專利名稱：一種交叉保護疫苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌交叉保護疫苗及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌為世界上，包括我國，水產(chǎn)養(yǎng)殖生物重要病原，二者皆具有廣泛的宿主范圍，能夠感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，如魚、蟲下、貝等。另外，遲緩愛德華氏菌尚可感染人類，是一種人/畜共患菌。目前對于哈氏弧菌和愛德華氏菌病的防治主要依賴于抗生素(包括各種化學(xué)品、農(nóng)藥等)和傳統(tǒng)疫苗免疫，即簡單的滅活疫苗。針對這兩種病原的重組亞
單位疫苗，雖有研究報道，但尚未見于實際應(yīng)用。滅活疫苗需要一定的制備過程，而且在這一過程中通常部分抗原結(jié)構(gòu)被破壞，由此影響免疫效果。相對而言，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的重組亞單位疫苗則具有特異性強、免疫效應(yīng)較高等特點，但常規(guī)亞單位疫苗的缺點是需要提取、純化大量蛋白，因而制備較昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌交叉保護疫苗及其構(gòu)建方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為交叉保護疫苗具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。交叉保護疫苗的構(gòu)建方法
1)質(zhì)粒pPT6構(gòu)建以質(zhì)粒pTrcHis為模板，用引物TRF1和TRR1進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc,得質(zhì)粒pBSTR;將pBSTR與質(zhì)粒pBR322用EcoRI/BamHI雙酶切后連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a,得質(zhì)粒pBSTRl;將pBTRl用Mel酶切，與寡聚核苦酸NDEF連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a ，得質(zhì)粒pPTN;將pPTN用BamHI/XhoI酶切，與寡聚核苷酸bnsnx連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 oc,得質(zhì)粒pPT6;
所述寡聚核苷酸NDEF: 5， -TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3'
寡聚才亥苦酸bnsnx: 5， — gatccaaggagaccatgggagctcgcggccgcac —3，；
2 )質(zhì)粒pT6VH的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用引物GDF5和GDR1 PCR進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,得質(zhì)粒pBSVH;將pBSVH和質(zhì)粒pPT6用Ncol/Xhol雙酶切，連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，得質(zhì)粒pT6VH;
3 )質(zhì)粒pT6VH18的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，用引物ETF6
4和ETR1進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，得質(zhì)粒pBS18，將pBS18和pT6VH用Xhol酶切，連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，得質(zhì)粒即為具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列交叉保護疫苗。
步驟l)中用EcoRI/BamHI雙酶切回收的段為130bp和4kb片段，將兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，而后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 oc 。步驟2)中用Ncol/Xhol雙酶切回收590bp和4kb片段，將兩段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc。步驟3)中用Xhol酶切回收520bp和4. 6kb片段，將兩段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc。所述轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后均在含有100 ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24 ug/ml異丙基-(3 -D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選白色轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。步驟3)所得具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列交叉保護疫苗在含有100ug/ml的Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取lml過夜后的培養(yǎng)液將其加入100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37。C下?lián)u動培養(yǎng)至OD6。。為0.8，而后離心，收集菌液，即得表達(dá)含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的疫苗抗原Vhel8。所述以160-200rpni搖動培養(yǎng)，離心條件為5000g, 4°C， 10min。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 交叉免疫保護性。本發(fā)明的交叉保護疫苗能夠在一定程度上同時防御哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌感染，構(gòu)建針對哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌的融合型重組亞單位疫苗抗原Vhel8,能夠同時保護牙鲆抵御哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌感染。
2. 高保護g。本發(fā)明的交叉保護疫苗對哈氏弧菌的免疫保護效率達(dá)82%。
3.應(yīng)用簡單。本發(fā)明的疫苗抗原制備過程簡單，毋需蛋白質(zhì)提取、純化等。本發(fā)明運用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了該抗原的細(xì)菌表面展示型表達(dá)載體，從而使得抗原載體菌可以直接作為疫苗接種，避免了蛋白質(zhì)提取、純化過程。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均釆用如下方法
1. 質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、頭A片段從凝膠中回收、細(xì)菌基因組DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相應(yīng)試劑盒。
2. 質(zhì)粒、薩A連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001 );
3. 所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司"。實施例1
本發(fā)明保護性疫苗抗原由序列表SEQ ID No. 1中的vhel8堿基序列所示。
疫苗抗原表面展示載體的構(gòu)建方法
1) 質(zhì)粒pPT6的構(gòu)建
以質(zhì)粒pTrcHis (購自于美國Invitrogen公司)為模板，用下列引物PCR: TRF1 (5, — gaattcattaatcactgcataattcgtg _3，，戈寸線堿基為EcoRI位點)，
TRR1 (5， — GGATCCGATATCATTATACGAGCCGGATG —3，， 戈'J線堿基為BamHI/EcoRV位
點)，PCR條件為94。C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s, 48°C 60s, 72°C60s, 5個循環(huán)后改為94°C 40s, 57°C 60s, 72°C 60s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)10min。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T(購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉素(Ap )、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-0-D-乳糖苷)和24 ug/ml異丙基-P-D-硫代半乳糖苦(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，即為質(zhì)粒pBSTR。將pBSTR與質(zhì)粒pBR322 (購自"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京)用EcoRI/BamHI雙酶切后分別回收130bp和4kb片段；將該2片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Ap ( 50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，挑取1個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為pBTRl。將pBTRl用Ndel酶切，將酶切片 段 與 寡 聚 核 苷 酸 NDEF ( 5 '-TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3，)用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有Ap (50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，挑取1個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為pPTN。將pPTN用BamHI/XhoI酶切，將酶切片段與寡聚核苷酸bnsnx (5，-
GATCCAAGGAGACCATGGGAGCTCGCGGCCGCAC —3，)用TMDNA連接酵于室i顯連接2 — 4 /j、時,
連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有Ap (50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，挑取1個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為pPT6。
2) 質(zhì)粒pT6VH的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用下列引物PCR: GDF5 (5'-AGTACCATGGATGAAGAGAAGGAATCCTC G -3，,劃線堿基為Ncol位點),GDR1(5， - CTGTCTCGAGTTTCAATCTAGTTGGTTTTG -3，，劃線堿基為Xhol位點)，PCR條件為:94。C60s預(yù)變性模板DNA,然后94°C 40s， 52。C 60s, 72。C 60s,5個循環(huán)后改為94°C 40s, 62。C 60s, 72°C 60s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室溫連接2-4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉素(Ap )、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-p-D-乳糖苷)和24 ug/ml異丙基-(3 -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為PBSVH。將pBSVH和上述步驟1)的質(zhì)粒pPT6用Ncol/Xhol雙酶切后分別回收590bp和4kb片段；將上述兩段DNA片段用T4顧A連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有Ap (100ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pT6VH。
所述LB固體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，瓊脂1.5%， 97. 5%蒸餾水；所述哈氏弧菌T4保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No.1985。
3)質(zhì)粒pT6VH18的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，用下列引物PCR: ETF6 (5， - CTCGAG GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCGTCGCCGCCGT -3，，劃線堿基為Xhol位點)，ETR1 (5， - CTCGAGCCCGGGCTTCAGCAGCGAGAACGCG -3,,劃線堿基為Xhol位點)，PCR條件為94。C60s預(yù)變性模板DNA，然后94。C40s， 58°C 60s, 72°C 60s, 5個循環(huán)后改為94°C 40s， 72°C 100s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)10min。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc后在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/mlIPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 - 30小時，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為pBS18。將pBS18和上述步驟2)的質(zhì)粒pT6VH用Xhol酶切后分別回收520bp和4. 6kb片段；將上述兩段DNA片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30小時，挑取2個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測序驗證為正確重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為pT6VH18。
其中所述遲緩愛德華氏菌TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC,保藏編號為CGMCC No. 2330。
(a)序列特征:
:1038 bp: 堿基序列:單鏈結(jié)構(gòu)線性
度型型撲
長類鏈拓
7(b) 分子類型雙鏈DNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源哈氏弧菌T4和遲緩愛德華氏菌TX1
(f) 特異性名稱vhel8
4 )疫苗制備方法將含有上述步驟3 )的質(zhì)粒pT6VH18的大腸桿菌DH5a在含有Ap(100ug/ml)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取lml過夜后的培養(yǎng)液將其加入100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速160-200rpm搖動培養(yǎng)至OD鋼為0.8。而后將細(xì)菌培養(yǎng)液離心(5000g, 4。C, 10min),收集菌液，即得表達(dá)含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的疫苗抗原Vhel8的大腸桿菌，即疫苗。所述LB液體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。
實施例2
疫苗的免疫應(yīng)用
步驟l)疫苗的免疫注射。將上述所收集的菌體懸浮于PBS中至終濃度為5xl08cfu/ml，即為疫苗制備液。將120條牙鲆(每條重約13g)隨機分為4組，每組30條。將這4組分別命名為A, B, C，和D組。將A和C組的每條魚分別腹腔注射10G ul上述疫苗制備液。將B和D組的每條魚分別腹腔注射1Q0 ul PBS。
其中PBS組成成分為0. 8gNaCl， 0. 02g KC1, 0. 358g Na2HP04. 12H20，0. 024g NaH2PO"
步驟2 )哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)哈氏弧菌T4和遲緩愛德華氏菌TX1至OD,為0. 6,然后離心(5000g, 4°C )10 min。 收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度分別為5xl08 cfu/ml(T4)和lx107 cfu/ml (TX1),即為哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌懸液。
步驟3)交叉保護性疫苗針對哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌的免疫保護效應(yīng)檢測。在步驟1)第一次免疫注射后的第34天，用上述步驟2)的哈氏弧菌懸液腹腔注射步驟l)的A和B兩組魚，用上述步驟2)的遲緩愛德華氏菌懸液腹腔注射步驟l)的C和D兩組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，4條；B組，22條；C組，11條，D組，24條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS):
RPS = 100x (1 -免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)
由此得出疫苗Vhel8針對哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌的免疫保護效率分別為82%和54%,故其能夠在不同程度上保護牙鲆抵御哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌侵染。序列表.
SEQUENCE LISTING
〈110〉中國科學(xué)院海洋研究所
<120〉 一種交叉保護疫苗及其構(gòu)建方法
<130〉
<160> 2
<170〉 Patentln version 3.1
<210〉 1
《211〉 1038
<212〉 DNA
<213〉 哈氏弧菌T4和遲緩愛德華氏菌TX1
<220〉
<221> CDS<222〉 (l)..<223〉
(1038)
<400〉 13tg tgc gtcMet Cys1
Val
gccAla
gccAla5
Val
lie
ggcGly
叫tSer
gcg acc atg gcaAla Thr Met Ala10
Thr
cag gcgGin /Ua15
48
gcc age gat ccc cgc age gtg ggt acc cag gtc gac gat ggt acg ctgAla Ser Asp Pro Arg Ser Val Gly Thr Gin Val Asp Asp Gly Thr Uu20 25 30
96
gag gcc cgc ate tec aac gcc ctg age aaa gac gca cag ctg aag aaaiGlu人la Arg lie Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp人la Gin Leu Lys Lys35 40 45
144
gag gcg cgc gtc gtg gta acc gcc tat cag ggg cag gtg ctg ctg accGhi Ala Arg Val Val Val Thr Ala Tyr Gin Gly Gin Val Leu Leu Thr50 55 60
192
ggt cag gcg cca age cag gcg ctg att age cgc gcc aag cag ate gcgGIy Gin Aia Pro Ser Gin Ma Leu He Ser Arg Ala Lys Gin lie Ala65 70 75 80
240
atg ggc gU gaa ggc acc aag gcg gtc tat aat gag ate cgt tta ggcMet. Glv Val Glu Glv Thr Lys Ala Val Tvr Asn Glu lie Arg Leu Gly85 9b 95
288
cag ccg gtc age ctg ggc act gcc teg gcc gat gcc tgg ate acc accGin Pro Val Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala, Trp lie Thr Thr100 105 110
336
鄉(xiāng)gtc cgc tec cag ctg,ys Val Arg Ser Gin Leu
tg gcc age gac cag gtg aaa tec acc aacw A]a Ser Asp Gin Vai Lys Ser Thr Asn
384
9序列表.txt 125
gtg aag gtg acc acc gaa aat ggc gag gtc ttc ctg ctg ggg ctg gtg Val Lvs Val Thr Thr Glu Asn Glv Glu Val Phe Leu Leu Glv Leu Val 130 135 140
432
acg ccc aaa gag gga cag gcc gcc gcg caa acg gcc agt犯a gtc age Thr Pro Lys Glu Gly Gin Ala Ala Ala Gin Thr Ala Ser Lys Val Ser 145 150 155 160
480
ggg gta aaa cat gtc act acc gcg ttc teg ctg ctg aag tgc gtc gcc Gly Val Lys His Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys Cys今al人la . ' 165 170 175
528
gcc gtg ate ggc agt gcg acc atg gca acc cag gcg gcc age gat ccc Ala Val lie Gly Ser Ala Thr Met Ala Thr Gin Ala Ala Ser Asp Pro 18b 185 190
576
cgc age gtg ggt acc cag gtc gac gat ggt acg ctg gag gcc cgc ate Arg Ser Val Gly Thr Gin Val Asp Asp Gly Thr Leu Glu Ala Arg lie 195 200 205
624
tec aac gcc ctg age aaa gac gca cag ctg aag aaa gag gcg cgc gtc Ser Asn Ala_ Leu Ser Lys Asp Ala Gin Leu lvs Lvs Glu Ala Arg Val 210 215 2^0
672
gtg gta acc gcc tat cag ggg cag gtg ctg ctg acc ggt cag gcg cca Val Val Thr Ala Tyr Gin G1y Gin Val Leu Leu Thr Glv Gin Ala Pro 225 230 235 240
720
age cag gcg ctg att age cgc gcc aag cag ate gcg a/tg ggc gtt gaa Ser Gin Ala Leu lie Ser Arg Ala Us Gin lie Ala Met Glv Val Glu 245 250 255
768
ggc acc aag gcg gtc tat aat gag ate cgt tta ggc cag ccg gtc age Gly Thr Us Ala Val Tyr Asn Glu lie Arg Leu Gly Gin Pro Val Ser 260 265 270
816
ctg ggc act gcc teg gcc gat gcc tgg ate acc acc aag gtc cgc tec Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp lie Thr Thr Lys Val Arg Ser 275 280 2&
864
cag ctg ctg gcc age gac cag gtg aaa tec acc aac gtg aag gtg acc Gin Leu Leu Ala Ser Asp Gin Val Lys Ser Thr Asn Vai Lys Val Thr 290 295 300 '
912
acc gaa aat ggc gag gtc ttc ctg ctg ggg ctg gtg acg ccc aaa gag Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val Thr Pro Lys Glu 305 310 315 320
960
gga cag gcc gcc gcg caa acg gcc agt aaa gtc age ggg g"ta aaa cat Gly Gin Ala Ala Ala Gin Thr Ala Ser Lvs Val Ser Glv Val Us His 325 3^0 335
1008
gtc act acc gcg "ttc teg ctg ctg aag taa Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys 340 3&
1038
<210〉 2
〈211〉 345
〈212〉 PRT
<213> 哈氏弧菌T4和遲緩愛德華氏菌TX1
〈400〉 2
Met Cys Val Ala Ala Val lie Glv Ser Ala Thr Met. Ala 丁hr 1 5 10
Gin 15
Ala序列表.txt
Ala Ser Asp Pro Arg Ser Val Gly Thr Gin Val Asp Asp Gly Thr Leu 20 25 30
Glu Ala Arg lie Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gin Leu Lys Lvs 35 40 45 ' '
Glu Ala Arg Val Val Val Thr Ala Tyr Gin Glv Gin Val Leu Leu Thr 50 55 60
Gly Gin Ala Pro Ser Gin Ala Leu lie Ser Arg Ala Lys Gin lie Ala
65
70 75
80
Met Gly Val Glu Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu lie Arg Leu Gly
85 90
95
Gin Pro Val Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp lie Thr Thr
100
105
110
Lys Val Arg Ser Gin Leu Leu Ala Ser Asp Gin Val Lys Ser Thr Asn 115 120 125
Val Lys Val Thr Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val
130
135
140
Thr Pro Lys Glu Gly Gin Ala Ala Ala Gin Thr Ala Ser Lys Val Ser
145
150 155
160
Gly Val Lys His Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys Cys Val Ala
165 170
175
Ala Val lie Glv Ser Ala Thr Met Ala Thr Gin Ala Ala Ser Asp Pro 18& 185 190
Arg Ser Val Gly Thr Gin Val Asp Asp Gly Thr Leu Glu Ala Arg lie
195
200
205
Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gin Leu Lvs Lys Glu Ala Arg Val 210 '215 ' 2&
Val Val Thr Ala Tyr Gin Gly Gin Val Leu Leu Thr Gly Gin Ala Pro
225
230 235
240
Ser Gin Ala Leu lie Ser Arg Ala Lys Gin lie Ala Met Gly Val Glu
245 250
255
Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu lie Arg Leu Gly Gin Pro Val Ser
260
265
270
Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp lie Thr Thr Lys Val Arg Ser
275
280
285
Gin Leu Leu Ala Ser Asp Gin Val Lys Ser Thr Asn Val Lys Val Thr
290
295
300
Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val Thr Pro Lys Glu
305
310 315
320
11序列表.txt
Gly Gin Ala Ala Ala Gin Thr Ala Ser Lys Val Ser Gly Val Lvs His 325 350 335
Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lvs 340 34權(quán)利要求
1.一種交叉保護疫苗，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。
2. —種按權(quán)利要求l所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于1)質(zhì)粒pPT6構(gòu)建以質(zhì)粒pTrcHis為模板，用引物TRF1和TRR1進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cx,得質(zhì)粒pBSTR;將pBSTR與質(zhì)粒pBR322用EcoRI/BamHI雙酶切后連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc，得質(zhì)粒pBSTRl;將pBTRl用Ndel酶切，與寡聚核苷酸NDEF連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 oc ，得質(zhì)粒pPTN;將pPTN用BamHI/Xho1酶切，與寡聚核苷酸BNSNX連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 cx ,得質(zhì)粒pPT6;所述寡聚核苷酸NDEF: 5， -TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3，寡聚核苷酸BNSNX: 5， - GATCCAAGGAGACCATGGGAGCTCGCGGCCGCAC -3，；2)質(zhì)粒pT6VH的構(gòu)建以哈氏弧菌T4為模板，用引物GDF5和GDR1 PCR進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,得質(zhì)粒pBSVH;將pBSVH和質(zhì)粒pPT6用Ncol/Xhol雙酶切，連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a,得質(zhì)粒pT6VH;3)質(zhì)粒pT6VH18的構(gòu)建以遲緩愛德華氏菌TX1為模板，用引物ETF6和ETR1進行PCR擴增，產(chǎn)物與載體pBS-T連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc,得質(zhì)粒pBS18，將pBS18和pT6VH用Xhol酶切，連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，得質(zhì)粒即為具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列交叉保護疫苗。
3. 按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1 )中用EcoRI/BamHI雙酶切回收的段為130bp和4kb片段，將兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 - 4小時，而后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a 。
4. 按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于步驟2)中用Ncol/Xhol雙酶切回收590bp和4kb片段，將兩段用T4DNA連接酶于室溫連接2 - 4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a 。
5. 按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于步驟3)中用Xhol酶切回收520bp和4. 6kb片段，將兩段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a。
6. 按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后均在含有100 ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24 ug/ml異丙基-e-D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選白色轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。
7. 按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于步驟3)所得具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列交叉保護疫苗在含有100ug/ml的Ap的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取lml過夜后的培養(yǎng)液將其加入100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,于37t下?lián)u動培養(yǎng)至OD6。。為0.8，而后離心，收集菌液，即得表達(dá)含有序列表SEQ ID Nol中的堿基序列的疫苗抗原Vhel8。
8.按權(quán)利要求2所述的交叉保護疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述以160-200rpm搖動培養(yǎng)，離心條件為5000g, 4°C, 10min。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌交叉保護性疫苗、其抗原表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用方法。具體為所述交叉保護性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列，其構(gòu)建方法構(gòu)建質(zhì)粒pPT6和pT6VH，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌交叉保護性疫苗抗原的質(zhì)粒pT6VH18。pT6VH18轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，于常規(guī)條件下培養(yǎng)后即得保護性疫苗。本發(fā)明所得疫苗不但具有交叉保護效應(yīng)，而且不需要任何純化過程。
文檔編號A61K39/106GK101491671SQ200810237789
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者鯤 孫, 黎 孫 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所