專利名稱：側(cè)孢芽孢桿菌及由該菌種制備的土壤接種劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及側(cè)孢芽孢桿菌及由該菌種制備的土壤接種劑。
背景技術(shù)：
我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)是國民經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)，是“安天下的產(chǎn)業(yè)”。我國和世界大多數(shù)農(nóng)業(yè)國家一樣，目前均面臨著因大量施用化肥農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染、土壤酸化板結(jié)、地力衰退、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、有毒化學(xué)物質(zhì)殘留超標(biāo)、危害人類健康等日趨嚴(yán)峻的問題。尤其是食品安全、餐桌污染給人類帶來的危害，已引起國際社會普遍關(guān)注。因此，發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，生產(chǎn)綠色食品，保障人民健康，倍受各國政府重視和支持?！熬G色、環(huán)保、健康”已成為當(dāng)今社會發(fā)展的主題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種側(cè)孢芽孢桿菌類的新菌種及由該菌種制備的土壤接種劑。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案對從土壤中分離的菌株進(jìn)行鑒定并定名為側(cè)孢芽孢桿菌WY9701((Bacilluslaterosporus WY9701).→利用側(cè)孢芽孢桿菌WY9701菌株進(jìn)行發(fā)酵配方及發(fā)酵條件試驗→進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)工藝條件試驗→確定生產(chǎn)工藝→毒性試驗→大田使用效果試驗。
本發(fā)明所述的側(cè)孢芽孢桿菌WY9701已于2006年7月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.1755，CGMCC No.1755菌是由自然分離的側(cè)孢芽孢桿菌，經(jīng)菌種選育后得到。
CGMCC No.1755菌株具有以下微生物特性1、形態(tài)學(xué)特性形狀及排列菌體桿狀，端稍細(xì)，單生成對、成堆；芽孢呈橢圓形，(1～1.2)×(2.5～3)μm，附著于芽孢一側(cè)有獨木舟形體，芽孢在紡錘形孢囊中側(cè)生、中生。
運動及鞭毛能運動2、生理特性(1)明膠穿刺培養(yǎng)液化陽性；液化速度慢、弱(2)淀粉水解陰性；(3)與氧的關(guān)系有氧、無氧均生長(4)酪蛋白水解陽性；(5)酪氨酸分解陰性；(6)二羥丙酮的形成陰性；(7)NaCl中生長2％NaCl生長；5，7，10％NaCl不生長；(8)0.001％溶菌酶中生長陰性CGMCC №.1755菌株能利用葡萄糖，不利用木糖、阿拉伯糖(9)硝酸鹽還原陽性3、培養(yǎng)學(xué)特性


1與溫度的關(guān)系培養(yǎng)基J-肉汁 PH7.3-7.5最高溫度47℃ 最適溫度30-40℃ 耐受溫度80℃ 10分鐘附表1、WY9701菌株特征
注“v”在一個菌株內(nèi)性質(zhì)不穩(wěn)定，“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)，“+/-”為反應(yīng)較弱，“d”為反應(yīng)不同，11～89％的菌株陽性。利用側(cè)孢芽孢桿菌
WY9701生產(chǎn)土壤接種劑的制備工藝斜面菌種→搖瓶種子→發(fā)酵罐發(fā)酵→發(fā)酵液→超級過濾→過濾液→吸附干燥→混配→成品；上述的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件(1)斜面菌種配方(％)營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基.PH7.0-7.5；培養(yǎng)溫度32-34℃；時間48-60hr(2)搖瓶菌種配方(％)豆粕粉0.2-0.5 麥麩粉0.8-1.2 酵母膏0.1-0.3氯化鈉0.25-0.3硫酸鎂0.015-0.02 磷酸氫二鉀0.2-0.3硫酸錳0.005PH7.0-7.5 搖床轉(zhuǎn)速160-200r/min培養(yǎng)溫度32--34℃，培養(yǎng)24-30hr至對數(shù)生長期時接種。
(3)種子培養(yǎng)基配方(％)豆粕粉0.3-0.6 麥麩粉0.8-1.5 硝酸銨0.15-0.2酵母膏0.2-0.4 氯化鈉0.25-0.3 硫酸鎂0.015-0.02磷酸氫二鉀0.2-0.4 硫酸錳0.005PH7.0-7.5 通氣量1∶0.6-0.7 培養(yǎng)溫度32-34℃，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時移種入發(fā)酵罐。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(％)豆粕粉0.3-0.6 麥麩粉0.8-1.5 硝酸銨0.15-0.2酵母膏0.2-0.4 氯化鈉0.25-0.3 硫酸鎂0.015-0.02磷酸氫二鉀0.2-0.4 硫酸錳0.005
PH7.0-7.5通氣量1∶0.6-0.7培養(yǎng)溫度32--34℃，培養(yǎng)至80％以上形成芽孢時放罐。
上述制備工藝中的超級過濾發(fā)酵液經(jīng)超級過濾濃縮二十倍，溫度控制在50℃以內(nèi)，時間控制在8hr以內(nèi)；上述制備工藝中的吸附干燥利用輕質(zhì)碳酸鈣、草碳、鋸木屑和硅藻土等做載體，吸附劑∶濃縮液＝(1-2)∶(2-3)，混合均勻后經(jīng)100℃閃蒸干燥得孢子粉劑。
本發(fā)明的優(yōu)點1、原料易得、價廉、發(fā)酵工藝穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)品有效活菌數(shù)高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)設(shè)備可與其他微生物菌劑生產(chǎn)設(shè)備通用。
2、產(chǎn)品抗逆性強，活化性好，繁殖速度快。遇到適當(dāng)?shù)臏囟?、水分、養(yǎng)分等條件，便迅速活化繁殖，形成優(yōu)勢有益菌群發(fā)揮作用。
3、將側(cè)孢芽孢桿菌WY9701菌株接種于BCP液體培養(yǎng)基中，36±1℃兼性厭氧培養(yǎng)48h，培養(yǎng)物的原液和5倍濃縮液，經(jīng)口以20.0ml/kgBW給小鼠連續(xù)灌胃3d，觀察7d，未觀察到受試小鼠有毒性反應(yīng)或死亡。
4、產(chǎn)品穩(wěn)定性好，有效期長，在常溫下保存兩年不失效，使用方便；對作物無害，無特殊異味，不刺激皮膚。
5、經(jīng)試驗示范和應(yīng)用證明，產(chǎn)品適用作物范圍廣泛，應(yīng)用效果顯著。作用機理①、防病抗病，促進(jìn)作物生長。本土壤接種劑施用于土壤后通過空間、營養(yǎng)的競爭，抑制病原菌等有害微生物繁殖；通過拮抗作用，殺死或抑制病原菌，在根際周圍形成一圈生物屏障，阻止病原菌的入侵、定殖，起到減少病害(特別是土傳病害)的作用。本土壤接種劑可有效地阻止以下病菌病毒對作物的侵害細(xì)菌密執(zhí)安棒形桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、菊歐文氏菌、青枯假單胞菌、丁香假單胞菌、油菜單胞菌等；真菌曲霉菌、離蠕孢、頭孢霉、毛殼菌、刺盤孢、尖鐮孢、肉桂疫霉、柑桔生疫霉、柑桔黑腐病疫霉、寄生疫霉、仙人掌疫酶、瓜果腐霉、終極腐霉、立枯絲核菌、齊整小核菌、黃萎輪枝孢、大麗菊輪枝孢、輪枝孢屬等；病毒煙草花葉病毒、馬鈴薯病毒、黃瓜花葉病毒等。
在上述致病菌中，有相當(dāng)部分是農(nóng)作物主要病害的病原菌②、促進(jìn)養(yǎng)分分解、增加土壤肥力。本土壤接種劑通過互生作用，促進(jìn)土壤中有益微生物如解磷菌(巨大芽孢桿菌)、解鉀菌(硅酸鹽細(xì)菌)、酵母菌等繁殖，一方面促進(jìn)土壤有機質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，釋放出氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，另一方面能增加生物固氮量或?qū)⑼寥赖V物質(zhì)中含有的磷、鉀等元素分解、釋放，增加土壤肥力，供植物吸收利用，減少化肥使用量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。
③、改良土壤，平衡施肥。本土壤接種劑可促進(jìn)土壤有益微生物大量繁殖，保持土壤微生態(tài)平衡，改善因長期施用化肥而導(dǎo)致的土壤板結(jié)、酸化狀況，改良土壤理化特性和土壤結(jié)構(gòu)，增強土壤保水保肥能力，提高土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)水平，使養(yǎng)分供應(yīng)均衡，提高肥料利用率。
④、分泌生長物質(zhì)，促進(jìn)根系發(fā)育。側(cè)孢芽孢桿菌在其代謝過程中分泌的多種植物生長物質(zhì)，可促進(jìn)植物根系生長，增加吸收養(yǎng)分的能力。其分泌的營養(yǎng)物質(zhì)還可直接被植物吸收利用，促進(jìn)植物生長。用稀釋50倍和100倍的土壤接種劑原液處理小麥種子后，其麥苗分別比對照增高25％和16％；百株干重分別為5.88克，5.75克，分別比對照增重15.7％和13.1％。
⑤、表現(xiàn)較強的生物酶活性。側(cè)孢芽孢桿菌在代謝過程中會表現(xiàn)出較高的SOD酶活性，可使植物體內(nèi)酶活性提高2-3倍。SOD酶可參與植物的防御反應(yīng)，增強植物的抗病抗逆性，減少病害，提高產(chǎn)量。同時增加產(chǎn)品中的P、K、Ca等礦物質(zhì)及維生素，還原糖、氨基酸等的含量，使農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)提高，口味變佳，耐貯、耐腐、耐運輸。
⑥、降解土壤有毒有害物質(zhì)，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。本土壤接種劑對土壤的氮污染有很強的降解作用，可使農(nóng)產(chǎn)品中的硝酸鹽含量降低48.6-87.7％；本土壤接種劑對土壤中的有毒有害物質(zhì)也有較強的降解作用(如降解土壤中的殘留除草劑、降低煙草中氯的含量等)，并對已經(jīng)劣化的土壤起到生物治療和生物修復(fù)作用，從而改良土壤，使農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)大幅度提高。
主要功效及實例(一)改良土壤使用土壤接種劑后，土壤肥力、微生物活性及種群結(jié)構(gòu)明顯改善。經(jīng)對使用后的土壤進(jìn)行對比測試表明它能夠增加土壤中有益微生物數(shù)量；減少有害微生物數(shù)量，提高土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)水平。同一地塊，施用30天后土壤中的微生物數(shù)量比例發(fā)生巨大變化霉菌、酵母菌+43％；速效氮+13％；速效鉀+13％；速效磷+3％。好氣性細(xì)菌-42％；總大腸桿菌-95％；糞便大腸桿菌-99％；凝結(jié)陽性葡萄菌-87％；沙門氏菌-99％；克雷伯氏菌-99％。使用結(jié)果證明土壤中側(cè)孢芽孢菌越多，活性越強，理化性狀越好，土壤越肥沃。
(二)促進(jìn)生長農(nóng)作物施用本土壤接種劑后，根系發(fā)達(dá)、植株增高、莖稈增粗、葉片增多增厚、葉色濃綠，生長穩(wěn)健。本土壤接種劑具有明顯促進(jìn)煙株生長的作用。采烤前其株高和葉面積均比對照增加。據(jù)某兩地在蔬菜上施用土壤接種劑20天后調(diào)查，比未施用的葉片數(shù)增多1.1-1.7片，株高增加1.8-8.6cm，莖粗增加0.1-0.5cm，初采期提早4-10天。
(三)增強抗性1、增強抗病能力。農(nóng)作物施用上壤接種劑均表現(xiàn)抗病能力增強。被喻為“植物癌癥”的煙草花葉病、棉花枯黃萎病，在施用上壤接種劑后發(fā)病率明顯降低。據(jù)大田病毒接種試驗均表明施用土壤接種劑煙草花葉病發(fā)生率降低60-70％；蔬菜類作物施用土壤接種劑后，猝倒病、炭疽病、根腐病、軟腐病、疫病、白粉病、霜霉病、葉斑病等發(fā)病率均明顯下降，尤其根腫病和根結(jié)線蟲病發(fā)生率大幅度降低。
2、增強抗寒能力。某地遭三十年未遇的特大寒潮，施用土壤接種劑的香蕉、荔枝，抗寒能力明顯增強，活葉率達(dá)68％，比未施用的提高55％。浙江某地茶廠在其它茶樹遭到嚴(yán)重凍害的情況下，使用土壤接種劑的茶樹抵御了“倒春寒”襲擊，葉片未受凍害，表現(xiàn)了較強的抗霜凍能力，產(chǎn)量大幅度提高。
3、增強抗旱抗?jié)衬芰ΑＪ┯猛寥澜臃N劑后，作物耐干旱、澇漬能力均有增強；無論酸性土壤還是堿性土壤，施用土壤接種劑后，作物生長優(yōu)勢均明顯好于對照。
(四)改善品質(zhì)能改良土壤，平衡供肥，促進(jìn)作物穩(wěn)健生長，對病害有明顯防效，減少農(nóng)藥、化肥施用量，降解有毒有害化學(xué)物質(zhì)殘留，從而有效改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。對煙樣進(jìn)行檢測分析，施用土壤接種劑的煙葉組織疏松，上等煙比例提高10.2％；香氣增加，品味改善達(dá)顯著水平，可提高煙葉的感官評吸質(zhì)量，有利于生產(chǎn)安全無公害煙葉。
(五)提高產(chǎn)量土壤接種劑在不同地域、不同作物上應(yīng)用，均表現(xiàn)出良好的豐產(chǎn)性能。作物產(chǎn)量明顯提高蔬菜增產(chǎn)12-30％；水果增產(chǎn)20％左右；水稻增產(chǎn)10-15％；煙草增產(chǎn)7.5-19.8％；茶葉鮮產(chǎn)量增收26.8％，蠶桑產(chǎn)量增加20.8％。
(六)增加效益土壤接種劑對各類農(nóng)作物均具有不同程度地提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提早上市，減少農(nóng)藥、化肥用量，減少農(nóng)業(yè)投入等作用，經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。據(jù)統(tǒng)計，蔬菜類作物畝增值一般為120-400元，投入產(chǎn)出比為1∶12-20；煙草等經(jīng)濟(jì)作物畝增值為100-540元，投入產(chǎn)出比為1∶10-27；糧食作物畝增值為50-200元，投入產(chǎn)出比為1∶7-10。煙草使用土壤接種劑，可使上等煙比例提高5-10個百分點，均價提高0.25-1.93元，畝產(chǎn)能增加72-430元，投入產(chǎn)出比為1∶9-50。
利用側(cè)孢芽孢桿菌生產(chǎn)的土壤接種劑能明顯抑制有害病菌病毒的生長繁殖，增強作物根系活力，促進(jìn)作物生長，對減少化肥農(nóng)藥用量、保護(hù)環(huán)境有明顯作用。
具體實施例方式
實施例1CGMCC No.1755菌的選育將自然分離的側(cè)孢芽孢桿菌野生菌株通過自然選育得到一株生物量較大的純培養(yǎng)菌株，以此菌株為出發(fā)菌株，其發(fā)酵液芽孢菌數(shù)為1億/ml，再用紫外誘變15-50s，取得了較好的誘變效果，得到一株CGMCC No.1755，其發(fā)酵液芽孢菌數(shù)高達(dá)10億/ml，是出發(fā)菌株的10倍。
實施例2、利用CGMCC No.1755菌生產(chǎn)土壤接種劑制備工藝是將CGMCC No.1755置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，條件是PH7.0-7.5搖床轉(zhuǎn)速160/min培養(yǎng)溫度33±1℃，培養(yǎng)24-30hr至對數(shù)生長期時接種入種子罐，在種子罐內(nèi)培養(yǎng)24-30hr，再轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐中培養(yǎng)至80％以上形成芽孢；將發(fā)酵放罐液經(jīng)超級過濾、載體吸附、干燥工藝得到高濃度的厚壁休眠孢子粉劑；搖瓶菌種配方(％)豆粕粉0.5 麥麩粉1.2 酵母膏0.1 氯化鈉0.3硫酸鎂0.02磷酸氫二鉀0.3 硫酸錳0.005PH7.0-7.5 搖床轉(zhuǎn)速160r/min培養(yǎng)溫度33±1℃培養(yǎng)18-36hr至對數(shù)生長期時接種。
種子培養(yǎng)配方(％)豆粕粉0.6 麥麩粉1.5 硝酸銨0.15 酵母膏0.2 氯化鈉0.25
硫酸鎂0.015磷酸氫二鉀0.4硫酸錳0.005PH7.0-7.5 通氣量1∶0.6 培養(yǎng)溫度33±1℃培養(yǎng)24-30hr至對數(shù)生長期時接種。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方(％)豆粕粉0.6 麥麩粉1.5 硝酸銨0.2 酵母膏0.3 氯化鈉0.25硫酸鎂0.015 磷酸氫二鉀0.4 硫酸錳0.005PH7.0-7.5 通氣量1∶0.6 培養(yǎng)溫度33±1℃培養(yǎng)至80％以上形成芽孢時放罐。
2后處理工藝(1)超級過濾發(fā)酵液經(jīng)超級過濾濃縮二十倍，溫度控制在50℃以內(nèi)，時間控制在8hr以內(nèi)；(2)吸附干燥利用輕質(zhì)碳酸鈣、草碳、鋸木屑和硅藻土等做載體吸附超濾液，吸附劑∶濃縮液＝(1-2)∶(2-3)，混合均勻后經(jīng)100℃閃蒸干燥得孢子粉劑。
權(quán)利要求
1.側(cè)孢芽孢桿菌WY9701，按照張經(jīng)忠“微生物分類學(xué)”，依據(jù)“伯杰系統(tǒng)細(xì)菌分類學(xué)手冊”和“芽孢桿菌屬”，用側(cè)孢芽孢桿菌ATCC64作模式菌株，WY9701菌株被鑒定為側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)，定名為側(cè)孢芽孢桿菌WY9701(Bacillus laterosporus WY9701)，保藏號為CGMCCNo.1755。
2.一種土壤接種劑，其特征在于利用側(cè)孢芽孢桿菌WY9701菌株經(jīng)微生物液體深層發(fā)酵得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤接種劑的制備方法，其特征在于將CGMCC No.1755置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，條件是PH7.0-7.5，搖床轉(zhuǎn)速160-200r/min，培養(yǎng)溫度32--34℃，培養(yǎng)24-30hr至對數(shù)生長期時接種入種子罐，在種子罐內(nèi)培養(yǎng)24-30hr，再轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐中培養(yǎng)至80％以上形成芽孢；將發(fā)酵放罐液經(jīng)超級過濾濃縮、吸附、干燥工藝得到高濃度的厚壁休眠孢子粉劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的土壤接種劑的制備方法，其特征在于厚壁休眠孢子粉劑可拌入底肥或追肥中施用，也可拌種施用或加水澆灌作物根部。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤接種劑在阻止有害菌繁殖、改善作物營養(yǎng)條件、防病、促生、增產(chǎn)上的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及側(cè)孢芽孢桿菌及由該菌種制備的土壤接種劑，該菌種保藏號為CGMCC No.1755；利用側(cè)孢芽孢桿菌WY9701菌株經(jīng)微生物液體深層發(fā)酵得到土壤接種劑，土壤接種劑在阻止有害菌繁殖、改善作物營養(yǎng)條件、防病、促生、增產(chǎn)上的用途。本發(fā)明的優(yōu)點1.原料易得、價廉、發(fā)酵工藝穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)品有效活菌數(shù)高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)設(shè)備可與其他微生物菌劑生產(chǎn)設(shè)備通用。2.產(chǎn)品抗逆性強，活化性好，繁殖速度快。遇到適當(dāng)?shù)臏囟?、水分、養(yǎng)分等條件，便迅速活化繁殖，形成優(yōu)勢有益菌群發(fā)揮作用。3.產(chǎn)品穩(wěn)定性好，有效期長，在常溫下保存兩年不失效，使用方便；對作物無害，無特殊異味，不刺激皮膚。
文檔編號B09C1/10GK1966670SQ20061003692
公開日2007年5月23日 申請日期2006年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月4日
發(fā)明者張新雄, 韓斌, 林滿文 申請人:東莞市保得生物工程有限公司