專利名稱：表達(dá)豬類病毒基因的浣熊痘病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)單獨(dú)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)基因或其與豬圓環(huán)病毒 (PCV)基因的組合的新穎重組浣熊痘病毒載體、及所述載體作為疫苗在由PCV及/或PRRSV 所引起的疾病預(yù)防中的用途。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)是正鏈RNA病毒，其是動(dòng)脈病毒科 (Arteriviridae)動(dòng)脈病毒屬(genus Arterivirus)家族的成員。PRRSV感染豬，引起最初 于1987年在北美檢測到的"神秘豬疾病"，隨后所述疾病在1990年傳播至歐洲并傳遍歐洲。 自1990年以來，PRRSV已成為豬產(chǎn)業(yè)的主要全球性威脅，給豬群造成嚴(yán)重生產(chǎn)損失。
現(xiàn)稱為豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)的神秘豬疾病(也稱為藍(lán)耳病、豬流行性流產(chǎn) 及呼吸綜合癥(PEARS)或呼吸綜合癥(SIRS))的特征在于妊娠母豬的繁殖障礙，此導(dǎo)致妊 娠期的最后階段期間異常高數(shù)量流產(chǎn)、厭食癥、死產(chǎn)、干癟胎兒、母豬分娩后呼吸問題及仔 豬虛弱(出生之后不久即死于呼吸系統(tǒng)疾病或二次感染)。在仔豬中，感染PRRSV造成呼吸 窘迫及可能高達(dá)70%及更高仔豬死亡率的高死亡率。年長豬可能顯示呼吸系統(tǒng)疾病或二次 感染的輕微體征。所述病毒在豬群體中快速傳播，且畜群中高達(dá)95%的豬在最初感染后兩 個(gè)至三個(gè)月內(nèi)可能變成血清陽性。即使感染已經(jīng)穩(wěn)定化，也存在通過排菌幼小雌豬散布的 PRRSV將感染妊娠母豬及再次發(fā)生繁殖問題的強(qiáng)烈可能性。PRRS對豬飼養(yǎng)畜群的經(jīng)濟(jì)影響 相當(dāng)大。 引起神秘豬疾病且首先在荷蘭被分離出來的PRRSV稱為萊利斯塔德病毒 (Lelystad virus) (LV)(溫斯伍特(G. Wesvoort)等人，獸醫(yī)季刊(Vet. Quarterly) 3 : 121-130(1991))。其后不久，在西班牙發(fā)現(xiàn)不同的01ot分離株(普拉納(Plana)等人，獸醫(yī) 微生物學(xué)(Vet. Microbiol. )，33 :203.211,1992)。隨后，PRRSV的新穎分離株在若干公開案 中予以闡述(參見，例如，歐洲專利申請案第0529584A2號、W0 93/06211及WO 93/07898)。
其它公開案揭示PRRS病毒分離株的結(jié)構(gòu)特征，例如全部萊利斯塔德病毒(LV)基 因組(蒙勒伯格(J. J. M. Meulenberg)等人，"豬流行性流產(chǎn)及呼吸綜合癥(PEARS)的致病因 子萊禾鵬塔德病毒與LDV及EAV有關(guān)(Lelystad virus, the causative agent ofporcine epidemic abortion and respiratory syndrome, is related to LDV and EAV)，，，病毒學(xué) (Virology) 192 :62-72(1993));圖賓根(Tubingen)(德國)PRRS病毒分離株(TV)基因組的 區(qū)段(考再曼(K-K. Cozelma皿)等人，"動(dòng)脈病毒屬成員豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的分子表 征(Molecular characterization of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, a member of the Arterivirus group)"，病毒學(xué)193 :329-339(1993))及允許基因 克隆及測序的其它分離株。 通常，動(dòng)脈病毒的病毒粒子直徑為50-70nm且含有同質(zhì)異構(gòu)(很可能為二十面 體)核衣殼，所述同質(zhì)異構(gòu)核衣殼的直徑為35nm，由緊密粘附的包膜圍繞且具有蜂巢狀表 面結(jié)構(gòu)?；蚪M由單個(gè)線性正義ssRNA分子(尺寸為13-15kb)組成。PRRS病毒的尺寸為50-60nm，在核衣殼內(nèi)含有約30_35nm的包膜及單個(gè)RNA分子。PRRSV的基因組RNA約為 15kb (15000個(gè)堿基對)。所述基因組編碼RNA復(fù)制酶(0RFla及0RFlb)、糖蛋白GP2至GP5、 整合膜蛋白M及核衣殼蛋白N(ORF 2至7)?；蚪MRNA是經(jīng)由全長反義復(fù)制中間體合成。
PRRSV基因組的單鏈RNA分子在3'末端含有多聚腺苷酸尾(poly-A tail)。所述 結(jié)構(gòu)含有7個(gè)編碼病毒蛋白的開放讀碼框(ORF)。 0RF1至0RF7之間顯示小重疊區(qū)段。病 毒蛋白的合成是自具有不同長度亞基因組轉(zhuǎn)錄物(mRNA)但具有相似的3'多聚腺苷酸化 末端、及源自非編碼5'末端序列的5'前導(dǎo)序列的群組產(chǎn)生。所述病毒蛋白表達(dá)形式視為 巢式mRNA，且先前已對冠狀病毒予以闡述(斯巴安(W.J.M. Spaan)等人，普通病毒學(xué)雜志 (J. Gen. Virol. )69 :2939-2952 (1988))?；谌R利斯塔德(LV)及圖賓根(TV) PRRSV病毒分 離株核苷酸序列且通過與用其它動(dòng)脈病毒所觀察到者同源，已提出在病毒基因組中ORFl(a 及b)編碼病毒聚合酶及復(fù)制酶。0RF2至0RF6編碼病毒包膜蛋白，且0RF7編碼核衣殼蛋 白。病毒復(fù)制酶及聚合酶是大尺寸蛋白，分別為260kDa及163kDa，且兩者均含有三個(gè)可能 的糖基化位點(diǎn)。位于3'末端的包膜蛋白(ORF 2至6)較小，介于30kDa與19kDa之間。所 有所述都含有兩個(gè)以上可能的糖基化位點(diǎn)，尤其0RF3含有7個(gè)位點(diǎn)。所有所述蛋白都在氨 基(N-)及羧基(C-)末端含有疏水性序列，其可作為前導(dǎo)序列及膜錨著點(diǎn)。通常，其為疏水 性蛋白，此與其與膜相關(guān)聯(lián)的位置一致。0RF6具有3個(gè)位于在N末端的90個(gè)氨基酸殘基內(nèi) 的疏水性區(qū)段。由0RF7編碼的蛋白(可能對應(yīng)于病毒核衣殼)與在N末端的精氨酸、賴氨 酸及組氨酸殘基一起極具堿性。LV及TV病毒聚合酶、結(jié)構(gòu)蛋白及核衣殼的氨基酸序列與 LDV病毒相比顯示介于29%與67%之間的一致性，且與EAV病毒相比顯示介于20%與36% 之間的一致性。 由PRRSV引起的疾病給全球豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。為此，人們已研究開發(fā)能夠預(yù) 防由PRRSV引起的感染的疫苗。以前疫苗研發(fā)的原理是PRRSV可在宿主細(xì)胞(豬)的基本肺 泡巨噬細(xì)胞及在猴腎細(xì)胞系中生長的事實(shí)。在很大程度上，曾在W092/21375、W0 93/06211、 W0 93/07898及西班牙專利第P9301973號中闡述的抵抗PRRSV的先前疫苗是獲自在巨噬 細(xì)胞上生長的病毒并隨后經(jīng)滅活的常用疫苗。揭示所述疫苗能夠避免豬繁殖與呼吸綜合癥 (PRRS)并預(yù)防母豬繁殖變異。 也對豬興隆具有重要意義者是另一種廣泛傳播的稱為斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥 (P麗S)的疾病。P麗S(通常侵襲約5-18周齡的斷乳仔豬)以流行比例對豬造成當(dāng)前或潛在 的健康威脅，并嚴(yán)重影響全球豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。P麗S的臨床體征由漸進(jìn)性體重?fù)p失、呼吸 困難、呼吸急促、貧血、腹瀉及黃疸組成。盡管在斷乳仔豬中更為普遍，但所述衰弱性疾病可 侵襲包括豬、公豬及成年豬在內(nèi)的任何豬家族動(dòng)物。死亡率可自1%至2%不等，且在一些 復(fù)雜情形下全世界死亡率可高達(dá)40%。已確定豬圓環(huán)病毒2型(通常稱為PCV-2)是P麗S 的主要致病因子(艾倫(G.M. Allan)等人，"來自患有消耗性疾病綜合癥的豬的新穎豬圓環(huán) 病毒(Novel porcine circoviruses from pigswith wasting disease syndromes)，，，獸醫(yī) 記錄(Vet. Rec.)，第142巻，第467-468頁，1998 ;艾倫(G.M.Allan)等人，"在美國及歐洲 自患有消耗性疾病的豬分離豬圓環(huán)病毒類病毒(Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USAand Europe)"，獸醫(yī)學(xué)診斷石開究 雜志(J. Vet. Diagn. Invest.)，第10巻，第3-10頁，1998)。因此，在商業(yè)豬事務(wù)內(nèi)，通過研 發(fā)抵抗PCV2(P麗S的病原體)的有效疫苗以對具有危險(xiǎn)的動(dòng)物實(shí)施大規(guī)模疫苗接種來預(yù)防豬家族中P麗S發(fā)作是重要目標(biāo)。 美國專利第6，217，883號(與法國專利第2， 781， 159B號對應(yīng))涉及5種經(jīng)分 離PCV菌株及其與至少一種豬細(xì)小病毒抗原的組合在多價(jià)免疫原性組合物中的用途，所述 PCV菌株來自自加拿大、加利福尼亞及法國感染P麗S的豬取樣的肺部或神經(jīng)節(jié)樣品。由 0RF1至0RF13組成的PCV2開放讀碼框(ORF)編碼的蛋白質(zhì)在所述專利中予以粗略闡述，但 無展示免疫原性特性的任何具體蛋白質(zhì)的例證。所述專利揭示由DNA質(zhì)粒、線性DNA分子 及含有并在活體內(nèi)表達(dá)編碼PCV抗原的核酸分子的重組病毒組成的載體。
美國專利第6， 368， 601號涉及分離自肺部或神經(jīng)節(jié)樣品的新穎豬圓環(huán)病毒菌株， 所述肺部或神經(jīng)節(jié)樣品獲自受斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(P麗S)侵襲的農(nóng)場。具體來說， 所述專利闡述所述菌株的經(jīng)純化制備品、常用減毒疫苗或滅活疫苗、重組活疫苗、質(zhì)粒疫苗 及亞單位疫苗以及試劑及診斷方法。所述專利進(jìn)一步揭示包含經(jīng)分離DNA分子序列的載 體，所述經(jīng)分離DNA分子序列可用于在活體外表達(dá)載體中產(chǎn)生亞單元或用作擬整合至病毒 或質(zhì)粒型活體內(nèi)表達(dá)載體中的序列。所述專利粗略闡述豬皰疹病毒、豬腺病毒或痘病毒且 更具體來說阿捷申氏病(Aujesky' s disease)病毒、牛痘病毒、鳥痘病毒或豬痘病毒的載 體。 先前，某些豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)基因(0RF2、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、 0RF7)已在不同載體系統(tǒng)中表達(dá)桿狀病毒、偽狂犬病病毒、TGEV及質(zhì)粒DNA。所有所述表 達(dá)系統(tǒng)都受能夠在一個(gè)病毒構(gòu)建體中表達(dá)僅一個(gè)或兩個(gè)開放讀碼框所限制。
例如，美國專利第5， 888， 513號涉及豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)的致病病毒的重 組蛋白，其與PRRSV西班牙分離株(PRRS-01ot)的0RF2至0RF7相對應(yīng)，其已在桿狀病毒表 達(dá)系統(tǒng)中使用Sf 9(草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)物作為容 許宿主產(chǎn)生。所述專利闡述適于調(diào)配能夠保護(hù)豬家畜免于PRRS的疫苗且適于制備用以檢 測抗PRRSV抗體以及豬生物樣品中的PRRSV的診斷試劑盒的重組蛋白。具體來說，所述專利 涉及包含重組桿狀病毒的重組表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)來自至少一種經(jīng)分離核苷酸序列的經(jīng)分離 病毒亞單位蛋白的方法，所述至少一種經(jīng)分離核苷酸序列選自由來自桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的 PRRS-01ot分離株的0RF2至0RF7組成的群組。所述專利也闡述含有至少一種重組PRRSV 蛋白的重組疫苗。 存在大量關(guān)于用于表達(dá)豬抗原且用作疫苗的重組浣熊痘病毒主題的出版資料。例 如，美國專利第6， 294， 176號揭示一種重組浣熊痘病毒(RCNV)載體，其使豬繁殖與呼吸綜 合癥病毒(PRRSV)、豬流感病毒血凝素(SIV HA)、豬流感病毒神經(jīng)氨酸酶(SIV NA)及豬細(xì) 小病毒(PPV)的開放讀碼框(0RF)的一個(gè)或兩個(gè)外來DNA序列(例如PRRSV的0RF 2_7中 的一個(gè))插入浣熊痘病毒基因組的HindIII "U"基因組區(qū)域、HindIII "M"基因組區(qū)域或 HindIII "N"基因組區(qū)域內(nèi)的非必需區(qū)域中。在所述專利中闡述淙熊痘病毒病毒基因組在 所述病毒基因組的浣熊痘病毒宿主范圍基因中含有缺失。所述專利通過向浣熊痘病毒基因 組中插入外來DNA序列提供用于產(chǎn)生重組浣熊痘病毒的同源載體。在實(shí)例中，所述專利僅 顯示如何預(yù)備將外來DNA插入至HindIII "U"基因組區(qū)域中。DNA序列分析顯示，專利權(quán)所 有人所揭示的HindIII "U"基因組區(qū)域并非重組淙熊痘病毒基因組的血凝素(ha)及/或 胸苷激酶(tk)插入?yún)^(qū)域。 美國專利第7， 109， 025號揭示使用重組豬腺病毒的病毒載體及疫苗。具體來說，所述專利闡述活體內(nèi)復(fù)制及包含異源核苷酸序列的重組豬腺病毒，所述異源核苷酸序列在 能夠使豬腺病毒在活體內(nèi)復(fù)制并表達(dá)所插入異源核苷酸序列的條件下插入至豬腺病毒中。 所述專利進(jìn)一步闡述使用來自豬腺病毒(PAV)血清型3或5(PAV-3或PAV-5)的腺病毒 基因組并插入異源核苷酸序列，所述異源核苷酸序列編碼至少一種在位于主要晚期啟動(dòng)子 (MLP)下游的PAV-3或PAV-5基因組的E3區(qū)域的非必需區(qū)中的產(chǎn)物。所述專利也涉及包 含所有或部分參考核苷酸序列的DNA片段。顯示重組PAV載體可表達(dá)選自由下列組成的群 組的豬病原體偽狂犬病病毒、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、細(xì)小病毒、豬霍亂病 毒、豬圓環(huán)病毒2型、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)及豬肺炎支 原體(Mycoplasma hyopneumoniae)。 美國專利第6， 497， 883號涉及含有來自豬圓環(huán)病毒2型的外來DNA的重組痘病毒 (例如鳥痘病毒)的用途與治療或預(yù)防由豬圓環(huán)病毒2型引起的疾病的方法。具體來說，所 述專利的重組痘病毒包含由豬圓環(huán)病毒2型的0RF1至13組成的經(jīng)分離DNA分子，其中所 述重組痘病毒是重組ALVAC金絲雀痘病毒。 美國專利第7， 211， 379號涉及通過借助投與包含PCV_2抗原的免疫原性組合物誘 發(fā)抵抗PCV-2的免疫反應(yīng)來降低豬中豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的病毒負(fù)荷的方法。所述專 利將所述抗原闡述為含有外源PCV-2核苷酸序列的載體，其中所述PCV-2核苷酸序列編碼 并表達(dá)0RF4、 0RF13或0RF4及0RF13。在所述專利中所示的一些實(shí)施例中，免疫原性組合 物包括一或多種其它豬病原體。所述專利所揭示的方法中所用的組合物另外包含至少一 種來自至少一種其它豬病原體的免疫原或表達(dá)所述免疫原的載體，其中所述其它豬病原體 選自由下列組成的群組PRRS、豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、萎縮性鼻炎、偽狂犬病、豬霍亂、豬流感、腦心肌炎病毒及PPV。所述專利中所揭示的 載體包含DNA載體質(zhì)粒、諸如大腸桿菌等細(xì)菌、諸如下述病毒桿狀病毒、包括豬皰疹病毒 或阿捷申氏病病毒(偽狂犬病)的皰疹病毒、包括豬腺病毒的腺病毒及包括牛痘病毒、鳥痘 病毒、金絲雀痘病毒、浣熊痘病毒及豬痘病毒的痘病毒。 美國專利第6， 241， 989號及其續(xù)篇美國專利第7， 087， 234號的揭示內(nèi)容涉及含有 一種以上插入至胸苷激酶基因或血凝素基因中的外源基因的多價(jià)重組淙熊痘病毒。在所述 兩個(gè)相關(guān)專利中所揭示的內(nèi)容是所述多價(jià)重組浣熊痘病毒作為疫苗來賦予貓抵抗隨后貓 病原體的攻擊的免疫性的用途。也揭示通過重組過程制造多價(jià)重組浣熊痘病毒的方法，所 述重組過程涉及構(gòu)建插入載體(外源基因插入至其中)；及使插入基因的側(cè)翼是可重組至 浣熊痘病毒胸苷激酶基因或血凝素基因中的序列；向易感染宿主細(xì)胞中引入含有所述外源 基因的插入載體及浣熊痘病毒二者；及自所得蝕斑中選擇重組浣熊痘病毒。所述專利的多 價(jià)重組浣熊痘病毒可在貓細(xì)胞中感染并復(fù)制，且含有一個(gè)以上插入至非病毒復(fù)制所必需的 由淙熊痘病毒基因組的血凝素基因或胸苷激酶基因組成的區(qū)域中的外源基因，值得注意的 是，其中所述外源基因可操作地連接于用于表達(dá)的啟動(dòng)子；且每一外源基因編碼貓病原體 抗原。所述專利闡述編碼諸如下述貓病原體抗原的外源基因貓白血病病毒(FeLV Env)、 貓免疫缺陷病毒(FIV Gag)、貓免疫缺陷病毒(FIV Env)、貓傳染性腦膜炎病毒(FIPV M)、 貓傳染性腦膜炎病毒(FIPV N)、貓杯狀病毒(FCV衣殼蛋白)、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPV VP2)及狂犬病-G。 除獸醫(yī)疫苗技術(shù)中所作的所有努力外，業(yè)內(nèi)仍公認(rèn)需要可充分地保護(hù)豬不受一或
7多種病毒感染的安全且有效的單價(jià)或多價(jià)PCV及/或PRRSV重組疫苗。也需要通過投與能 夠給與豬抵抗P麗S及/或PRRS的充分保護(hù)性免疫反應(yīng)的重組疫苗來預(yù)防由PCV及/或 PRRSV引起的感染或疾病的安全且有效的方法。在投與豬后除獲得安全性及功效外，通過所 述重組疫苗也將獲得優(yōu)于常用滅活PRRSV疫苗的其它益處，即消除意外感染游離病毒或回 復(fù)至其病原性狀態(tài)的滅活病毒的風(fēng)險(xiǎn)。顯然，研發(fā)安全且有效的以浣熊痘病毒為載體的豬 疫苗在使用時(shí)將達(dá)成重要優(yōu)點(diǎn)，其可預(yù)防嚴(yán)重豬疾病、確保疫苗生產(chǎn)期間雇員安全且完全 消除病原性病毒未亡滅活的任何機(jī)會(huì)及商業(yè)生產(chǎn)中所用的去污染程序。
本說明書中所引用的所有專利及出版物的全文都以引用方式并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的最廣泛方面中，本發(fā)明提供安全且有效的重組痘病毒載體疫苗，其中 所述載體表達(dá)一或多種由一或多種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)分離株編碼的抗原 蛋白，優(yōu)選為在ha及/或tk基因座的一或多種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)分離株 的多個(gè)開放讀碼框單獨(dú)或與一或多個(gè)豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的開放讀碼框組合所編碼的 抗原蛋白。在一特定實(shí)施例中，所述載體進(jìn)一步包含編碼帶有FeLV P27+表型的貓白血病 病毒的糖蛋白的核酸分子。FeLV P27+或PCV-2衣殼基因可用作篩選不同組合中的無性系 的單標(biāo)簽。本發(fā)明也提供通過向需要保護(hù)的豬投與強(qiáng)效新穎重組疫苗來保護(hù)豬抵抗斷奶后 多系統(tǒng)衰竭綜合癥及/或豬繁殖與呼吸綜合癥的方法。 因此，本發(fā)明第一方面提供包含一或多個(gè)編碼豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV) 蛋白的外源核酸分子的重組浣熊痘病毒載體(rRCPV)，其中 a.)至少一個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的血凝素基因座或胸苷激酶 基因座中；或 b.)至少兩個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的血凝素基因座或胸苷激酶 基因座中；或 c.)至少一個(gè)核酸分子插入至血凝素基因座中且至少一個(gè)核酸分子插入至浣熊痘 病毒基因組的胸苷激酶基因座中；或 在一個(gè)實(shí)施例中，所述浣熊痘病毒載體包含至少兩個(gè)插入至血凝素基因座中的核
酸分子及至少兩個(gè)插入至浣熊痘病毒基因組的胸苷激酶基因座中的核酸分子。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組浣熊痘病毒載體進(jìn)一步包含除在所述浣熊痘病毒基因
組的胸苷激酶及血凝素基因座外也在所述浣熊痘病毒基因組的第三非必需位點(diǎn)中插入編
碼豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)蛋白的核酸分子。重組浣熊痘病毒基因組的任何非必
需位點(diǎn)都可涵蓋用于本發(fā)明。 在一個(gè)實(shí)施例中，浣熊痘病毒基因組的第三非必需位點(diǎn)是絲氨酸蛋白酶抑制劑位 點(diǎn)。 在一個(gè)實(shí)施例中，一或多個(gè)外源核酸分子的每一個(gè)都編碼一或多個(gè)豬繁殖與呼吸 綜合癥病毒的開放讀碼框。所述開放讀碼框選自由0RF1、 0RF2、 0RF3、 0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其組合組成的群組。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述痘病毒載體編碼相同豬繁殖與呼吸綜合癥病毒蛋白的至少 兩個(gè)拷貝。相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝可由兩個(gè)不同核酸分子編碼，或其可由相同核酸分子編碼。相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子，或相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝 可操作地連接于各別啟動(dòng)子。相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝可由選自由0RF1 、0RF2、0RF3、0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其組合組成的群組的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒開放讀碼框編碼。
在一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子插入至淙熊痘病毒基因組的血凝素基因 座及/或胸苷激酶基因座中。 在一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)外源核酸分子編碼至少兩個(gè)選自由下列組 成的群組的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的開放讀碼框0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0腦、0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及 0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。 在一個(gè)實(shí)施例中，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒是ISU12(愛荷華州)、Olot/91 (西班
牙)或二者。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組浣熊痘病毒載體進(jìn)一步包含編碼豬圓環(huán)病毒2型
(PCV2)的開放讀碼框(ORF)的核酸分子。 在一個(gè)實(shí)施例中，豬圓環(huán)病毒2開放讀碼框是0RF2。 在一個(gè)實(shí)施例中，PCV20RF2可單獨(dú)插入至浣熊痘病毒基因組的胸苷激酶基因座 中。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組浣熊痘病毒載體進(jìn)一步包含編碼貓白血病病毒P27+表 型的糖蛋白的核苷酸序列。 在一個(gè)實(shí)施例中，浣熊痘病毒是活病毒且可復(fù)制。 本發(fā)明第二方面提供包含免疫有效量的一或多種任何本文所述重組浣熊痘病毒 載體及任選地適宜載劑、稀釋劑或佐劑的重組豬疫苗。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組豬疫苗包含免疫有效量的兩種或更多種本文所述重組
浣熊痘病毒載體及任選地適宜載劑或稀釋劑。 在一個(gè)實(shí)施例中，浣熊痘病毒是活病毒且可復(fù)制。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述疫苗不含佐劑。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述疫苗以單次劑量或重復(fù)劑量投與。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組豬疫苗進(jìn)一步包含至少一種其它豬抗原。其它豬抗原 選自由下列組成的群組豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原、多殺巴斯德菌抗原、豬鏈 球菌抗原、胸膜肺炎放線桿菌抗原、支氣管敗血性博德特菌抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、豬 丹毒桿菌抗原、鉤端螺旋體細(xì)菌抗原、豬流感病毒抗原、豬細(xì)小病毒抗原、大腸桿菌抗原、豬 呼吸冠狀病毒抗原、輪狀病毒抗原、阿捷申氏病的致病病原體抗原、豬傳染性胃腸炎抗原及 其組合。 本發(fā)明第三方面提供誘發(fā)抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包
含向豬類動(dòng)物投與由一或多種本文所述重組浣熊痘病毒載體構(gòu)成的重組豬疫苗。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述免疫反應(yīng)是體液或抗體調(diào)介的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述
免疫反應(yīng)是細(xì)胞調(diào)介或T細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng)。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述保護(hù)性免疫反應(yīng)是通過投與介于約4. 5Logl。TCID5。/ml至約 7. 5Logl。TCID5。/ml范圍內(nèi)的疫苗劑量誘發(fā)。 在一個(gè)實(shí)施例中，用于誘發(fā)免疫反應(yīng)的重組豬疫苗包含一或多種活的且可復(fù)制的
9重組浣熊痘病毒載體。 在一個(gè)實(shí)施例中，用于誘發(fā)免疫反應(yīng)的重組豬疫苗包含兩種或更多種活的且可復(fù) 制的重組浣熊痘病毒載體。 本發(fā)明第四方面提供預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合癥及斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥的方
法，其包含向需要保護(hù)的豬類動(dòng)物投與包含免疫有效量的一或多種本文所述重組浣熊痘病
毒載體及任選地適宜載劑、稀釋劑或佐劑的重組豬疫苗。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組浣熊痘病毒載體是活載體且可復(fù)制。 本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明任一載體或疫苗的用途，其用以制備用于誘發(fā)對抗哺
乳動(dòng)物豬類病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)或預(yù)防哺乳動(dòng)物豬繁殖與呼吸綜合癥及/或斷奶后多
系統(tǒng)衰竭綜合癥的藥劑。


圖1是pFD2000A-FDAH質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO :1) 圖2是pFD2001TK-FDAH質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO :2) 圖3是pFD2003SEL-FDAH質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO :3) 圖4是pFD2003SEL-GPV-PV-FDAH質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO :4) 圖5是PCV2A 0RF2-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :5) 圖6是PCV2B 0RF2-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :6) 圖7是PRRSV ISU12-0RF3-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :7) 圖8是PRRSV ISU12-0RF4-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :8) 圖9是PRRSV ISU12-0RF5-FDAH的核酸序歹lj (SEQ ID NO :9) 圖IO是PRRSV ISU12-0RF6-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :10) 圖11是PRRSV ISU12-0RF7-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :11) 圖12是PRRSV 01ot91-0RF5_FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :12)
具體實(shí)施例方式
在闡述本發(fā)明方法及治療方法學(xué)之前，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于所述特定方法及實(shí)
驗(yàn)條件，因?yàn)樗龇椒皸l件可以變化。也應(yīng)了解，本文所用的術(shù)語僅出于闡述特定實(shí)施例
的目的而非意欲限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受限于隨附權(quán)利要求書。 除非上下文另外明確指出，否則本說明書及隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式
"一 (a、an)"及"所述(the)"包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，例如，"所述方法"的指示物包括一
或多種方法及/或本文所述類型步驟及/或在閱讀本揭示內(nèi)容后所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而
易見者等。 因此，在本申請案中，可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的常用分子生物學(xué)、微 生物學(xué)及重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中對所述技術(shù)進(jìn)行了充分闡釋。參見，例如，伯德(Byrd， CM)及赫魯比(Hruby， DE)，分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)，第269 巻牛痘病毒及痘病毒學(xué)(Vaccinia Virus and Poxvirology)，第3章，第31-40頁；薩 姆布魯克(Sambrook)，弗里茨赫(Fritsch)及瑪尼蒂斯(Maniatis)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室 手冊(Molecular Cloning :A Laboratory Ma皿al)，第二版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，紐約(本文中"薩姆布魯克等人， 1989") ;DNA克隆實(shí)踐途徑(DNA Cloning :A Practical Approach)，第I及II巻(格 洛弗(D.N. Glover)編輯，1985);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(給特 (M. J. Gait)編輯，1984);核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)(黑姆斯(B. D. Hames) 及希金斯(S. J. Higgins)編輯，(1985));轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)i華(Transcription And Translation) (黑姆斯及希金斯編輯，(1984));動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)(弗萊士尼 (R. I. Freshney)編輯，(1986));固定化細(xì)胞及酶(Immobilized Cells And Enzymes) (IRL出版社，(1986));珀巴奧(B. Perbal)，分子克隆的實(shí)踐指導(dǎo)(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984);奧蘇貝爾(F. M. Ausubel)等人(編輯)，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 技術(shù)(Current Protocols in MolecularBiology)，約翰威利父子出版公司(John Wiley & Sons) (1994)。 盡管任何與本文所述方法及材料類似或等效者都可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中， 但目前所述是優(yōu)選方法及材料。本文所提及的所有出版物的全文都以引用方式并入本文 中。 定義 本文所用的術(shù)語具有所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所公認(rèn)及習(xí)知的含義，然而，為方便及 完整起見，下文將對特定術(shù)語及其含義予以闡明。 術(shù)語"約"意指在20%內(nèi)，更優(yōu)選在10%內(nèi)且更優(yōu)選在5%內(nèi)。
術(shù)語"佐劑"是指可增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的化合物或混合物。佐劑可用作緩慢釋 放抗原的組織庫，且也可用作非特異性增強(qiáng)免疫反應(yīng)的淋巴樣系統(tǒng)激活劑(胡德(Hood)等 人，免疫學(xué)(Immunology)，第二版，1984，本杰明/卡明門洛園(Benjamin/Cummings :Menlo Park)，加利福尼亞，第384頁)。視環(huán)境而定，在無佐劑存在下單獨(dú)用抗原實(shí)施基本攻擊可 能不能引發(fā)體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑(complete Freund' s adjuvant)、不完全弗氏佐劑、皂苷、諸如氫氧化鋁等礦物凝膠、諸如溶血卵磷脂等表面活性 物質(zhì)、普流尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液、鑰孔蟲戚血蘭素、二硝基苯 酚及潛在有用的人類佐劑，例如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))及短小棒狀桿 菌(Corynebacterium parvum)。優(yōu)選地，佐劑是醫(yī)藥上可接受的佐劑。 術(shù)語"抗原"是指可在動(dòng)物中剌激抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞反應(yīng)的化合物、組合物或免疫 原性物質(zhì)，包括注射或吸收至動(dòng)物中的組合物。所述術(shù)語可用以指單個(gè)大分子或指抗原性 大分子的均質(zhì)或異質(zhì)群體。抗原與特定體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)。術(shù)語"抗原"廣義上涵 蓋包括蛋白質(zhì)、多肽、抗原蛋白片段、核酸、寡糖、多糖、有機(jī)及無機(jī)化學(xué)品或組合物及諸如 此類在內(nèi)的部分。而且，抗原可衍生自或獲自任何病毒、細(xì)菌、寄生蟲、原生動(dòng)物或真菌，且 可為整個(gè)生物體。術(shù)語"抗原"包括所有相關(guān)抗原表位。類似地，表達(dá)抗原的寡核苷酸或多核 苷酸(例如在核酸免疫應(yīng)用中)也包括于所述定義中。也包括合成抗原，例如，多表位、側(cè)翼 表位及其它重組或合成衍生抗原(伯格曼(Bergmann)等人，(1993)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur. J. Immunol.) 23 :27772781 ;伯格曼等人，(1996)免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 157 :3242 3249 ; 蘇赫貝爾(Suhrbier， A.) (1997)免疫學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)(Immunol, and Cell Biol. )75: 402408 ;加德納(Gardner)等人，(1998)第12屆世界AIDS會(huì)議，日內(nèi)瓦(Geneva)，瑞士， 1998年6月28日至7月3日)。
"由…編碼"或"編碼"是指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列含有具有 至少3個(gè)至5個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少8個(gè)至10個(gè)氨基酸、且甚至更優(yōu)選至少15個(gè)至20個(gè) 氨基酸的氨基酸序列，由所述核酸序列編碼的多肽。也涵蓋可與由所述序列編碼的多肽在 免疫學(xué)上視為一致的多肽序列。因此，抗原"多肽"、"蛋白質(zhì)"或"氨基酸"序列可與抗原的 多肽或氨基酸序列具有至少70%相似性，優(yōu)選至少約80%相似性，更優(yōu)選約90_95%相似 性且最優(yōu)選約99%相似性。 本文所用的術(shù)語"外源"意欲涵蓋在浣熊痘病毒基因組外部產(chǎn)生、起源、衍生或發(fā) 展者，即，自痘病毒基因組外部起源，例如，自相對于浣熊痘病毒基因組視為外來的PRRSV 獲得或分離的基因物質(zhì)。 在本發(fā)明上下文中所用的"基因"是遺傳功能所相關(guān)的核酸分子(染色體、質(zhì)粒 等)中的核苷酸序列?；蚴?例如)生物體的遺傳單位，其包含在生物體基因組內(nèi)占據(jù)特 定物理位置("基因基因座(gene locus)"或"遺傳基因座(genetic locus)")的多核苷酸 序列(例如，哺乳動(dòng)物的DNA序列)?；蚩删幋a所表達(dá)的產(chǎn)物，例如多肽或多核苷酸(例 如，tRNA)。或者，基因可界定特定事件/功能的基因組位置，例如蛋白質(zhì)及/或核酸的結(jié)合 (例如，噬菌體附著位點(diǎn))，其中所述基因不編碼所表達(dá)的產(chǎn)物。通常，基因包括諸如多肽編 碼序列等編碼序列及諸如啟動(dòng)子序列、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(例如，增強(qiáng)子序 列)等非編碼序列。許多真核基因具有由"內(nèi)含子"(非編碼序列)中斷的"外顯子"(編 碼序列)。在某些情形下，基因可與一或多個(gè)另外基因(例如，重疊基因)共享序列。
對抗原或疫苗組合物的"免疫反應(yīng)"是在個(gè)體中形成對存在于所關(guān)注抗原或疫苗 組合物中的分子的體液及/或細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng)。對本發(fā)明來說，"體液免疫反應(yīng)"是抗 體調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，且涉及產(chǎn)生對本發(fā)明抗原/疫苗具有親和性的抗體，而"細(xì)胞調(diào)介的免 疫反應(yīng)"是由T淋巴細(xì)胞及/或其它白細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng)。"細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng)"是通 過遞呈與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的I型或II型分子相關(guān)聯(lián)的抗原表位而引發(fā)。此激 活抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞("CTL") 。 CTL對與主要組織 相容性復(fù)合物(MHC)所編碼且在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)一起遞呈的肽抗原具有特異性。 CTL幫助誘發(fā)及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的細(xì)胞內(nèi)破壞或感染所述微生物的細(xì)胞溶解。細(xì)胞免疫 的另一方面涉及輔助T細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)。輔助T細(xì)胞用于幫助剌激所述功能，并使 非特異性效應(yīng)細(xì)胞的活性集中抵抗在表面上顯示肽抗原與MHC分子的細(xì)胞。"細(xì)胞調(diào)介的免 疫反應(yīng)"也是指產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子及激活T細(xì)胞及/或其它白細(xì)胞所產(chǎn)生的其它分子 (包括衍生自CD4+及CD8+T細(xì)胞者)。特定抗原或組合物剌激細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng)的能力 可通過數(shù)種分析法測定，例如通過淋巴組織增生(淋巴細(xì)胞激活)分析法、CTL細(xì)胞毒性細(xì) 胞分析法、通過分析對經(jīng)敏化個(gè)體中的抗原具有特異性的T淋巴細(xì)胞、或通過測量T細(xì)胞響 應(yīng)抗原再剌激而產(chǎn)生的細(xì)胞因子。所述分析法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。參見，例 如，埃里克森(Erickson)等人，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) (1993) 151 :4189-4199 ;都(Doe) 等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur. J. Immunol.) (1994)24 :2369-2376。
"免疫原性0RF"或"免疫原性orf "是指能引發(fā)免疫反應(yīng)的開放讀碼框。
本文所用的"免疫有效量"是指通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知的標(biāo)準(zhǔn)分析法測 量足以引發(fā)免疫反應(yīng)(細(xì)胞(T細(xì)胞)或體液(B細(xì)胞或抗體)反應(yīng))的抗原或疫苗的量。 例如，對于本發(fā)明來說，"免疫有效量"是> 4. 5至7. 5Logl。TCID5。/mL的最小保護(hù)劑量(效價(jià))?？乖鳛槊庖咴男Я赏ㄟ^增殖分析法、通過細(xì)胞溶解分析法(例如鉻釋放分析 法以測量T細(xì)胞溶解其特異性耙細(xì)胞的能力)或通過測量B細(xì)胞活性水平(通過測量對血 清中的抗原具有特異性的循環(huán)抗體水平)來測量。而且，免疫反應(yīng)的保護(hù)水平可通過攻擊 具有經(jīng)注射抗原的免疫化宿主來測量。例如，若期望免疫反應(yīng)的抗原是病毒或腫瘤細(xì)胞，則 "免疫有效量"的抗原所誘發(fā)的保護(hù)水平可通過檢測對動(dòng)物實(shí)施病毒或腫瘤細(xì)胞攻擊后的 存活率百分比或死亡率百分比來測量。 本文所定義的淙熊痘病毒基因組中的"非必需位點(diǎn)"意指病毒基因組中非病毒感 染或復(fù)制所必需的區(qū)域。浣熊痘病毒基因組中的非必需位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于胸苷激 酶(TK)位點(diǎn)、血凝素(HA)位點(diǎn)及絲氨酸蛋白酶抑制劑位點(diǎn)。浣熊痘病毒的TK位點(diǎn)闡述 于盧策-華萊士 (C. Lutze-Wallace)，西杜(M. Sidhu)及卡普樂(A. Ka卯eler)，病毒基因 (Virus Genes) 10 (1995)，第81-84頁。淙熊痘病毒的TK基因的序列也可參見PubMed登錄 號DQ066544及U08228。浣熊痘病毒的HA位點(diǎn)闡述于卡瓦拉羅(Cavallaro KF)及埃斯波 西托(Esposito， JJ)，病毒學(xué)(Virology) (1992) ，190(1) :434-9。淙熊痘病毒的HA基因的 序列也可參見PubMed登錄號AF375116。 術(shù)語"核酸分子"或"核酸序列"具有其普通含義，是指重復(fù)核苷酸(例如指導(dǎo)蛋 白質(zhì)合成過程的嘌呤及嘧啶堿基重復(fù)單元)長鏈，即，其編碼并表達(dá)蛋白質(zhì)物質(zhì)。與術(shù)語在 權(quán)利要求書中的使用一樣，核酸是指編碼豬繁殖與呼吸綜合癥病毒蛋白的已知外源或外來 基因，期望為開放讀碼框基因。 本文所用的術(shù)語"開放讀碼框"或"ORF"或"orf "是指無間插終止密碼子下編碼 特定病毒蛋白所需要的最小核苷酸序列。"可操作地連接"是指元件的排列，其中所闡述組件經(jīng)構(gòu)造可實(shí)施其通常功能。因 此，當(dāng)存在調(diào)節(jié)蛋白及合適酶時(shí)，可操作地連接于編碼序列(例如，編碼所關(guān)注抗原的序 列)的給定啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)。在一些情形下，某些控制元件不需要與編碼 序列鄰接，只要所述控制元件起指導(dǎo)其表達(dá)的作用即可。例如，啟動(dòng)子序列與編碼序列之間 可存在未經(jīng)轉(zhuǎn)譯而經(jīng)轉(zhuǎn)錄的間插序列，且所述啟動(dòng)子序列仍可視為"可操作地連接"于所述 編碼序列。因此，在細(xì)胞中，當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄至mRNA (其隨后經(jīng)反式RNA剪接 并轉(zhuǎn)譯成由所述編碼序列編碼的蛋白質(zhì))中時(shí)，編碼序列"可操作地連接"于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯控 制序列。 術(shù)語"豬(porcine及swine)"可互換使用，且是指任何豬科(Suidae)家族成員動(dòng) 物，例如豬(Pig)。"保護(hù)性"免疫反應(yīng)是指疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)(體液或細(xì)胞調(diào)介的免疫反應(yīng))的能 力，其用以保護(hù)哺乳動(dòng)物不受感染。所提供的保護(hù)無需為絕對的，即，感染無需完全預(yù)防或 根除，只要與豬哺乳動(dòng)物的對照群體(例如未投與疫苗的感染動(dòng)物)相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 改良即可。保護(hù)可限于減輕感染癥狀發(fā)作的嚴(yán)重性或迅速性。 本文所用的術(shù)語"重組體"僅僅是指通過標(biāo)準(zhǔn)基因工程方法所產(chǎn)生的浣熊痘病毒 構(gòu)建體。 術(shù)語"可復(fù)制的"是指能夠在適宜宿主細(xì)胞中復(fù)制、重制或再制的微生物，例如，諸
如淙熊痘病毒等病毒。 術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"在本文中可互換使用，且是指包含至少一種可在動(dòng)
13物中誘發(fā)免疫反應(yīng)及/或保護(hù)動(dòng)物免于由感染所引起的疾病或可能死亡的免疫活性組份 的醫(yī)藥組合物，且可能包括或可能不包括一或多種能夠增強(qiáng)活性組份的免疫活性的其它組 份。疫苗可另外包含其它典型醫(yī)藥組合物組份。"載體"是能夠在宿主生物體中復(fù)制且基因插入至其中以構(gòu)建重組DNA分子的DNA 分子。 概述 根據(jù)本發(fā)明，提供獨(dú)特的重組痘病毒載體，其中所述載體包含一或多個(gè)編碼豬繁 殖與呼吸綜合癥病毒蛋白的外源核酸分子。在一個(gè)實(shí)施例中，所述痘病毒載體可編碼相同 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒蛋白的至少兩個(gè)拷貝。所述相同蛋白的兩個(gè)拷貝可由兩個(gè)不同核 酸分子編碼或所述相同蛋白的兩個(gè)拷貝可由相同核酸分子編碼。所述相同蛋白的兩個(gè)拷貝 可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子或各別啟動(dòng)子。 所述蛋白可由分別在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多種豬繁 殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)分離株的開放讀碼框(例如0RFla或0RFlb至0RF7，優(yōu)選 為0RF5、 0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)與或不與豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的一或多個(gè)開 放讀碼框(例如0RF1至0RF13，優(yōu)選為0RF2)編碼。用于插入本文所述任何核酸分子的 痘病毒基因組的另一第三非必需位點(diǎn)是絲氨酸蛋白酶抑制劑位點(diǎn)。在一個(gè)特定實(shí)施例中， 兩個(gè)或更多個(gè)外源核酸分子編碼兩個(gè)或更多個(gè)選自由下列組成的群組的豬繁殖與呼吸綜 合癥病毒的開放讀碼框0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0RF6、 0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。
也在ha及/或tk基因座插入表達(dá)帶有FeLV P27+表型(在FeLV P27 ELISA中為藍(lán) 色)的貓白血病病毒(FeLV)的糖蛋白的基因。在所述構(gòu)建體中，F(xiàn)eLV P27+或PCV-20RF2 (衣 殼基因)用作單標(biāo)簽來篩選不同組合中的無性系。優(yōu)選的PRRSV分離株包含ISU12(愛荷 華州)及01ot/91(西班牙)菌株，但其它分離株可容易地代替在下文實(shí)例中闡釋本發(fā)明的 菌株。 因此，本發(fā)明的目的是在一個(gè)病毒構(gòu)建體中表達(dá)在浣熊痘病毒(RCNV)基因組的 血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的四個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV)的美國及歐洲菌株的開放讀碼框(ORF)或其與豬圓環(huán)病毒(PCV2)的ORF的組合以 制造強(qiáng)效疫苗。 本發(fā)明的另一 目的是使用新穎克隆篩選系統(tǒng)，所述系統(tǒng)利用有限稀釋及 藍(lán)-至-白蝕斑途徑或有限稀釋及病毒ELISA而非常用篩選標(biāo)簽(如LacZ)作為篩選標(biāo)簽。
上述目的是通過提供包含重組浣熊痘病毒載體(rRCNV)的新穎疫苗實(shí)現(xiàn)，其中所 述rRCNV表達(dá)分別在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多種PRRSV分離株的 多個(gè)開放讀碼框(優(yōu)選為0RF5、0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)與或不與PCV-2的開放讀碼 框(優(yōu)選為0RF2)。 先前表達(dá)系統(tǒng)的能力限于在一個(gè)病毒構(gòu)建體中僅表達(dá)PRRSV基因的一個(gè)或兩個(gè) 開放讀碼框(ORF)。本發(fā)明有利地容許表達(dá)四個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV)的美國及歐洲菌株的0RF或其與豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的開放讀碼框的組合。迄 今業(yè)內(nèi)無闡述，本發(fā)明的優(yōu)良表達(dá)系統(tǒng)容許在一個(gè)病毒構(gòu)建體中將來自PRRSV的多個(gè)ORF 插入至浣熊痘病毒(RCNV)基因組的ha及/或tk基因座及/或絲氨酸蛋白酶抑制劑基因座中由此產(chǎn)生保護(hù)豬抵抗PRRS的強(qiáng)效重組疫苗。 本發(fā)明使用利用有限稀釋及藍(lán)_至_白蝕斑途徑或有限稀釋及ELISA用作篩選標(biāo) 簽的篩選系統(tǒng)。非常有益地，所述篩選系統(tǒng)在一個(gè)病毒構(gòu)建體中可提供多個(gè)位點(diǎn)表達(dá)。
淙熊痘病毒(赫爾曼(Herman)菌株)首先由赫爾曼(Y. F. Herman)于1961-1962 年在馬里蘭(Maryland)阿伯丁 (Aberdeen)自無臨床癥狀的浣熊呼吸道中分離出來(赫爾 曼(Y. F. Herman)，"天然存在淙熊痘病毒的分離及表征(Isolation and characterization of anaturally occurring pox virus of raccoons)，，，細(xì)菌學(xué)進(jìn)展(Bacteriol. Proc.)， 第64屆美國微生物學(xué)學(xué)會(huì)年會(huì)(64th Annual Meeting of the American Society for Microbiology)，第117頁(1964))。在本發(fā)明rRCNV-PRRS構(gòu)建體中，將一或多種PRRSV基 因菌株的多個(gè)開放讀碼框(例如，0RF5、 0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)插入至浣熊痘病毒 (RCNV)基因組的ha及/或tk基因座中使無毒性赫爾曼菌株進(jìn)一步減毒。有利地，本發(fā)明 以rRCNV為載體的PRRSV疫苗也使疫苗生產(chǎn)期間雇員的安全性得以改良，且完全消除了病 原性病毒未亡滅活的機(jī)會(huì)及商業(yè)生產(chǎn)期間所用的去污染程序。 本發(fā)明涵蓋，本發(fā)明中所闡述的科學(xué)進(jìn)步及新穎方法可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng) 用于具有多個(gè)獲自PRRSV菌株而非ISU12及01ot/91的開放讀碼框的抗原蛋白，且可在浣 熊痘病毒載體的tk及/或ha基因座插入以提供用于抵抗PRRS的免疫原性疫苗。例如，諸如 北美菌株VR-2332、歐洲菌株萊利斯塔德病毒及諸如此類等其它菌株可容易地代替ISU12 及/或Olot/91菌株?；蛘?，由于RNA病毒易發(fā)生突變，因此可分離新領(lǐng)域分離株或病毒突 變體的期望ORF基因并用于本發(fā)明重組疫苗中。盡管如此，在迄今發(fā)現(xiàn)的PRRSV的許多突 變體及眾多分離株間存在高度同源性，且因此，在本發(fā)明疫苗構(gòu)建體中使用某些開放讀碼 框(例如0RF5或0RF6)具有可顯著有效抵抗PRRS的優(yōu)點(diǎn)。對于具有約40%的較低同源性 的分離株，本發(fā)明構(gòu)建體的實(shí)用優(yōu)點(diǎn)在于其可容易地容納來自多種病毒來源的若干ORF的 抗原蛋白以提供有效廣譜疫苗。通過對仔豬成功實(shí)施疫苗接種程序而進(jìn)行的所述PRRS預(yù) 防對豬產(chǎn)業(yè)極具重要性，此是因?yàn)閷τ谒黾膊]有有效的長期治療方案。
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋，可用于本發(fā)明的痘病毒載體可包含但不限于浣熊痘病毒、金 絲雀痘病毒、家禽痘病毒、豬痘病毒、牛痘病毒及諸如此類，但期望使用淙熊痘病毒。雖然滅 活痘病毒載體可用于本發(fā)明方法的實(shí)踐中，但優(yōu)選為活載體。 本發(fā)明也提供保護(hù)豬抵抗斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(P麗S)及/或豬繁殖與呼吸 綜合癥(PRRS)的新穎方法，其通過向需要保護(hù)的豬投與強(qiáng)效新穎重組疫苗來實(shí)施。
在本發(fā)明方法中，將免疫有效量的本發(fā)明疫苗投與至需要保護(hù)以抵抗P麗S及/或 PRRS的豬(尤其是幼小仔豬)以在動(dòng)物中誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。給與豬的有效免疫量是 可獲得疫苗的充分免疫反應(yīng)以保護(hù)豬不受PCV-2及/或PRRSV的有害影響的量。當(dāng)疫苗能 夠如疫苗領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)值所要求保護(hù)至少相當(dāng)數(shù)量的經(jīng)接種豬時(shí)，視為獲得保護(hù)性免疫反 應(yīng)。給動(dòng)物接種并引發(fā)滿意疫苗接種效應(yīng)的免疫學(xué)有效劑量或有效免疫量可通過常規(guī)測試 (例如，通過標(biāo)準(zhǔn)滴定研究)容易地測定或容易地滴定。 本發(fā)明新穎疫苗構(gòu)建體可用于約3月齡健康仔豬的疫苗接種以預(yù)防斷奶后多系 統(tǒng)衰竭綜合癥(P麗S)及/或豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)。也可將所述疫苗給與生育之前 的成熟或成年母豬(即，大于3個(gè)月)。所述疫苗可以單次劑量投與，或若抗體效價(jià)下降且 認(rèn)為需要加強(qiáng)注射則以重復(fù)劑量投與。期望地，所述疫苗以單次接種方式投與至健康動(dòng)物
15以提供抵抗疾病的長期保護(hù)，保護(hù)動(dòng)物至少一年至三年或更長時(shí)間。適當(dāng)劑量可通過標(biāo)準(zhǔn) 劑量滴定研究來測定。所述疫苗可含有免疫有效量的任何一種本文所述以重組浣熊痘病毒 為載體的構(gòu)建體。在另一實(shí)施例中，所述疫苗可含有免疫有效量的任何兩種或更多種本文 所述的重組浣熊痘病毒載體構(gòu)建體。 所述疫苗可容易地通過任一投與途徑給與，經(jīng)口、經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)皮(即，施于皮膚表 面上或皮膚表面處以全身吸收)、非經(jīng)腸等，盡管一些途徑對于特定動(dòng)物及處理者可能在邏 輯上較為困難。非經(jīng)腸投與途徑包括但不限于皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)(即，注射 或置于皮膚下)途徑及諸如此類。優(yōu)選地，所述疫苗是經(jīng)皮下投與。 雖然本發(fā)明疫苗高度期望使用活浣熊痘病毒以獲得最佳且強(qiáng)效免疫功效，但是所 述痘病毒載體可為活載體或通過常用程序滅活以制備滅活病毒疫苗，例如使用BEI(二元 氮丙啶)、甲醛及諸如此類，BEI是優(yōu)選滅活劑。 有益的是，表達(dá)PCV-2及/或PRRSV的多個(gè)0RF的活重組RCNV(單獨(dú)或與適宜 載劑、稀釋劑及佐劑組合)是有用的疫苗。疫苗產(chǎn)物可任選地含有多種典型無毒性醫(yī)藥 上可接受的添加劑、稀釋劑及佐劑，包括但不限于防腐劑；穩(wěn)定劑；乳化劑；氫氧化鋁；磷 酸鋁；pH調(diào)節(jié)劑，例如氫氧化鈉、鹽酸等；表面活性齊U，例如吐溫(Tween) 80(聚山梨醇酯 80，可自西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密蘇里州(MO)購 得)；脂質(zhì)體；免疫剌激復(fù)合物(iscom)佐劑；合成糖肽，例如胞壁酰二肽；增量劑，例如葡 聚糖或葡聚糖與例如磷酸鋁、硫酸葡聚糖、DEAE-葡聚糖及諸如此類的組合；聚羧乙烯，例 如卡波姆(CARB0P0L) (聚丙烯酸聚合物，可自古德銳馳(B. F. Goodrich)公司，克里夫蘭
向
(Cleveland)，俄亥俄州(Ohio)購得)；乙烯馬來酸酐或乙烯/馬來酸酐共聚物(EMA ，線性
乙烯/馬來酸酐共聚物，具有大致等量的乙烯及馬來酸酐，其估計(jì)平均分子量為約75， 000 至100，000，可自孟山都公司(Monsanto Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密蘇里州(M0)購得); 丙烯酸系共聚物乳液，例如苯乙烯與丙烯酸及甲基丙烯酸的混合物的共聚物，如NE0CRY1^ A640(例如美國專利第5，047， 238號，與苯乙烯混合的丙烯酸及甲基丙烯酸的未聚結(jié)水性 丙烯酸共聚物，可自聚乙烯基化學(xué)(Polyvinyl Chemicals)公司，威爾明頓(Wilmington), 馬薩諸塞州(MA)購得)；細(xì)菌細(xì)胞壁，例如分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；衍生自棒狀桿菌的佐 劑，例如短小棒狀桿菌；衍生自丙酸桿菌的佐劑，例如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne);牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG);亞病毒微粒佐劑，例如環(huán)狀 病毒(orbivirus);霍亂毒素；N， N-二 (十八烷基)-N' ， N' _雙(2-羥基乙基)-丙二 胺(阿夫立定(avridine));單磷酰脂質(zhì)A;二甲基二 (十八烷基)溴化銨(DDA，可自柯達(dá) (Kodak)，羅徹斯特(Rochester)，紐約州(NY)購得)；其合成物及混合物?？稍诒景l(fā)明疫 苗中使用的其它添加劑包括但不限于右旋糖、常用抗氧化劑及常用螯合劑，例如乙二胺四 乙酸(EDTA)?？扇芜x地補(bǔ)充疫苗調(diào)配物的其它醫(yī)藥上可接受的佐劑包括但不限于聚陰離 子、聚陽離子、肽、礦物油乳液、免疫調(diào)節(jié)齊U、多種組合及諸如此類。適宜佐劑的其它非限制 性實(shí)例包括角鯊?fù)榧敖酋徬?或其它動(dòng)物來源的油)；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物， 例如普羅尼克(PLUR0NIC) (L121，例如，可自巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，路 德維希港(Ludwigshafen)，德國購得)；皂苷；Quil A(皂樹皮經(jīng)純化形式的商品名，可自 斯泰克(Iscotec AB)，瑞典及蘇珀福斯(Superfos Biosector a/s)，維德伯克(Vedbaek)， 丹麥購得)；礦物油，例如瑪考(MARCOL)②(液體飽和烴的經(jīng)純化混合物，可自?？松梨?Exxon-Mobil)，費(fèi)爾法克斯(Fairfax)，弗吉尼亞州(VA)購得)；植物油，例如花生油；白 細(xì)胞介素，例如白細(xì)胞介素-2及白細(xì)胞介素-12 ;干擾素，例如Y干擾素；動(dòng)物痘病毒蛋白
或其混合物。適宜穩(wěn)定劑的實(shí)例包括但不限于蔗糖、明膠、蛋白胨、諸如NZ-胺或NZ-胺AS 等經(jīng)消化的蛋白質(zhì)提取物。乳化劑的實(shí)例包括但不限于礦物油、植物油、花生油及其它可用 于可注射或鼻內(nèi)疫苗的標(biāo)準(zhǔn)可代謝無毒性油。期望地，氫氧化鋁與諸如皂苷或Quil A等其 它佐劑混合以形成諸如皂苷_氫氧化鋁或Quil A-氫氧化鋁等組合。 優(yōu)選佐劑包含乙烯/馬來酸酐共聚物、苯乙烯與丙烯酸及甲基丙烯酸混合物的共 聚物、礦物油乳液或其組合。可顯著增強(qiáng)本發(fā)明rRCNV-PRRS構(gòu)建體效能的尤其優(yōu)選佐劑 系統(tǒng)包含諸如EMA-31 (線性乙烯/馬來酸酐共聚物，具有大致等量的乙烯及馬來酸酐，其 估計(jì)平均分子量為約75， 000至100， OOO，可自孟山都公司(Monsanto Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密蘇里州(M0)購得)等乙烯/馬來酸酐共聚物與諸如NE0CRYL (與苯乙烯混合 的丙烯酸及甲基丙烯酸的未聚結(jié)水性丙烯酸共聚物(丙烯酸系_苯乙烯乳液)，可自聚乙烯 基化學(xué)(Polyvinyl Chemicals)公司，威爾明頓(Wilmington)，馬薩諸塞州(MA)購得)等 丙烯酸共聚物乳液的組合。 本發(fā)明重組疫苗組合物也可任選地含有一或多種其它豬抗原的混合物，所述一或 多種其它豬抗原是例如豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎 放線桿菌、支氣管敗血性博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌、鉤端螺旋體細(xì)菌、豬流感 病毒(SIV)、豬細(xì)小病毒、大腸桿菌、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、阿捷申氏病的致病病原體、 豬傳染性胃腸炎等。 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知的任一方法均可用于制備本發(fā)明的基因構(gòu)建體。例 如，可利用特定限制位點(diǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)方法將任何期望核酸序列插入至浣熊痘病毒載體中?；?者，如本文所述，當(dāng)期望插入較大序列時(shí)或當(dāng)期望插入多個(gè)基因時(shí)，可利用同源重組技術(shù)。 在所述方法中，插入位點(diǎn)(擬向其中插入多個(gè)基因)側(cè)翼的質(zhì)粒序列含有與存在于浣熊痘 病毒基因組中的序列具有充分同源性的序列以調(diào)介重組。所述側(cè)翼序列必須與非浣熊痘病 毒生長及繁殖所必需的浣熊痘病毒區(qū)域同源，例如血凝素基因座或胸苷激酶基因座或絲氨 酸蛋白酶抑制劑基因座。盡管可使用一個(gè)啟動(dòng)子來推動(dòng)兩個(gè)擬重組外源基因的表達(dá)，但是 在插入載體中使用兩個(gè)啟動(dòng)子(各啟動(dòng)子可操作地連接于單個(gè)基因)也將提供充分表達(dá)。
通常，病毒rRCNV-PRRS可通過藍(lán)-至-白蝕斑途徑構(gòu)建，例如，通過以下五 個(gè)主要步驟(1)將PRRSV ISU12 (愛荷華州)及Olot/91 (西班牙分離株)菌株的 0RF5、 0RF6、 0RF7或0RF3克隆至質(zhì)粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；(2)構(gòu)建質(zhì)粒 pFD2000A PRRS 0RF7 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)或質(zhì)粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pu) -0RF5 (Olot) (PSEL) -0RF6 (PSEL) -0RF5 (PSEL) ; (3)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系 庫C0S7細(xì)胞、步驟2中的質(zhì)粒及rRCNV-FeLV ; (4)通過有限稀釋及藍(lán)-至-白蝕斑途徑實(shí) 施無性系篩選；及(5)通過PCR、ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRSbtJ勺分子特征?；蛘撸?可使用白-至-藍(lán)蝕斑途徑，其中實(shí)施以下五個(gè)主要步驟(l)將PRRSV ISU12及Olot/91 菌株的0RF5及0RF6、FeLV P27克隆至質(zhì)粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；(2)構(gòu)建質(zhì)粒 pFD2000A FeLV P27 (Pu)-PRRS 0RF5(01ot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)或pFD2000A PRRS 0RF5 (Olot) (P弧)-0RF6 (P弧)-0RF5〃LacZ (P7.5) ; (3)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫 C0S7細(xì)胞、步驟2中的質(zhì)粒及RCNV ; (4)通過有限稀釋及FeLV P27ELISA或LacZ實(shí)施無性系篩選；及(5)通過PCR、ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRS幽的分子特征。
本發(fā)明rRCNV-PRRS-PCV可通過以下五個(gè)主要步驟構(gòu)建(l)將PRRSV ISU12及 01ot/91菌株的0RF5、 0RF6、 0RF3及PCV20RF2 (衣殼基因)克隆至質(zhì)粒pFD2000A及/或 pFD2003SEL中;(2)構(gòu)建質(zhì)粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-ORF 5 (P弧)-PCV20RF2 (Pu或P弧)；(3)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、步驟2 中的質(zhì)粒及RCNV ; (4)通過有限稀釋及PCV2ELISA(作為篩選標(biāo)簽)實(shí)施無性系篩選；及(5) 通過PCR、ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRSPCT的分子特征?；蛘?，可使用白_至_藍(lán)蝕 斑途徑，其中實(shí)施以下四個(gè)主要步驟(l)將PCV20RF2克隆至質(zhì)粒pFD2001TK或pFD2006TK 中以產(chǎn)生質(zhì)粒pFD2001TK PCV 0RF2 ; (2)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、 步驟l中的質(zhì)粒及rRCNV-PRRS 0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL) ;(3)通 過有限稀釋及PCV2ELISA或LacZ實(shí)施無性系篩選；及(5)通過PCR、ELISA及西方墨點(diǎn)法測 定rRCNV-PRRS〃PCV的分子特征。
實(shí)例 以下實(shí)例展示本發(fā)明的某些方面。然而，應(yīng)了解所述實(shí)例僅用于闡釋而非欲將本 發(fā)明完全限定于所述條件及范圍。應(yīng)了解，當(dāng)給出典型反應(yīng)條件(例如，溫度、反應(yīng)時(shí)間等) 時(shí)，也可使用規(guī)定范圍以上及以下的條件，雖然通常較為不適宜。所述實(shí)例是在室溫(約 23t:至約28t:)及大氣壓力下實(shí)施。除非另有說明，否則本文所提及的所有份數(shù)及百分比 都以重量計(jì)，且所有溫度都以攝氏度表示。
實(shí)例1 :構(gòu)建rRCNV-PRRS (藍(lán)-至-白蝕斑途徑) rRCNV-PRRSbtw是通過以下五個(gè)主要步驟構(gòu)建(l)將PRRSV ISU12 (愛荷華 州)及01ot/91 (西班牙分離株)菌株的0RF5、 0RF6、 0RF7或0RF3克隆至質(zhì)粒pFD2000A 及/或pFD2003SEL中；(2)構(gòu)建質(zhì)粒pFD2000A PRRS 0RF7或0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (P弧)-0RF6 (P弧)-0RF5 (P弧)；(3)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、步驟2 中的質(zhì)粒及rRCNV-FeLV ; (4)通過有限稀釋及藍(lán)-至-白蝕斑途徑實(shí)施無性系篩選；及(5) 通過PCR、 ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRSbtw的分子特征。 所述藍(lán)-至-白蝕斑篩選途徑使用具有FeLV P27+表型(在FeLV P27ELISA 中為藍(lán)色)的親本病毒rRCNV-FeLV。 通過介于rRCNV-FeLV與pFD200A PRRS 0RF7-0RF5 (Olot) -0RF6-0RF5之間的RCNV HA側(cè)翼序列的同源重組，重組rRCNV-PRRS的表 型將自藍(lán)蝕斑變成白蝕斑，這是因?yàn)镻RRSV ORF插入ha基因座以替代親本菌株中的FeLV gag-env gp85序列(rRCNV-FeLV-藍(lán)蝕斑)。
實(shí)例2 :構(gòu)建rRCNV-PRRS (白-至-藍(lán)蝕斑途徑) rRCNV-PRRSwtb是通過以下五個(gè)主要步驟構(gòu)建(1)將PRRSV ISU12及Olot/91菌 株的0RF5及0RF6、 FeLV P27克隆至質(zhì)粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中;(2)構(gòu)建質(zhì)粒 pFD2000A FeLV P27 (Pn)-PRRS 0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL) ;(3)通過三方面 感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、步驟2中的質(zhì)粒及RCNV ; (4)通過有限稀釋及FeLV P27ELISA或LacZ實(shí)施無性系篩選；及(5)通過PCR、ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRS^ 的分子特征。 所述白-至-藍(lán)蝕斑篩選途徑使用具有FeLV P27+或LacZ表型(在FeLV P27ELISA 或LacZ+表型中為藍(lán)色)的重組病毒rRCNV-PRRS幽，而野生型RCNV在FeLV P27ELISA或LacZ染色中顯示白色。 實(shí)例3 :構(gòu)建rRCNV-PRRS-PCV rRCNV_PRRSpcv是通過以下五個(gè)主要步驟構(gòu)建(1)將PRRSV ISU12及01ot/91菌 株的0RF5、 0RF6、 0RF3及PCV20RF2 (衣殼基因)克隆至質(zhì)粒pFD2000A及/或pFD2003SEL 中;(2)構(gòu)建質(zhì)粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pu)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)-PCV2 0RF2(Pn或P^) ;(3)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、步驟2中的質(zhì)粒及 RCNV ; (4)通過有限稀釋及PCV2ELISA(作為篩選標(biāo)簽)實(shí)施無性系篩選；及(5)通過PCR、 ELISA及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRSpev的分子特征。 所述PCV2途徑使用PCV-2衣殼ELISA作為單標(biāo)簽來篩選無性系，且用以在一個(gè)病 毒構(gòu)建體中創(chuàng)建新穎rRCNV-PRRS/PCV組合疫苗。 或者，所述rRCNV-PRRSp。v是通過以下四個(gè)主要步驟構(gòu)建(l)將PCV2 0RF2(衣殼 基因)克隆至質(zhì)粒pFD2001TK及/或pFD2006TK中以產(chǎn)生質(zhì)粒pFD2001TKPCV20RF2 (P^或 PSJ ; (2)通過三方面感染/轉(zhuǎn)染創(chuàng)建無性系庫C0S7細(xì)胞、步驟1中的質(zhì)粒及rRCNV-PRRS ; (3)通過有限稀釋及PCV2ELISA(作為篩選標(biāo)簽)實(shí)施無性系篩選；及(5)通過PCR、ELISA 及西方墨點(diǎn)法測定rRCNV-PRRS〃PCV的分子特征。
實(shí)例4 :rRCNV-PRRS候選疫苗在豬中的功效研究在有或無免疫增強(qiáng)佐劑下調(diào)配上述構(gòu)建體(rRCNV-PRRSbtw、 rRCNV_PRRSwtb及
rRCNV-PRRSpev)，并在豬中評價(jià)疫苗功效。攻擊研究的成功結(jié)果將顯示重組PRRS、 PCV或組
合疫苗在豬中的功效。 實(shí)例5 :構(gòu)建rRCNV-PRRSV 簡單來說，病毒rRCNV-PRRSV是通過將豬呼吸與繁殖綜合癥病毒(PRRSV) ISU12(美國菌株)的包膜糖蛋白(orf 5)基因及基質(zhì)蛋白(orf 6)基因及PRRSV Olot 91(歐洲菌株)基因的包膜糖蛋白(orf 5)基因插入至RCNV基因組(無毒性赫爾曼菌株) 的血凝集(ha)基因座中來構(gòu)建。 rRCNV-PRRSV的構(gòu)建過程通過兩個(gè)主要步驟來提供。第一，將PRRSV ISU 12菌 株的經(jīng)PCR擴(kuò)增的603bp orf 5及525bp orf6及PRRSV Olot 91菌株的606bp orf 5亞 克隆至質(zhì)粒pFD2003SEL載體(在啟動(dòng)子Pll控制下含有l(wèi)acZ報(bào)告基因)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒 pFD2003SEL-PRRSV Olot 91 orf5-(SEL)-ISU 12orf 6(SEL)_ISU 12orf 5 (SEL)。 PRRSV ISU 12orf5及orf6及PRRSV Olo 91 orf5基因二者在啟動(dòng)子P弧控制下共表達(dá)。第二，實(shí)施 C0S-7細(xì)胞中的rRCNV-FCV(2280-DDl)及質(zhì)粒pFD2003SEL-PRRSV01ot 91 orf5-(SEL)-ISU 12 orf 6 (SEL)-ISU 12 orf 5 (SEL)的三方面共感染/轉(zhuǎn)染以通過ha基因座處的等位 基因交換產(chǎn)生rRCNV-PRRSV。通過五個(gè)蝕斑純化相繼循環(huán)在非洲綠猴腎細(xì)胞中克隆藍(lán) 蝕斑(Lac+)。將候選無性系在非洲綠猴腎細(xì)胞中使用補(bǔ)充有0.05%乳清蛋白水解產(chǎn)物 (LAH) 、30 ii g/mL硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate)及5%胎牛血清的最低必需培養(yǎng)基 (MEM)進(jìn)一步再擴(kuò)展兩次，且其后通過基因特異性PCR證實(shí)。第七通道用以制備預(yù)備種源 (pre-master seed)。種源是通過對預(yù)備種源及指定rRCNV-PRRSV分別實(shí)施1 : 20， 000稀 釋建立，其中作為活載體的浣熊痘病毒能夠表達(dá)在ha基因座的PRRSV ISU 12及Olot 91 菌株的PRRSV包膜糖蛋白(orf5)及基質(zhì)蛋白(M) 。 PRRSV疫苗的種源病毒活浣熊痘病毒載 體(rRCNV-PRRSV)是通過PRRSV orf5或orf6基因特異性PCR測試確定。正在仔豬及母豬
19中實(shí)施豬呼吸與繁殖綜合癥病毒疫苗的免疫原性研究，單獨(dú)活/滅活浣熊痘病毒載體或其 與蘇瓦克PCV2—?jiǎng)?SuvaxynPCV20ne Dose)及或蘇瓦克MH-1 (Suvaxyn MH-one)、或活嵌合 cPCVl-2及或經(jīng)修飾的活豬肺炎支原體(例如，J菌株)的組合。 實(shí)例6 :豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗在仔豬中的免疫原性研究，單獨(dú)活浣熊痘 病毒載體或其與蘇瓦克PCV2 —?jiǎng)?Suvaxyn PCV20ne Dose)的組合 為展示PRRSV部分的功效，將以兩次劑量方案以2-3周間隔向豬投與rRCNV-PRRSV 疫苗(凍干的餅)及作為稀釋劑的含佐劑的無菌水或蘇瓦克PCV2 —?jiǎng)?Suvaxyn PCV20ne Dose)，隨后在第二次疫苗接種后實(shí)施毒性PRRSV攻擊或PRRSV/PCV2共攻擊2-3周。 rRCNV-PRRSV部分的功效將基于PRRSV病毒血癥減輕及由PRRSV引起的肺損傷減輕來評價(jià)。 蘇瓦克(Suvaxyn) PCV20ne含有用FDAH的專利佐劑調(diào)配的滅活豬第一型_圓環(huán)病毒2型 嵌合體(cPCVl-2)。
材料和方法
測試動(dòng)物 所述研究使用至少40只(20只疫苗接種及20只對照)混合飼養(yǎng)雄性及雌性常見 豬(3周齡或更大)。用于所述研究的豬自商業(yè)農(nóng)場購得，且使用耳標(biāo)標(biāo)識(shí)。將自單個(gè)畜群 來源獲得豬。在第一次疫苗接種時(shí)，通過埃特斯畜檢ELISA(IDEXX HerdCheckELISA)試劑 盒(S/P比率小于0. 4)測定，豬呈現(xiàn)PRRSV血清陰性。
測li式錢
測li鵬制勺誠 凍干部分所述疫苗由活rRCNV-PRRSV組成。將在五次平行測定分析中滴定疫 苗的病毒效價(jià)以確定研究中的投與劑量。液體部分稀釋劑為蘇瓦克PCV2—?jiǎng)?Suvaxyn PCV20ne Dose)或20%的SL-CD佐劑。在疫苗接種時(shí)，將rRCNV-PRRSV的凍干部分用液體
部分再水化。
研究設(shè)計(jì) 所提出的研究為隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)(優(yōu)效性試驗(yàn))。將同胎幼仔(Litter)分配 至各研究平行測定中。隨后將各研究中同胎幼仔內(nèi)的仔豬如下分成兩個(gè)群組
群組疫苗動(dòng)物數(shù)量
vi-疫苗接種凍干rRCNV-PRRSV (餅)+蘇瓦克PCV2 —?jiǎng)?S證xynPCV2 0neDose)> 20
ci-對照蘇瓦克PCV2 —?jiǎng)?SuvaxynPCV20neDose)(稀釋劑)> 20
V2-疫苗接種凍干rRCNV-PRRSV (餅)+水-SL-CD佐劑(稀釋劑)> 20
C2-對照水-SL-CD佐劑(稀釋劑)> 20 疫苗接種 疫苗接種途徑為在頸右側(cè)上經(jīng)肌內(nèi)。
20
對于研究1中的豬將給與群組VI兩次2. 0mL劑量的rRCNV_PRRSV+蘇瓦克PCV2
一劑；將給與對照群組CI中的豬兩次2. OmL劑量的蘇瓦克PCV2 —?jiǎng)?。對于研?中的豬將給與群組V2兩次2. OmL劑量的rRCNV_PRRSV+水/SL-CD ;
將給與對照群組C2中的豬兩次2. OmL劑量的水-SL-CD佐劑。 第一次疫苗接種在3周齡時(shí)實(shí)施，且在2-3周之后重復(fù)疫苗接種。 所有動(dòng)物將在第二次疫苗接種后兩周至三周實(shí)施毒性攻擊。 用至少2 x 104' 8FAID5。的野生型病原性PCV2 (菌株40895)及用至少2 x10"TCIDs。的PRRSV(ISU-12或等效物)對群組V1及C1中的豬進(jìn)行攻擊。在攻擊之前將所述兩種攻擊物質(zhì)在一起混合至少30分鐘。攻擊劑量為鼻內(nèi)4mL(2mL/鼻孔)。
用至少2 x 104°TCID5。的PRRSV(ISU_12或等效物)對群組V2及C2中的豬進(jìn)行攻擊。攻擊劑量為鼻內(nèi)2mL(lmL/鼻孔)。攻擊報(bào)告參見附件2。 在攻擊當(dāng)天通過PCV2特異性及PRRSV特異性間接免疫熒光分析(IFA)對攻擊病
毒進(jìn)行滴定。
纖 在攻擊后(DPC)第-2天至第10天每天觀測所有豬的臨床體征及溫度。將任何異常觀測報(bào)告給研究主管或農(nóng)場獸醫(yī)。 所監(jiān)測的臨床體征可包括但不限于食欲不振、嗜睡、抑郁癥、腹瀉、噴嚏、咳嗽、流
鼻涕、眼分泌物、呼吸困難及死亡。若任何豬在攻擊后觀測時(shí)間段期間死亡，則將實(shí)施尸檢
且尸檢報(bào)告附于最后報(bào)告中。 樣品收集及測試 樣品收集 鼻擦拭物 在PRRSV及PCV2分離株第一次疫苗接種后(DPV1)第0天收集鼻擦拭物以確保在疫苗接種之前測試動(dòng)物中無PRRSV或PCV2感染。 將鼻擦拭物樣品放置于含有3mL MEM的單獨(dú)滅菌管中，并在-S(TC下或低于_50°C下儲(chǔ)存直至測試，所述MEM中含有乳清蛋白水解產(chǎn)物(LAH)及慶大霉素(60ii g/mL)、青霉素(100U/mL)及鏈霉素(lOOii g/mL)。
血清樣品在0DPV1、0DPV2、7DPV2、14DPV2、-1、6及9對豬進(jìn)行抽血以獲得血清樣品(不多于lOmL)用于ELISA測試，且在_1、3、6及9抽血用于PCR測試。
■ 將在10-11DPC對所有動(dòng)物進(jìn)行尸檢。收集肺以用于肺損傷記分。 樣品測試 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) 通過埃特斯⑧畜檢ELISA試劑盒(威斯布魯克(Westbrook) ， ME)檢測PRRSV的血清抗體。簡單來說，將血清樣品l : 40稀釋于樣品稀釋劑中，并將100iiL每種樣品一式兩份(一個(gè)孔用于PRRSV抗原且一個(gè)孔用于正常宿主細(xì)胞(NHC)抗原)添加至涂敷有抗原的96孔板中。在于室溫下培育30分鐘時(shí)間段后，倒出液體，并將所述板用約300i! L磷酸鹽緩沖洗滌溶液洗滌3-5次。隨后向所有孔中添加100 y L抗豬-HRP0偶聯(lián)物。將板在室溫下培育30分鐘。在培育時(shí)間段后，再次如上洗滌板。隨后向各孔中添加lOOyL TMB底物溶液。將所述板在室溫下培育15分鐘，隨后向所有孔中添加100 L終止溶液以終止反應(yīng)。隨后在650nm處于微量板讀數(shù)器上測量光密度(OD)。任意血清效價(jià)將以樣品/陽性(S/P)比率報(bào)告，且通過使樣品OD-PRRSV減去樣品OD-NHC的數(shù)值除以平均陽性對照-PRRSV減去平均陽性對照-NHC的數(shù)值來測定。
PCR測試 利用PRRSV特異性RT-PCR測試來檢測血清中PRRSV的存在。RNA提取將在血清樣品上使用恰普(QIAamp)⑧病毒RNA微型試劑盒(瓦倫西亞(Valencia) ， CA)實(shí)施。
各個(gè)體豬的肺將由兩個(gè)獨(dú)立記分員針對總?cè)庋劭梢姄p傷基于損傷所侵襲肺薄壁組織的量來檢驗(yàn)。損傷記分員不知情各豬的治療方案一致性。簡單來說，各肺葉中的肺損傷記分將通過估計(jì)展示PRRSV樣損傷(基于顏色及紋理)的肺葉百分比來確定，并乘以所述肺葉的可能點(diǎn)值。各肺葉的最大記分是通過所述肺葉占總肺體積的相對百分比來測定。隨后將所有肺葉的背側(cè)及腹側(cè)方面的記分相加在一起以獲得各豬的總記分。每一動(dòng)物的可能的最大總記分是100。
一級結(jié)果 為主張肺損傷減少，對肺上所存在損傷的總記分予以評定。
二級結(jié)果 二級結(jié)果為PRRSV病毒血癥的發(fā)生。
鄉(xiāng)充i十，條
估i十量 為對肺損傷嚴(yán)重性的降低予以評價(jià)，估計(jì)量將為減輕部分(MF)統(tǒng)計(jì)量。減輕部分將如下計(jì)算 MF，—"""""') 其中=魏克森等級和統(tǒng)計(jì)量(Wilcoxon Rank sum statistic) n。=對照群組中個(gè)體的數(shù)量 nv =每一疫苗接種群組中個(gè)體的數(shù)量 *注將對每一研究平行測定的MF統(tǒng)計(jì)量予以估計(jì)。 i十算區(qū)間估i十的方法的陳沭 將計(jì)算每一研究平行測定的減輕部分的95%置信區(qū)間。 假設(shè)陳沭 為主張肺損傷嚴(yán)重性降低 H0:MV = MC HA:MV#MC 其中 Mv =疫苗接種群組中肺 損傷記分等級的中值
M。=對照群組中肺損傷記分等級的中值 所述研究將測試零假設(shè)，即對于每一研究平行測定疫苗接種群組與安慰劑對照群組之間無肺損傷嚴(yán)重性(等級)差異。
其它統(tǒng)計(jì)學(xué)考虎 豬同胎幼仔分布將在同胎幼仔內(nèi)隨機(jī)分配。
鄉(xiāng)充i十，條
統(tǒng)i十學(xué)方法
一級結(jié)果 動(dòng)物內(nèi)記分的測試再現(xiàn)性將通過同類相關(guān)進(jìn)行評定。若認(rèn)為測試再現(xiàn)性足夠，則將通過取來自每一記分員的肺記分的平均值來計(jì)算每只豬的平均肺記分。通過魏克森等級和以計(jì)算的肺記分作為因變量且以所包括的治療作為自變量對各研究平行測定的兩個(gè)治療群組間計(jì)算的肺記分進(jìn)行比較。若存在足夠完全區(qū)組，則將通過同胎幼仔對所述分析進(jìn)行分級。估計(jì)HL偏移。自魏克森統(tǒng)計(jì)量估計(jì)MF。
二級結(jié)果 針對病毒血癥發(fā)生對二級結(jié)果予以評定。單次發(fā)生病毒血癥將把豬歸類為病毒血癥陽性(是或否)。在一般化線性混合模型中以病毒血癥發(fā)生(是或否)作為二項(xiàng)式因變量且以所包括的治療作為自變量對治療群組間的病毒血癥進(jìn)行比較。若存在足夠完全區(qū)組，則將同胎幼仔作為隨機(jī)效果協(xié)變量包括于模型中。 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將使用SAS系統(tǒng)(賽仕研究所(SAS Institute)公司)實(shí)施。顯著性水平設(shè)置為p〈0. 05。 在上文中，已出于闡釋而非限制目的提供本發(fā)明特定實(shí)施例的詳細(xì)說明。應(yīng)了解，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員基于所述揭示內(nèi)容顯而易見的所有其它修改、分支及等效物均意欲包括在所主張的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種重組浣熊痘病毒載體(rRCNV)，其包含一或多個(gè)編碼豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)蛋白的外源核酸分子，其中(a)至少一個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中；或(b)至少兩個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中；或(c)至少一個(gè)核酸分子插入至所述血凝素基因座中且至少一個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的胸苷激酶基因座中。
2. 如權(quán)利要求1所述的重組浣熊痘病毒載體，其中至少兩個(gè)核酸分子插入至所述血凝 素基因座中且至少兩個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的胸苷激酶基因座中。
3. 如權(quán)利要求1或2中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其進(jìn)一步包含除在 所述浣熊痘病毒基因組的胸苷激酶及血凝素基因座外也在所述浣熊痘病毒基因組的第三 非必需位點(diǎn)中插入編碼豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)蛋白的核酸分子。
4. 如權(quán)利要求3所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述浣熊痘病毒基因組的所述第三 非必需位點(diǎn)是絲氨酸蛋白酶抑制劑位點(diǎn)。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述痘病毒載 體編碼相同豬繁殖與呼吸綜合癥病毒蛋白的至少兩個(gè)拷貝。
6. 如權(quán)利要求5所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝是由 兩個(gè)不同核酸分子編碼。
7. 如權(quán)利要求5所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝是由 相同核酸分子編碼。
8. 如權(quán)利要求7所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述相同蛋白的所述兩個(gè)拷貝可操 作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子。
9. 如權(quán)利要求6或7中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述相同蛋白 的所述兩個(gè)拷貝可操作地連接于各別啟動(dòng)子。
10. 如權(quán)利要求6、7、8或9中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述相同 蛋白的所述兩個(gè)拷貝是由選自由0RF1、0RF2、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、0RF7及其組合組成的 群組的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)開放讀碼框(ORF)編碼。
11. 如權(quán)利要求1或2中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述外源核酸 分子的每一者都編碼PRRSV ORF。
12. 如權(quán)利要求11所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述ORF是選自由0RF1、 0RF2、 0RF3、 0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其組合組成的群組的一或多者。
13. 如權(quán)利要求2所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)外源核酸分 子編碼兩個(gè)或更多個(gè)選自由下列組成的群組的PRRSV ORF :0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0腦、0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及 0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。
14. 如權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述豬繁殖 與呼吸綜合癥病毒是ISU12(愛荷華州(1owa))、01ot/91(西班牙)或二者。
15. 如權(quán)利要求1至14中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因組的血凝素基因座中。
16. 如權(quán)利要求15所述的重組浣熊痘病毒載體，其進(jìn)一步包含編碼豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)的開放讀碼框的核酸分子。
17. 如權(quán)利要求16所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述PCV2開放讀碼框是0RF2。
18. 如權(quán)利要求17所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述PCV20RF2各別插入至所述浣 熊痘病毒基因組的胸苷激酶基因座中。
19. 如權(quán)利要求15至18中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其進(jìn)一步包含編 碼貓白血病病毒P27+表型的糖蛋白的核苷酸序列。
20. 如權(quán)利要求1至19中任一權(quán)利要求所述的重組浣熊痘病毒載體，其中所述浣熊痘 病毒是活病毒且可復(fù)制。
21. —種重組豬疫苗，其包含免疫有效量的如權(quán)利要求1至20中任一權(quán)利要求所述的 重組浣熊痘病毒載體及任選地適宜載劑、稀釋劑或佐劑。
22. —種重組豬疫苗，其包含免疫有效量的兩種或更多種如權(quán)利要求1至20中任一權(quán) 利要求所述的重組浣熊痘病毒載體及任選地適宜載劑或稀釋劑。
23. 如權(quán)利要求21或22中任一權(quán)利要求所述的重組豬疫苗，其中所述浣熊痘病毒是活 病毒且可復(fù)制。
24. 如權(quán)利要求21或22所述的重組豬疫苗，其進(jìn)一步包含至少一種其它豬抗原。
25. 如權(quán)利要求24所述的重組豬疫苗，其中所述其它豬抗原選自由下列組成的群組 豬月巿炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原、畐U豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis) 抗原、多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)抗原、豬鏈球菌(Str印tococcus suis)抗 原、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)抗原、支氣管敗血性博德特 菌(Bordetella bronchis印tica)抗原、豬霍舌L沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)抗 原、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)抗原、鉤端螺旋體細(xì)菌(l印tospira bacteria)抗原、豬流感病毒抗原、豬細(xì)小病毒抗原、大腸桿菌(Escherichia coli)抗原、 豬呼吸冠狀病毒抗原、輪狀病毒抗原、阿捷申氏病(Aujesky' s disease)的致病病原體抗 原、豬傳染性胃腸炎(Swine Transmissible Gastroenteritis)抗原及其組合。
26. —種誘發(fā)抵抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包含向豬類動(dòng)物投 與免疫有效量的如權(quán)利要求21至25中任一權(quán)利要求所述的重組豬疫苗。
27. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述重組豬疫苗包含活的且可復(fù)制的重組浣熊痘 病毒載體。
28. —種預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合癥及斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥的方法，其包含向需要 保護(hù)的豬類動(dòng)物投與包含免疫有效量的如權(quán)利要求16至19中任一權(quán)利要求所述的重組浣 熊痘病毒載體及任選地適宜載劑、稀釋劑或佐劑的重組豬疫苗。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述重組浣熊痘病毒載體是活載體且可復(fù)制。
30. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疫苗的免疫有效量介于約4. 5Logl。TCID5。/ml 至約7. 5Logl。TCID5。/ml范圍內(nèi)。
31. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疫苗是以單次劑量或以重復(fù)劑量投與。
32. 如權(quán)利要求21至25中任一權(quán)利要求所述的重組豬疫苗，其中所述疫苗不含佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎重組浣熊痘病毒載體疫苗，其中所述載體表達(dá)在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒菌株的多個(gè)開放讀碼框(優(yōu)選為ORF5、ORF6及/或ORF3/ORF4/ORF7)單獨(dú)或與豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的開放讀碼框(優(yōu)選為ORF2)組合所編碼的一或多種抗原蛋白。
文檔編號C12N15/86GK101730742SQ200880017817
公開日2010年6月9日 申請日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者信覺·朱, 斯蒂芬·奇圖·吳, 邁克爾·A·吉爾 申請人:惠氏有限責(zé)任公司