檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物。所述特異性引物的序列為：引物F1：5'?GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC；R1：5'?GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT。檢測(cè)的靈敏度達(dá)到1:2500。
【專利說(shuō)明】
檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引 物。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲(chóng)病原真菌能夠侵染寄生昆蟲(chóng)，使昆蟲(chóng)罹病死亡，其殺蟲(chóng)功能已被用于農(nóng)、林、 草等植物害蟲(chóng)的防控治理中。近年研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)病原真菌除了能夠侵染害蟲(chóng)減少植物蟲(chóng) 害以外，還能夠進(jìn)入植物宿存，促進(jìn)植物的發(fā)育生長(zhǎng)。至今證明至少有8屬種殺蟲(chóng)真菌可在 植物體內(nèi)定植，包括綠僵菌（Metarhizium anisopliae，M.robertsii)、白僵菌 (Beauveriabassiana)、擬青霉（Paecilomyces sp ·)、錯(cuò)蟻輪枝抱 (Lecanicilliumlecanii)、蟲(chóng)草棒束抱（Isariafarinosa)、支頂抱(Acremoniumsp ·)、枝抱 菌（Cladosporiumsp ·)、食線蟲(chóng)真菌（Plectosphaerellacucumerina)，還有抑制植物土傳病 害的粉紅粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生的殺蟲(chóng)真菌與植物形成一定的互 惠共生關(guān)系，例如綠僵菌提高番茄的株高、根長(zhǎng)和生物量，（Garcia et al.2011)，促進(jìn)柳枝 稷和扁豆根生長(zhǎng)發(fā)育（Sasan&Bidochka2012)，提高大豆的抗鹽特性Khan et al. (2012);白 僵菌在小麥植株中定植，促進(jìn)了小麥植株的生長(zhǎng)(Sanchez et al. 2012)。這些控制植物蟲(chóng) 害或病害的生防真菌自身種群的大量繁殖并不在植物內(nèi)，而是在相應(yīng)的寄主蟲(chóng)體中。它們 在植物中宿存的生物學(xué)意義深受關(guān)注，已成為近年研究熱點(diǎn)。
[0003] 不像植物病害菌侵入植物后會(huì)大量繁殖，殺蟲(chóng)真菌在植物中通常只有少量存在， 發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)植物內(nèi)生的殺蟲(chóng)真菌需要一定的技術(shù)方法。目前檢測(cè)植物內(nèi)生菌主要采用選擇 分離培養(yǎng)法，即用選擇性培養(yǎng)基分離到植物內(nèi)生菌群，在單菌落培養(yǎng)，通過(guò)鑒別菌落形態(tài)和 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的顯微形態(tài)來(lái)鑒定類別（Wyrebeket et al.，2011;Garciaet al.，2011;Dober& Tribe，1980)。這種方法需要有選擇性好的培養(yǎng)基，適用于可在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的、在植 物中存活數(shù)量較大的類群，其檢測(cè)的靈敏度較低，像殺蟲(chóng)真菌這些存活量較少的種類極易 在分離中被遺漏掉。為了確證殺蟲(chóng)真菌的內(nèi)生性，研究者將供試殺蟲(chóng)菌株加上易于檢測(cè)的 人工標(biāo)記，如同位素或熒光蛋白等，然后通過(guò)人工接種植物共培養(yǎng)后，檢測(cè)植物中是否存在 殺蟲(chóng)真菌的人工標(biāo)記。應(yīng)用同位素標(biāo)記證明了綠僵菌的植物內(nèi)生性，并且發(fā)現(xiàn)它通過(guò)侵染 地下害蟲(chóng)轉(zhuǎn)而進(jìn)入植株體內(nèi)，將蟲(chóng)體有機(jī)氮源傳遞到植株根內(nèi)，是氮營(yíng)養(yǎng)素在昆蟲(chóng)與植株 之間的橋梁(Behieet al. 2012)。通過(guò)基因工程技術(shù)將綠色熒光蛋白基因 gfp轉(zhuǎn)入殺蟲(chóng)真菌 綠僵菌中表達(dá)GFP蛋白，然后用帶gfp標(biāo)記的菌株接種柳枝稷和扁豆，共培養(yǎng)后在熒光顯微 鏡下觀察到兩種植物根中內(nèi)生定植的綠僵菌菌絲，證明綠僵菌是一種內(nèi)生菌并能促進(jìn)植物 生的生長(zhǎng)(Sasan&Bidochka2012)。然而，同位素或焚光蛋白標(biāo)記方法需要特殊的檢測(cè)儀器 和環(huán)境，檢測(cè)過(guò)程也較為繁瑣。先標(biāo)記后檢測(cè)的方法，顯然不適用于對(duì)自然狀況下植株的檢 測(cè)，因?yàn)轭A(yù)期的內(nèi)生殺蟲(chóng)真菌并沒(méi)有可見(jiàn)的人工標(biāo)記。對(duì)于目標(biāo)菌株的檢測(cè)，預(yù)先人工加入 DNA分子標(biāo)記，在進(jìn)行改菌株的各類生物學(xué)研究時(shí)，再通過(guò)PCR檢測(cè)可確定目標(biāo)菌株的存在。
[0004] 因此，建立綠僵菌特異性標(biāo)記及其在植物內(nèi)生性的檢測(cè)方法，對(duì)推動(dòng)綠僵菌功能 多樣性研究和建立植保生物防治綜合評(píng)價(jià)有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了檢測(cè)確定綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的植物內(nèi)生性，本發(fā)明的目的是 提供檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，分別提取了綠僵菌DNA和其他種類真菌DNA，包括白僵菌 (Beauveria bas si ana )、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans) lSi(Fusarium oxysporum)、青霉（Penicillium sp·)、毛霉（Mucor sp ·)、單頂抱(Monacrosporium sp.)及 幾種未鑒定的土壤分離真菌，引物FI ( 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC)，R1 ( 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT)能夠獨(dú)特地從綠僵菌DNA中擴(kuò)增出清晰的目的片段，而其它 種類真菌DNA均沒(méi)有擴(kuò)增片段，因而確定引物F1/R1可作為鑒別綠僵菌、區(qū)分其他種類真菌 的特異性PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增得到綠僵菌的特異性片段，（序列如SEQ ID No.1所示）。
[0007] GGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTGAATTATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCG GGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAA TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGC GTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGCGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCT TAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACGGGAGCCCGGCGCGGTCC ACTGCCGTAAAACCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACT
[0008] 引物F1/R1進(jìn)行PCR檢測(cè)的靈敏度，當(dāng)綠僵菌在植物中內(nèi)生宿存，通過(guò)PCR檢測(cè)其 DNA是混合的，而且是小量綠僵菌DNA混合于大量植物DNA中。試驗(yàn)分別提取了綠僵菌DNA和 花生根DNA，將綠僵菌DNA與花生DNA按 1:500、1:1000、1:1500、1: 2000、1: 2500、1: 3000、1: 3500比例混合，以上述1中的引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增重復(fù)3次，結(jié)果顯示在1:500-2500 比例下能夠擴(kuò)做到目的片段，即檢測(cè)的靈敏度達(dá)到1:2500。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，以引物F1/R1PCR檢測(cè)綠僵菌的植物內(nèi)生性。在花生 播種后的7d時(shí)，將綠僵菌孢子懸浮液澆淋在幼苗根莖周圍，同時(shí)設(shè)澆淋清水為對(duì)照。分別在 花生生長(zhǎng)15(1、30(1、45(1、60(1、75(1、90(1時(shí)取樣。提取各個(gè)時(shí)間段的花生根樣本0嫩，分別以上 述1中的引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)樣本3次，結(jié)果顯示在60d、75d、90d的根樣中檢測(cè)到目 的片段，而之前的15d、30d、45d樣本和對(duì)照樣本均沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)片段，從而證明了綠僵菌 在花生根的宿存內(nèi)生，而且在60d后達(dá)到可監(jiān)測(cè)的量級(jí)。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1用引物F1/R1進(jìn)行PCR檢測(cè)區(qū)分綠僵菌與其他真菌的電泳圖譜，泳道順序：1綠 僵菌防地下害蟲(chóng)菌株MBJQH2-2;2-12不同地理或寄主來(lái)源的綠僵菌菌株；13-15購(gòu)買引進(jìn)的 綠僵菌菌株；16空白對(duì)照；17-21的非綠僵菌其他種類真菌菌株;22-24:田間土壤分離后鑒 定的綠僵菌菌株;25-31田間土壤分離后鑒定的非綠僵菌其他種類真菌菌株;32空白對(duì)照;Μ marker；
[0011]圖2用F1/R1引物PCR檢測(cè)花生根中綠僵菌的內(nèi)生性的電泳圖譜，泳道順序：1和2為 MBJQH2-2處理75d和90d根樣；3和4位Ma9處理75d和90d根樣；5位對(duì)照根樣;Μ為marker;
[0012] 圖3用F1/R1引物PCR檢測(cè)玉米根中綠僵菌的內(nèi)生性的電泳圖譜，左圖F1/R1PCR泳 道順序：1為marker; 2為無(wú)模板清水對(duì)照;3為對(duì)照根樣;4為MBJQH2-2處理根樣;5為gpd-ben 標(biāo)記的M2-2-44044菌株處理根樣。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1用特異性引物F1/R1的PCR檢測(cè)區(qū)分綠僵菌與其他真菌
[0014]實(shí)驗(yàn)菌株共30個(gè)，分別為不同地理、寄主來(lái)源的綠僵菌菌株12個(gè)、購(gòu)買引進(jìn)的綠僵 菌菌株3個(gè)、已知的其他種類真菌菌株5個(gè)、從花生試驗(yàn)地土壤分離純化后鑒定為綠僵菌的 菌株3個(gè)和鑒定為其他種類真菌菌株7個(gè)(表1)。分別接種培養(yǎng)各菌株，收集菌絲體，按照 Fungi DNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)操作提取DNA。以引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為:反 應(yīng)體系總體積50yL，含lOXEx Taq Buffer 5yL、5U/yL Ex Taq 0.25yL、2.5mmol/L dNTP Mixture 4yL、10ymol/L的FI和R1 各lyL、DNA模板lyL，超純水37.75yL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 3min-94°C15sec，59°C10sec，72°C10sec，45 個(gè)循環(huán)-72°C 延伸 lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊 脂糖電泳，得到電泳圖譜（圖1)。結(jié)果顯示，所有18個(gè)綠僵菌中均能夠擴(kuò)增到特異性片段，而 12個(gè)非綠僵菌的其他種類真菌菌株均沒(méi)有該擴(kuò)增片段。因此證明，本發(fā)明的F1/R1引物及 PCR條件具有區(qū)分綠僵菌與其他真菌的優(yōu)良特異性。
[0015] 表1試驗(yàn)菌株名錄
[0016]
[0017]
[0018] 實(shí)施例2用F1/R1引物PCR檢測(cè)花生根中綠僵菌的內(nèi)生性
[0019]設(shè)置2個(gè)綠僵菌菌株接種花生的實(shí)驗(yàn)。在PDA培養(yǎng)基上，分別接種綠僵菌菌株 MBJQH2-2和Ma9菌株，25°C培養(yǎng)15d，獲得的分生孢子粉。配制孢子懸浮液，調(diào)整濃度為1 X 107孢子/ml。播種花生時(shí)，在種穴內(nèi)澆淋100ml孢子液。以澆淋清水為不接種對(duì)照。按一致條 件下常規(guī)管理種植，于播種后第75d和90d收取花生根檢測(cè)。方法步驟如下：
[0020] 1)清洗花生根，吸干表面水分，保存于-20°C備用。2) DNA提取。3) PCR檢測(cè)。①合成 引物F1 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC和引物R1 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT;②配 制 PCR 反應(yīng)體系；③運(yùn)行程序 941€3111丨114941€2〇86(3,571€2〇86(3,72 1€2586(3,40個(gè)循環(huán)472 °C 1 Omin。④電泳分離鑒定:將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖電泳，得到電泳圖譜。
[0021] 結(jié)果見(jiàn)圖2,可見(jiàn)接種了綠僵菌M2-2或Ma9菌株的花生根DNA可擴(kuò)增出預(yù)期的綠僵 菌特征條帶，而對(duì)照花生根沒(méi)有擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶，證明了引物F1/R1-PCR是檢測(cè)綠僵菌在 花生內(nèi)生的有效方法。
[0022]實(shí)施例3用F1/R1引物PCR檢測(cè)玉米根中綠僵菌的內(nèi)生性
[0023] 設(shè)置gpd-ben標(biāo)記的綠僵菌菌株M2-2-44044和原始菌株菌株MBJQH2-2接種玉米的 實(shí)驗(yàn)。在Η)Α培養(yǎng)基上，分別接種綠僵菌菌株M2-2-44044和MBJQH2-2，25°C培養(yǎng)15d，獲得的 分生孢子粉。配制孢子懸浮液，調(diào)整濃度為IX 1〇7孢子/ml。在玉米播種后第4d，將100ml孢 子液澆淋到幼苗基部周圍。以澆淋清水為不接種對(duì)照。按一致條件下常規(guī)管理種植，于施菌 后第28d收取玉米根檢測(cè)。
[0024]方法步驟如下：1)清洗玉米根，吸干表面水分，保存于-20°C備用。2)DNA提取。3) pcr 檢測(cè)，合成弓丨物 fus'-ggggtagtcagtattctggcgggckrus'-ggggttccacggcgagaccgccaat) ; 配制 PCR 反應(yīng)體系 。運(yùn)行 PCR 程序 ，將 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1. 2 % 瓊 脂糖電泳，得到電泳圖譜。
[0025] 結(jié)果見(jiàn)圖3,可見(jiàn)接種了帶gpd-ben標(biāo)記的綠僵菌M2-2-44044菌株的玉米根DNA用 F1/R1和F2/R2引物均能擴(kuò)增出預(yù)期的綠僵菌特征條帶，而接種原始菌株MBJQH2-2的根樣只 能用F1/R1引物，而對(duì)照根樣用F1/R1引物均沒(méi)有擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶，證明了 F1/R1引物能有 效檢測(cè)綠僵菌物種在玉米種的內(nèi)生性，而F2/R2引物能夠針對(duì)特定gpd-ben標(biāo)記的菌株檢測(cè) 其植物內(nèi)生性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物的序列 為： 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇2. 特異性檢測(cè)綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下 引物進(jìn)行檢測(cè)的步驟， 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK105907872SQ201610395664
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】農(nóng)向群, 劉少芳, 王廣君, 李興佳, 曹廣春, 張澤華
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所