茶樹nrt1基因、蛋白及基因表達方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種茶樹NRTl基因、蛋白及基因表達方法，屬于分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] 茶樹[Camellia sinensis (L.)]是原產(chǎn)中國的多年生木本植物，它以葉片為收獲 目標，對氮素需求量較大。氮肥施用量與茶葉品質成分氨基酸、茶多酚含量密切相關，所以， 氮肥是茶園中主要的肥料，通常占施肥總量的一半以上（Kamau et al.，2008)。茶樹對不同 氮源具有偏性吸收特性，吸收銨態(tài)氮的量高于吸收的硝態(tài)氮十倍以上，研究表明，造成這種 差異的原因，主要在于吸收運載系統(tǒng)的差異（杜旭華和彭方仁，2010 ;Yang et al.，2013)。 故研究茶樹NO3吸收、轉運和累積的機制，對于提高其NO 3的利用效率，從而提高茶樹氮素 利用率，提高茶葉品質，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
[0003] 硝態(tài)氮轉運蛋白（Nitrate transporters, NRTs)負責植物根系對NO3-的吸收和 轉運，一直是植物營養(yǎng)領域研究熱點之一。植物具有三個NO 3轉運系統(tǒng)，以適應外界不同 的NO3濃度。兩個高親和運載系統(tǒng)（High-affinity transport system, HATS)，當外界 NO3的濃度低于lmmol/L時發(fā)揮作用，而當外界NO13的濃度高于lmmol/L時，植物通過低 親和運載系統(tǒng)（Low-affinity transport system, LATS)進行 NO3 的吸收（Dechorgnat et al.，2010;Gojon et al.，2011)。目前，已證實擬南芥基因組有53個NRTl亞家族成員，7個 NRT2 亞家族成員（Okamato et al. ,2003 ;0rsel et al. ,2002)，水稻中 NRTl 亞家族成員有 100 多個，NRT2 亞家族成員為 6 個（Araki&Hasegawa, 2006) 〇
[0004] 茶樹吸收利用氮素的生理特性已有研究，但對于氮吸收轉運蛋白特性的研究仍較 為缺乏，對茶樹NRT2家族基因研究已有報道（馮素花等，2014 ;汪進等，2014)，而對茶樹 NRTl家族分子的報道極少。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供茶樹NRTl基因序列、蛋白結構及基因表達方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案為：一種茶樹NRTl基因，其特征在于：其序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種茶樹NRTl蛋白，其特征在于：其序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 進一步的，所述茶樹NRTl蛋白所對應的氨基酸數(shù)目為595個，分子量為65912. 9， 理論等電點為8. 99,負電荷氨基酸殘基數(shù)為40個，正電荷氨基酸殘基數(shù)為49個，不穩(wěn)定系 數(shù)為32. 96,為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為101. 92,總平均親水性為0. 315。
[0009] 進一步的，所述茶樹NRTl蛋白序列跨膜螺旋區(qū)位置分別在41-63, 78-100, 107-12 9, 149-171，192-214, 218-240, 340-362, 380-402, 423-442, 462-484, 505-527, 547-569。 [0010] 本發(fā)明還公開了上述茶樹NRTl基因表達方法，其步驟包括：
[0011] (1)合成引物序列NRTlF和NRT1R，其中NRTlF的序列如SEQ ID No. 3所示，NRTlR 的序列如SEQ ID No. 4所不；
[0012] ⑵實時定量PCR擴增出茶樹NRTl基因全長序列，反應產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠 電泳回收；
[0013] (3)回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5a ;
[0014] 進一步的，所述步驟（2)中PCR體系反應體系為25 μ L，其中10 X Taq plus buffer 2.5yL，25mM MgCl21.5yL，10mM dNTP 14 1^，1〇4]?正向引物141^1(^]\1反向引物141^ 模板 I μ L，滅菌 H20 16. 75 μ L，5U/ μ L 的 Taq plus DNA polymerase 0· 25 μ L ;PCR 反應條 件為：941€5111丨11，941€3〇8,54 1€3〇8,721€6〇8,30個循環(huán)；72。(：1〇11^11。
[0015] 茶樹NRTl基因序列全長為1880bp，編碼595個氨基酸，其蛋白質分子量為 65. 92kD，理論等電點為9. 07043。含有12個跨膜螺旋區(qū)，其中，第6個和第7個跨膜結構域 之間存在一個大的親水環(huán)。且該蛋白為親水性蛋白。在茶樹根和葉中均有表達，說明茶樹 NRTl為組成型基因。茶樹NRTl在茶樹根系和葉部開始吸收NO3，5min內表達均受到抑制， 葉片中NRTl短時間內可以達到較高水平，而根部一直低于對照，96h才顯著提高，表明茶樹 NRTl受到了外界NO3的抑制，且這種抑制作用對根部影響較大，而對葉片中影響較小，說明 茶樹不同組織部位中，吸收同化NO 3的機理可能存在差異，也說明NRTl不僅只作為硝酸鹽 轉運蛋白，其更可能是感受硝酸鹽的信號受體。
【附圖說明】
[0016] 圖1為茶樹NRTl基因 PCR擴增電泳圖。
[0017] 圖2為NO3處理后茶樹根和葉中NRTl基因相對表達量。
[0018] 圖3為茶樹NTRl蛋白跨膜結構模式圖。
[0019] 下面結合附圖對本發(fā)明的實施方式做進一步說明。
【具體實施方式】 [0020] 實施例1
[0021] 茶樹NRTl基因表達方法，其步驟包括：
[0022] (1)合成引物序列NRTlF和NRT1R，其中NRTlF的序列如SEQ ID No. 3所示，NRTlR 的序列如SEQ ID No. 4所不；
[0023] (2)實時定量PCR擴增出茶樹NRTl基因全長序列，PCR體系反應體系為25 μ L， 其中10\丁&1口1118 1311打6『2.5 4 1^，2511111%(：121.5 4 1^，1〇1111(1犯1314 1^，1(^]\1正向引 物 1μL，10μΜ反向引物 lyL，模板 lyL，滅菌 Η20 16.75 yL，5U/yL 的 Taq plus DNA 口〇171^抑86 0.25以1^屮〇?反應條件為：941€511^11，941€308,54 1€308,721€608,30個循環(huán)； 72°C IOmin ;反應產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳回收，PCR擴增電泳圖見圖1 ;
[0024] (3)回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5a ;
[0025] 實施例2
[0026] 分別提取茶樹根和葉片中的RNA進行實時熒光定量RT-PCR分析，結果如圖2所 示，與對照相比，茶樹受NO 3處理5min后根和葉的NRTl表達量均顯著下降。根部表達量始 終低于對照，48h后增加，96h達到最高值。葉部NRTl表達量半小時后顯著高于對照，之后 一直保持"降-升-降"的規(guī)律。
[0027] <110 江.1:簣農(nóng)業(yè)科學:院 <?20 茶樹NRTi S因、蛋白及基因喪達方法 4； \210 1 <2ii mm <212 DM \213 Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze <400 I I gtttRgcccc ctt tttcttc attcat tcnc iacgf^cccaa ct ^ctaglaa agrttgataa 61 cecccgangc cla L^cddca hat^gcaclc ccigHHacac ,idCHhggc Lc taa^^ccLlc 121 ccdgalgcct gggacttccia aggcccicccc gcccacagat ccaccaccgg tggt tggacc Ihl cgtgccgcca fgattctagg ggttgaggcn tgtgagaggf taaccacact tggaat3gcg 241 gt.T^cttgg tgacatactt gactpgtacg- atgcacttgg ^cifitgctaa ctoagccaac 301 actt HCCci ;-icI lCCI \ gg tdcc U;U I c illgcic (^cc IicicgycgK c t I c^l I gcc 361 gatncit tcc t tggcaggla tcgaaccatt dtcat^litg icttlgt tci- agclactgga 4-1 gttgcaalct taacgatctc caecataatc cccacuctcc aaecgcecaa acgcactctc 481 aacagcccat catgcgtccc cgccaccgcc RCgua^1Ctaa c ^gtcctcta cp;gagctcta 54