一種防治煙草青枯病的短短芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害的生物防治，具體說是一株高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶且對煙草青枯病具有明顯抑制作用的短短芽孢桿菌，屬于微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草青枯病Wsitwia是威脅我國煙草生產(chǎn)的主要病害，主要為害植株的根莖，嚴(yán)重降低煙草產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的防治措施主要采用化學(xué)防治、栽培防治和抗病品種選育等。煙草為葉用經(jīng)濟(jì)作物，長期大規(guī)模使用化學(xué)殺菌劑防治煙草青枯病可引致農(nóng)藥殘留、抗藥性和環(huán)境污染，使煙葉的品質(zhì)下降，同時也限制煙葉的國內(nèi)外貿(mào)易。而栽培防治和抗病品種選育措施具有局限性，該病害的防治尚無理想的安全有效控制措施。篩選和鑒定具有高效生防效果和光譜殺菌能力的微生物菌株是植物病害生物防治研究的重要內(nèi)容，特別是具有高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的菌株(Prasanna L, EijsinkVGHj Meadow Rj Gaseidnes S.2013.A novel strain of BrevibadIlus laterosporusproduces chitinases that contribute to its b1control potential.Appl Microb1lB1technol, 97: 1601-1611.)。高效生物微生物釋放和土壤生態(tài)調(diào)控相結(jié)合有望成為煙草青枯病可持續(xù)治理的重要途徑之一。通過合理的施用土壤添加劑如有機(jī)質(zhì)和幾丁質(zhì)類物質(zhì)增強(qiáng)生防微生物活性和誘導(dǎo)寄主植物抗性，可以明顯提高病害控制的穩(wěn)定性。
[0003]幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶已被證明為消解植物病原真菌和細(xì)菌細(xì)胞壁的主要降解酶系，其中幾丁質(zhì)酶作為生防因子由于其具有廣泛的殺菌譜，并與如蛋白酶和β-1，3葡聚糖酶具有協(xié)同抗菌活性，而備受關(guān)注(Lorito Mj Harman GE，HayesCKj Broadway RMj Tronsmo A, Woo SLj Di Pietro A.1993.Chitinolytic enzymesproduced by Trichodema harzianum^antifungal activity of purified endochitinaseand chitob1sidase.Phytopathology, 83: 302-307.; Arora NKj Kim MJj Kang SC，Maheshwari DK.2007.Role of chitinase and β —1，3—glucanase activities producedby a fluorescent pseudomonad and in vitro inhibit1n of Phytophthoracapsiciand Rhizoctonia solani.Can J Microb1l, 53: 207-212.; Someya N，TsuchiyaKj Yoshida T，Noguchi MT，Akutsu RKj Sawada H.2007.Fungal cell walldegrading enzyme-producing bacterium enhances the b1control efficacy ofantib1tic-producing bacterium against cabbage yellows.J Plant Dis Protect,114: 108-112.) 某些微生物如細(xì)小芽抱桿菌eereiAs和哈茨木霉Trichoderma
等產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶具有廣譜抑制病原真菌(Lorito Mj Harman GE，HayesCKj Broadway RMj Tronsmo A, Woo SLj Di Pietro A.1993.Chitinolytic enzymesproduced by Trichodema harzianum^antifungal activity of purified endochitinaseand chitob1sidase.Phytopathology, 83: 302-307.; Huang CJj Wang TKj ChungSC， Chen CY.2005.1dentificat1n of an antifungal chitinase from a potentialb1control agent, Bacillus cereus 28-9.J B1chem Mol B1l 38:82-88.);焚光假單孢桿菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β -1, 3-葡聚糖酶對大雄疫霉菌和立枯絲核菌的細(xì)胞壁具有明顯的消解作用。雖然幾丁質(zhì)酶廣譜殺菌能力的重要性，短短芽孢桿菌及其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對煙草青枯病的生物防治研究尚未見系統(tǒng)報道。本項(xiàng)研究應(yīng)用篩選具有高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的短短芽孢桿菌GB6-1，在離體條件下測定其對煙草青枯病菌的抑制作用，評價該菌對煙草青枯病的生物防治潛力，為進(jìn)一步開發(fā)和利用該菌提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種短短芽孢桿菌菌株，該菌株對煙草青枯病菌具有高效生物防治功能。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種短短芽孢桿菌，分類命名:Brevibacillus Are [is，該菌漢 brevis GB6-1 的 16S rRNA 序列(1031bp)已上傳至 NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號:KP715564)，于2015年7月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏編號:CGMCC No: 11135。
[0006]本發(fā)明的基本技術(shù)方案為，將2013年8月13日采自貴州省畢節(jié)市大方縣發(fā)生煙草黑脛病的煙田土壤，依據(jù)16SrRNA序列分析和培養(yǎng)形狀等，確定該菌為短短芽孢桿菌。
[0007]通過大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的短短芽孢桿菌具有高效分泌幾丁質(zhì)酶和β -1, 3-葡聚糖酶特性，對煙草青枯病菌具有明顯的抑制作用。
[0008]短短芽孢桿菌菌株的分離:土壤樣品經(jīng)無菌水梯度稀釋至10 5，37°C接種至平板培養(yǎng)基(0.1%K2HP04、0.05%MgS04.7Η20、0.2% 膠體幾丁質(zhì)，pH 6.8)培養(yǎng) 2_3d 后，挑取周圍有透明圈的菌落，在含0.2%膠體幾丁質(zhì)的平板上純化，獲得此產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株。
[0009]菌株的培養(yǎng)性狀鑒定:將純化好的菌株移入到幾丁質(zhì)和營養(yǎng)(NA)培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第3d分別觀看菌落顏色及是否具有透明圈，測量菌落大小及透明圈直徑。革蘭氏染色法染色。鑒別細(xì)菌，經(jīng)初染、媒染、脫色、復(fù)染四步制作薄片，干燥，鏡檢。
[0010]菌株的分子生物學(xué)鑒定，16S rRNA基因片段序列比對，系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0011]短短芽孢桿菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)降解酶系測定:幾丁質(zhì)降解酶系活性依據(jù)膠體幾丁質(zhì)生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG, N-acetyglucosamine)含量測定。
[0012]短短芽孢桿菌產(chǎn)生的β -1, 3-葡聚糖酶活性測定:β -1, 3-葡聚糖酶活性依據(jù)昆布多糖降解生成的葡萄糖含量測定。
[0013]短短芽孢桿菌對煙草青枯病菌的抑制作用:采用菌液對煙草青枯病菌的消解作用。
[0014]本發(fā)明的一個方面，一種包含短短芽孢桿菌的菌劑，所述菌劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知任何技術(shù)手段制備任何形式的菌劑，例如通過發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行凍干獲得的干菌劑，也可以是液體形式的濃縮液態(tài)菌劑。
[0015]本發(fā)明的一個方面，所述包含短短芽孢桿菌菌株的菌劑在抑制煙草青枯病菌應(yīng)用。
[0016]
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明的短短芽孢桿菌菌株煙草青枯病菌具有明顯的抑制作用；并具有高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶β-1，3-葡聚糖酶活性，本發(fā)明的短短芽孢桿菌菌株對煙草青枯病的生物防治具有很大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0017]
圖1為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生的菌落形態(tài)圖。
[0018]圖2為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1在含0.2%幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌落形態(tài)圖。
[0019]圖3為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1的透射電鏡照片。
[0020]圖4為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1的16SrRNA特異性序列。
[0021]圖5為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0022]圖6為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上5d內(nèi)的產(chǎn)酶活性變化。
[0023]圖7為本發(fā)明中短短芽孢桿菌GB6-1對煙草青枯病具有明顯抑制作用的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1:本發(fā)明的短短芽孢桿菌菌株的分離
分離培養(yǎng)基:誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，0.1% Polyp印tone, 0.05% MgS047H20，0.1% KH2PO4,0.2%NaCl，0.2% 1%膠體幾丁質(zhì)，PH調(diào)制6.8。1%膠體幾丁質(zhì)制作:稱取1g幾丁質(zhì)(Sigma，St.Louis, MO，USA)于100 mL 85%的Η3Ρ04ψ，充分溶解，4°C過夜，加入500mL超純水，電動攪拌使其充分分散，用超純水洗至PH5.0左右，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025]擴(kuò)繁培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基，1g酪蛋白胨；10g牛肉浸提取物；5g酵母提取物；20g葡萄糖，定容lOOOmL，供抑菌測定用。
[0026]分離方法:稱取Ig病土放到15mL帶塞試管中，加入9mL水，室溫下在搖床上200 r/min,搖晃lh。取上清液ImL梯度稀釋至10 5倍，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(0.1%Κ 2ΗΡ04、0.05%MgS04*7H20、0.2%膠體幾丁質(zhì)，pH 6.8)上劃線，放于37°C培養(yǎng)箱3 d。挑取周圍有透明圈的菌落，在含0.2%膠體幾丁質(zhì)的平板上純化，獲得此產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株。觀察菌落生長情況，挑取有透明圈的菌落純化培養(yǎng)并保存。
[0027]實(shí)施例2:本發(fā)明