專利名稱：：姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子urat1抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物姜黃素的新用途，具體是涉及姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：尿酸排出減少或生成增加，可導(dǎo)致血液中尿酸濃度增高，直接或間接引起相關(guān)疾病。尿酸的排泄是一復(fù)雜過程，尿酸隨血液循環(huán)流入腎小球時，游離型的尿酸將全部濾過；在近端腎小管有約99%尿酸鹽被重吸收(DiamondHS,MeiselAD.Postsecretoryreabsorptionofurateinman.ArthritisAndRheumatism,1975，18(6):805-809.)。位于近曲小管的尿酸轉(zhuǎn)運子(蛋白)URAT1參與尿酸重吸收過程，通過與陰離子的交換將尿酸鹽由管腔轉(zhuǎn)運入細(xì)胞。URAT1蛋白主要分布于腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞向腔膜，是一個電中性的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白。URAT1基因由Enomoto等于2002年首先從人腎臟克隆出來，位于染色體llql3，由SLC22A12基因編碼，由10個內(nèi)含子9個外顯子組成，擁有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，其cDNA全長2642bp，編碼區(qū)1659bp，編碼含555個氨基酸的蛋白質(zhì)。原發(fā)性腎低尿酸血癥(hypouricemia)病人的SLC22A12基因缺陷病例進(jìn)一步證明人的URAT1(hURATl)參與尿酸的重吸收(AtsushiEnomoto,HiroakiKimura，ArthitChairoungdua,YasuhiroShigeta,etal.Molecularidentificationofarenalurate-anionexchangerthatregulatesblooduratelevels./Vatare,2002,417(6887):447-452)。姜黃素結(jié)構(gòu)式、分子式和美國化學(xué)文摘收錄號(CASNo.)見下OMeOMeC21H2006458-37-7姜黃素可以由天然產(chǎn)物中分離得到，例如有文獻(xiàn)報道了釆用滲漉法提取及大孔樹脂分離正交試驗，確定了提取姜黃素用9倍體積的70%乙醇，以3mL/min的速度滲漉的最佳提取工藝和利用D101大孔樹脂純化姜黃素工序中調(diào)節(jié)上樣料液以及pH7，8(^乙醇以4ml/min的速率洗脫的最佳分離工藝，由姜黃中分離姜黃素(尤本明，王忠壯，胡晉紅.姜黃中姜黃素的提取及分離工藝研究.藥學(xué)服務(wù)與研究2006:6(4):277-279)。也有報道由化學(xué)改構(gòu)/合成得到姜黃素(Venkateswarlu,Som印alli;Ramachandra，Marell即udiS.;Subbaraju，GottumukkalaV.Synthesisandbiologicalevaluationofpolyhydroxycurcuminoids.Bioorganic&MedicinalChemistry(2005)，13(23),6374-6380.)。姜黃素已見有多種生理和藥理活性的報道，包括抗氧化作用、抗腫瘤作用、抗炎作用、抗病毒作用等(許東暉，王勝，金晶，梅雪婷，許實波.姜黃素的藥理作用研究進(jìn)展.中草藥2005:36(11):1737-1740)。但單體化合物姜黃素用于制備針對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl的抑制藥物，則未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供黃酮類單體化合物姜黃素的新用途，具體是姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案之一是提供黃酮類單體化合物姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物的新用途。該新用途包括了以本發(fā)明所述的姜黃素，配以本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的藥用輔料(賦形劑、助溶劑、控釋劑等)，制成本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的劑型(包括口服液、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、微囊劑等)，用于制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物。本發(fā)明的優(yōu)點是，提供了對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl具有確切抑制調(diào)節(jié)作用的姜黃素，用于制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物，可用于治療與尿酸轉(zhuǎn)運子URATl異常高表達(dá)相關(guān)疾病。與針對痛風(fēng)或者高尿酸血病癥的發(fā)明比較，本發(fā)明提供的單體化合物姜黃素制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物新用途具有3個明顯的進(jìn)步和優(yōu)點1、有效成分確切(單體化合物)；2、作用靶點明確(尿酸排泄過程中重吸收作用的尿酸轉(zhuǎn)運子URATl);3、調(diào)節(jié)作用明確(抑制調(diào)節(jié))。本發(fā)明利用高尿酸血動物模型在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上科學(xué)地評價并確定了單體化合物姜黃素對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl的抑制調(diào)控作用。本發(fā)明所涉及的單體化合物姜黃素對模型動物表達(dá)異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URATl具有確切的抑制作用；而對正常動物的正常水平的尿酸轉(zhuǎn)運子表達(dá)無顯著抑制作用，具有很好的安全性。為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用單體化合物姜黃素的的藥理實驗及結(jié)果來說明其在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物中的應(yīng)用。具體實施例方式以下實施例僅作為進(jìn)一步闡述發(fā)明之用，不能用來限制本發(fā)明。實施例1:黃酮類單體化合物姜黃素對尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1的抑制調(diào)節(jié)作用實驗動物昆明種小鼠，15-20克，雄性藥物配制姜黃素均勻分散于生理鹽水中，用于灌胃給藥，給藥劑量為25mg/kg實驗材料TrizolReagment(Invigen)，氯仿，異丙醇，無水乙醇，DEPC，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液等實驗儀器高速冷凍離心機(jī)，高速勻漿機(jī)，Bio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、水平電泳槽等實驗?zāi)Ｐ托∈蟾吣蛩嵫Y模型。實驗方法1、模型的建立動物適應(yīng)環(huán)境l周后，灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250rag/kg;對照給予等體積生理鹽水，造模周期io天。2、給藥造模期間同時給藥，在給予氧嗪酸鉀鹽造模/生理鹽水對照lh后，灌胃給予單體化合物姜黃素25mg/kg;對照給予生理鹽水。3、小鼠處死及組織的保存小鼠于灌胃給予姜黃素/生理鹽水后l小時處死，冰臺上分離腎臟組織，腎組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-so'c。4、蛋白質(zhì)印跡法(Western-blotting):取組織約100mg加入lml的RIPA裂解液勻漿提取，12000g4'C離心15分鐘，得腎臟組織總蛋白提取液，Bradford法測蛋白濃度，稀釋蛋白樣品至終濃度為5ug/ul?；旌仙蠘泳彌_液變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1小時后加入mURATl抗體(根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫mURATl蛋白序列制備，使用濃度1:4000)4'C孵育過夜，二抗(1:4000)室溫?fù)u床孵育l小時，HRP-ECL發(fā)光，暗室曝光顯影。膠片掃描后對圖片進(jìn)行灰度分析。5、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):提取小鼠腎臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的mURATl基因設(shè)計引物，進(jìn)行mURATl目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后UV成像，對圖片進(jìn)行灰度分析。實驗結(jié)果a-蛋白質(zhì)印跡法Western—Blotting<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>v°<0.01與空白+生理鹽水組比較"尸<0.01與模型+生理鹽水組比較連續(xù)10天灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg造模造成小鼠腎組織中URAT1蛋白高水平表達(dá)，灰度值達(dá)到84.3，顯著高于空白對照44.9。灌胃給予25mg/kg的單體化合物姜黃素可顯著抑制模型小鼠腎組織中URAT1蛋白的高水平表達(dá)，灰度值為51.7，接近空白對照水平。說明單體化合物姜黃素顯著抑制模型動物異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1蛋白表達(dá)。灌胃給予單體化合物姜黃素對空白小鼠腎組織中URAT1蛋白表達(dá)水平無顯著影響，說明單體化合物姜黃素對小鼠腎組織正常水平的URAT1蛋白無顯著抑制作用，具有較好的安全性。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCRGroup空白+生理鹽水空白+姜黃素模型+生理鹽水模型+姜黃素n=5_灰度值33.0±9.135.7±10.268.7±18.0++38.9±10.4'++尸<0.01與空白+生理鹽水組比較**戶〈0.01與模型+生理鹽水組比較連續(xù)10天灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg造模造成小鼠腎組織中URAT1mRNA高水平表達(dá)，灰度值達(dá)到68.7，顯著高于空白對照33.0。灌胃給予25mg/kg的單體化合物姜黃素可顯著抑制模型小鼠腎組織中URAT1mRNA的高水平表達(dá)，灰度值為38.9，接近空白對照水平。說明單體化合物姜黃素可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1mRNA表達(dá)。灌胃給予單體化合物姜黃素的空白小鼠腎組織中URAT1mRNA表達(dá)水平為35.7，相對于空白對照組無顯著變化，說明單體化合物姜黃素對小鼠腎組織正常水平的URAT1mRNA無顯著抑制作用，具有較好的安全性。實施例2:將單體化合物姜黃素按照常規(guī)制劑方法，加入水及適量增溶劑(聚乙二醇400)溶解，分裝，滅菌，制備成規(guī)格為20mg/ml的姜黃素口服液；將單體化合物姜黃素按照常規(guī)制劑方法，軟膠囊材質(zhì)選用明膠和山梨醇，制備成規(guī)格為20mg/粒的姜黃素膠囊；將單體化合物姜黃素按照常規(guī)制劑方法，加入賦形劑環(huán)糊精，混合均勻，制粒，壓片，制備成規(guī)格為20mg/片的姜黃素片劑。權(quán)利要求1.黃酮類單體化合物姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物姜黃素的新用途，具體是涉及姜黃素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。經(jīng)動物試驗結(jié)果表明姜黃素對高尿酸血模型動物表達(dá)異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1具有確切的抑制作用，而對正常動物的正常水平的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1表達(dá)無顯著抑制作用，具有很好的安全性，利用姜黃素配以相關(guān)的藥用輔料，用常規(guī)的制劑方法可制成姜黃素口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑等尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1的抑制藥物，可用于治療與尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1異常高表達(dá)相關(guān)的疾病。文檔編號A61K31/12GK101181249SQ20071019013公開日2008年5月21日申請日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者孔令東,李建梅,穎潘,闖王申請人:南京大學(xué)