定。取24孔生化測(cè)試板，各取1mL供試藥液置于小孔中，加入等體積的線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液，空白對(duì)照加入等量的無(wú)菌水，置于(25±1℃)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

處理后24h調(diào)查試蟲(chóng)死亡情況(判斷供試蟲(chóng)死亡標(biāo)準(zhǔn)是以顯微鏡下觀察無(wú)自主反應(yīng))，每處理調(diào)查100頭，記錄總蟲(chóng)數(shù)和死蟲(chóng)數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌對(duì)煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的殺線(xiàn)活性明顯高于厚孢輪枝菌的殺線(xiàn)活性。

表1堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌對(duì)煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的室內(nèi)活性測(cè)定原始數(shù)據(jù)

實(shí)施例3

不同藥劑防治煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)田間藥效試驗(yàn)

選用三種常用藥劑:2.5×10⁹活孢子/克厚孢輪枝菌微粒劑、3％阿維菌素微囊懸浮劑、10％噻唑磷顆粒劑與1×10¹⁰活芽孢/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌可濕性粉劑對(duì)煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(800克/畝)防效最高為84.87％，2.5×10⁹活孢子/克厚孢輪枝菌微粒劑和3％阿維菌素微囊懸浮劑分別為75.57％和76.06％，10％噻唑磷顆粒劑最低為68.28％。田間藥效試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2四種不同藥劑防治煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)田間藥效試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例4

堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌不同時(shí)期、不同方式用藥對(duì)煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果試驗(yàn)

將1×10¹⁰活芽孢/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌可濕性粉劑與干細(xì)土按1：100混勻做成備用藥粉(穴施、溝施、撒施，每株用藥粉約50克)；

將1×10¹⁰活芽孢/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌可濕性粉劑按1:200對(duì)水混勻做成備用藥液(灌根，每株用藥液約100毫升)。

試驗(yàn)選在同一田塊內(nèi)，肥水相同，分6組處理：第一組移栽時(shí)穴施；第二組移栽時(shí)溝施；第三組移栽后撒施；第四組移栽后用藥液作為定根水灌根；第五組移栽后20天灌根；第六組是對(duì)照組，不施藥粉或藥液；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。然后在封頂、打頂后25天、采烤結(jié)束時(shí)分別觀察其病珠情況，并記錄。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3，試驗(yàn)表明，用1×10¹⁰活芽孢/克堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌可濕性粉劑防治煙草根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，在煙草移栽時(shí)穴施效果最好。

表3各處理防效統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注:表中各數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。