球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表達(dá)載體、含有其基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表達(dá)載體、含有其基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法和應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制農(nóng)作物產(chǎn)量提高的重要因素。目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥作為防治病害的主要手段，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)還造成生態(tài)環(huán)境的破壞。因此，抗病品種選育越來(lái)越受關(guān)注，成為植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常規(guī)育種周期長(zhǎng)、育種資源有限、病原菌變異迅速，因此不易獲得抗性植株，難以滿足生產(chǎn)的需要。隨著生物工程技術(shù)發(fā)展，研宄者開始利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源抗病基因轉(zhuǎn)入植物以提高植株的抗病性；這種方法具有選育速度快，易于獲得抗性植株，且具有較好的遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，已成為獲得抗病性植株的主要手段。但目前由于缺乏高效、廣譜、持久的抗病基因，植物抗病基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)上的應(yīng)用受到很大限制；因此，獲得高效、廣譜的抗病基因，并分析其對(duì)植物抗病能力的影響是植物抗病基因工程的研宄重點(diǎn)。
[0004]昆蟲病原真菌，如球孢白僵菌與金龜子綠僵菌，是控制自然界昆蟲種群數(shù)量的主要因子，已被開發(fā)成生物農(nóng)藥，廣泛用于農(nóng)林害蟲及城市衛(wèi)生昆蟲的防治。球孢白僵菌是我國(guó)應(yīng)用范圍較廣的生防真菌，具有寄主范圍廣、毒力高等特點(diǎn)；目前的研宄顯示，球孢白僵菌除能致病昆蟲外，還能寄生于植物，拮抗植物病原真菌的生長(zhǎng)，為植物提供保護(hù)。我們通過前期研宄，將來(lái)自球孢白僵菌的水解酶基因，如Bbchitl導(dǎo)入番茄及棉花中，顯著提高了植株的抗病能力；這一研宄表明，球孢白僵菌可能是篩選獲得高效抗病基因的重要來(lái)源。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供球孢白僵菌(及?awreriabassiana )的抗菌蛋白Bbafp，解決目前植物抗病基因工程缺乏有效抗病基因的問題；該抗菌蛋白具有抑制植物病原真菌生長(zhǎng)的活性，并能提高植物材料的抗病性的功效。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列的酵母表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)菌株的制備方法。
[0009]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的核苷酸序列的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明還提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法。
[0011]本發(fā)明又提供上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在對(duì)植物病原真菌的抑菌方面的應(yīng)用。
[0012]實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp，該抗菌蛋白氮端為含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，羧基端為70個(gè)氨基酸的成熟蛋白區(qū)域；該抗菌蛋白具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0013]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)載體，包括上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列和酵母表達(dá)載體。
[0014]上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟: DBbafp的克隆:
以球孢白僵菌的cDNA為模版，利用引物Pl和P2，擴(kuò)增Bbafp的成熟蛋白序列；所述成熟蛋白序列不包含信號(hào)肽；
其中，PCR 反應(yīng)體系如下:2.5 μ? 10XLA buffer, 2 μ? dNTP Mix, 2.5 μ? 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 Mmol/L的上下游引物各I μ?，(λ2 μ? LA Taq DNA聚合酶，I μ? cDNA模板，加水補(bǔ)至總體積為25 μ? ;其中Pl為上游引物，Ρ2為下游引物；LA Taq DNA聚合酶為5U/uL ;所述dNTP Mix為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的鈉鹽水溶液預(yù)混合的產(chǎn)品，其中，四種物質(zhì)在dNTP Mix中的濃度均為2.5 mmol/L ;PCR反應(yīng)參數(shù)為:95°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 s，56°C退火 30 sec，72°C延伸 I min，32 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 5 min ；
PCR反應(yīng)后，回收Bbafp片段，約227bp，克隆進(jìn)pEASY_Tl載體；經(jīng)測(cè)序正確的載體命名為 pEASY-Bbafp ；
所述引物Pl和P2序列如下:
Pl:51 - gaattcacccctgagcaatttgaggc-3'；
P2:5? - gcggccgcctagtggcacacgacagctcggc -3'；
其中，Pl的下劃線部分為EcoRI序列，P2的下劃線部分為NotI序列；
2)Bbafp的酵母表達(dá):
用EcoR I和Not I雙酶切步驟I)構(gòu)建的pEASY-Bbafp載體，回收Bbazf片段，克隆進(jìn)相同EcoR I和Not I雙酶切的酵母表達(dá)載體，獲得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)載體。
[0015]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)菌株的制備方法，將上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入酵母中，經(jīng)篩選獲得表達(dá)Bbafp的酵母表達(dá)菌株。
[0016]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表達(dá)載體，包括上述抗菌蛋白Bbafp的全部核苷酸序列和植物表達(dá)載體。
[0017]上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:以野生型球孢白僵菌的cDNA為模板，引物PBbafp-pexl和PBbafp-pex2，擴(kuò)增出Bbafp的全長(zhǎng)片段，包括其氮端的信號(hào)肽序列；
PCR 反應(yīng)體系:2.5 μ? 1XLA buffer, 2 μ? dNTP Mix, 2.5 μ? 25 mmol/L 的 MgCl2S液，10 Mmol/L 的 PBbafp-pexl 和 PBbafp_pex2 各 I μ?，0.2 μ? LA Taq DNA 聚合酶，I μ?cDNA模板，加水補(bǔ)至總體積為25 μι;所述LA Taq DNA聚合酶為5 U/uL;所述dNTP Mix為dATP, dCTP、dGTP和dTTP的鈉鹽水溶液預(yù)混合的產(chǎn)品，其中，四種物質(zhì)在dNTP Mix中的濃度均為2.5 mmol/L ;PCR反應(yīng)參數(shù)為:95°C預(yù)變性5 min;94°C變性30 s，56°C退火30 sec，72°C延伸I min，32個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 min ；
擴(kuò)增反應(yīng)后，回收Bbafp片段，克隆進(jìn)pEASY-Tl載體，獲pEASY-fBbafp ;用BamHI與EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，并克隆進(jìn)相同BamHI與EcoRI酶切的植物表達(dá)載體，獲得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表達(dá)載體；
所述引物PBbafp-pexl和PBbafp-pex2的序列如下:
PBbafp-pexl:cg^gatccatgcagattatttccatcgc ；
PBbafp-pex2:cg￡aattcctagtggcacacgacagctc ；
其中，PBbafp-pexl的下劃線序列為BamHI序列，PBbafp-pex2的下劃線序列為EcoRI序列。
[0018]含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，將上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證獲得Bbafp的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的轉(zhuǎn)基因植物。
[0019]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的應(yīng)用，上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在對(duì)植物病原真菌的抑菌方面的應(yīng)用。
[0020]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌在受到植物病原真菌拮抗時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種抗菌