一種新的短小芽孢桿菌漆酶基因及其表達與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種漆酶基因，尤其是一種短小芽孢桿菌L-9的漆酶基因及其表達與 應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶〇^(：(^%3.(：.1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化還 原反應(yīng)，在木質(zhì)素及其前體類似物的生物降解中發(fā)揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣泛， 包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶應(yīng)用潛力巨大。 在木材加工領(lǐng)域，漆酶能代替化學(xué)膠合劑，不但能提高產(chǎn)品質(zhì)量，而且能減輕對人體健康的 傷害及對環(huán)境的污染;在造紙工業(yè)中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙廠的 污染，有助于造紙業(yè)最終實現(xiàn)清潔生產(chǎn);在食品加工領(lǐng)域，漆酶可用于除去果汁中酚類化合 物引起的混濁，從而提高果汁的質(zhì)量。此外，漆酶還可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，減 少以氯酚類為工業(yè)原料生產(chǎn)染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑等化工產(chǎn)品而造成的環(huán)境污染。
[0003]漆酶按來源不同可分為三大類:植物漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶。植物漆酶主要由 漆樹漆液分離而得。真菌漆酶來源更為廣泛(存在于多種擔(dān)子菌中），具單電子氧化還原電 位高、催化活性強等優(yōu)點，既能催化底物的氧化聚合又能對木質(zhì)素進行催化降解，是一直以 來人們重點研究的漆酶種類。細菌漆酶則發(fā)現(xiàn)相對較晚，最初是1993年由Givaudan等人首 先在一種生脂固氮螺菌中鑒定出來的。隨后，科研人員又陸續(xù)在交替單胞菌、大腸桿菌、假 單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、極端耐堿芽孢桿菌、灰色鏈霉菌等細 菌中發(fā)現(xiàn)了不同種類的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽孢桿菌的CotA蛋白、 海單胞菌的PpoA蛋白、大腸桿菌的CueO蛋白、灰色鏈霉菌的EpoA蛋白等，這些細菌漆酶與真 菌漆酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個銅離子結(jié)合位點。
[0004]由于真菌來源漆酶在工作環(huán)境pH偏堿性時活性非常低或幾乎沒有，熱穩(wěn)定性也較 差，且絲狀真菌生長周期長，培養(yǎng)基要求高，菌絲在發(fā)酵罐中易受到高剪切力的損傷，這大 大限制了真菌漆酶在工業(yè)上的應(yīng)用。研究揭示，細菌來源漆酶雖氧化活性普遍略低于真菌 來源漆酶，然而它們往往具有一些自身獨特的優(yōu)點：如無需糖基化修飾、熱穩(wěn)定性好、酶活 性的最適pH范圍廣等，這些性質(zhì)正是目前漆酶工業(yè)應(yīng)用所急需的。
[0005]據(jù)最新資料統(tǒng)計，我國每年印染廢水排放量占總工業(yè)廢水排放量的35%，己成為 危害最大的重要污染源，大部分合成染料都難以被微生物降解。這些染料化合物通常被用 于紡織、食品、塑膠和生物醫(yī)學(xué)的著色劑，每年全世界商用染料使用達7X105噸，種類達IX 1 〇4種，其中5~10 %的染料都以工業(yè)污水形式排放出來。有色污水直接釋放到環(huán)境中，許多 染料在厭氧環(huán)境下可能轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)或致癌物質(zhì)，眾多國家相繼都頒布了嚴(yán)厲的法規(guī)來 限制工業(yè)染料污水的排放。由于染料自身特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用物理或化學(xué)法(凝結(jié)、臭氧、 活性炭)處理往往效果不佳，且還易造成二次污染。研究表明，生物法(使用漆酶、錳過氧化 物酶等)具有脫色率高、運行成本低、綠色環(huán)保的優(yōu)勢，是處理印染廢水的潛在有效手段，是 當(dāng)前印染廢水脫色研究的熱點。絕大多數(shù)排放的工業(yè)印染污水往往溫度很高且pH值偏堿。 在各類來源的漆酶中，真菌漆酶由于只在pH偏酸環(huán)境下具有較好的脫色效果，在偏堿性條 件下難以發(fā)揮作用，且耐熱溫度低于細菌漆酶，所以細菌漆酶憑借其獨特優(yōu)勢在工業(yè)印染 廢水處理中更具應(yīng)用潛力。
[0006]因此，挖掘能耐受高溫和高pH值(耐堿)條件的細菌漆酶基因并實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)具 有重要研究意義和應(yīng)用價值。
[0007] 本研究組在先專利申請201310261242.1中，公開了一種漆酶基因，來源于短小芽 孢桿菌，以SGZ為底物時，最適作用pH為7.2;以2，6-DMP為底物時，最適作用pH為7.8，最適作 用pH值均高于(耐堿性能力)其他已報道過的微生物來源漆酶;該漆酶以SGZ為底物時，最適 作用溫度為80°C，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。如何進一步提高生物酶的高溫穩(wěn)定性需 要進一步做出研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種新的漆酶基因cotA，其核苷酸序列為在核苷酸 序列為SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩(wěn) 定的漆酶。
[0009] 所述突變位點為第57位Lys突變?yōu)門hr、第120位Lys突變?yōu)門hr。
[0010] 所述基因編碼的蛋白質(zhì)及含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系、基因工程菌、表達載體 或克隆載體均屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0011] 本發(fā)明的第三個目的在于提供上述重組漆酶在印染廢水脫色中的應(yīng)用，尤其是對 偶氮類和蒽醌類染料脫色的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明分析了純化的重組漆酶對2種代表性偶氮類和2種代表性蒽醌類染料的脫 色作用，偶氮類染料和蒽醌類染料是目前印染工業(yè)上使用量最大的兩種染料類型。實驗結(jié) 果顯不在堿性環(huán)境pH9.0,90°C溫度作用10h后，該漆酶對2種偶氮類染料reactivered11 和reactiveblue171的脫色率分別達到98%以上，對2種蒽醌類染料reactiveblue4和 reactivebri11iantblue的脫色率分別達到96%以上?？刂茰囟仍?0°C，2小時后，酶的剩 余活力為85%，10小時后，酶的剩余活力為75%，具有優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性。
[0013]本名提供的漆酶具有良好的脫色效果，同時具有優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性，具有很廣的 應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0014]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0015]下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0016]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0017]實施例1CotA基因的獲得
[0018] 通過化學(xué)全合成或定向突變基因克隆方法獲得在核苷酸序列為SEQIDNO. 1所示 核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩(wěn)定的漆酶。
[0019] 所述突變位點為第57位Lys突變?yōu)門hr、第120位Lys突變?yōu)門hr。
[0020]實施例2漆酶的大腸桿菌重組表達、純化、活性染色及免疫印跡鑒定[0021] 將獲得的CotA基因序列克隆到商業(yè)化表達質(zhì)粒pColdII(TaKaRa公司），構(gòu)建重組 質(zhì)粒pColdll-cotA。隨后將pColdll-cotA轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，通過氨芐抗生 素平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，隨后利用IPTG進行漆酶的誘導(dǎo)表達。
[0022]培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯 化鈉(NaCl)lOg/L，pH7.4。誘導(dǎo)表達條件為:將重組表達質(zhì)粒pColdll-cotA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，含重組質(zhì)粒的工程菌在37°C條件下培養(yǎng)至0D6Q() = 0.5,隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加 入終濃度為O.lmM的IPTG，誘導(dǎo)表達24h，轉(zhuǎn)速160rpm。誘導(dǎo)表達后，超聲破碎菌體，利用Ni+ 柱親和層析法純化得到可溶性漆酶，咪唑洗脫濃度為500mM。
[0023]實施例3純化的B.pumilus L-9重組漆酶高溫穩(wěn)定性分析
[0024]采用常規(guī)測定方法，使用SGZ作為底物，反應(yīng)pH為6.9。1個酶活單位定義為1分鐘內(nèi) 氧化1以1底物362所需的酶量?？刂茰囟仍?0°(3,2小時后，酶的剩余活力為85%，10小時后， 酶的剩余活力為75%，體現(xiàn)出了優(yōu)異的高溫穩(wěn)定性。
[0025]實施例4漆酶在堿性條件下對偶氮類和蒽醌類染料的脫色率測定。
[0026]本發(fā)明分析了純化的重組漆酶對2種代表性偶氮類和2種代表性蒽醌類染料的脫 色作用，偶氮類染料和蒽醌類染料是目前印染工業(yè)上使用量最大的兩種染料類型。實驗結(jié) 果顯不在堿性環(huán)境pH9.0,90°C溫度作用10h后，該漆酶對2種偶氮類染料reactivered11 和reactiveblue171的脫色率分別達到98%以上，對2種蒽醌類染料reactiveblue4和 reactivebrilliantblue的脫色率分別達到98%以上。以上數(shù)據(jù)表明該漆酶良好的脫色 效果與堿性穩(wěn)定性。
[0027]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種新的短小芽孢桿菌漆酶基因cotA，其特征在于其核苷酸序列為在核苷酸序列為 SEQIDNO. 1所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成的高溫穩(wěn)定的漆 酶。2. 權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌漆酶基因cotA，其特征在于所述突變位點為第57位 Lys突變?yōu)門hr、第120位Lys突變?yōu)門hr。3. 權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)。4. 含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。5. 含有權(quán)利要求1所述基因的基因工程菌。6. 含有權(quán)利要求1所述基因的表達載體或克隆載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，優(yōu)選重組大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)〇8. -種權(quán)利要求7所述生產(chǎn)漆酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，選取大腸桿 菌冷休克表達載體pColdll，構(gòu)建重組表達載體pColdll-cotA，以大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)為宿主進行表達。9. 一種權(quán)利要求7所述生產(chǎn)漆酶的重組大腸桿菌生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于，利用 IPTG對重組菌產(chǎn)漆酶進行誘導(dǎo)表達;所述誘導(dǎo)表達條件為IPTG誘導(dǎo)終濃度為O.lmM，誘導(dǎo)溫 度15°C，誘導(dǎo)時間24h，轉(zhuǎn)速160rpm;培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化 鈉10g/L，pH7.4。10. 權(quán)利要求1所述基因在印染廢水脫色中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)漆酶基因突變體及其重組表達與應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明公開的漆酶突變體具有良好的耐堿性和耐高溫能力佳的優(yōu)點，耐高溫可高達90℃對偶氮類染料和蒽醌類染料均具有很好的脫色效果，具有重大應(yīng)用潛力。
【IPC分類】C02F101/16, C12N9/02, C12N15/53, C12N15/63, C12N1/21, C02F3/00
【公開號】CN105420253
【申請?zhí)枴緾N201510918392
【發(fā)明人】管政兵, 廖祥儒, 張寧, 宋晨萌
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月11日