遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原、相關(guān)表達(dá)載體、疫苗和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原、相關(guān)表達(dá)載體、疫苗和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及免疫保護(hù)性抗原技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原、相關(guān)表達(dá)載體、疫苗和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的不斷穩(wěn)步發(fā)展，各種病害問題日益突出，對養(yǎng)殖產(chǎn)量及成長造成嚴(yán)重影響。在我國，近幾年發(fā)展起來的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖魚類的突發(fā)性、爆發(fā)性疾病頻繁發(fā)生。目前，我國的海水養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)160 億元，病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。針對各種病害的發(fā)生，以抗生素為代表的化學(xué)療法對病害的控制和防治曾發(fā)揮了積極作用。但是，這種病害控制措施造成的環(huán)境污染、抗藥病原的大量出現(xiàn)、水產(chǎn)品的藥物殘留等負(fù)面影響日趨嚴(yán)重。在歐盟、美國和加拿大，以抗生素為主的化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已逐漸被禁用。為遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的養(yǎng)殖魚類病害日益嚴(yán)重的發(fā)展趨勢，推進(jìn)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，世界糧農(nóng)組織結(jié)合發(fā)達(dá)國家漁業(yè)發(fā)展的成功經(jīng)驗(yàn) (Ormonde P. Fisheries resources :trends in production, utilization and trade. In :Nomura I(ed. ). The State of World Fishery and Agriculture2002. Rome :FA0 Information Division, 2002, p3-p45.)，倡導(dǎo)“系統(tǒng)管理途徑” (System management approaches, SMA)養(yǎng)殖模式預(yù)防各種病害的發(fā)生。這一措施中的一個主要內(nèi)容就是提倡以疫苗接種為代表的各種免疫防治技術(shù)的應(yīng)用。這些措施的采用將大大減少化學(xué)藥物的使用，既避免了對環(huán)境的污染，又增加了水產(chǎn)品的消費(fèi)安全性。作為符合環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的經(jīng)濟(jì)有效的疾病控制策略和手段，接種疫苗在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范中正成為世界各國研究和開發(fā)的主要前沿和應(yīng)用領(lǐng)域。疫苗具有針對性強(qiáng)、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治主動的特點(diǎn)。以病原菌細(xì)胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗(Kill vaccine)為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護(hù)力)的技術(shù)應(yīng)用缺陷，對于需要免疫成千上萬數(shù)量的魚類養(yǎng)殖業(yè)來說極為不便，給藥成本往往不能為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所承受。而且，對于病害發(fā)生嚴(yán)重的魚苗和幼魚則無法實(shí)施注射給藥，同時，對許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無效。這一切都給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來了阻礙。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)要求病害防治技術(shù)必須經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用實(shí)施方便。因此，疫苗產(chǎn)品的開發(fā)除高效價的技術(shù)要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養(yǎng)殖業(yè)的承受能力。減毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發(fā)廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護(hù)性)的新技術(shù)優(yōu)勢，已成為當(dāng)前國際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開發(fā)的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。
愛德華氏菌屬是導(dǎo)致淡水、海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的一類常見的病原體，具體分為遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)，鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri) 和?？茞鄣氯A氏菌(Edwardsiella hoshinae) 0由其引起的魚類出血性敗血癥統(tǒng)稱為愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)。該病傳播面積廣，無明顯季節(jié)性，感染率及死亡率高，危害的種類多，有鯉魚，羅非魚，鰻鱺，鯔魚，鮭魚，鱒魚，鲆鰈等大多數(shù)具有較高經(jīng)濟(jì)價值的魚種。此外，遲鈍愛德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類。值得注意，遲鈍愛德華氏菌還是一種重要的人畜共患病原菌，它是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前， 我國養(yǎng)殖魚類愛德華氏菌病病害比較嚴(yán)重的病原體主要為遲鈍愛德華氏菌，并有存在病原體向人體轉(zhuǎn)移的巨大威脅。美國專利有利用利福平篩選得到野生毒株的自然減毒突變體作為減毒活疫苗的報(bào)道(Evans J J，Klesius，P H and Shoemaker C A2006 Modifi ed live Edwardsiella tarda vaccine for aquatic animals ；United States Patent7067122)。 目前在我國尚無該病害的有效防治措施。本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌野生毒株EIB202從我國東海海域養(yǎng)殖漁場內(nèi)爆發(fā)的愛德華氏菌病的病魚體內(nèi)分離得到，是一種強(qiáng)毒性的遲鈍愛德華氏菌菌株 (Edwardsiella tarda EIB202,宵 M"Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China，，，((Aquaculture Research)) Vol. 40，2009)，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO =M 208068，保藏日期為2008年5月1日，具體參見中國發(fā)明專利申請 CN200910052707. 6。因?yàn)閷t鈍愛德華氏菌致病機(jī)理仍然缺少系統(tǒng)性的認(rèn)識，其多宿主適應(yīng)性也導(dǎo)致對該菌的防治尤為困難。目前，愛德華氏菌病的控制主要依靠抗生素的使用，以化學(xué)治療為主。由于抗生素能被廣泛識別，它們在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越受到限制。此外，致病的遲鈍愛德華氏菌常常被發(fā)現(xiàn)對多重抗菌素復(fù)合物有自然抗性，增加了以抗生素為基礎(chǔ)的治療的難度。相比之下，從一個長期的觀點(diǎn)來看，疫苗是疾病控制更安全更有效的方法。由于滅活疫苗的抗原性較弱，而減毒疫苗的安全性不穩(wěn)定，為此，研制使用方便、高效、易商品化大規(guī)模生產(chǎn)、切實(shí)有效的亞單位疫苗，對水產(chǎn)業(yè)尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原、相關(guān)表達(dá)載體、疫苗和應(yīng)用，該遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫原性較好，為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原，其特點(diǎn)是，所述遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白， 所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。較佳地，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種重組表達(dá)載體，其特點(diǎn)是，包括表達(dá)載體和整合在所述表達(dá)載體上的編碼上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原的外源核苷酸序列。較佳地，所述外源核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，其特點(diǎn)是，由上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原制備而成。在本發(fā)明的第四方面，提供了上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原在制備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應(yīng)用。較佳地，所述遲鈍愛德華氏菌是遲鈍愛德華氏菌EIB202，保藏編號為CCTCC NO M 208068。本發(fā)明的有益效果具體在于本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示，實(shí)驗(yàn)表明該遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原對遲鈍愛德華氏菌有較好的免疫保護(hù)作用，同時，對于亞單位疫苗開發(fā)而言，該遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原也將作為后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)的優(yōu)選靶點(diǎn)，為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明的重組表達(dá)載體的一具體實(shí)施例表達(dá)的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原純化后的SDS-PAGE圖，泳道1 蛋白Marker ；泳道2和3 :FD蛋白表達(dá)結(jié)果；泳道4 和5 :FD蛋白純化結(jié)果。圖2是本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫斑馬魚后的相對免疫保護(hù)分析。圖3是本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫大菱鲆后的相對免疫保護(hù)分析。圖4是本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫大菱鲆血清殺菌活力分析。圖5是本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫大菱鲆血清中特異性抗體效價分析。
具體實(shí)施例方式為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1重組蛋白疫苗的制備一、實(shí)驗(yàn)材料1、菌株和質(zhì)粒大腸桿菌Escherichia coli T0P10、大腸桿菌Ε. coli BL21 (DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；遲鈍愛德華氏菌E. tarda EIB202，保藏號為CCTCC M 208068 ；pET 28a (+)載體購自寶生物工程(大連)有限公司。2、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基LB 1 % Tryptone, 0. 5 % Yeast extract，1 % NaCl。固體培養(yǎng)基加入 2 % ager。 121°C高壓滅菌20min。用于大腸桿菌培養(yǎng)。TSB 3% TSB。固體培養(yǎng)基加入2% ager。121°C高壓滅菌20min。用于EIB202培養(yǎng)。
DHL培養(yǎng)基60g膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基溶于IL去離子水中，反復(fù)煮沸溶解至澄清，冷卻后制作平板。培養(yǎng)條件大腸桿菌在37°C LB固體培養(yǎng)基中平板靜置培養(yǎng)或LB液體培養(yǎng)基中搖床震蕩培養(yǎng)遲鈍愛德華氏菌接種于TSB液體培養(yǎng)基，28°C,200r/min過夜振搖。遲鈍愛德華氏菌液涂布或劃線于DHL固體培養(yǎng)基上，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，在DHL固體培養(yǎng)基上形成邊緣半透明的黑心菌落。3、實(shí)驗(yàn)試劑常規(guī)分子生物學(xué)試劑及試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶Nde I, Xho I購自寶生物工程(大連)有限公司。蛋白表達(dá)及純化常規(guī)試劑，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。親和層析介質(zhì)Ni-S印harose FF購自GE Healthcare0 抗大菱鲆IgM的單克隆抗體購自Aquatic Diagnostics,羊抗鼠單克隆抗體購自Tiangen。4、抗原蛋白基因序列根據(jù)E. tarda EIB202全基因組序列，得到相應(yīng)遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白FD 基因的DNA序列(SEQ ID NO :1)。其氨基酸序列見SEQ ID NO :2。5、抗原蛋白引物用I^rimer Premier 5軟件設(shè)計(jì)FD基因的特異性引物，引物經(jīng)上海生物工程公司合成，為PAGE純化產(chǎn)物。FDf GGGAGATCATATGGCCATTTCGGTATCG (Nde I)FDr GCCGCTCGAGTAAGATCTGGCGTACGT (Xho I)6、實(shí)驗(yàn)動物及免疫試劑斑馬魚，購于上海養(yǎng)殖場，體長如m，體重約0.4g。實(shí)驗(yàn)前先置于水族箱內(nèi)適應(yīng)訓(xùn)養(yǎng)2周，后移至魚飼養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)2周。魚飼養(yǎng)系統(tǒng)每天流動更換水體，養(yǎng)殖溫度22°C左右。 每天喂養(yǎng)2次并及時清除糞便殘?jiān)?。大菱鲆，購于山東濰坊養(yǎng)殖場，體重30g，體長10cm，置于水槽內(nèi)適應(yīng)馴養(yǎng)2周，備用。實(shí)驗(yàn)中每天使用天然海水替換2/3體積養(yǎng)殖水并充氣，水溫14-16°C。免疫接種前后按照常規(guī)的養(yǎng)殖程序管理。魚用麻醉劑 tricaine methanesulphonate (MS-222)購于 Sigma 公司。魚用佐劑 MONTANIDE ISA 763A，購買于法國 SEPPIC 公司。二、實(shí)驗(yàn)方法1、FD重組抗原蛋白基因的構(gòu)建載體質(zhì)粒pET28a的抽提根據(jù)TIANpr印Mini Plasmid Kit的操作說明進(jìn)行。根據(jù)TIANamp Bacteria DNA Kit的操作說明進(jìn)行遲鈍愛德華氏菌EIB202基因組的提取?；蚪M用于PCR反應(yīng)，所用引物為設(shè)計(jì)的特異性引物FDf/FDr，得到兩端含Nde I和)(h0 I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的目的產(chǎn)物。選用限制性內(nèi)切酶Nde I和B10 I進(jìn)行雙酶切，酶切后的目的基因和載體經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，切割下目的條帶后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA。得到帶有粘性末端的目的基因和質(zhì)粒后，在DNA連接酶的作用下將兩者連接起來，形成含有目的基因的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒即可以用于轉(zhuǎn)克隆大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。平板上的克隆經(jīng)測序和酶切驗(yàn)證確定為陽性，即為遲鈍愛德華氏菌FD蛋白的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-28a-FD。2、FD重組抗原蛋白的表達(dá)純化將測序成功的表達(dá)菌株接種，生長到一定程度加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌液離心后用用超聲波法破壁，離心后收集上清。蛋白電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)的FD重組蛋白，見圖1箭頭所示。蛋白電泳結(jié)果表明FD重組蛋白有大量表達(dá)。FD重組蛋白兩端各帶了一個His標(biāo)記，能特異地與Ni結(jié)合。因此可以用Ni柱來專一地純化目標(biāo)蛋白。將洗脫得到的蛋白，裝入截留分子量為14kD的透析袋內(nèi)，在PBS溶液中透析，-70°C保存。實(shí)施例2 以斑馬魚為試驗(yàn)動物的注射給藥免疫保護(hù)試驗(yàn)蛋白濃度測定利用核酸定量儀NanoDrop ND-1000 spectrophotometer檢測其0擬80，確定重組蛋白濃度，用PBS緩沖液將蛋白稀釋至預(yù)定的濃度。斑馬魚的免疫注射純化FD重組蛋白與佐劑ISA 763A按照7 3的比例混合，最終蛋白濃度達(dá) 0.3μδ/μ1ο斑馬魚隨機(jī)分組養(yǎng)殖，30條/組，每條斑馬魚進(jìn)行尾部肌肉注射免疫。然后正常飼養(yǎng)，觀察魚的活動及死亡情況。免疫時間為一個月。陰性對照為PBS和佐劑混合組。注射操作前，先將斑馬魚浸泡于lOOng/ml MS-222中進(jìn)行麻醉。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后， 將剩余斑馬魚進(jìn)行安樂死，即浸泡于300ng/ml MS-222中10分鐘以上。斑馬魚的攻毒注射收集遲鈍愛德華氏菌EIB202菌體，用滅菌PBS洗滌三次，用分光光度計(jì)測定重懸后的菌體密度，定量OD6tltl為1，并用PBS將菌液稀釋至濃所需度梯度；每條試驗(yàn)斑馬魚按照 δμ /fish的劑量進(jìn)行尾部肌肉注射免疫；觀察記錄各組斑馬魚發(fā)病及死亡的情況。重組蛋白免疫保護(hù)力的測定斑馬魚免疫后養(yǎng)殖4周后，根據(jù)野生株半數(shù)致死量LD50值，選擇合適的劑量對免疫過的斑馬魚進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)；觀察記錄各組斑馬魚發(fā)病及死亡情況。按(1)公式計(jì)算相對保護(hù)率(Relativepercent survival, RPS)RPS = (1-免疫組亡率/對照組死亡率)X 100%(1)斑馬魚攻毒后8天內(nèi)的死亡情況見圖2。斑馬魚攻毒后第一天有極少量魚死亡，隨后魚體穩(wěn)定下來。第三天開始有大量死亡的情況，并且發(fā)現(xiàn)斑馬魚活動緩慢，臨死前尾部左右擺動，感染部位體色發(fā)黑。第8天死亡情況已經(jīng)趨于穩(wěn)定。其中空白對照組的死亡率為 81%,免疫組的死亡率為23 %。計(jì)算得知，F(xiàn)D蛋白的相對保護(hù)率為71 %。將病魚解剖后發(fā)現(xiàn)魚體脾臟腫大，失血呈粉紅色，肝臟出現(xiàn)彌散性出血。將病魚組織適當(dāng)處理稀釋后涂DHL板，28°C過夜培養(yǎng)，板上有大量黑心菌落存在，說明斑馬魚致病原因的確是感染了遲鈍愛德華氏菌。實(shí)施例3 以大菱鲆為試驗(yàn)動物的注射給藥免疫保護(hù)試驗(yàn)大菱鲆的免疫大菱鲆隨機(jī)分組養(yǎng)殖，30條/組，每條按照100μ I/fish的劑量進(jìn)行尾部肌肉注射。純化蛋白透析過夜后，按照其濃度，與佐劑ISA 763A按照7 3的比例混合至蛋白濃
7度達(dá)0.3yg/yl。PBS和佐劑ISA 763A免疫組為陰性對照。然后正常飼養(yǎng)，觀察魚的活動及有無死亡。免疫時間為10周。注射操作前，先將大菱鲆浸泡于lOOng/ml MS-222中進(jìn)行麻醉。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后， 將剩余大菱鲆進(jìn)行安樂死，即浸泡于300ng/ml MS-222中10分鐘以上。大菱鲆的攻毒大菱鲆的攻毒于斑馬魚攻毒方法相同，大菱鲆在免疫之后，第10周，根據(jù)野生株 LD50值，選擇合適的劑量對免疫過的大菱鲆進(jìn)行分組攻毒實(shí)驗(yàn)?？乖鞍自诖罅怫殷w內(nèi)免疫保護(hù)力分析大菱鲆攻毒后8天內(nèi)的死亡情況見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大菱鲆攻毒后第三天開始有大量死亡的情況，并且有明顯發(fā)病癥狀病魚的鰓蓋緣，膜鰭基部及腹面皮下充血、發(fā)紅， 隨后出血處病灶發(fā)生膿瘍，形成皮下膿腫。第7天死亡情況已經(jīng)趨于穩(wěn)定。其中空白對照組的死亡率為80%，免疫組的死亡率為30%。計(jì)算得知，F(xiàn)D蛋白的相對保護(hù)率為62. 5%。比較斑馬魚和大菱鲆免疫FD蛋白所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明一級動物模型斑馬魚上初篩獲得的候選抗原蛋白FD，在二級動物模型大菱鲆上也有較好的免疫保護(hù)作用，這一方面為后續(xù)進(jìn)一步的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)打下來良好基礎(chǔ)，也證實(shí)了斑馬魚可以成為篩選保護(hù)性抗原的新的動物模型。同時，對于亞單位疫苗開發(fā)而言，F(xiàn)D也將作為后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)的優(yōu)選靶點(diǎn)。實(shí)施例4 =FD抗原蛋白免疫水平分析大菱鲆采血及抗血清的制備大菱鲆免疫FD重組蛋白后，分別在第8周和第10周從實(shí)驗(yàn)魚尾靜脈取血，每尾取出約0. 3ml血。全血室溫靜置后離心，收集上層血清，存儲于-80°C備用?？寡鍤⒕鷮?shí)驗(yàn)接種遲鈍愛德華氏菌EIB202，過夜培養(yǎng)。用PBS洗滌三次，取一定量菌懸液與免疫血清混合孵育，于1，2，3，4，證分別取樣涂布平板；空白對照樣為菌懸液與非免疫血清混合。每組設(shè)三組平行對照。所有平板培養(yǎng)20h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算抗血清在不同時間點(diǎn)的殺菌能力。將大菱鲆免疫FD重組蛋白所獲得的抗血清與EIB202孵化，取不同孵化時間點(diǎn)分析抗血清的殺菌能力。結(jié)果見圖4。由上圖結(jié)果可知，抗血清與遲鈍愛德華氏菌孵化4小時后，活菌數(shù)最少，即此時血清具有最佳的殺菌能力。與活菌孵化4小時后，第8周血清中遲鈍愛德華氏菌的存活率為 41%，第10周血清中菌的存活率為53%，顯然第8周的抗血清具有更加的殺菌性能。血清抗體水平測定分析實(shí)驗(yàn)魚大菱鲆免疫后產(chǎn)生的特異性抗體水平測定常規(guī)間接ELISA方法檢測將純化后的重組蛋白FD包板孵化過夜。洗板3次，拍干；加入封閉液溶液，于22°C 封閉池。洗板3次，拍干；加入魚免疫血清，100 μ 1/孔，以2倍系列稀釋度加到各孔中，初始稀釋度為1 4，最大稀釋度為1 512，將空白血清做相同處理作為對照。于22°C孵育池。洗板5次，拍干；加入抗大菱鲆IgM的單克隆抗體，于22°C孵育lh。洗板5次，拍干；加入羊抗鼠單克隆抗體(HRP標(biāo)記)，于22°C孵育lh。洗板5次，拍干；加入可溶型TMB底物洗液，室溫避光放置IOmin ；加入反應(yīng)終止液，置于酶標(biāo)儀中以0D450波長檢測。抗體效價根據(jù)P/N值來確定。試驗(yàn)血清吸光度值(P)=待檢血清OD值-空白血清OD值，陰性對照血清吸光度值(N)=陰性血清OD值-空白OD值，當(dāng)兩者比值大于2. 1時，抗血清的最高稀釋倍數(shù)為其最終抗體效價。利用常規(guī)間接ELISA方法測定大菱鲆免疫FD重組蛋白產(chǎn)生的的特異性抗體水平， 結(jié)果見圖5。結(jié)果表明抗血清的吸光值明顯大于空白血清。大菱鲆免疫FD重組蛋白后產(chǎn)生了一定的特異性抗體。綜上所述，本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫原性較好，為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原，其特征在于，所述遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原，其特征在于，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括表達(dá)載體和整合在所述表達(dá)載體上的編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原的外源核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原，其特征在于，所述外源核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
5.一種遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，其特征在于，由根據(jù)權(quán)利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原制備而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原在制備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述遲鈍愛德華氏菌是遲鈍愛德華氏菌 EIB202，保藏編號為CCTCC NO :M 208068。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原，其是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白，遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。較佳地，遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關(guān)蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，還提供了相關(guān)的重組表達(dá)載體，制成的遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，及在制備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護(hù)性抗原免疫原性較好，為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗，有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C07K14/195GK102206257SQ20111009582
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者吳海珍, 張?jiān)d, 張萌, 李小勇, 沈斌兵, 王啟要 申請人:華東理工大學(xué)