治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體涉及一種治療多發(fā)型骨髓瘤的靶點。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM)是一種病因尚不清楚的惡性B細胞腫瘤， 特點是骨髓中終末分化的漿細胞的惡性增殖。多發(fā)性骨髓瘤在我國每年新發(fā)病例為1-2/10 萬人口，在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中僅次于白血病和淋巴瘤。若不予治療，進展期MM患者 的中位生存期僅為6個月。接受傳統(tǒng)化療的患者中位生存期也不超過3年，僅有25%的患 者可以生存5年以上。所以多發(fā)性骨髓瘤一直被認為是一種不可治愈的疾病。
[0003] 目前，對初發(fā)患者仍然以糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid，Ge)為代表的化療方案為 主。這些方案中糖皮質(zhì)激素地塞米松（Dexamethasone，Dex)發(fā)揮了主要的治療作用，但多 次治療后患者不可避免地產(chǎn)生耐藥，Dex耐藥是影響骨髓瘤治療效果及預(yù)后不良的重要原 因。因此，尋找Dex耐藥及預(yù)后不良相關(guān)的治療靶點并進行有效干預(yù)，對于判斷預(yù)后、指導 治療，提尚患者生存率有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的有實際應(yīng)用價值的多發(fā)性骨髓瘤治療靶點，以克 目前治療方法的缺陷，為多發(fā)性骨髓瘤病人提供一種新的治療途徑，以進一步提高療效、改 善病人預(yù)后。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點，該靶點為癌基因 CIP2A，所述癌基因 CIP2A氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明還提供一種治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點，在制備抗多發(fā)性骨髓瘤藥物中的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明的治療多發(fā)型骨髓瘤的靶點，既進一步闡明了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制， 又為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的治療靶點。這一新靶點的發(fā)現(xiàn)對開發(fā)多發(fā)性骨髓瘤基 于癌蛋白的靶向療法具有重要意義，對改善多發(fā)性骨髓瘤病人預(yù)后具有潛在的臨床應(yīng)用價 值。
【附圖說明】
[0008] 圖1所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例1-1病人CIP2A表達圖。
[0009] 圖2所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例1-2中4種健康志愿者外周血 單核細胞CIP2A表達圖。
[0010] 圖3所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例1-3中病人的預(yù)后指標。
[0011] 圖4所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例2-1中多發(fā)性骨髓瘤細胞系中 CIP2A基因表達圖。
[0012] 圖5所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例2-2中多發(fā)性骨髓瘤細胞系中 CIP2A蛋白表達圖。
[0013] 圖6所示為本發(fā)明治療多發(fā)性骨髓瘤的靶點實施例3中多發(fā)性骨髓瘤細胞系中 CIP2A敲除后地塞米松的治療效果圖。
【具體實施方式】
[0014] 下文將結(jié)合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當注意的是，下述實施例中 描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術(shù)效果。
[0015] 下述實施例中的人 HL-60、U266、RPMI 8226、MM. 1S、MM. IR 均購買自 ATCC。
[0016] 實施例1、CIP2A高表達于多發(fā)性骨髓瘤病人細胞，且和病人預(yù)后密切相關(guān)。
[0017] 1-1、CIP2A高表達于多發(fā)性骨髓瘤病人細胞
[0018] 按照如下方法用美天旎的⑶138磁珠分選試劑盒將7例骨髓瘤病人骨髓中⑶138 陽性的腫瘤細胞進行分選：
[0019] (1)將病人標本用RPMI-1640,4倍稀釋后，用淋巴細胞分離液分離，400Xg，離心 35分鐘，尚心機設(shè)置為不剎車。
[0020] ⑵小心吸取中層細胞，用IOml預(yù)冷Buffer (含1% FBS，2mM EDTA的PBS，F(xiàn)BS購 自Hyclone，EDTA購自Sigma)洗兩次，300 X g，離心10分鐘。
[0021] (3)盡量去上清，每5X IO6個細胞加10 μ I MACS⑶138免疫磁珠（購自美天旎）， 90μ1 Buffer，6-12°C放置 15 分鐘。
[0022] (4)加入10-20倍的Buffer，300Xg，離心10分鐘，洗一次。棄上清加0· 5-lml Buffer，將細胞制成單細胞懸液。
[0023] (5)選擇合適的免疫分選柱（購自美天旎），安放柱子在分選器上（美天旎），放 上30 μ m篩網(wǎng)，0.5ml Buffer潤柱。將上述細胞過柱，0.5ml Buffer沖柱三次，收集陰性細 胞。
[0024] (6) Iml Buffer推柱得到陽性細胞。
[0025] 熒光定量PCR檢測上述分選法分選的7例病人細胞及HL-60細胞中CIP2A基因表 達水平，發(fā)現(xiàn)病人細胞均高表達CIP2A(見圖1)。實驗重復(fù)三次。其中，熒光定量PCR檢測 以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測內(nèi)參基因的PCR引物序列為：
[0026] GAPDH forward primer 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3' ；
[0027] GAPDH reverse primer 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3' 〇
[0028] 熒光定量PCR檢測CIP2A基因表達水平的引物為：
[0029] CIP2A gene forward primer 5'-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3' ；
[0030] CIP2A gene reverse primer 5'-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3' 〇
[0031] 1-2、CIP2A低表達于正常志愿者細胞
[0032] 按照如下方法用淋巴細胞分離液將4名志愿者外周血的單核細胞進行分選：
[0033] (1)將志愿者的外周血用RPMI-1640,4倍稀釋后用淋巴細胞分離液分離，400X g， 尚心35分鐘，尚心機設(shè)置為不剎車。
[0034] ⑵小心吸取中層細胞，用IOml預(yù)冷Buffer (含1% FBS，2mM EDTA的PBS，F(xiàn)BS購 自Hyclone，EDTA購自Sigma)洗兩次，300 X g，離心10分鐘。盡量去上清，收集細胞。
[0035] 熒光定量PCR檢測上述分選法分選的4名志愿者外周血單核細胞及HL-60細胞中 CIP2A基因表達水平，發(fā)現(xiàn)健康志愿者外周血單核細胞均低表達CIP2A (見圖2)。實驗重復(fù) 三次。其中，熒光定量PCR檢測以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測內(nèi)參基因的PCR引 物序列為：
[0036] GAPDH forward primer 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3' ；
[0037] GAPDH reverse primer 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3' 〇
[0038] 熒光定量PCR檢測CIP2A基因表達水平的引物為：
[0039] CIP2A gene forward primer 5'-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3' ；
[0040] CIP2A gene reverse primer 5'-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3' 〇
[0041] 1-3、高表達CIP2A的骨髓瘤病人表現(xiàn)出預(yù)后不良
[0042] 發(fā)明人對7例骨髓瘤病人的預(yù)后指標進行了分析，包括年齡、骨髓漿細胞含量、血 小板、血紅蛋白、白蛋白、本周氏蛋白含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達CIP2A的三位病人Ρ5-Ρ7，表現(xiàn) 出明顯的預(yù)后不良，包括年齡大于60歲；骨髓中漿細胞含量大于30% ;本-周氏蛋白含量 大于3. 5mg/L ;血小板、血紅蛋白及白蛋白含量較少（見圖3)。
[0043] 圖1是