周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的cDNA全長序列及應(yīng)用
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明得到：國家自然科學(xué)基金（31201730);天津市高等學(xué)校科技發(fā)展計劃項(xiàng)目 (20110602);天津師范大學(xué)博士基金（52XB1003)及天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金 的資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，研究周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的cDNA全長序列 和不同溫度下Hsp90表達(dá)的變化。
【背景技術(shù)】
[0003] 熱激蛋白Heat shock protein (Hsp)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的，對體內(nèi)外 環(huán)境變化極為敏感的高保守性蛋白質(zhì)，廣泛參與了各種生理代謝途徑，近年來已成為生物 研究領(lǐng)域中的一個熱點(diǎn)。根據(jù)其分子量的大小可將其分為不同的蛋白家族，其中Hsp90與 溫度脅迫應(yīng)激性密切相關(guān)。溫度是影響生物體生存至關(guān)重要的環(huán)境因子，只有在一定的溫 度范圍內(nèi)生物體才能進(jìn)行物質(zhì)能量代謝以維持正常生理活動，超出溫度的耐受范圍都會使 生物的生長發(fā)育停滯甚至死亡。一般來說生物體受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量會有 顯著變化，用以增強(qiáng)抗逆境能力。由于熱激蛋白會在脅迫消除后一段時間內(nèi)保持一定的含 量使生物體更好生存，可以認(rèn)為其存在對于生物體適應(yīng)環(huán)境有著重要作用。
[0004] 周氏嚙小蜂CAoi/ioia craea Yang是我國重要入侵物種美國白蛾 craea(Drury)的重要寄生性天敵，體長1.1-1. 5mm,群集內(nèi)寄生于美國白蛾蛹中，是抑制 美國白蛾的主要天敵因子，對控制美國白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美國白蛾外，還 可寄生于鱗翅目的枯葉蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和雙翅目的蠅科、寄蠅科及鞘 翅目的葉甲科和瓢甲科等 通過野外釋放C 可以達(dá)到有效防治美國白蛾的目的。然而，在野外環(huán)境下，C ??ea的活力會受到多重因素的影響，其中，溫度作為一個主要生態(tài)因素，會影響C??ea的生命力。在合適的溫度范圍投放小蜂，才會起到更好的防治效果。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄組測 序，報道了一個周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的cDNA全長序列，該序列可為深入研究周氏嚙 小蜂的溫度耐受性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過實(shí)時熒光定量PCR方法，研究不同溫度下白蛾周氏 嚙小蜂Hsp90基因表達(dá)的變化，研究結(jié)果可為科學(xué)利用天敵昆蟲周氏嚙小蜂提供理論基 礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是報道一個周氏嚙小蜂熱激蛋白基因Hsp90基因的cDNA全序列及 其對于溫度協(xié)迫的影響。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得周氏嚙小蜂熱激蛋白基因Hsp90 基因的全序列，在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp90基因表達(dá)的變化。
[0007] 為此本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容： 周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的核苷酸序列，該序列全長2169bp，含完整的開放閱讀 框，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。對應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示；該序列 編碼722個氨基酸，分子量為83. 3KDa，等電點(diǎn)為5. 01。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的核苷酸序列在用于檢測防治 美國白蛾病方面的應(yīng)用。所述防治美國白蛾指的是：Hsp90基因表達(dá)受溫度調(diào)控，通過檢測 Hsp90基因的表達(dá)情況，可以得知周氏嚙小蜂對于溫度脅迫的耐受情況，在低于周氏嚙小蜂 承受極限溫度下釋放小蜂，可以更好的起到防治美國白蛾的目的。通過實(shí)時熒光定量PCR 方法，研究不同溫度下白蛾周氏嚙小蜂Hsp90基因表達(dá)的變化，研究結(jié)果可為科學(xué)利用天 敵昆蟲周氏嚙小蜂提供理論基礎(chǔ)。
[0009] 周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90基因，其CDNA序列和編碼氨基酸的序列如表1、表2所 /_J、1〇
[0010] 表 1


本發(fā)明公開的周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的cDNA全長序列的優(yōu)點(diǎn)在于： (1)本發(fā)明是在國內(nèi)外首次公開周氏嚙小蜂Hsp90基因的cDNA全序列，該序列可為深 入研究周氏嚙小蜂的溫度耐受性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0011] (1)在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp90基因表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在 不同溫度條件下周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp90基因的表達(dá)水平處于一個動態(tài)過程中，高溫和低 溫脅迫都使周氏嚙小蜂體內(nèi)Hsp90有一個高的表達(dá)量，在40°C和_7°C體內(nèi)表達(dá)量最大。因 此本發(fā)明的提出研究了周氏嚙小蜂適應(yīng)外界環(huán)境的變化，避免受到脅迫因子對自身的傷害 的保護(hù)機(jī)制，對于防治美國白蛾有重大意義，為綠色防治林業(yè)害蟲提供了一個新的思路和 技術(shù)。
【附圖說明】
[0012] 圖1為周氏嚙小蜂Hsp90在相同時間不同溫度脅迫下表達(dá)變化。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發(fā)明中 所述的提取白蛾周氏嚙小蜂總RNA的提取，cDNA的合成，實(shí)時熒光定量RT-qPCR等方法都 是本領(lǐng)域成熟的技術(shù)，試劑盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等 都可以從生產(chǎn)商家購買。
[0014] 實(shí)施例1 : 獲得白蛾周氏嚙小蜂Hsp90基因序列 實(shí)驗(yàn)材料取自室內(nèi)傳代培養(yǎng)的白蛾周氏嚙小蜂(培養(yǎng)條件：于人工氣候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相對濕度60%~80%，無光黑暗)。取羽化后24h內(nèi)的雌性周氏嚙小蜂，于解剖 鏡下切取觸角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM7020)中；每200頭雌性白蛾周氏嚙小 蜂的觸角貯存于一個1. 5mL離心管中，共搜集8管樣品，并于-20°C下低溫保存，樣品制備 完成后送華大基因科技服務(wù)有限公司（http://www.genomics,cn/index)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。
[0015] 應(yīng)用高通量測序平臺IlluminaHiSeq? 2000對周氏嚙小蜂觸角樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組 測序，采用Trinity軟件對每個讀取序列片段進(jìn)行聚類后拼接成unigene，再結(jié)合生物信 息學(xué)軟件進(jìn)行靶標(biāo)序列cDNA全長的判定，進(jìn)行Blast同源序列檢索予以確認(rèn)，得到Hsp90 基因cDNA序列和編碼氨基酸的序列。
[0016] 實(shí)施例2: 總RNA的提取 選取30頭左右白蛾周氏嚙小蜂進(jìn)行不同溫度處理，高溫處理（lh)為28 °C、32 °C、36 °C、 40°C和42°C;低溫處理（lh)為ll°C、6°C、rC、-3°C、-7°C。處理后產(chǎn)物立即使用或保存 于-20°C冷凍。
[0017] (1)取30頭左右白蛾周氏嚙小蜂置于1. 5mL的無菌離心管內(nèi)，倒入液氮并迅速用 研磨棒進(jìn)行充分研磨。將600μLTrizon溶液加入離心管，靜置5min。
[0018] (2)將200μL氯仿加入離心管，劇烈振蕩15s，靜置3min。
[0019] (3) 4°C下12000rpm離心15min，將上層無色水相轉(zhuǎn)入新無菌離心管中，加入 400μL異丙醇，_20°C下放置 20min，12000rpm離心 10min〇
[0020] (4)小心倒掉管中液體，保留沉淀，加入600μL75%乙醇洗滌沉淀。4°C下7500rpm 離心5min，再重復(fù)一次乙醇洗滌沉淀操作。
[0021] (5)小心棄去上清液，室溫干燥2min。將RNA沉淀溶于20μLRelutionBuffer中， 必要時可55°C-60°C水浴lOmin。
[0022] (6)所得沉淀即為白蛾周氏嚙小峰總RNA，產(chǎn)物立即使用或冷凍保存于-70°C。
[0023] 實(shí)施例3: cDNA的合成 以實(shí)施例2所述白蛾周氏嚙小蜂總RNA作為模板。取一消毒的0.2mL離心管，加入以 下反應(yīng)體系（20以1^體系）：TotalRNA5yL，orRandomPrimer(N9) (0.1yg/yL)lyL， 2XTSReactionMix10μL,TransScript?RT/RIEnzymeMix1μL,RNase-freeWater 3μL，混勻。
[0024] 反應(yīng)條件為25 °C水浴保溫10分鐘，42 °C水浴保溫30分鐘，85 °C高溫加熱5分鐘， 以使離心管中存留的TransScript?RT失去活性。產(chǎn)物立即使用或保存于-20°C冷凍。
[0025] 實(shí)施例4: 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 (1) 引物設(shè)計：根據(jù)所得Hsp90基因的全長序列，使用Primer5軟件設(shè)計適用于實(shí)時 熒光PCR檢測的特異性引物，引物序列如下：
(2) 實(shí)時熒光PCR:運(yùn)用SYBRGreen嵌合熒光法進(jìn)行RT-PCR分析。使用CF96XPCR儀 (Bio-Rad)進(jìn)行PCR反應(yīng)。以上述實(shí)施例3中合成的cDNA為模板，用上述（1)中所設(shè)計的 特異性引物，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品設(shè)3個平行管，擴(kuò)增后所得3個平行管 的Ct值(即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù)）取平均數(shù)。
[0026] 實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增體系設(shè)置如下：
實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置如下： 50°C 120s； 95°C 120s ;95°C Is ;6(TC 30s (40個循環(huán)）； 白蛾周氏嚙小蜂在不同溫度下Hsp90基因相對表達(dá)量計算： 當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時，采用ΛΛCT法計算各個溫度下Hsp 90基 因的m RNA相對表達(dá)量，用SPSS 19. 0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏新復(fù)極差法 檢驗(yàn)不同處理間差異顯著性。
[0027] 圖1為不同溫度下周氏嚙小蜂Hsp90基因的相對表達(dá)量。從圖中看出無論是高溫 還是低溫都可以影響周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp90的表達(dá)。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的 不斷降低，周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp90的相對表達(dá)量呈上升的趨勢，并且在-7°C時達(dá)到最大 表達(dá)量；在高溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏嚙小峰體內(nèi)的Hsp90的相對表達(dá) 量也呈上升的趨勢，但在40°C時達(dá)到最大表達(dá)量。這對于以后在何種室外溫度下放飛白蛾 周氏嚙小蜂防治美國白蛾具有重要意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的核苷酸序列，該序列全長2169bp，含完整的開放閱讀 框，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。2. 權(quán)利要求1所述的序列，其中所述核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所 示；該序列編碼722個氨基酸，分子量為83. 3KDa，等電點(diǎn)為5. 01。3. 權(quán)利要求1所述周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的核苷酸序列在用于檢測防治美國白蛾 方面的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述防治美國白蛾指的是：Hsp90基因表達(dá)受溫度調(diào) 控，通過檢測Hsp90基因的表達(dá)情況，可以得知周氏嚙小蜂對于溫度脅迫的耐受情況，在低 于周氏嚙小蜂承受極限溫度下釋放小蜂，可以更好的起到防治美國白蛾的目的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp90的cDNA全長序列及應(yīng)用，該序列全長2169bp，含完整的開放閱讀框，編碼722個氨基酸。通過實(shí)時熒光定量PCR方法，研究不同溫度下白蛾周氏嚙小蜂Hsp90基因表達(dá)的變化，結(jié)果表明，高溫和低溫脅迫都會誘導(dǎo)周氏嚙小蜂Hsp90表達(dá)量增高，在40℃和-7℃時表達(dá)量最大。本發(fā)明可為科學(xué)利用天敵昆蟲周氏嚙小蜂提供分子基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/12
【公開號】CN105420244
【申請?zhí)枴緾N201510838112
【發(fā)明人】李敏, 王鳳竹, 張新玥, 李婷婷, 朱耿平, 劉強(qiáng)
【申請人】天津師范大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月26日