專利名稱：用姜黃素治療人多發(fā)性骨髓瘤的制作方法
參照相關(guān)專利申請本非臨時專利申請要求2002年6月24日提交現(xiàn)已撤銷的美國臨時專利申請序列號60/390,926的權(quán)益。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的涉及癌生物領(lǐng)域。更具體說，本發(fā)明揭示用姜黃素治療人多發(fā)性骨髓瘤的方法。
相關(guān)領(lǐng)域的描述多發(fā)性骨髓瘤是一種B細胞惡性腫瘤，其特征是增殖指數(shù)低且壽命延長的分泌性漿細胞在骨髓中的潛優(yōu)性積聚。多發(fā)性骨髓瘤占所有癌癥的1％和所有血液癌的10％以上。其標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括聯(lián)合應(yīng)用長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素和強的松或地塞米松。盡管采用大劑量糖皮質(zhì)激素和烷化劑治療，此惡性瘤仍不能治愈。其完全緩解率是5％，存活時間中值是30-36個月。在90％以上的病人中，此病變?yōu)榛瘜W(xué)藥物抗性。因此，治療多發(fā)性骨髓瘤迫切需要安全和有效的制劑。
現(xiàn)認為漿細胞的細胞凋亡機制失調(diào)是多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機理和后來的化學(xué)藥物抗性的主要因素。已確定以自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生的IL-6通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長和存活在多發(fā)性骨髓瘤惡性發(fā)展中起著重要作用。IL-6的存在導(dǎo)致組成型活化Stat 3，進而導(dǎo)致高水平抗細胞凋亡蛋白Bcl-xL的表達。Bcl-2過度表達是大部分多發(fā)性骨髓瘤細胞系的另一個重要特征，拯救這些腫瘤細胞避免了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細胞凋亡。用TNF治療多發(fā)性骨髓瘤細胞使NF-kB活化，誘導(dǎo)IL-6分泌，誘導(dǎo)各種粘附分子表達和促進增殖。此外，多發(fā)性骨髓瘤細胞顯示可表達能活化NF-kB受體的配基(RANKL)，RANKL是TNF超家族的成員，能介導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤誘導(dǎo)的溶骨性疾病。
多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)展成細胞凋亡抗性的一種可能機制是通過活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB。在正常條件下，NF-kB作為無活性的異三聚體存在于細胞質(zhì)中，由p50、p65和IkBα亞基組成。活化時，IkBα經(jīng)過磷酸化和泛素-依賴的26S蛋白體降解，從而使p50-p65異二聚體上暴露出核定位信號，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)位和結(jié)合于特異的共有DNA序列(5’-GGGACTTTC-3’，SEQ ID NO.1)。NF-kB結(jié)合于DNA可活化基因表達，進而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄。通過活化IkBα激酶(IKK)而發(fā)生IkBα磷酸化。IkB激酶復(fù)合體由3種蛋白質(zhì)IKKa、IKKb和IKKg/NF-kB必需調(diào)節(jié)物(NEMO)組成。IKKα和IKKβ是能磷酸化IkBα的激酶，而IKKγ/NEMO是對IKKα和IKKβ活性關(guān)鍵的支架蛋白質(zhì)。
過去幾年中的廣泛研究表明NF-kb可調(diào)節(jié)各種基因的表達，這些基因在細胞凋亡、腫瘤發(fā)生和炎癥中起著關(guān)鍵作用。一些NF-kB調(diào)節(jié)基因包括IkBα、細胞周期蛋白D1、Bcl-2、bcl-xL、COX-2、IL-6和粘附分子ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1。近來報導(dǎo)NF-kB在多發(fā)性骨髓瘤細胞中可被組成型活化，導(dǎo)致bcl-2表達，而此表達可拯救這些細胞避免了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細胞凋亡。由于多發(fā)性骨髓瘤細胞表達IL-6、多種粘附分子、Bcl-xL和Bcl-2，都受到NF-kb的調(diào)節(jié)，也由于它們的抑制能導(dǎo)致細胞凋亡，已提出NF-kB是治療多發(fā)性骨髓瘤的重要靶標(biāo)。然而，現(xiàn)有技術(shù)不足以鑒定能阻斷多發(fā)性骨髓瘤中組成型NF-kb活化的藥學(xué)上安全和有效的制劑。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域這一長期存在的需求。
發(fā)明概述由于核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在細胞存活和增殖中的重要作用，研究了將它用作治療多發(fā)性骨髓瘤的靶標(biāo)的可能性，采用已知在人中體毒性很小或無毒的制劑姜黃素(二阿魏酸基甲烷(diferuloylmethane))。NF-kb能在所有檢測的人多發(fā)性骨髓瘤細胞系中組成型活化，化學(xué)預(yù)防劑姜黃素如電泳遷移率變化試驗所示那樣，能下調(diào)所有細胞系中的NF-kB，且如免疫細胞化學(xué)所示那樣，能防止p65的核內(nèi)保留。所有多發(fā)性骨髓瘤細胞系顯示有組成型活化的IkB激酶(IKK)和IkBα磷酸化。姜黃素能通過抑制IkB激酶活性來抑制組成型IkBα磷酸化。姜黃素也能下調(diào)NF-kB-調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達，包括IkBα、Bcl-2、Bcl-xL、細胞周期周期蛋白D1和白介素-6的表達。這導(dǎo)致增殖抑制和細胞停滯在細胞周期的G1/S期。
IKKg/NF-kB必需調(diào)節(jié)物-結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽對NF-kB復(fù)合體的抑制，也抑制了多發(fā)性骨髓瘤細胞的增生。姜黃素也能誘導(dǎo)細胞凋亡，如通過胱冬酶-7和胱冬酶-9的活化和PARP切割所示。姜黃素誘導(dǎo)的NF-kB下調(diào)也誘導(dǎo)了對長春新堿的化學(xué)敏感性，其中NF-kB是參與化學(xué)抗性的一種因子。這些結(jié)果表明姜黃素能下調(diào)人多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-kB，從而抑制增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡。
本發(fā)明也測試了22個多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓的CD138+細胞并通過免疫細胞化學(xué)核查NF-kB和STAT3的活化形式。發(fā)現(xiàn)所有病人的多發(fā)性骨髓瘤細胞均表達NF-kB和STAT3的活化形式。NF-kB的組成型活化已獨立的通過電泳遷移率變化試驗得到驗證。與多發(fā)性骨髓瘤患者相反，健康個體的細胞中沒有NF-kB和STAT3?；铙w外用姜黃素(二阿魏酸基甲烷)處理抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-kB和STAT3活化，導(dǎo)致了細胞活力減少。地塞米松可部分抑制NF-kB活化且對骨髓瘤細胞的細胞毒性最小?？傊@些結(jié)果表明多發(fā)性骨髓瘤患者的新鮮細胞能表達組成型活化的NF-kB和STAT3，抑制這些轉(zhuǎn)錄因子可抑制這些細胞的存活。
本發(fā)明的其它和更多方面、特征和優(yōu)點將從以下提供的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述中得知。給出這些實施方案目的是說明。
附圖的簡要說明

圖1顯示姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞中的組成型核NF-kB。圖1ANF-kB對姜黃素處理U266細胞的劑量反應(yīng)。將200萬個細胞/ml用所示濃度的姜黃素處理4小時，并用EMSA測試核NF-kB。圖1B接觸持續(xù)時間對U266細胞中姜黃素誘導(dǎo)的NF-kB抑制的作用。細胞用姜黃素(50μM)處理所示時間并用EMSA測試核NF-kB。圖1C接觸持續(xù)時間對MM.1細胞中姜黃素誘導(dǎo)的NF-kB抑制的作用。細胞如圖1B所述處理。圖1D接觸持續(xù)時間對MM.1R細胞中姜黃素誘導(dǎo)的NF-kB抑制的作用。細胞如圖1B所述處理。圖1E接觸持續(xù)時間對RPMI 8226中姜黃素誘導(dǎo)的NF-kB抑制的作用。細胞如圖1B所述處理。圖1FNF-kB結(jié)合DNA是特異性的且由p50和p65亞基組成。從U266細胞(2×106/ml)中制備核提取物，用不同抗體或未標(biāo)記的NF-kB寡核苷酸探針孵育30分鐘，然后用EMSA測定NF-kB。
圖2顯示姜黃素誘導(dǎo)p65的重分布。U266和RPMI 8226細胞單獨或用姜黃素(50μM)孵育4小時，然后用免疫細胞化學(xué)分析p65的分布。紅色表示p65的定位，藍色(Hoechst)表示核(放大200X)，圖3顯示姜黃素抑制IkBα磷酸化和IkB激酶。將500萬個U266細胞/2.5ml用姜黃素(50μM)處理所示時間并制備細胞質(zhì)提取物。圖3A用蛋白質(zhì)印跡法測定磷酸化IkBα的水平。圖3B免疫沉淀IkB激酶和測定IkB激酶活性的激酶試驗(上面一排圖)或蛋白質(zhì)印跡法分析細胞質(zhì)提取物中的總IKKα和IKKβ蛋白質(zhì)(下面一排圖)。圖3C免疫沉淀IkB激酶，激酶試驗在沒有或存在所示濃度姜黃素時進行(上面一排圖)。下面一排圖表示在同一干燥凝膠的各孔中用考馬斯藍染色的GST-IkBα蛋白的量。
圖4顯示姜黃素對NF-κB調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的作用。將200萬個U266細胞用姜黃素(50μM)處理所示時間，制備細胞質(zhì)提取物。將60微克細胞質(zhì)提取物在10％SDS-PAGE凝膠上分離，電轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上，探測下列各項IκBα(圖4A)；Bcl-2(圖4B)；Bcl-XL(圖4C)和細胞周期蛋白D1(圖4D)。將同一印跡切成條帶用抗β-肌動蛋白抗體再探測顯示相等蛋白免載量(各圖中下面一排圖)。圖4E姜黃素下調(diào)IL-6的產(chǎn)生。將U266、MM.1或RPMI 8226細胞(1×107)在5ml培養(yǎng)液中用姜黃素(10mM)處理所示時間。收集上清液并濃縮約20倍，用IL-6 ELISA試劑盒定量IL-6。將所示值標(biāo)準(zhǔn)化至1ml未濃縮上清液。
圖5顯示姜黃素抑制人多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長。將U266(圖5A)；RPMI8226(圖5B)；MM.1(圖5C)或MM.1R細胞(圖4D)(5000個細胞/0.1ml)用姜黃素(1mM或10mM)37℃孵育所示時間，用標(biāo)準(zhǔn)臺盼藍染料排除試驗計數(shù)活細胞。結(jié)果表示為一式三份培養(yǎng)物的平均(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)細胞計數(shù)。
圖6顯示姜黃素抑制人多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡。圖6A將U266細胞(5000個細胞/0.1ml)用不同濃度姜黃素孵育24小時，如所述進行細胞增殖測定。結(jié)果表示為一式三份培養(yǎng)物與未處理對照相比的平均(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)[3H]-胸苷摻入百分率。圖6B將U266細胞(5000個細胞/0.1ml)用不同濃度姜黃素孵育24小時，用MTT方法測定細胞活力。結(jié)果表示為一式三份培養(yǎng)物的平均(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)活性百分比。
圖6C-E顯示U266細胞(2×106個細胞/ml)在沒有或存在姜黃素(50μM)時孵育所示時間。洗滌細胞然后裂解細胞提取總蛋白質(zhì)。取60微克提取物在10％SDS-PAGE凝膠上分離，電轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上，用抗胱冬酶原-9(圖6C)、抗胱冬酶原-7(圖6D)、抗PARP(圖6E，上面一排圖)和抗切斷PARP(圖6E，下面一排圖)抗體探測。
圖7顯示姜黃素使細胞停滯在細胞周期的G1/S期。U266細胞(2×106個細胞/ml)在沒有或存在姜黃素(10μM)時孵育所示時間。然后洗滌細胞、固定、碘化丙錠染色、流式細胞儀分析DNA含量。
圖8顯示NEMO-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)肽抑制了多發(fā)性骨髓瘤細胞中的組成型NF-κB和誘導(dǎo)了細胞毒性。圖8A將U266細胞(2×106個細胞/ml)用所示濃度的NEMO-對照或NBD-肽(100μM)處理所示時間。然后用EMSA檢查核提取物中NF-κB DNA結(jié)合活性的存在。圖8B用細胞旋轉(zhuǎn)似離子未處理或NBD-肽處理的(100μM；12小時)U266細胞，如所述進行p65免疫細胞化學(xué)分析。紅色表示p65的定位，藍色表示核(放大200X)。圖8C將U266細胞(2×106個細胞/ml)用所示濃度的NEMO-對照或NBD-肽(100μM)處理所示時間段，用臺盼藍染料排除法監(jiān)測細胞活力。測定細胞殺傷百分比為(臺盼藍染色細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100。
圖9顯示姜黃素加強長春新堿對多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用。U266細胞(10000個細胞/0.ml)在沒有或存在姜黃素(10μM)時不用或用長春新堿(500μM)孵育24小時，然后用MTT法測定細胞活性。
圖10顯示人多發(fā)性骨髓瘤細胞系(圖10A)、健康受試者外周血單個核細胞(PBMC)、患者的骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞(圖10B)中NF-κB的免疫細胞化學(xué)定位。通過Ficoll-Pague密度梯度離心收集健康受試者血中的PBMC。用磁珠分離法富集，多發(fā)性骨髓瘤患者(患者#1)骨髓抽吸物中富含的CD138+細胞，免疫染色NF-κB(p65)。紅色表示NF-κB的特異性染色，而藍色表示相應(yīng)視野中核的相對位置。
圖11顯示多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓CD138+細胞中NF-κB的核定位。對不同多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中富集的CD138+細胞作NF-κB免疫染色(p65)(圖11A)。紅色表示NF-κB的特異性染色，而藍色表示相應(yīng)視野中核的相對位置。圖11B顯示用電泳遷移率變化試驗測定多發(fā)性骨髓瘤患者(患者#4)骨髓抽吸物中所富含的CD138+細胞(2×106個細胞)的核中NF-κB活性。未處理或TNF-處理的KBM-6(TNF-1nM，30分鐘)分別用作陰性和陽性對照。
圖12顯示多發(fā)性骨髓瘤細胞系(圖12A)、PBMCs和患者的骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞(圖12B-C)中STAT3的核定位。如下所述對不同多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中富含的CD138+細胞作STAT3免疫染色。紅色表示STAT3的特異性染色，而藍色表示相應(yīng)視野中核的相對位置。
圖13顯示姜黃素可防止骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-κB和STAT3的核定位。將多發(fā)性骨髓瘤患者#5、#9或#10骨髓抽吸物中富集的CD138+細胞(1×105個細胞/0.1ml)在沒有或存在姜黃素(50μM)時培養(yǎng)1小時作STAT3分析或培養(yǎng)2小時作NF-κB分析。將細胞通過細胞旋轉(zhuǎn)離心固定于載玻片上并免疫染色NF-κB或STAT3。紅色表示NF-κB或STAT3的特異性染色，而藍色表示相應(yīng)視野中核的相對位置。
圖14顯示姜黃素抑制人多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266和骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長/活性。將細胞系U266(圖14A)或多發(fā)性骨髓瘤患者#7、#9或#10骨髓抽吸物中富集的CD138+細胞(2×104個細胞/0.1ml)(圖14B-D)在沒有或存在所示濃度姜黃素時培養(yǎng)24小時，用MTT試驗(圖14A、B)或標(biāo)準(zhǔn)臺盼藍染料排除法(圖14C、D)測定細胞活性。
圖15顯示姜黃素和地塞米松對NF-κB和STAT3在骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞中核定位的作用。將多發(fā)性骨髓瘤患者#20骨髓抽吸物中富含的CD138+細胞(1×105個細胞/0.1ml)在沒有或存在姜黃素或地塞米松(各50μM)時培養(yǎng)2小時，將細胞通過細胞旋轉(zhuǎn)離心固定于載玻片上并免疫染色NF-κB或STAT3。如所示紅色表示NF-κB或STAT3的特異性染色，而藍色表示相應(yīng)視野中核的相對位置。
圖16顯示姜黃素和地塞米松對骨髓CD138+多發(fā)性骨髓瘤細胞生長/活性的作用。將多發(fā)性骨髓瘤患者#20骨髓抽吸物中富集的CD138+細胞(2×105個細胞/0.1ml)在沒有或存在所示濃度姜黃素(圖16A)或地塞米松(圖16B)時培養(yǎng)24小時，用MTT試驗測定細胞活性。
發(fā)明詳述已證明姜黃素能抑制多種炎癥刺激所誘導(dǎo)的NF-κB活化，和抑制NF-κB活化所需的IκB激酶活性的活化。姜黃素也能下調(diào)不同NF-κB調(diào)節(jié)基因，包括bcl-2、COX2、MMP-9、TNF、細胞周期蛋白D1和粘附分子的表達。此外，報導(dǎo)姜黃素能在多種細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡，這是通過相繼活化胱冬酶-8、BID切割、細胞色素C釋放、胱冬酶-9和胱冬酶-3而致。許多動物研究證明姜黃素對于多種不同腫瘤具有強效化學(xué)預(yù)防活性(Rao等，1995；Kawamori等，1999)，即使以8g每天，人服用姜黃素，在I期臨床試驗中安全(Cheng等，1998)。
本文所示結(jié)果表明NF-κB在所有受檢查的人多發(fā)性骨髓瘤細胞系中組成型活化。姜黃素下調(diào)了NF-κB的核庫或活性形式，并抑制了組成型IκBα的磷酸化、IKK激酶的活性及NF-κB調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物IκBα、Bcl-2、Bcl-XL、細胞周期蛋白D1和白介素-6的表達。這導(dǎo)致增殖抑制、細胞停滯在細胞周期的G1/S期邊界并誘導(dǎo)了細胞凋亡如胱冬酶-7和胱冬酶-9的活化和PARP切斷指示的那樣。姜黃素也誘導(dǎo)了對長春新堿的化學(xué)敏感性。
本文所用的全部4種多發(fā)性骨髓瘤細胞系(U266、RPMI8226、MM.1和MM.1R)均表達了組成型活化的NF-κB。這些結(jié)果與最近2個報導(dǎo)相一致，這2個報導(dǎo)通過電泳遷移率變化試驗顯示U266和RPMI8226細胞中有組成型NF-κB。MM.1和MM.1R是地塞米松抗性細胞系，也表達了組成型NF-κB。這些結(jié)果與Hideshima等的結(jié)果不同，他的結(jié)果顯示MM.1S細胞中缺乏組成型活化的NF-κB，而MM.1S細胞與MM.1細胞在此點上相同。由于NF-κB的組成型活化導(dǎo)致p65的核轉(zhuǎn)位，證實了免疫細胞化學(xué)檢測的所有細胞系中均存在核p65。這些結(jié)果進一步表明多發(fā)性骨髓瘤細胞有組成型活化的IκB激酶，NF-κB活化需要此激酶。這是第1個顯示多發(fā)性骨髓瘤細胞中IκB激酶水平升高的報導(dǎo)。
姜黃素在本文檢測的所有4種多發(fā)性骨髓瘤細胞系中抑制了組成型NF-κB的活化，這與以前的報導(dǎo)一致，這些報導(dǎo)顯示姜黃素是NF-κB活化的強效抑制劑。姜黃素通過阻斷多發(fā)性骨髓瘤細胞中存在的組成型活性IκB激酶而抑制NF-κB的活化。由于姜黃素能抑制細胞內(nèi)和體外的IκB激酶活性，故提出姜黃素可能是IκB激酶的直接抑制劑。因為沒采用重組IκB激酶，還不能完全排除姜黃素間接抑制IκB激酶的可能性。在任何情況中，姜黃素似乎均抑制IκB激酶活化，從而抑制IκBα磷酸化并因此消除了IκBα的降解。這些結(jié)果與以前的報導(dǎo)一致，這些報導(dǎo)顯示姜黃素能抑制結(jié)腸癌細胞和巨噬細胞中的IκB激酶。最近的報導(dǎo)顯示合理設(shè)計的IκB激酶抑制劑PS-1145能阻斷MM.1細胞中TNF-誘導(dǎo)的NF-kB活化。阻斷這些細胞中IκB激酶活化所需的姜黃素濃度相當(dāng)于PS-1145所報導(dǎo)的。
姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞增殖與以前的報導(dǎo)一致，這些報導(dǎo)顯示姜黃素誘導(dǎo)的NF-κB抑制可導(dǎo)致皮膚T細胞淋巴瘤和急性髓性白血病的細胞增殖抑制。姜黃素抗增殖作用的結(jié)果與Hideshima等的結(jié)果一致，他顯示IKK阻斷劑PS-1145能抑制細胞增殖。這些學(xué)者報導(dǎo)50μM PS-1145可抑制不到50％的多發(fā)性骨髓瘤細胞系MM.1S、RPMI-8226和U226增殖。相反，發(fā)現(xiàn)用少至10μM的姜黃素幾乎完全抑制了所有這些細胞系的增殖。
幾種可能的機制能解釋為什么姜黃素下調(diào)NF-κB會導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖抑制。一種可能的機制包括如本文所示抑制了IL-6的產(chǎn)生。許多研究表明IL-6是多發(fā)性骨髓瘤細胞的強效生長因子。關(guān)于IL-6是多發(fā)性骨髓瘤細胞的旁分泌還是自分泌生長因子仍有很多爭議。然而，在這些研究中，然而姜黃素不可能通過抑制IL-6的產(chǎn)生來抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長，因為所檢測4個細胞系有3個不產(chǎn)生可檢測的IL-6。姜黃素也不可能通過下調(diào)組成型活化的Stata3信號傳遞來抑制細胞生長，因為不表達組成型活化Stata3的細胞增殖也受到姜黃素的抑制。此研究中，姜黃素下調(diào)了bcl-2和bcl-XL的表達，這些蛋白參與了多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞存活。因此姜黃素下調(diào)bcl-2和bcl-XL可能導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖的抑制。
也發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細胞過量表達另一種NF-κB調(diào)節(jié)基因細胞周期蛋白D1，而其表達受到姜黃素下調(diào)。已注意到多種腫瘤中有細胞周期蛋白D1的過量表達，但它在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的作用未見報導(dǎo)。鑒于細胞從細胞周期的G1進入到S期需要細胞周期蛋白D1，姜黃素誘導(dǎo)G1/S停滯和因此抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖很可能是由于細胞周期蛋白D1的下調(diào)。
姜黃素抑制NF-κB也可導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞凋亡，如胱冬酶活化和PARP切割所表明的那樣。這些結(jié)果與NF-κB可介導(dǎo)抗細胞凋亡作用的報導(dǎo)一致。NF-κB的下調(diào)也使多發(fā)性骨髓瘤細胞對長春新堿敏感。甚至顯示對地塞米松有抗性的MM.1R細胞對長春新堿也敏感。
多發(fā)性骨髓瘤是不能治愈的侵襲性B細胞惡性腫瘤，90％以上的多發(fā)性骨髓瘤患者成為化療抗性。在尋找更有效治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中測試了一些制劑。這些制劑包括蛋白體抑制劑PS341和TNF產(chǎn)生抑制劑酞咪哌啶酮。非特異性藥物毒性是藥物開發(fā)中的主要問題之一。然而，許多研究顯示姜黃素在藥學(xué)上安全。最近證明在1期臨床試驗中，口服時每天人能耐受多至8克的姜黃素(Cheng等，1998)。此外，姜黃素顯示能下調(diào)ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表達，它們都是參與多發(fā)性骨髓瘤細胞活化基質(zhì)細胞的NF-κB調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物。另一種細胞因子TNF已知在多發(fā)性骨髓瘤中具有致病作用，也顯示其到受姜黃素的下調(diào)。本文所示結(jié)果清楚地證明姜黃素能抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-κB、IKK、bcl-2、bcl-XL、細胞周期蛋白D1和細胞增殖。這些結(jié)果提供足夠的基礎(chǔ)認為姜黃素值得在多發(fā)性骨髓瘤患者中進行臨床試驗。
如本文所用，“多發(fā)性骨髓瘤細胞”指多發(fā)性骨髓瘤細胞系或分離得自多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+漿細胞。
在本發(fā)明中，提供了采用姜黃素處理以抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡和提高化學(xué)治療劑抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用的方法。一般，化學(xué)治療劑一般可以是長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素、強的松或地塞米松。
本發(fā)明也涉及采用姜黃素處理來治療個體的多發(fā)性骨髓瘤和提高化學(xué)治療劑抗個體多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用的方法。化學(xué)治療劑通常是上面所列的那些制劑。
特別考慮本發(fā)明的方法采用了包括姜黃素的藥物組合物，例如含姜黃素和本領(lǐng)域熟知和常規(guī)使用的藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。鑒于已發(fā)表的臨床試驗(Cheng等，1998)和其它涉及采用姜黃素的研究，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不需過多實驗即能容易地確定本發(fā)明方法中姜黃素的適當(dāng)給藥劑量和途徑，當(dāng)用于體內(nèi)治療時，姜黃素以治療有效量予給病人或動物，即給予的量能抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡或提高化學(xué)治療劑抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用，例如給藥劑量從約0.01mg/kg個體體重到約500mg/kg個體體重。
給出下列例子用于闡明本發(fā)明的各種實施方案但不意味以任何方式限制本發(fā)明。本文實施例與本文所述的方法、過程、處理、分子和特定化合物一起，代表了優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解本發(fā)明很適合實施而完成目標(biāo)和獲得所述的結(jié)果及優(yōu)點，以及本文內(nèi)在的目標(biāo)、結(jié)果和優(yōu)點。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道對其的變化和其它用途均在權(quán)利要求范圍所定義的本發(fā)明的思路內(nèi)。
實施例1細胞和試劑人多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266、RPMI 8226和MM.1得自美國典型培養(yǎng)物保藏所(Rockville，MD)。細胞系U266(ATCC#TIB-196)和RPMI 8226(ATCC#CCL-155)是B細胞來源的漿細胞瘤。U266已知能產(chǎn)生單克隆抗體和IL-6。RPMI 8226僅產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈而沒有證明能產(chǎn)生重鏈或IL-6。RPMI 8226的阿霉素(Dox-6)-和美法侖(LR-5)-抗性克隆由Dr.Willium Dalton(H.Lee Moffitt Cancer Center andResearch Institute，Tampa，F(xiàn)L.)提供。
從IgA骨髓瘤患者外周血細胞建立的MM.1(也稱為MM.1S)細胞系能分泌λ輕鏈，EBV基因組存在為陰性，能表達白細胞抗原DR、PCA-1、T9和T10抗原。MM.1R是MM.1細胞的地塞米松抗性變體。這2個細胞系由Dr.Steve T.Rosen ofNorthwestern University Medical School(Chicago，IL)提供。
抗IkBa、p50、p65、細胞周期蛋白D1、Bcl-2、Bcl-xL及PARP和STAT3的兔多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)?？骨袛嗟?PARP、磷酸-IkBa、胱冬酶原-7、胱冬酶原-9的抗體和多核苷酸激酶試劑盒購自NewEngland Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。抗IKKa和抗IKKb抗體由Imgenex(SanDiego，CA)友情提供。山羊抗兔-HRP偶聯(lián)物購自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)，山羊抗小鼠-HRP偶聯(lián)物購自Transduction Laboratories(Lexington，KY)，山羊抗兔-Alexa 594購自Molecular Probes(Eugene，OR)。抗CD138微珠和PE-偶聯(lián)的抗CD138購自Miltenyi Biotech(Auburn，CA)。
細胞可滲透的NEMO(NF-κB必需修飾物；也稱為IKKγ)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽(NBD)、NH2-DRQIKIWFQNRRMKWKKTALDWSWLQTE-CONH2，(SEQ ID NO.2)和對照肽NEMO-C，NH2-DRQIKIWFQNRRMKWKK-CONH2，(SEQ ID NO.3)得自Imgenex(San Diego，CA)。
姜黃素購自LKT Laboratories，Inc.(St.Paul，MN.)，制備成為二甲基亞砜中的20mM溶液，然后用細胞培養(yǎng)液進一步稀釋。長春新堿、Hoechst 33342和MTT購自Sigma-Aldrich Chemicals(St.Louis，MO)。RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、0.4％臺盼藍活性染色液和100X抗生素-抗真菌混合物得自Life TechnologiesInc.(Grand Island，NY)。蛋白A/G-瓊脂糖珠得自Pierce(Rockford，IL)。g-P32-ATP得自ICN Pharmaceuticals(Costa Mesa，CA)。人IL-6試劑盒購自BioSourceInternational(Camarillo，CA)。Ultrafree 4離心濾器購自MilliporeCorporation(Bedford，MA)。
所有的人多發(fā)性骨髓瘤細胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含1X抗生素-抗真菌。U266、MM.1和MM.1R在10％FBS中培養(yǎng)，而細胞系RPMI 8226在20％FBS中培養(yǎng)。偶爾，用Hoechst染色和常規(guī)PCR來檢測細胞的支原體污染。
實施例2制備用于NF-κB的核提取物核提取物根據(jù)Bharti等(2003)制備。簡言之，2×106個細胞用冷PBS洗滌并懸浮于含蛋白酶抑制劑的0.4ml低滲裂解緩沖液中30分鐘。細胞隨后用12.5μl 10％諾乃洗滌劑P-40裂解。離心均勻混合物，取含細胞質(zhì)提取物的上清液-80℃冷凍保存。將核沉淀物重懸于25μl冰冷核提取物緩沖液中。間歇混合30分鐘后，離心該提取物，收集含核提取物的上清液。用Bradford方法測定蛋白含量。如果上清不是立即使用，將它們保存于-80℃。
實施例3NF-κB的電泳遷移率變化試驗NF-κB的活化通過前述電泳遷移率變化試驗(EMSA)進行分析(Chaturvedi等，1994)。簡言之，將從姜黃素處理或未處理細胞中制備的8μg核提取物用NF-κB寡核苷酸的32P末端標(biāo)記雙鏈45聚體37℃孵育15分鐘，該NF-kB寡核苷酸來自人免疫缺陷病毒-1的長末端重復(fù)(5’-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGA CTTTCCAGGGAGGCGTGG-3’，SEQ ID NO.4)，將DNA-蛋白復(fù)合體在6.6％天然聚丙烯酰胺凝膠上分離。用Phosphor Imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)顯示和定量干燥凝膠的放射性條帶，使用ImageQuant軟件。
實施例4NF-κB P65和STAT3的免疫細胞化學(xué)分析將未處理或處理的多發(fā)性骨髓瘤細胞用細胞離心涂片器4(Cytospin 4)(Thermoshendon，Pittsburg，PA)離心接種在聚-L-賴氨酸-包被的載玻片上，室溫空氣干燥1小時，冷丙酮固定。用PBS中短暫洗滌后，載玻片用5％正常山羊血清封閉1小時，然后用兔多克隆抗人NF-κB p65抗體(SC-109；稀釋度，1∶100)或抗人STAT3抗體(SC-482；稀釋度，1∶100)孵育。孵育過夜后，洗滌載玻片，然后用山羊抗兔IgG-Alexa 594(A-11037；稀釋度，1∶100)孵育1小時和用Hoechst(50ng/ml)復(fù)染核5分鐘。將染色的載玻片用封固劑(Sigma Co.)封固并在落射熒光顯微鏡(Labophot-2，Nikon，Tokyo，Japan)下分析。用PhotometricsCoolsnap CF彩色攝影機(Nikon，Lewisville，TX)和MetaMorph版本4.6.5軟件(Universal Imaging Corp.，Downingtown PA)捕捉圖片。分別計數(shù)具有NF-κBp65或STAT3核染色的細胞。各樣品計數(shù)100個細胞，根據(jù)4級給樣品評分-，無核陽性細胞(0％)；+，低數(shù)量的核陽性細胞(＜10％)；++，中等數(shù)量的核陽性細胞(10-50％)；+++，高數(shù)量的核陽性細胞(＞50％)。
實施例5蛋白質(zhì)印跡在10％SDS-PAGE凝膠上分離按所述制備(Chaturvedi等，2000)的30-50微克細胞質(zhì)蛋白提取物。電泳后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝化纖維膜上，用5％脫脂牛奶封閉，用抗IkBa、磷酸-IkBa、Bcl-2、Bcl-xL或細胞周期蛋白D1的抗體(1∶3000)探測1小時。之后，洗滌印跡，使其接觸HRP-偶聯(lián)二抗1小時，最后通過化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham Pharmacia Biotech.，Arlington Heights，IL)檢測。
對于PARP切割產(chǎn)物的檢測，全細胞提取物的制備通過用裂解緩沖液(20mMTris，pH7.4、250mM NaCl、2mM EDTA，pH8.0、0.1％Triton-X100、0.01mg/ml抑酶肽、0.005mg/ml亮抑酶肽、0.4mM PMSF和4mM NaVO4)裂解姜黃素處理的細胞。裂解物然后以14000rpm離心10分鐘去除不溶物質(zhì)，在7.5％凝膠上分離并用PARP抗體探測。將PARP從116-kDa的完整蛋白質(zhì)切割成85-kDa和40-kDa肽產(chǎn)物。為檢測胱冬酶原7和胱冬酶原9的切割產(chǎn)物，將全細胞提取物在10％凝膠上分離并用適當(dāng)?shù)目贵w探測。
實施例6IkB激酶試驗IkB激酶試驗用前述改良方法(Manna等，2000)進行。簡言之，取200μg細胞質(zhì)提取物用各1μg的抗IKKa和IKKb抗體作免疫沉淀，將如此形成的免疫復(fù)合物用0.01ml蛋白A/G-瓊脂糖珠沉淀2小時。先用裂解緩沖液洗滌珠，然后用激酶試驗緩沖液(50mM HEPES pH7.4、20mM MgCl2和2mM DTT)洗滌。接著測定該免疫復(fù)合物的激酶活性，采用的激酶試驗緩沖液含有20mCi[g-P32]ATP、10μM未標(biāo)記的ATP和2μg/樣品谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-IkBa(1-54)。30℃孵育30分鐘后，通過在6xSDS樣品緩沖液中煮沸該溶液來終止反應(yīng)。然后在12％SDS-PAGE上分離反應(yīng)混合物。用PhosphorImager觀察和定量干燥凝膠的放射性條帶。
為測定各樣品中的IKK復(fù)合物的總量，將60mg細胞質(zhì)蛋白在質(zhì)7.5％丙烯酰胺凝膠上分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝本纖維膜上。用5％脫脂牛乳蛋白質(zhì)封閉此膜1小時，然后用抗IKKα或抗IKKβ抗體孵育1小時。洗滌膜和用HRP-偶聯(lián)的第二抗小鼠IgG抗體處理，最后用化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham Pharmacia Biotech.，ArlingtonHeights，IL)檢測。
實施例7增殖試驗姜黃素對不同多發(fā)性骨髓瘤細胞系的抗增殖作用通過前述MTT染料吸收方法(Manna等，1998)測定。簡言之將細胞(5000/孔)在96孔板中作一式三份培養(yǎng)，存在或沒有所示測試樣品，終體積為0.1ml，37℃培養(yǎng)24小時。之后，條孔加入0.025ml MTT溶液(PBS配成5mg/ml)。37℃培養(yǎng)2小時后，加入0.1ml提取緩沖液(20％SDS、50％二甲基甲酰胺)。37℃連續(xù)培養(yǎng)過夜，然后測定590nm的OD，采用96孔多頭掃描儀自動讀數(shù)器(Dynatech MR 5000)，用取緩沖液作為空白。細胞活性百分比＝(實驗樣品的OD/對照OD)×100。
姜黃素的抗增殖作用也用胸苷摻入法監(jiān)測。將100微外培養(yǎng)液中含5000個細胞在96孔板中一式三份培養(yǎng)24小時，存在或沒有姜黃素。實驗完成前6小時，用0.5mCi3H-胸苷脈沖細胞，用Matrix-9600 b-計數(shù)器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)監(jiān)測3H-胸苷的摻入。
實施例8流式細胞計數(shù)分析為確定姜黃素對細胞周期的作用，用其處理多發(fā)性骨髓瘤細胞不同次數(shù)，洗滌，用70％乙醇固定。-20℃孵育過夜后，用PBS洗滌細胞，然后碘化丙錠(PI)染色，隨后懸浮于染色緩沖液(PI為10mg/ml；吐溫-20為0.5％；RNA酶用PBS配成0.1％)中。細胞用FACS Vantage流式細胞儀分析，流式細胞儀使用CellQuest獲得和分析程序(Becton Dickinson，San Jose，CA)。
實施例9IL-6蛋白的測定收集未處理或姜黃素處理的多發(fā)性骨髓瘤細胞培養(yǎng)物的上清涂并濃縮約20倍，采用裝有Biomax-10K NMWL膜的Ultrafree 4離心濾器(Millipore)。取出100微升等分樣品，用ELISA試劑盒(Biosource International)測定IL-6含量。
實施例10姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞表達組成型NF-κB首先通過電泳遷移率變化試驗(EMSA)研究了4種不同多發(fā)性骨髓瘤細胞系中的NF-κB狀況。圖1所示結(jié)果表明所有4種細胞系均表達組成型活化的NF-κB，分離為該圖上面和下面的條帶。隨后檢測完全抑制NF-κB所需的姜黃素劑量，研究了姜黃素對組成型活性NF-κB的作用。U266細胞用不同濃度的姜黃素處理4小時，然后用EMSA檢測NF-κB。光密度分析滯留的放射性同位素標(biāo)記探針，顯示NF-κB DNA結(jié)合活性降低。這些結(jié)果顯示50μM姜黃素足以完全抑制U266細胞中組成型NF-κB的活化(圖1A)。
隨后檢測抑制NF-κB所需的姜黃素最小接觸持續(xù)時間。多發(fā)性骨髓瘤細胞用50μM姜黃素孵育不同時間，然后制備核提取物并用EMSA檢測NF-κB。結(jié)果顯示姜黃素在所有4種細胞系中均下調(diào)了組成型NF-κB，但動力學(xué)不同。U266(圖1B)、MM.1(圖1C)和MM.1R(圖1D)細胞中NF-κB的完全下調(diào)發(fā)生于4小時內(nèi)，而在RPMI8226細胞(圖1E)中下調(diào)NF-κB需8小時。在大多數(shù)情況中，姜黃素下調(diào)的只是上面的NF-κB條帶，而不是下面的條帶。在RPMI8226細胞中，2條帶都下調(diào)。
由于NF-kB是一種蛋白家族，Rel/NF-kB蛋白的不同組合可能構(gòu)成能結(jié)合特異性DNA序列的活性NF-kB異二聚體。為顯示多發(fā)性骨髓瘤細胞中EMSA觀察到的滯留條帶確實是NF-Kb，將多發(fā)性骨髓瘤細胞的核提取物用抗NF-kB的p50(NF-kB1)或p65(RelA)亞基的抗體孵育二。條帶都移動到更高分子量(圖1F)，從而提示多發(fā)性骨髓瘤細胞中的主要NF-kB帶由p50和p65亞基組成。在一些多發(fā)性骨髓瘤細胞系中沒見到因抗體所移動的非特異性小條帶。免疫前血清或不相關(guān)抗體如抗細胞周期蛋白D1抗體都沒有任何效果。過量未標(biāo)記NF-kB(100倍)而不是突變寡核苷酸，可導(dǎo)致帶完全消失。
當(dāng)NF-κB時活化，含反式激活結(jié)構(gòu)域的NF-κB p65亞基轉(zhuǎn)位到核中。NF-κB的p65亞基以無活性狀態(tài)留在細胞質(zhì)中。隨后用免疫細胞化學(xué)證實了姜黃素能抑制p65的核滯留。將姜黃素處理和未處理細胞離心加在載玻片上，用抗p65抗體免疫染色，然后用上述Alexa-594偶聯(lián)二抗顯現(xiàn)。圖2的結(jié)果清楚地證明姜黃素在所有4種多發(fā)性骨髓瘤細胞系中防止了NF-κB的p65亞基轉(zhuǎn)位到核內(nèi)。這些細胞學(xué)發(fā)現(xiàn)與EMSA觀察到的NF-κB抑制相一致。
實施例11姜黃素抑制IκBα磷酸化和IκB激酶活化IκBα降解和隨后的NF-κB(p65:p50)釋放需要其ser 32和ser 36殘基預(yù)先磷酸化。因此，為研究姜黃素的抑制作用是否是通過改變IκBα磷酸化來介導(dǎo)，用姜黃素處理U266細胞，檢查它們蛋白提取物的磷酸-IκBα表達。圖3A的結(jié)果顯示未處理的U266細胞組成型表達了ser 32-磷酸化IκBα。姜黃素處理時，磷酸化的IκBα含量迅速減少。
IkBa磷酸化通過IκB激酶介導(dǎo)。體外激酶試驗采用未處理U266細胞的免疫沉淀的IκB激酶，以GST-IκBα作為底物，顯示組成型IκB激酶的活化，而在類似條件下，從姜黃素-處理細胞免疫沉淀的IκB激酶表現(xiàn)出激酶活性降低，與姜黃素處理的持續(xù)時間相對應(yīng)(圖3B；上面一排)。然而，免疫印跡分析未處理和姜黃素-處理細胞的細胞提取物顯示，IκB激酶亞基IKKα和IKKβ蛋白的水平無顯著變化(圖3B；中間和下面一排)。
已顯示IκB激酶受到一些上游激酶的調(diào)節(jié)。為確定姜黃素是否可作為IκB激酶活性的直接抑制劑，免疫沉淀未處理U266細胞中以IκB激酶，然后用不同濃度的姜黃素處理30分鐘。處理后，用GST-IκBα作為底物檢測樣品的IκB激酶活性。圖3C的結(jié)果(上面一排)顯示姜黃素以劑量依賴方式直接抑制了IκB激酶活性。這些結(jié)果提示姜黃素是IκB激酶的直接抑制劑。由于未用純化的IκB激酶，不能完全排除姜黃素抑制IκB激酶活化所需的上游激酶的可能性。
實施例12姜黃素下調(diào)NF-κB調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達由于IκBα、Bcl-2、Bcl-XL和細胞周期蛋白D1都顯示受NF-κB調(diào)節(jié)，用免疫印跡法檢測了姜黃素對這些基因產(chǎn)物表達的作用。如圖4所示，所有4種基因產(chǎn)物在U266細胞中均有表達。經(jīng)姜黃素處理的細胞以時間依賴方式下調(diào)了IκBα(圖4A)、Bcl-2(圖4B)、Bcl-XL(圖4C)和細胞周期蛋白D1(圖4E)的蛋白庫，盡管抑制動力學(xué)不同。在姜黃素處理的4小時內(nèi)細胞周期蛋白D1顯示最迅速和完全的損耗。Bcl-2也表現(xiàn)出完全下降，但在8小時到達最低水平。另一方面，IκBα和Bcl-XL僅顯示部分下降。
白介素-6是另一種受NF-κB調(diào)節(jié)的基因，顯示其作用是多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長因子。U-266細胞以時間依賴方式產(chǎn)生顯著量的IL-6蛋白，而用ELISA測定MM.1或RPMI 8226都不產(chǎn)生任何可檢測量的IL-6蛋白(圖4E)。如圖4E所示，姜黃素處理抑制了U266細胞產(chǎn)生IL-6。
實施例13姜黃素抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖由于NF-κB參與細胞存活和增殖，檢測了姜黃素對多發(fā)性骨髓瘤細胞系增殖的作用。U266、RPMI 8226、MM.1和MM.1R細胞在存在不同濃度姜黃素時培養(yǎng)，用臺盼藍染料排除方法檢測活細胞數(shù)。
圖5的結(jié)果顯示低至1μM的姜黃素濃度分別抑制了U266(A排)、RPMI 8226(B排)、MM.1(C排)和MM.1R(D排)細胞的生長達27％、23％、45％和51％。10μM姜黃素完全抑制了所有細胞系的生長。這些結(jié)果表明姜黃素能抑制所有測試的多發(fā)性骨髓瘤細胞系的增殖，包括抗地塞米松-誘導(dǎo)細胞凋亡的MM.1R。
也通過胸苷摻入U266細胞檢測了姜黃素的抗增殖作用。姜黃素以劑量依賴方式在24小時內(nèi)抑制胸苷的摻入(圖6A)。能顯示細胞線粒體活性的MTT試驗結(jié)果顯示24小時內(nèi)姜黃素以課題依賴方式抑制了U266細胞的線粒體活性且抑制(圖6B)。
實施例14姜黃素誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡研究了多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-κB抑制是否也能導(dǎo)致細胞凋亡。細胞凋亡的一個特點是胱冬酶活化。U266細胞用姜黃素處理不同時間，制備全細胞提取物并分析胱冬酶-9(一種上游胱冬酶)、胱冬酶-7(一種下游胱冬酶)和PARP的切割，PARP是胱冬酶-3、胱冬酶-6和-7的熟知底物。
姜黃素處理細胞提取物的免疫印跡分析清楚顯示胱冬酶-9(圖6C)和胱冬酶-7(圖6D)的時間依賴性活化，如47-kDa和35-kDa條帶分別消失所顯示的那樣。下游胱冬酶的激活導(dǎo)致118-kDa PARP蛋白切割成89-kDa片段，這是經(jīng)歷凋亡的細胞的另一特征(圖6E)，而未處理細胞不顯示任何PARP切割。采用只能識別切割的89-kDa PARP物質(zhì)的抗體也檢測到89-kDa片段量的增加(圖6E，下面一排)。綜合在一起，這些結(jié)果清楚地證明姜黃素能誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡。
實施例15姜黃素使細胞停滯在細胞周期的G1/S期細胞從細胞周期的G1期前進到S期(DNA合成)需要D型細胞周期蛋白。由于在姜黃素處理的多發(fā)性骨髓瘤細胞中觀察到細胞周期蛋白D1迅速下降，因而接著測定了姜黃素對U266細胞周期的作用。
地姜黃素處理細胞的DNA的流式細胞計數(shù)分析顯示用10μM姜黃素處理24小時內(nèi)，G1期細胞百分比顯著增加(從52％到70％)，而S期細胞百分比減少(從22％到9％)(圖7)。這些結(jié)果清楚地顯示姜黃素可誘導(dǎo)細胞的G1/S停滯。
實施例16NEMG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)肽抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的組成型NF-κB和增殖IKK由IKKα、IKKβ和IKKγ(也稱為NEMO)組成。已顯示NEMO的氨基末端a-螺旋區(qū)能與IKKα和IKKβ的C末端區(qū)相互作用。IKKα和IKKβ NEMO C末端的一個小肽顯示能阻斷此相互作用。為使NBD肽能透入細胞，將其與觸角足(cautennapedia)同源結(jié)構(gòu)域的一段小序列相偶聯(lián)。此肽顯示能特異性抑制NF-κB的活化。將沒有觸角足同源結(jié)構(gòu)域蛋白序列的肽用作對照。
上述結(jié)果顯示姜黃素抑制了組成型NF-κB，進而導(dǎo)致細胞增殖的抑制和細胞凋亡的誘導(dǎo)。這里采用HBD和對照肽確定了NF-κB抑制與增殖和細胞凋亡相關(guān)連。
如圖8A所示，用NEMO-對照肽處理U266細胞無效，而NBD肽以時間依賴方式抑制了組成型NF-κB，完全抑制發(fā)生于12小時內(nèi)。也通過免疫細胞化學(xué)單獨確定了多發(fā)性骨髓瘤細胞中的NF-κB活化抑制。結(jié)果表明NF-κB的p65亞基核庫減少(圖8B)。NBD肽對NF-κB的抑制也導(dǎo)致U266細胞增殖的抑制。NBD處理后24小時觀察到約32％的細胞生長受到抑制(圖8C)。因此這些結(jié)果表明NF-κB抑制在多發(fā)性骨髓瘤細胞中確實與抗增殖作用相關(guān)連。
實施例17姜黃素加增強了長春新堿的細胞毒作用由于NF-κB參與細胞的化療抗性，研究了姜黃素對化學(xué)敏感性的作用。選擇長春新堿，是因為它是用于治療多發(fā)性骨髓瘤的一種化學(xué)治療劑。在低濃度姜黃素(10μM)存在時用長春新堿處理U266細胞，24小時后減少了細胞活性(圖9)。單用最高濃度(50μM)的長春新堿殺傷U266細胞的效果最??；單用姜黃素可殺傷約35％的細胞；而2種試劑一起可殺傷65％的細胞。這些結(jié)果表明姜黃素可使多發(fā)性骨髓瘤細胞對長春新堿的細胞殺傷作用敏感。
實施例18NF-κB在多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞中組成型活化此實施例檢測在多發(fā)性骨髓瘤患者的新鮮細胞中NF-κB和STAT3是否組成型活化。表1描述這些患者的臨床特征。用正常受試者的PBMC作對照。
如下分離多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓CD138+細胞。CD138+抗原也稱為多配體聚糖-1(Syndecan-1)，在正常和惡性漿細胞上有利表達，但在循環(huán)B細胞、T細胞和單核細胞上無表達。采用抗CD138微珠(Miltenyi Biotec，Auburen，CA)陽性選擇多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中的CD138+細胞。從上髂嵴或胸骨中抽吸2-10ml骨髓樣品，用等體積HEPES-緩沖細胞培養(yǎng)液IMDM稀釋，添加有100U/ml濃度的肝素，溫和攪拌。為防止細胞聚集，將稀釋的骨髓懸浮于含100U脫氧核糖核酸酶(DNA酶)I/ml的IMDM中并室溫溫和振搖30分鐘。接著，將30ml稀釋的骨髓細胞懸浮液層疊在50ml錐形管中的20ml菲可帕克(Ficoll-Paque)上，400xg離心30分鐘分離單個核細胞(MNC)。然后，收集界面的MNC層，用含2mM EDTA的PBS300xg室溫離心10分鐘洗滌2次。
將MNC濃度調(diào)至107每80μl電泳緩沖液(PBS含有2mM EDTA加0.5mM BSA)。對于107MNC每80μl電泳緩沖液，加入20μl抗CD138微珠(Miltenyi Biotec，Auburen，CA)，將細胞懸浮液在4℃-8℃孵育15分鐘。細胞懸浮液隨后用1ml冷電泳緩沖液稀釋并以300xg 4℃離心10分鐘。棄上清，將細胞沉淀懸于1ml電泳緩沖液中，上樣到AutoMACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotec)的磁性柱上，此系統(tǒng)置于層流罩超凈臺中。
通過陽性選擇分離抗CD138+細胞。測定分離的CD138+漿細胞群的純度，這是通過10μl偶聯(lián)了藻紅蛋白(PE)的抗CD138抗體處理105個CD138+細胞并在冰箱中6-12℃暗處孵育。細胞用冷PBS洗滌2次，1％多聚甲醛固定，用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析。
首先檢測了各種多發(fā)性骨髓瘤細胞系的NF-κB狀態(tài)。圖10a表明所有多發(fā)性骨髓瘤細胞系表達了NF-κB的核形式，說明多發(fā)性骨髓瘤細胞系表達NF-κB的組成型活化形式。PBMC(對照)表達了NF-κB的細胞質(zhì)(失活)形式(圖10B，上面一排)?；颊?1的多發(fā)性骨髓瘤細胞像多發(fā)性骨髓瘤細胞系，僅表達NF-κB的核形式(圖10B，下面一排)。
隨后用上述方法檢測了22位不同多發(fā)性骨髓瘤患者樣品的NF-κB活化。所有22個病人顯示核中有NF-κB蛋白(p65)表達，表明其組成型活化(圖11)。然而，活化程度相當(dāng)不同3位病人顯示低表達組成型NF-κB，5位顯示中等表達，14位顯示高表達。
NF-κB的組成型活化通過電泳遷移率變化試驗獨立得到證實。如圖11B所示，KBM-5中的對照NF-κB受到TNF的激活，KBM-5是一種無組成型NF-κB的骨髓細胞系。類似的，NF-κB活化也見于患者#4的樣品，免疫細胞化學(xué)顯示該患者有組成型NF-κB活化(圖11B)。
表1多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床特征患者年齡 MMHgbWBC血小板％漿細血清病變尿病變位置編號性別 類型(1000) 胞 蛋白(gm)蛋白(gm)1 67MIgG 10.3 4.2203 44 6.4 0.6 骨(擴散)2 40FIgG 8.65.049 90 9.3 3.4 (-)骨測量3 57FIgG 10.2 5.3217 90 6.7 4.25 骨(擴散)4 50MIgA 11.1 4.9184 40 5.7 0 骨(擴散)5 52MIgG 12.1 2.9257 35 4.4 0.12 (-)骨測量6 56FIgG 84.0 33 96 8.4 1.68(-) 骨測量7 63FIgG 10 5.5336 45 9.9 0.36 (-)骨測量8 63MIgG 12.3 4.6151 18 (-) 0.02 骨(擴散)9 64MIgG 10.5 4.2219 50 3.5 0.01 T11，鎖骨10 35FIgA 9.12.685 7 1.5 0.21 (-)骨測量11 52MIgA 10.4 3.354 66 0.8 17(-)骨測量12 45MIgG 10.2 11.8 338 63 0.1 4.273 骨(擴散)13 54MIgG 14.1 4.5262 14 4.7 0 (-)骨測量14 66MIgA 10.2 5.9154 60 3.4 0.1 骨(擴散)15 50FIgG 11.9 7.1364 18 3.7 0 骨(擴散)16 40FIgG 10.3 6.2335 60 (-) 0 頭骨，頂端17 58MIgA 13.9 5.1205 20 4.3 0 (-)骨測量18 67MIgG 8.98.852 25 0.4 3.9 (-)骨測量19 56MIgG 13.3 7.8233 22 4.6 0.02 肋骨20 65MIgG 13.3 4.8227 40 2.8 0.32 C221 57MIgA 6.09.6219 68 3.1 4.8 (-)骨測量22 67FIgG 12.8 5.0249 14 1.6 0 (-)骨測量MM，多發(fā)性骨髓瘤；Hgb，血色素；WBC，白細胞實施例19STAT3在多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞中組成型活化僅U266細胞在核中表達STAT3(圖12A)，提示U266細胞表達STAT3的組成型活化形式。正常受試者的PBMC表達STAT3的細胞質(zhì)(失活)形式(圖12B，上面一排)。患者#1的多發(fā)性骨髓瘤細胞同樣表達STAT3的核形式。這提示此患者的新鮮細胞表達STAT3的組成型活化形式(圖12B，下面一排)。
檢測了22位不同多發(fā)性骨髓瘤患者CD138+細胞的STAT3活化。不像NF-κB，不是所有22位病人都顯示核中有STAT3蛋白表達(圖12C)。核STAT3含量也不同.1位病人沒有組成型STAT3活化的表達，3位有低表達，5位有中等表達，14位病人顯示高表達。
實施例20姜黃素下調(diào)多發(fā)性骨髓瘤患者CD138+細胞中的組成型NF-κB和STAT3活化上述結(jié)果表明大部分多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞表達組成型活化的NF-κB和STAT3。此實施例研究了姜黃素是否能抑制多發(fā)性骨髓瘤患者新鮮細胞中NF-κB和STAT3的組成型活化。為確定這一點，使多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞接觸50μM姜黃素2小時，然后檢測STAT3和NF-κB表達。
圖13A說明NF-κB在患者#5、#9和#10(僅測試病人)中組成型活化，并且接觸姜黃素下調(diào)了NF-κB。圖13B的結(jié)果表明STAT3同樣在患者#5、#9和#10中組成型活化，并且接觸姜黃素下調(diào)了此轉(zhuǎn)錄因子。
實施例21姜黃素下調(diào)多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞存活由于NF-κB和STAT3活化參與細胞存活并且姜黃素下調(diào)了多發(fā)性骨髓瘤患者的CD138+細胞中的這些轉(zhuǎn)錄因子，故有興趣研究此種下調(diào)是否可導(dǎo)致細胞活性的降低。使細胞接觸不同濃度的姜黃素，隨后用MTT方法檢測細胞活性。如圖14所示，姜黃素處理U266細胞或患者#7、#9和#10的新鮮細胞可以劑量依賴方式減少細胞存活。圖14B的結(jié)果表明STAT3也在患者#5、#9和#10中組成型活化并且接觸于姜黃素下調(diào)了此轉(zhuǎn)錄因子。這些結(jié)果提示NF-κB和STAT3的組成型活化是多發(fā)性骨髓瘤患者CD138+細胞的細胞存活因素。
實施例22地塞米松下調(diào)多發(fā)性骨髓瘤患者CD138+細胞中的組成型NF-κB和STAT3活化目前，地塞米松用作多發(fā)性骨髓瘤患者的標(biāo)準(zhǔn)療法。研究了地塞米松是否也影響多發(fā)性骨髓瘤患者細胞中的NF-κB和STAT3。圖15的結(jié)果說明地塞米松下調(diào)了患者#20CD138+細胞中的NF-κB(圖15A)和STAT3(圖15B)的組成型活化。然而，地塞米松下調(diào)二轉(zhuǎn)錄因子的效果低于姜黃素。
地塞米松也影響多發(fā)性骨髓瘤患者的細胞存活。圖16A的結(jié)果表明地塞米松減少了患者#20的細胞存活。然而，地塞米松效果比姜黃素低得多(圖16B)。
以前曾報導(dǎo)地塞米松能抑制NF-κB活化。本研究第1個顯示了地塞米松對STAT3的作用。姜黃素比地塞米松更有效地抑制了多發(fā)性骨髓瘤細胞的存活(圖16)。由于已確定姜黃素的藥理學(xué)安全性和其能夠下調(diào)大量參與細胞存活和化療抗性的基因表達，故有足夠理由聯(lián)用姜黃素和地塞米松來治療多發(fā)性骨髓瘤患者。近來已批準(zhǔn)用蛋白體抑制劑(PS341，稱為Velcade)和TNF生成抑制劑(鎮(zhèn)靜劑)治療多發(fā)性骨髓瘤患者。這些抑制劑也都顯示能抑制NF-κB活化。本文所提供的結(jié)果提示NF-κB和STAT3是開發(fā)治療多發(fā)性骨髓瘤藥物的理想靶標(biāo)。
本文引用了下列參考文獻Bharti等，姜黃素(diferuloylmethane)下調(diào)人多發(fā)性骨髓病細胞中的核因子-kB和IKBa激酶的組成型活化，導(dǎo)致抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡Blood 1011053(2003)。
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此說明書中提到的任何專利或出版物表明了本發(fā)明涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。此外，這些專利和出版物以相同程度納入本文作參考就好像各單獨出版物具體和單獨所表明那樣納入本文供參考。
序列表<110>B.艾加瓦爾(Aggarwal，Bharat)<120>用姜黃素治療人多發(fā)性骨髓瘤<130>D6467PCT<140>
<141>2003-06-24<150>US 60/390,926<151>2002-06-24<160>4<210>1<211>9<212>DNA<213>未知<220>
<221>protein-bind<223>結(jié)合NfkB p50-p65異源雙體的同義DNA序列<400>1gggactttc<210>2<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>peptide<223>細胞可滲透的NEMO(NF-κB必需調(diào)制蛋白；也稱為IKKy)-結(jié)合域肽<400>2Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp5 10 15Lys Lys Thr Ala Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu20 25<210>3<211>17<212>PRT<213>未知<220>
<221>peptide<223>細胞可滲透的NEMO的對照肽
<400>3Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp5 10 15Lys Lys<210>4<211>45<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒-1<220>
<221>gene<223>來自人免疫缺陷病毒-1長末端重復(fù)的NF-_B寡核苷酸<400>4ttgttacaag ggactttccg ctggggactt tccagggagg cgtgg 4權(quán)利要求
1.一種抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟使所述細胞接觸姜黃素，其中所述姜黃素能抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖。
2.一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟使所述細胞接觸姜黃素，其中所述姜黃素誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡。
3.一種提高化學(xué)治療劑抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟使所述細胞接觸化學(xué)治療劑和姜黃素，其中所述姜黃素能提高所述化學(xué)治療劑抗多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)治療劑選自長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素、強的松和地塞米松。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多發(fā)性骨髓瘤細胞是CD138+漿細胞。
6.一種治療個體中多發(fā)性骨髓瘤的方法，其特征在于，所述方法包括給予所述個體姜黃素的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述姜黃素口服給藥。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述姜黃素給藥劑量從約0.01mg/kg個體體重到約500mg/kg個體體重。
9.一種提高化學(xué)治療劑抗個體多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟給予所述個體所述化學(xué)治療劑和姜黃素，其中所述姜黃素能提高所述化學(xué)治療劑抗所述個體多發(fā)性骨髓瘤細胞的細胞毒作用。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)治療劑選自長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素、強的松和地塞米松。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述姜黃素口服給藥。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述姜黃素給藥劑量從約0.01mg/kg個體體重到約500mg/kg個體體重。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述多發(fā)性骨髓瘤細胞是CD138+漿細胞。
全文摘要
所有檢測的多發(fā)性骨髓瘤細胞系均顯示組成型活化的I
文檔編號A61K31/56GK1674917SQ03819713
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月24日
發(fā)明者B·艾加瓦爾 申請人:研究發(fā)展基金會