專利名稱：γ－氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑在制備治療酒精成癮和濫用藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明述及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地講是γ-氨基丁酸(GABA)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑在制備治療酒精成癮和濫用藥物中的應(yīng)用雖然對酒精的神經(jīng)藥理學(xué)作用還未有透徹地了解，但是近年的科學(xué)研究加快了這一進(jìn)程。例如酒精戒斷后重燃的渴望可能由γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸的受體介導(dǎo)[Gonzalez L.P.et al.，Alcohol Clin Exp Res，2001，25(5Suppl ISBRA)197S-201S]，酒精成癮的記憶可能由多巴胺、鴉片和谷氨酸系統(tǒng)介導(dǎo)，壓力誘導(dǎo)對酒精的渴望可能由5-羥色胺系統(tǒng)介導(dǎo)，或和其它機(jī)制協(xié)同作用。因而治療酒精的成癮性可通過不同的途徑達(dá)到。
到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一些藥物可以用來治療酒精的成癮性。主要有以下三類第一種是戒酒硫(disulfiram)，它在40年前就已被獲準(zhǔn)在臨床上使用。它的作用機(jī)制是阻斷酒精代謝產(chǎn)物乙醛的進(jìn)一步代謝，從而導(dǎo)致乙醛在體內(nèi)的積累。這種積累會引起皮膚發(fā)紅、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，因而在臨床上的應(yīng)用受到很大的限制。此外，也有研究表明戒酒硫的療效并不比安慰劑好[Fuller R.K.et al.，JAMA，1986，2561449-1455]。第二類是鴉片受體拮抗劑，其中臨床上應(yīng)用最多的是納曲酮(naltrexone)。1995年它被美國FDA批準(zhǔn)用于治療酒精的成癮性，但是它的療效同樣受到質(zhì)疑，因?yàn)橛行┭芯拷Y(jié)果表明納曲酮并不能治療嚴(yán)重的酒精長期成癮性[Krystal J.H.et al.，N Engl J Med，2001，345(24)1734-1739；Kranzler H.R.et al.，Neuropsychopharmacology，2000，22493-503]。納曲酮也有一些副作用，如惡心、腹痛、頭痛等。此外，由于納曲酮是鴉片受體的拮抗劑，因此在使用納曲酮時(shí)，鴉片類藥物如嗎啡的鎮(zhèn)痛療效就會受到影響，這對嚴(yán)重急性疼痛發(fā)作時(shí)的病人會產(chǎn)生麻煩。第三種是acamprosate，它是?；撬岬难苌?，主要作用于腦中的谷氨酸受體，調(diào)節(jié)谷氨酸信號的傳遞，對于它的療效還需作進(jìn)一步的研究。
綜上所述，酒精的成癮性與濫用是一種重大的社會問題，人們一直在努力尋找治療酒精的成癮與濫用的藥物，但遺憾的是迄今為止尚未有療效很理想的藥物。
GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)功能是通過攝取神經(jīng)突觸間隙的GABA神經(jīng)遞質(zhì)來終止其神經(jīng)抑制信息傳遞，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞的強(qiáng)度和時(shí)效性。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞型I(GAT1)是GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(GAT1、GAT2、GAT3、GAT4)中最重要的一種[Radian R.et al.，J Neurosci，1990，101319-1330]。具有專一性抑制功能的化合物已有報(bào)道，主要是3-哌啶甲酸和四氫煙酸及以這兩種化合物為母核的很多衍生物。除此以外還有很多化合物是GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，如高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇及其衍生物等等，有關(guān)這些化合物的合成及作為抑制劑的研究參見文獻(xiàn)[Andersen K.E.，et al.，J.Med.Chem.，2001，442152-2163；Krogsgaard-Larsen P.，et al.，Current Pharmaceutical Design，2000，61193-1209]。本發(fā)明揭示了γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對治療酒精的成癮和濫用具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明找到上述這類具有抑制功能的化合物能使機(jī)體降低酒精攝入量，從而達(dá)到治療酒精的成癮和濫用的良好效果。這類化合物的作用機(jī)理是抑制GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，使得機(jī)體對酒精很敏感，因而機(jī)體就會降低對酒精的攝入量，從而避免過度地飲酒，達(dá)到治療酒精的成癮和濫用的目的。通過以下實(shí)驗(yàn)可得到證實(shí)。γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑包括所有能降低γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取(轉(zhuǎn)運(yùn))功能的化合物，例如上述已知化合物3-哌啶甲酸、四氫煙酸、高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇以及它們的衍生物等，例舉化合物結(jié)構(gòu)圖參見

圖1(上述衍生物并不限于這些例舉化合物)。這些化合物可按照前述文獻(xiàn)上報(bào)道的方法合成或從市場上購買。本發(fā)明選取其中一種競爭性抑制劑3-哌啶甲酸乙酯(是3-哌啶甲酸的衍生物)和一種非競爭性抑制劑N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸(NO-711，是四氫煙酸的衍生物)為例來測定它們改變了機(jī)體對酒精的敏感性。
本發(fā)明首先用突觸體GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能檢測實(shí)驗(yàn)，揭示了急性和慢性酒精攝入導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高，接著用細(xì)胞GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能檢測實(shí)驗(yàn)證明這種活性的改變并非由酒精與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接發(fā)生作用，用半定量RT-PCR證明這種效應(yīng)也不是改變GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，最后用免疫熒光技術(shù)揭示了酒精能促使GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位(translocation)，也就是從突觸體內(nèi)轉(zhuǎn)移到突觸體膜上，增加了細(xì)胞膜上有效的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量，導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的增強(qiáng)。接著本發(fā)明用GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的競爭性抑制劑(3-哌啶甲酸乙酯)和非競爭性抑制劑(N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸)測試小鼠對酒精誘導(dǎo)的睡眠反應(yīng)，結(jié)果表明兩種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑預(yù)先處理后，小鼠變得對酒精很敏感。本發(fā)明進(jìn)一步用過量表達(dá)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的轉(zhuǎn)基因小鼠測試它們對酒精誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜、睡眠和致死反應(yīng)，結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)的小鼠對酒精較為耐受。最后，本發(fā)明證實(shí)了GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能改變小鼠對酒精的敏感性，但并不影響酒精在體內(nèi)的代謝。上述結(jié)果表明，酒精的攝入增強(qiáng)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，而GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的強(qiáng)弱又決定了小鼠對酒精的敏感程度，因此能改變GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的藥物應(yīng)能改變機(jī)體對酒精的敏感性，減少機(jī)體對酒精的攝入量，從而避免過度地飲酒，達(dá)到治療酒精的成癮和濫用的目的。
γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的治療酒精的成癮和濫用應(yīng)用，可給予患者有效藥量的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑藥物達(dá)到治療的目的。臨床使用給藥方式可以是口服或注射?？诜幇闯Ｒ?guī)可制成片劑、膠囊、粉末、溶液等劑型，注射可以是肌肉注射、皮下注射或靜脈注射等。
使用γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑在治療酒精的成癮和濫用時(shí)，藥物的量取決于疾病的性質(zhì)和程度以及病人已接受治療的情況。最終由處方醫(yī)生決定給予病人多少劑量，臨床使用的劑量為每公斤體重每日可使用0.05-1mg的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑。
在制備γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑治療酒精的成癮和濫用藥物過程中，藥物除含有GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑外，還可包括藥理學(xué)上可被接受的載體、溶劑、填充物、緩沖劑和穩(wěn)定劑等物質(zhì)。所謂“藥理學(xué)上可接受的”是指不影響GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑生物活性的無毒物質(zhì)。載體和其它物質(zhì)的選擇取決于不同的給藥途徑。
本發(fā)明揭示了GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑具有增加機(jī)體對酒精的敏感性，從而可減少機(jī)體對酒精的攝入量，避免過度地飲酒，達(dá)到治療酒精的成癮和濫用的目的，為GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，也為臨床上治療酒精的成癮和濫用開辟了新的研究領(lǐng)域和新藥篩選途徑。該抑制劑包括所有能抑制GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有增加機(jī)體對酒精敏感性的化合物。由于酒精的成癮與濫用是一種重大的社會問題，迄今為止尚未找到療效很理想的藥物，因此人們一直在努力尋找治療酒精的成癮與濫用的藥物。本發(fā)明的這類化合物對治療酒精的成癮和濫用具有臨床應(yīng)用價(jià)值，它們的作用位點(diǎn)是GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)影響GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能并不影響酒精在體內(nèi)的代謝，因而可避免戒酒硫出現(xiàn)的副作用；本發(fā)明的這類化合物本身具有鎮(zhèn)痛作用，且并不直接阻斷鴉片受體，因而對鴉片類藥物的鎮(zhèn)痛療效應(yīng)該不會產(chǎn)生較大的影響。鑒于γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑具有以上優(yōu)點(diǎn)，因此，這類化合物應(yīng)用于制備治療酒精的成癮和濫用藥物，具有廣闊的開發(fā)前景。
圖2顯示急性酒精攝入15分鐘后和長期慢性酒精攝入導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的變化，結(jié)果顯示急性酒精攝入15分鐘后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度加快，表明急性酒精攝入15分鐘后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性升高(a)，長期慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度也加快，表明長期慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性升高(b)，但并不導(dǎo)致米氏常數(shù)Km的變化(c)，其中的直線圖是v對v/[s]作圖法，斜率為-Km值)(n＝8，*表示p＜0.05，酒精對生理鹽水，one-way ANOVA評價(jià)顯著性)。
圖3顯示含20mM和100mM酒精時(shí)G1細(xì)胞的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度與無酒精時(shí)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度一樣，表明酒精的存在并不影響GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，這個(gè)結(jié)果證明了酒精與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I在體外并不直接相互作用。(a)時(shí)間曲線，(b)動力學(xué)曲線，其中的直線圖是v對v/[s]作圖法，斜率為-Km值。G1指穩(wěn)定表達(dá)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的CHO細(xì)胞。
圖4中(a)顯示以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為定量基準(zhǔn)，慢性酒精攝入并沒有引起GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(GAT1)在RNA水平表達(dá)的變化((a)中的第一列為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。圖4中(b)顯示急性和慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I定位在突觸體的一側(cè)(箭頭頭部所指)，而無酒精攝入的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I定位在整個(gè)突觸體(箭頭所指)，說明急性和慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I從突觸體內(nèi)轉(zhuǎn)移到突觸體膜上，標(biāo)尺為1μm。
圖5顯示注射3-哌啶甲酸乙酯的小鼠比注射生理鹽水的小鼠在注射酒精后延遲時(shí)間縮短(a)，睡眠時(shí)間延長(b)，表明3-哌啶甲酸乙酯使小鼠對酒精敏感(n＝10，*表示p＜0.05，3-哌啶甲酸乙酯對生理鹽水，one-wayANOVA評價(jià)顯著性)。
圖6顯示注射NO-711的小鼠比注射生理鹽水的小鼠在注射酒精后延遲時(shí)間縮短(a)，睡眠時(shí)間延長(b)，表明NO-711使小鼠對酒精敏感(n＝10，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，NO-711對生理鹽水，one-way ANOVA評價(jià)顯著性)。
圖7中(a)顯示GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性得到增強(qiáng)，慢性酒精攝入的轉(zhuǎn)基因小鼠比對照轉(zhuǎn)基因小鼠GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能進(jìn)一步升高(n＝6，*表示p＜0.05，轉(zhuǎn)基因小鼠對正常小鼠， 表示p＜0.05，慢性酒精攝入轉(zhuǎn)基因小鼠對正常轉(zhuǎn)基因小鼠，one-wayANOVA評價(jià)顯著性)。(b)顯示GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高后對酒精誘導(dǎo)的運(yùn)動能力喪失作用減弱，表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高使小鼠對酒精產(chǎn)生一定程度的耐受。(n＝8，*表示p＜0.05，轉(zhuǎn)基因小鼠和慢性酒精攝入小鼠對正常小鼠，one-way ANOVA評價(jià)顯著性)。(c)顯示增強(qiáng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能后延長了酒精誘導(dǎo)睡眠的延遲時(shí)間，(d)顯示增強(qiáng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能后縮短了酒精誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間，3-哌啶甲酸乙酯的使用同樣能使GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能高的小鼠對酒精產(chǎn)生敏感，這些結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低決定了小鼠對酒精的敏感性(n＝6，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，不同類型小鼠對比； 表示p＜0.05， 表示p＜0.01，同種小鼠3-哌啶甲酸乙酯對生理鹽水，one-way ANOVA評價(jià)顯著性)。
圖8顯示在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性高的情況下，小鼠的存活時(shí)間明顯延長，當(dāng)用抑制劑阻斷GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性后死亡迅速加快，這個(gè)結(jié)果同樣表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低決定了小鼠對酒精的敏感性。
圖9顯示在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性高的情況下小鼠死亡率降低，半數(shù)致死劑量升高，這個(gè)結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高可以導(dǎo)致酒精耐受。
圖10顯示轉(zhuǎn)基因小鼠和抑制劑預(yù)處理的正常小鼠與正常小鼠相比，在酒精注射后1小時(shí)和3小時(shí)血液中酒精含量無明顯差別，表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性與酒精代謝無關(guān)。
實(shí)施例中的注射液配制3-哌啶甲酸乙酯、NO-711和酒精分別溶解于生理鹽水，3-哌啶甲酸乙酯配成濃度為3mg/ml的溶液，NO-71l配成濃度為0.25mg/ml的溶液，酒精配成濃度為20％(v/v)的溶液。
實(shí)施例1急性與慢性酒精攝入導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作如下(1)在小鼠正常飲水中加入終濃度為20％(v/v)酒精，小鼠連續(xù)攝入酒精兩個(gè)月，這些小鼠即為慢性酒精攝入的小鼠；急性酒精攝入小鼠是小鼠在實(shí)驗(yàn)前15分鐘腹腔注射酒精2.4g/kg，對照則注射生理鹽水。(2)斷頸處死小鼠，迅速取出全腦，在勻漿緩沖液(0.32M蔗糖，10mM葡萄糖，用Tris-HCl調(diào)節(jié)PH至7.4)中勻漿12-15次，組織與勻漿緩沖液的重量比為1∶9，操作在冰浴中進(jìn)行。(3)以1100g的轉(zhuǎn)速在冷凍離心機(jī)中離心12分鐘，取出上清液，以10000g的轉(zhuǎn)速在冷凍離心機(jī)中離心20分鐘，棄上清，沉淀用人工腦脊液(126.6mM NaCl，27.4mMNaHCO3，2.4mM KCl，0.49mM KH2PO4，1.2mM CaCl2，0.83mM MgCl2，0.49mM Na2HPO4，7.1mM葡萄糖，PH7.2-7.4，用95％ O2/5％ CO2飽和)懸浮，即為突觸體懸液，用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Perice公司)測定各樣品的蛋白濃度。(4)以蛋白濃度為0.75mg/ml進(jìn)行GABA轉(zhuǎn)運(yùn)功能測定，突觸體先在37℃保溫5分鐘。對于時(shí)間曲線，加入濃度為40nm的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA為4nM)，在37℃反應(yīng)0.5、1、2、3、4和5分鐘；對于動力學(xué)曲線，加入濃度分別為40nM、100nM、400nM、1μM、4μM、10μM、20μM、30μM與40μM的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA始終保持4nM)，在37℃反應(yīng)5分鐘。最后用多頭細(xì)胞收集儀(紹興市衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備制造有限公司)將突觸體吸附到膜上，將膜放在閃爍液(2，5-二苯基噁唑3.6g，1，4-雙-[5-苯基噁基-2]苯0.36g，300ml曲拉通X-100，600ml二甲苯)中，用液閃儀(Beckman公司)測定同位素量(CPM)(樣品同位素量取100μl測定，總同位素量取4μl測定)，計(jì)算GABA轉(zhuǎn)運(yùn)活性，換算公式為0.053×樣品同位素量×GABA濃度/總同位素量(pmol/mg protein)。
測定結(jié)果時(shí)間曲線顯示急性酒精攝入15分鐘后和長期慢性酒精攝入均導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度加快(圖2中(a)及(b)，*表示p＜0.05)，表明急性酒精和長期慢性酒精攝入都能導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能增強(qiáng)；動力學(xué)曲線表明長期慢性酒精攝入導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度變快，但并不導(dǎo)致米氏常數(shù)Km的變化(圖2中(c)，*表示p＜0.05)。
實(shí)施例2證明酒精與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(GAT1)在體外是否直接相互作用的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作如下(1)在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的CHO細(xì)胞(G1細(xì)胞)，實(shí)驗(yàn)前3小時(shí)換成無血清培養(yǎng)基。(2)去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，每孔中分別加入含20mM、100mM酒精或不含酒精的Hank’s鹽緩沖液(HBSS)100μl，室溫放置10分鐘。(3)對于時(shí)間曲線，加入濃度為40nm的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA為4nM)，在室溫反應(yīng)2.5、5、10、15、20、25和30分鐘；對于動力學(xué)曲線，加入濃度分別為40nM、100nM、400nM、1μM、4μM、10μM、20μM、30μM與40μM的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA始終保持4nM)，在室溫反應(yīng)30分鐘。用真空泵(紹興市衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備制造有限公司)抽去反應(yīng)液，用PBS洗滌三次。(4)每孔中加入100μl 2N的NaOH，室溫裂解30分鐘后將樣品移入閃爍液中，用液閃儀(Beckman公司)測定同位素量，計(jì)算GABA轉(zhuǎn)運(yùn)活性(與實(shí)施例1類似)。
測定結(jié)果時(shí)間曲線(圖3中(a))和動力學(xué)曲線(圖3中(b))結(jié)果顯示含20mM和100mM酒精時(shí)G1細(xì)胞的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度與無酒精時(shí)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度一樣，表明酒精的存在并不影響GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，這個(gè)結(jié)果證明了酒精與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I在體外并不直接相互作用。
實(shí)施例3急性與慢性酒精攝入促使GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I從突觸體內(nèi)轉(zhuǎn)移到突觸體膜上的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作如下1.RT-PCR分析(1)斷頸處死慢性酒精攝入小鼠和對照小鼠，迅速取出全腦，在Trizol試劑(GIBCO公司)中充分勻漿，按照常規(guī)的RNA抽提方法將總RNA抽提出來。(2)將總RNA樣品用無RNA酶的DNA酶在37℃處理45分鐘，再用酚/氯仿抽提純化。(3)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO公司)在37℃逆轉(zhuǎn)錄90分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，所得樣品即為cDNA樣品。(4)做PCR反應(yīng)，GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的引物為5’ACCAAGCTTAGGCTGCAAAGCTGCTG3’，5’AGGCCTTTGAACATGGGCGCCAG3’；GAPDH的引物為5’ACGACCCCTTCATTGACC3’，5’AGACACCAGTAGACTCCACG3’。反應(yīng)條件為94℃45秒，60℃45秒，72℃1分鐘。(5)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，用分子映像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)定量產(chǎn)物量。2.免疫熒光分析(1)按實(shí)施例1所述方法將突觸體抽提出來。(2)將突觸體樣品涂布于明膠包被的載玻片上，37℃烘干。(3)進(jìn)行免疫反應(yīng)，突觸體先用血清室溫封閉1小時(shí)，然后與抗GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I抗體溫育過夜(4℃)。(4)用PBS洗滌之后，樣品與接生物素的二抗室溫反應(yīng)2小時(shí)。(5)用PBS洗滌之后，樣品與FITC標(biāo)記的親合素室溫反應(yīng)1小時(shí)。(6)用PBS洗滌，封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，并拍照。
測定結(jié)果RT-PCR電泳結(jié)果顯示以GAPDH為定量基準(zhǔn)，慢性酒精攝入小鼠的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的表達(dá)量與對照小鼠的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I的表達(dá)量無明顯差異(圖4中(a))，表明慢性酒精攝入并沒有引起GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I表達(dá)的變化。免疫熒光分析結(jié)果顯示急性和慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I定位在突觸體的一側(cè)(箭頭頭部所指)，而無酒精攝入的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I定位在整個(gè)突觸體(箭頭部所指)(圖4中(b))，說明急性和慢性酒精攝入后GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I從突觸體內(nèi)轉(zhuǎn)移到突觸體膜上。
實(shí)施例4通過睡眠實(shí)驗(yàn)測試GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I競爭性抑制劑3-哌啶甲酸乙酯預(yù)處理后小鼠對酒精的敏感度實(shí)驗(yàn)操作如下(1)給小鼠腹腔注射3-哌啶甲酸乙酯60mg/kg，對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。(2)10分鐘后給小鼠注射酒精3.6g/kg，立即將小鼠仰臥在“V”型槽中，記錄從注射酒精到小鼠不能翻正自己的時(shí)間，稱為延遲時(shí)間；記錄從小鼠不能翻正自己到又能翻正自己的時(shí)間，稱為睡眠時(shí)間。能否翻正的指標(biāo)是30秒內(nèi)能否翻正3次。
測試結(jié)果注射3-哌啶甲酸乙酯的小鼠比注射生理鹽水的小鼠在注射酒精后延遲時(shí)間縮短(圖5中(a)，*表示p＜0.05)，睡眠時(shí)間延長(圖5中(b)，*表示p＜0.05，)，表明3-哌啶甲酸乙酯使小鼠對酒精敏感。
實(shí)施例5
通過睡眠實(shí)驗(yàn)測試GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I非競爭性抑制劑N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸預(yù)處理后小鼠對酒精的敏感度實(shí)驗(yàn)操作如下(1)給小鼠腹腔注射NO-711 5mg/kg，對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。(2)10分鐘后給小鼠注射酒精3.6g/kg，立即將小鼠仰臥在“V”型槽中，記錄從注射酒精到小鼠不能翻正自己的時(shí)間，稱為延遲時(shí)間；記錄從小鼠不能翻正自己到又能翻正自己的時(shí)間，稱為睡眠時(shí)間。能否翻正的指標(biāo)是30秒內(nèi)能否翻正3次。
測試結(jié)果注射NO-711的小鼠比注射生理鹽水的小鼠在注射酒精后延遲時(shí)間縮短(圖6中(a)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，睡眠時(shí)間延長(圖6中(b)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，表明NO-711使小鼠對酒精敏感。
實(shí)施例6通過自由運(yùn)動實(shí)驗(yàn)和睡眠實(shí)驗(yàn)測試GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I活性升高后的小鼠對酒精的敏感度實(shí)驗(yàn)操作如下1.GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在腦中GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高(1)慢性酒精攝入的轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得同實(shí)施例1中慢性酒精攝入的正常小鼠的獲得。(2)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的測定同實(shí)施例1。2.自由運(yùn)動實(shí)驗(yàn)(1)將小鼠放入一個(gè)開放箱子中，箱子尺寸為50×50×30cm，底部分成10×10cm的方格，記錄小鼠在5分鐘內(nèi)跨越的方格數(shù)。(2)給小鼠腹腔注射酒精1.75g/kg，立即放回箱子中，以酒精注射為計(jì)時(shí)起點(diǎn)，分別記錄在2-7分鐘、12-17分鐘、32-37分鐘和60-65分鐘時(shí)間段內(nèi)記錄小鼠跨越的方格數(shù)。(3)計(jì)算小鼠在酒精注射后相對于酒精注射前活動的百分率。3.睡眠實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例4。
測試結(jié)果GABA轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間曲線顯示GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度比正常小鼠快，而慢性酒精攝入的轉(zhuǎn)基因小鼠GABA轉(zhuǎn)運(yùn)速度比對照轉(zhuǎn)基因小鼠快(圖7中(a)，*表示p(0.05， 表示p＜0.05)，表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性得到增強(qiáng)，慢性酒精攝入能進(jìn)一步增強(qiáng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。自由運(yùn)動實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高后對酒精誘導(dǎo)的運(yùn)動能力喪失作用減弱(圖7中(b)，*表示p＜0.05)，表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高使小鼠對酒精產(chǎn)生一定程度的耐受。睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示增強(qiáng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能延長了延遲時(shí)間(圖7中(c))，縮短了睡眠時(shí)間(圖7中(d))，3-哌啶甲酸乙酯的使用再一次證實(shí)了實(shí)施例4的結(jié)果(圖7中(c)及(d)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01， 表示p＜0.05， 表示p＜0.01)，這些結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低決定了小鼠對酒精的敏感性。
實(shí)施例7GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性與高劑量酒精致死的關(guān)系實(shí)驗(yàn)操作如下(1)給小鼠腹腔注射9g/kg的3-哌啶甲酸乙酯或相同體積的生理鹽水，立即將小鼠放回籠中。(2)記錄每只小鼠的死亡時(shí)間，以心跳停止作為評判標(biāo)準(zhǔn)。(3)統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間段內(nèi)同組小鼠的成活個(gè)數(shù)。
測試結(jié)果在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性高的情況下，小鼠的存活時(shí)間明顯延長，當(dāng)用抑制劑阻斷GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性后死亡迅速加快(圖8)，這個(gè)結(jié)果同樣表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低決定了小鼠對酒精的敏感性。
實(shí)施例8GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性與酒精半數(shù)致死劑量的關(guān)系實(shí)驗(yàn)操作如下(1)分別給小鼠腹腔注射6.5，7.0，7.5g/kg的酒精，立即將小鼠放回籠中。(2)記錄每組小鼠死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算死亡率。(3)作圖計(jì)算半數(shù)致死劑量(LD50)。
測試結(jié)果在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性高的情況下小鼠死亡率降低，半數(shù)致死劑量升高(圖9)，這個(gè)結(jié)果表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性升高可以導(dǎo)致酒精耐受。
實(shí)施例9GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的高低與酒精代謝無關(guān)實(shí)驗(yàn)操作如下(1)給小鼠腹腔注射60mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯或相同體積的生理鹽水，立即將小鼠放回籠中。(2)10分鐘后給這些小鼠腹腔注射3.6g/kg的酒精，立即將小鼠放回籠中。(3)酒精注射后1小時(shí)處死一半小鼠取血，另一半小鼠在酒精注射后3小時(shí)處死取血。(4)用Sigma公司酒精分析試劑盒測定每個(gè)小鼠血液中酒精的含量。
測試結(jié)果轉(zhuǎn)基因小鼠和抑制劑預(yù)處理的小鼠與正常小鼠相比，在酒精注射后1小時(shí)和3小時(shí)血液中酒精含量無明顯差別(圖10)，表明GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性與酒精代謝無關(guān)。
實(shí)施例10治療酒精成癮和濫用注射液的制備將3-哌啶甲酸乙酯0.75克、1.25克、2.5克各別溶解于1升水中，混合均勻后分裝成1.5mg/2ml/支、2.5mg/2ml/支、5mg/2ml/支濃度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒殺菌，制成產(chǎn)品，避光保藏。
實(shí)施例11 治療酒精成癮和濫用注射液的制備將NO-711 0.75克、1.25克、2.5克各別溶解于1升水中，混合均勻后分裝成1.5mg/2ml/支、2.5mg/2ml/支、5mg/2ml/支濃度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒殺菌，制成產(chǎn)品，避光保藏。
實(shí)施例12治療酒精成癮和濫用片劑的制備按公知的制片技術(shù)，取NO-711 10克，糊精130克，淀粉100克，羧甲基淀粉50克，一起放入粉碎機(jī)內(nèi)充分混合25-30分鐘，粉碎至約80-120目，再加入硬脂酸鎂3克，均勻混合，經(jīng)制片機(jī)制成1000片片劑，每片重量約0.3克，每片含NO-711 10mg。
權(quán)利要求
1.一種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑在制備治療酒精的成癮和濫用藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是包括3-哌啶甲酸，四氫煙酸，高β-脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇、五氫氮雜基異噁唑醇以及它們的衍生物為抑制劑在制備治療酒精的成癮和濫用藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是包括但并不限于下列這些化合物3-哌啶甲酸，四氫煙酸，3-哌啶甲酸乙酯，N-(二苯基亞胺基乙醇基)-四氫煙酸，4，4-雙(3-甲基噻吩基-3-丁烯基)-3-哌啶甲酸，雙(三氟甲基苯基)甲氧基乙基四氫煙酸，N-(二苯基-3-丁烯基)-3-哌啶甲酸，N-(二苯基-3-丁烯基)四氫煙酸，(二苯基甲氧乙基)-3-哌啶甲酸，二苯甲叉基乙氧基胺哌啶甲酸，二苯乙烯氧基乙基哌啶甲酸，二苯氨基乙氧基乙基哌啶甲酸，二苯丙氧基乙基哌啶甲酸，4，4-二對甲苯基-3-丁烯基哌啶甲酸，6-(3，3-二苯丙基)四氫煙酸，2-(3，3-二苯丙氧基)乙基哌啶甲酸，(10，11-二氫-二苯氮雜基)乙氧基乙基哌啶甲酸，2-(9-對甲氧基苯基)芴基乙氧基哌啶甲酸，三對甲氧基苯基甲氧基乙基哌啶甲酸，高β-脯氨酸，四氫吡啶基異噁唑醇，五氫氮雜基異噁唑醇，四氫吡啶基硫代異噁唑醇，五氫-4-胺基苯并異噁唑醇，五氫-4-甲胺基苯并異噁唑醇，4，4-二苯基-3-丁烯基四氫吡啶異噁唑醇，二苯基-3-丁烯基五氫氮雜異噁唑醇，3-氮雜芴基-4-鄰甲氧基苯基-吡啶醇，為抑制劑在制備治療酒精的成癮和濫用藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種γ－氨基丁酸(GABA)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑在制備治療酒精的成癮和濫用藥物中的應(yīng)用。該抑制劑包括所有能抑制GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使機(jī)體對酒精敏感的化合物，例如3－哌啶甲酸，四氫煙酸，高β－脯氨酸、四氫吡啶基異噁唑醇(THPO)、五氫氮雜基異噁唑醇(THAO)以及它們的衍生物等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這類抑制GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的化合物具有使機(jī)體對酒精敏感的作用，從而減少機(jī)體對酒精的攝入量。因此這類化合物對治療酒精的成癮和濫用具有臨床應(yīng)用價(jià)值，可用于制備治療酒精的成癮和濫用藥物。
文檔編號A61K31/445GK1401319SQ0213633
公開日2003年3月12日 申請日期2002年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月1日
發(fā)明者郭禮和, 胡佳華, 馬映華, 楊納, 費(fèi)儉, 張懋弧 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海賽達(dá)生物技術(shù)研究中心有限公司