專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)的siRNA重組慢病毒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物醫(yī)藥及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用慢病毒 (Retrovirus)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)的慢病 毒干擾體系(Retro-Heph)，及在制備鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNAi指的是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生 降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。2001年，Tuschl等將短的siRNA導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并由此解決了在哺乳細(xì)胞 內(nèi)導(dǎo)入長(zhǎng)的雙鏈RNA時(shí)引發(fā)的干擾素效應(yīng)，由此拓展了 RNAi在基因治療上應(yīng)用前景。RNAi 機(jī)制普遍存在于生物中，因此被認(rèn)為是進(jìn)化上相對(duì)保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。一種假說(shuō) 為，RNAi機(jī)制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機(jī)制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機(jī) 制中的相關(guān)一些因子如內(nèi)源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào) 控，其范圍已經(jīng)超越了 PTGS (post transcriptional gene silencing)，如 RNAi 機(jī)制同樣 參與了轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中。由外界導(dǎo)入的長(zhǎng)的雙鏈RNA首先被稱(chēng)作Dicer 并具有RNaselll活性的RNA酶切割成21 23堿基對(duì)的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱(chēng)作 small interferingRNAkiRNA)，其特征是3'端相對(duì)于互補(bǔ)鏈突出兩個(gè)堿基。完成上述過(guò) 程后，siRNA上結(jié)合RNAi蛋白因子，并形成稱(chēng)為RISC(RNA_induced silencingcomplex)的 RNA-蛋白復(fù)合物。在RISC復(fù)合物中，siRNA依賴(lài)于ATP/或ATP非依賴(lài)性的轉(zhuǎn)換為單鏈，進(jìn) 而RISC被活化?；罨蚏ISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)(guide strand)，序列特異性地結(jié) 合在標(biāo)靶mRNA上并切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡(jiǎn)單性，所以是基因功能研究的重要工具。 大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能 丟失(L0F)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(G0F)方法更具優(yōu)勢(shì)。因此，RNAi在今天的制藥 產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個(gè)重要工具。同時(shí)，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA 本身還可以被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為RNAi藥物。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被 用于臨床測(cè)試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。然而RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)以及表達(dá)效率等重要問(wèn)題阻礙了 RNA干擾技術(shù)運(yùn)用 于臨床治療，要將RNA干擾用于基因治療，必須解決其靶向性、安全性以及表達(dá)持續(xù)性的問(wèn) 題。shRNA 即短發(fā)夾 RNA (short hairpin RNA)。在 RNAi 感染過(guò)程中，產(chǎn)生 dsRNA 的一 個(gè)有效方法就是在體內(nèi)表達(dá)一個(gè)短發(fā)夾RNA，這種shRNA包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列(其中一 個(gè)與目的基因互補(bǔ))，中間由一個(gè)loop序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工 成siRNA，從而降解目的基因抑制其表達(dá)。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)介紹
早在1962年，Grewal等就在放射誘導(dǎo)的突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了一種新型的遺傳性小 細(xì)胞低色素性貧血。由于其與X染色體相關(guān)，這種小鼠被稱(chēng)為sla(伴性貧血)小鼠。Vulpe 等(1999)通過(guò)基因譜研究，證實(shí)了 sla小鼠X染色體上缺陷基因的存在。此基因被命名為 Hephaestin (HP或Heph)，取自希臘神話中的金屬工藝之神H印haestus。Heph 的分布HP在體內(nèi)的分布與鐵的吸收相關(guān)。免疫雜交技術(shù)和Westen印跡法、Northern印 跡法顯示在成年小鼠體內(nèi)HP蛋白及mRNA在整段小腸及結(jié)腸內(nèi)高表達(dá)，在腎、肺、皮膚、肝、 胎盤(pán)及其他組織中也有表達(dá)。原位雜交技術(shù)顯示在HP基因高表達(dá)的小腸區(qū)，絨毛處信號(hào)極 強(qiáng)，而隱窩處幾乎沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。這與鐵在小腸絨毛處的吸收相一致。但HP在結(jié)腸高表達(dá)， 而后者在鐵吸收過(guò)程中的作用甚微。在腸上皮細(xì)胞中，HP蛋白定位于基側(cè)膜，同時(shí)存在于 細(xì)胞內(nèi)的核周區(qū)；在培養(yǎng)的大鼠小腸細(xì)胞系IEC26中，HP蛋白主要分布于核周區(qū)，在細(xì)胞漿 中也有少量存在。H印h的功能HP作為亞鐵氧化酶的直接證據(jù)來(lái)自于對(duì)酵母菌的研究。研究證明，F(xiàn)et3p (外膜上 的亞鐵氧化酶)與Ftrlp (鐵透性酶)聯(lián)合作用，參與三價(jià)鐵的吸收過(guò)程。Fet3基因缺陷的 酵母菌會(huì)出現(xiàn)鐵缺乏，且不能在低鐵培養(yǎng)基上生存，但外源性表達(dá)的HP即可部分糾正酵母 菌的缺鐵狀態(tài)。以上說(shuō)明，HP可能與Fet3p相似，通過(guò)與一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)體共同作用來(lái)參與鐵 的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，HP只有一個(gè)跨膜區(qū)域，它不可能同時(shí)是一種跨膜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)鐵的 轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，也要求其必須與某種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)同作用使鐵穿過(guò)細(xì)胞膜。目前認(rèn)為這種轉(zhuǎn)運(yùn)體 為Ferroportinl (FP1)，又稱(chēng)Iregl、Mtpl。FP1在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)存在的肝、脾、胎盤(pán)等 組織表達(dá)，提示其與鐵的釋放相關(guān)。與HP相似，F(xiàn)P1基因在近端小腸內(nèi)高表達(dá)，且僅在成熟 的腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，免疫組化技術(shù)顯示FP1蛋白主要定位于細(xì)胞的基側(cè)膜，細(xì)胞內(nèi)也 有少量存在。FP1與HP共同分布于近端小腸，提示HP與FP1在腸上皮細(xì)胞中協(xié)同作用于鐵 的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。HP在細(xì)胞內(nèi)的分布，提示其可能在細(xì)胞內(nèi)參與鐵的氧化過(guò)程。如二價(jià)鐵離子 需要被氧化成三價(jià)，才能與鐵的主要儲(chǔ)存部位即鐵蛋白結(jié)合。此外，螯合三價(jià)鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白 在細(xì)胞內(nèi)的生理作用也可能需要HP的鐵氧化作用。由于HP基因在整段小腸和結(jié)腸中高表 達(dá)，而遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸并不是鐵吸收的主要部位，這就提示了 HP的其他功能或在遠(yuǎn)端腸道 補(bǔ)吸收鐵的功能。H印h對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的調(diào)節(jié)HP作為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，其表達(dá)首先受機(jī)體鐵需求量的調(diào)節(jié)。鐵在體內(nèi)的濃度主 要受鐵儲(chǔ)存量和紅細(xì)胞生成速率的影響。腸上皮細(xì)胞鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)量與整體鐵需求量成正相 關(guān)。當(dāng)機(jī)體缺鐵、溶血和缺氧時(shí)都可刺激鐵的吸收。研究表明，整體鐵水平信號(hào)先作用于隱 窩上皮細(xì)胞，在其分化為成熟腸上皮細(xì)胞并移至絨毛頂端后，細(xì)胞對(duì)該信號(hào)做出應(yīng)答，使基 側(cè)緣鐵轉(zhuǎn)出蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，從而影響到成熟腸上皮細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，最終決定了 刷狀緣DMT1等轉(zhuǎn)入蛋白上調(diào)或下調(diào)鐵的吸收。在鐵的吸收過(guò)程中，由于基側(cè)緣轉(zhuǎn)運(yùn)的鐵不 可能比刷狀緣吸收的鐵多，故目前認(rèn)為，基側(cè)緣鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)是鐵吸收過(guò)程的限速步驟。在小 腸，HP的最大調(diào)節(jié)限度是正常狀態(tài)下的2倍，F(xiàn)P1的調(diào)節(jié)范圍約3 5倍，而DMT1的調(diào)節(jié)能 力則要大得多。刷狀緣鐵轉(zhuǎn)運(yùn)成分對(duì)鐵濃度變化敏感而迅速的反應(yīng)，可以使基側(cè)緣轉(zhuǎn)運(yùn)分 子轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的速度恒定，從而保證機(jī)體對(duì)鐵的需求。所以整體鐵信號(hào)主要通過(guò)基側(cè)緣的轉(zhuǎn)運(yùn)成分HP和FP1起調(diào)節(jié)作用。在缺鐵的病人及動(dòng)物模型中，十二指腸的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)成分如Dcytb、 DMTUFP1及HP的表達(dá)都增高，從而保證鐵的吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題即RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)以及表達(dá) 效率等重要問(wèn)題，提供一種能夠有效抑制體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)、從而調(diào) 節(jié)體內(nèi)鐵水平的小干擾性RNA(siRNA)。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼含有上述小干擾性RNA的shRNA(短發(fā)夾RNA)的 DNA。本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的靶向性、安全性以及持續(xù)表達(dá)上述shRNA 并進(jìn)而抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達(dá)的重組慢病毒。本發(fā)明的再一目的在于提供上述小干擾性RNA、DNA以及重組慢病毒在制備藥物 方面的應(yīng)用。用途和藥物為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達(dá)的小干擾性 RNA(siRNA)，所述小干擾性RNA與人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補(bǔ)，其長(zhǎng)度為 19-27bp。 優(yōu)選地，所述小干擾性RNA含有以下序列Seq ID No. 1 :5，-AGGGGTGGATAAAGAATTC-3，本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種編碼含有上述小干擾性RNA的正義鏈及反義鏈的shRNA 的 DNA。優(yōu)選地，所述DNA還含有啟動(dòng)子及PolyA終止信息序列，啟動(dòng)子優(yōu)選為HI啟動(dòng)子。本發(fā)明還公開(kāi)了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達(dá)的重組慢病 毒，所述重組慢病毒含有上述DNA以及慢病毒載體。優(yōu)選地，所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了上述小干擾性RNA、上述DNA以及上述重組慢病毒在制備用 于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。所述鐵代謝紊亂疾病如老年性癡呆、帕金森綜合癥、神經(jīng)退行性疾病等。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內(nèi)人膜 鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)、抑制鐵的吸收與代謝，并降低體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到 治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。 特別地，本發(fā)明的重組慢病毒通過(guò)選擇第三代慢病毒載體——自身滅活慢病毒載 體(SIN)，大大的提高了載體的安全性以及靶向性。慢病毒載體可以選擇性插入染色體中， 不會(huì)出現(xiàn)插入失活的情況。慢病毒攜帶shRNA進(jìn)入靶細(xì)胞，可以整合入細(xì)胞的基因組，持續(xù) 長(zhǎng)期的表達(dá)相關(guān)shRNA，而不會(huì)引起對(duì)細(xì)胞的毒害作用。本發(fā)明的慢病毒干擾體系具有優(yōu)良 的靶向性、安全性以及表達(dá)持續(xù)性，降低血清鐵的濃度，并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)任何毒副作用。 通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，均證明本發(fā)明的慢病毒干擾體系能有效的調(diào)節(jié)鐵在體內(nèi)的代謝與吸收。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的shRNA經(jīng)過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明，能有效的抑制HEPH表達(dá)量的95%以上，有效的調(diào)節(jié)血清鐵的水平。


圖1是Retro-HEPHi系統(tǒng)構(gòu)建流程圖；圖2是Retro-HEPHi系統(tǒng)感染體細(xì)胞后，HEPH蛋白的表達(dá)情況圖；圖3是通過(guò)高鐵飼料飼養(yǎng)SD大鼠，構(gòu)建高血清鐵動(dòng)物模型，然后利用 Retrovirus-HEPHi系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，降低血清鐵水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用鐵代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，有針對(duì)性的調(diào)節(jié)HEPH的表達(dá)，設(shè)計(jì)特定 的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而降低血清鐵對(duì)細(xì)胞的損害。本發(fā)明的小干擾 性RNA以及shRNA所編碼的DNA，能特異性的識(shí)別序列AGGGGTGGATAAAGAATTC，該序列位于 HEPH(AJ296162)第 2379-2397 堿基處。要將RNA干擾技術(shù)運(yùn)用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)以及表達(dá) 效率等重要問(wèn)題。我們利用失活慢病毒載體攜帶RNA干擾片段的DNA模板，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄 成shRNA，完美的解決了 RNA干擾基因治療的靶向性、安全性以及表達(dá)持續(xù)性的問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)合成干擾片段，將片段連接至慢病毒載體當(dāng)中。轉(zhuǎn)染重組體入Phoenix 細(xì)胞，獲取病毒上清，體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明能夠有效抑制HEPH。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，構(gòu)建了人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)的慢 病毒干擾體系(Retro-HEPHi)，并取得了良好的抑制效果。下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1根據(jù)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)序列(匪000617. 2)，設(shè)計(jì)模板鏈與編 碼鏈。分別與5’端加上Bglll與Xhol酶切位點(diǎn)，送Invitrogen公司合成序列。經(jīng)過(guò)篩選， 獲得干擾效果最為顯著的本發(fā)明的HEPH干擾片斷序列如下優(yōu)選的實(shí)施例模板鏈(SeqID No. 2)5’ -GATCCCCAGGGGTGGATAAAGAATTCTTCAAGAGAGAATTCTTTATCCACCCCTTTTTTTA-3’編碼鏈(SeqID No. 3)5’ -AGCTTAAAAA AGGGGTGGATAAAGAATTC TCTCTTGAAATTCTTTATCCACCCCT GGGG-3，Retro-HEPHi 系統(tǒng)構(gòu)建將合成的HEPH干擾片段(Seq ID No. 2及Seq ID No. 3)進(jìn)行退火。具體步驟如下1.建立退火系統(tǒng)5ul 10x 退火 buffer2nmole 模板鏈 Seq ID No. 32hmole 編碼鏈 Seq ID No. 4用三蒸水補(bǔ)足至50ul。2.放入 PCR 儀，95 °C 5 分鐘，75 °C 5 分鐘，55 °C 5 分鐘，42 °C 5 分鐘，37 °C 15 分鐘，
之后逐步遞減溫度至室溫。
3.制12% lx TAE聚丙烯酰胺膠，取10ul上述退火產(chǎn)物跑膠200Vlh。銀染觀察退 火條帶。置于-80°C保存退火產(chǎn)物。酶切(Xbal與Xhol)慢病毒載體，膠純化回收后，用T4連接酶與退火產(chǎn)物室溫 連接24小時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選之后，獲得正確克隆。送Irwitrogen公司測(cè)序鑒定，命名為 Retro-HEPHi系統(tǒng)。具體操作步驟如下1.構(gòu)建質(zhì)粒酶切體系Bgl II10UXho I10UlOx Buffer5ulBSA0. 5ulRetro 質(zhì)粒lOul用水補(bǔ)足50ul，37°C，2h。3.利用試劑盒(invitrogen)膠純化上述酶切產(chǎn)物。4.構(gòu)建連接系統(tǒng)10x Buffer2ulT4 連接酶lulRetro 酶切產(chǎn)物 lul退火產(chǎn)物5ul用水補(bǔ)足20ul，16°C，16h。4.取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。5.挑取陽(yáng)性克隆，小量擴(kuò)增質(zhì)粒。6.用EcoR I與Xho I酶切鑒定質(zhì)粒，選擇陽(yáng)性結(jié)果質(zhì)粒，測(cè)序保存。重組慢病毒Retro-HEPHi的生產(chǎn)流程1、接種 Phoenix 細(xì)胞 1. 5X107 個(gè)細(xì)胞于 9cm 培養(yǎng)皿(Corning)中，37°C，5% C02 培 養(yǎng)過(guò)夜；2、轉(zhuǎn)染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；3、取20ul上述Retro-HEPHi與DMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標(biāo)記為A管，另取20ul 脂質(zhì)體與500ul DMEM培養(yǎng)基混勻，標(biāo)記為B管。將A管與B管混勻，室溫放置30min，將混 合物輕輕加入第1步中的9cm培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜；5、24小時(shí)后加7. 5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；6、收集細(xì)胞上清并用0.45um濾器過(guò)濾，細(xì)胞可以擴(kuò)大培養(yǎng)，持續(xù)收取病毒上清。7、測(cè)定病毒上清滴度，用PH8. OTris-HCl調(diào)整細(xì)胞滴度至1000VP/ml。8、包裝入2ml西林瓶中(每瓶含1ml)，保存于_80°C。9、對(duì)病毒進(jìn)行熱源檢測(cè)、微生物檢測(cè)，確保無(wú)熱源，無(wú)細(xì)菌、真菌、野生病毒污染。Retro-HEPHi系統(tǒng)構(gòu)建流程如圖1所示。重組慢病毒Retro-HEPHi體外實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔1X106個(gè)。取Retro-HEPHi慢病毒液， 按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混 勻，以充分感染細(xì)胞株，分別處理0h、6h、12h、24h、48h，收集細(xì)胞，利用real-time PCR技術(shù)
7進(jìn)行定量測(cè)定HEPH mRNA表達(dá)情況，以O(shè)h為對(duì)照組，可見(jiàn)HEPH的表達(dá)在12h之后受到明顯 的抑制。如圖2。重組慢病毒Retro-HEPHi體外鐵釋放實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇神經(jīng)元細(xì)胞株P(guān)12，接種于6孔板，每孔1X106個(gè)。將細(xì)胞分成兩組，一組加 PBS，一組加PLT-HEPHi慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加 入P12細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細(xì)胞株。按照0h、12h、24h、48h的時(shí)間點(diǎn) 進(jìn)行Fe55同位素釋放實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)后，鐵的釋放開(kāi)始受到抑制，48小時(shí)后出現(xiàn)明顯 抑制。如圖3.以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。能夠與HEPH的mRNA反向互補(bǔ)的所有其他19-27個(gè)堿基序列的小干擾性RNA、編 碼此類(lèi)小干擾性RNA的相應(yīng)shRNA的DNA模板、以及含有這些DNA模板的重組慢病毒也同 樣可以實(shí)施到本發(fā)明中。
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權(quán)利要求
一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)的小干擾性RNA，其特征在于所述小干擾性RNA與人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補(bǔ)，其長(zhǎng)度為19-27bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)的小干擾性RNA， 其特征在于所述小干擾性RNA含有以下序列Seq ID No. 1 :5’ -AGGGGTGGATAAAGAATTC-3，。
3.一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述shRNA是含有權(quán)利要求1或2所述的小干 擾性RNA的正義鏈或反義鏈的shRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述DNA含有序列表中 Seq ID No. 3和/或Seq ID No. 4所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述DNA還含有HI啟 動(dòng)子及PolyA終止信息序列。
6.一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)的重組慢病毒，其特征在于所述重組 慢病毒含有權(quán)利要求3 5中任意一項(xiàng)所述的DNA以及慢病毒載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因表達(dá)的重組慢病毒， 其特征在于所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。
8.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的小干擾性RNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求6或7中任意一項(xiàng)所述的重組慢病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應(yīng)用。
11.一種藥物組合物，包括具有權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的編碼shRNA的DNA。
12.—種藥物組合物，包括具有權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的編碼shRNA的DNA。
13.一種藥物組合物，包括具有權(quán)利要求6或7中任一項(xiàng)所述的一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白輔助蛋白基因表達(dá)的重組慢病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達(dá)的小干擾性RNA，所述小干擾性RNA與人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補(bǔ)，長(zhǎng)度為19-27bp。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了編碼所述小干擾性RNA的相應(yīng)shRNA的DNA序列以及能表達(dá)所述shRNA的重組慢病毒。本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白表達(dá)、抑制鐵的釋放與代謝，調(diào)節(jié)體內(nèi)的血清鐵水平，從而達(dá)到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101875931SQ20091010700
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者柯亞, 葛嘯虎, 錢(qián)忠明 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)深圳研究院