專利名稱：用于dna測序和其他用途的膜集成病毒dna包裝馬達(dá)蛋白連接器生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明實(shí)施例大體涉及生物傳感器領(lǐng)域。更具體地，這里描述的組合物和方法涉及一種工程病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，它可以嵌入脂質(zhì)膜內(nèi)以形成導(dǎo)電孔道，用于DNA 測序和其他用途。
背景技術(shù)：
微量化學(xué)制劑和生化制劑的高度敏感的檢測和表征代表了現(xiàn)代分析技術(shù)的理想目標(biāo)。強(qiáng)健的分子傳感裝置會(huì)在包括生物醫(yī)學(xué)、工業(yè)、環(huán)境、司法、安全及其他情形的廣泛領(lǐng)域內(nèi)有用，例如在疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測中檢測和鑒定極低濃度的病原體和化學(xué)制劑、高通量DNA測序和其他基因組學(xué)應(yīng)用、以及其他領(lǐng)域。分析方法已被描述的是利用分子間親和結(jié)合相互作用，典型地非共價(jià)鍵的性質(zhì)，以檢測感興趣的分析物由特定的親和配體結(jié)合或“捕捉”，例如，包括檢測細(xì)菌、病毒、寄生蟲或其他微生物病原體或病原體相關(guān)的抗原，檢測抗體、癌癥標(biāo)記、和其他分析物(例如，Kittigul 等，Am J Trop MedHyg. 1998 年 9 月；59 (3) :352-6 ；Cordiano 等，J ImmunolMethods. 1995 年 1 月 13 日；178(1) :121-30 ；Olson 等，JImmunolMethods. 1990 年 11 月 6 日；134(1) 71-9 ；Nerurkar 等，J Clin Microbiol. 1984 年 7 月；20(1) 109-14 Jia 等，J Virol Methods. 2009 年 10 月；161(1) 38-43 ；He 等，Clin Vaccine Immunol. 2007 年 5 月；14(5) :617-23 ；Xu 等，JClinMicrobiol. 2006 年 8 月；44(8) 2872-8 ；Che 等，JClin Microbiol. 2004 年 6 月；42 (6) :2629-35 ；Hunt 等，Brown 等，AmJ Trop MedHyg. 2001 年 9 月；65 (3) :208-13 ;Loa 等，Avian Dis. 2000 七月到九月；44 (3) 498-506 ；Lubenko等，Transfus Med. 2000年9月；10(3) :213-8 ;Chanteau等，Int J Tuberc LungDis. 2000 年 4 月；4 (4) :377-83 ；Brinker 等，JClin Microbiol. 1998 年 4 月；36 (4)1064-9 ；Vyse 等，J Virol Methods. 1997 年 1 月；63 (1-2) :93-101 ；Peterson 等，J Clin Microbiol. 1997 年 1 月；35(1) :208-12 ；Lairmore 等，AIDS Res Hum Retroviruses. 1993 年 6 月；9 (6) :565-71 ；Heller 等，Vet Microbiol. 1993 年 10 月；37 (1-2) :127-33 ；van Loon 等，Epidemiol Infect. · 1992 年 2 月；108(1) :165-74 ；WoIf-Rogers 等，JImmunol Methods. 1990 年 10 月 19 日；133 (2) :191-8 ；Barsoum 等，Exp Parasitol. 1990 年 7 月； 71(1) :107-13 ;Hierholzer 等，J ClinMicrobiol. 1989 年 6 月；27 (6) :1243-9 ；Hurley 等， J Immunoassay. 1986 年；7 :309-36 ；Wolff 等，Cancer Res. 53 :2560-65 (1993 年)；通常見，例如，Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988 ；Weir, D. M.，Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston, MA)。除了根據(jù)分析物參與親和結(jié)合相互作用來檢測其存在外，先進(jìn)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，通常通過將所述分析物的單一或多參數(shù)生理化學(xué)分布與使用一個(gè)或多個(gè)已知的參考標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的類型特征分布進(jìn)行比較，以對所述分析物進(jìn)行表征，因此被稱為“指紋識(shí)別”技術(shù) (例如，Li 等，Rapid Commun Mass Spectrom. 200923(22) :3533-3542 ；Ali 等，J Agric Food Chem. 2009 ；Leski 等，Appl Environ Microbiol. Sept. 18,2009 ；Weinkopff 等，J Parasito 1. June 18,2009 ；Song 等，Proteomics. 20099 (11) :3090-9 ；Ortea 等，J Agric Food Chem. 200957(13) :5665-72 ；Amini，Pharmeur Sci Notes. 2009(1) :11-6 ;Shi等，Biol Pharm Bull. 200932(1) :142-6 ；Sun 等，J Chromatogr A. 20091216(5) :830-6 ；Yin 等， Phytopathology. 200393(8) 1006-13 ;Roy 等，Clin Cancer Res. 200814(20) :6610-7 ；Pei 等，Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 200833(14) :1662-8 ；Arthur, Methods Mol Med. 2008, 141 :257-70 ；Zhao 等，Se Pu 200826(1) :43-9 ；Woo 等，Anal Chem. 200880(7) :2419-25 ； Damodaran 等，Genomics Proteomics Bioinformatics. 20075(3-4) :152-7; Fellstrom 等，J Microbiol Methods. 200872(2) :133-40 ;Song 等，Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 20061 :4556-9 ；De Vuyst 等，Int J Food Microbiol. 2008125(1) :79-90)?？缒ねǖ赖膽?yīng)用已在檢測隨機(jī)分析物中驗(yàn)證(Bayley等，200INature 13 225-230)，一種依靠實(shí)時(shí)觀測單一底物分子和受體之間個(gè)別結(jié)合事件的電化學(xué)方法，由底物(分析物)結(jié)合引起的通道(受體)改變的(例如，以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式減少或增加) 電導(dǎo)證明。已經(jīng)通過這種方法，例如，使用個(gè)別膜通道的電生理測量，研究了范圍廣泛的過程，例如，DNA、RNA、藥物制劑、肽類、蛋白質(zhì)、和聚合物的運(yùn)輸(Thieffry等，1988年，EMBO J7 1449 ；Hinnah 等，2002 年，Biophys J83 :899 ；Alcayaga 等，1992 年，F(xiàn)EBSLett. ,311 246-50 ；Benz 等，1986 j Bacteriol 165 :978 ；MoviIeanu 等，2000，Nat. Biotechnol. 18 1091)。例如，通過金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)的通道，細(xì)菌跨膜成孔蛋白質(zhì)， 的離子電流的瞬時(shí)封鎖，已被用來測量單鏈DNA或RNA的長度(Kasianowicz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,13770-13773 (1996)) 隨后，DNA 的發(fā)夾分子已被用來通過 α-溶血素(α-HL)孔隙使DNA轉(zhuǎn)移率減速，以展示跨膜離子通道辨別單核苷酸多態(tài)性的能力(Vercoutere等，2001，Nat. Biotechnol. 19 :248)。也已研究了對孔隙內(nèi)的堿基對堆積和鏈方向的檢測(Vercoutere 等，2003，Nucl Ac. Res. 31 :1311 ；Howorka 等，200INat. Biotechnol. 19 :636 ；deGuzman 等，2006Nucl. Ac. Res. 34 :6425)。具有共價(jià)連接適配器分子
13的α -HL的通道已被證明可辨別核苷酸A、Τ、G、和C (Clarke等，2009Nat. Nanotechnol. 4 265)。已經(jīng)研究的其他蛋白質(zhì)通道包括用于檢測聚乙二醇的阿拉霉素(alamethicin) (Bezrukov, 2000JMembr Biol. 174 :1-13)、和用于易位單鏈DNA的齒垢分支桿菌(M smegmatis)的重新設(shè)計(jì)的 MspA 蛋白(Butler 等，2008Proc. Nat. Acad. Sci. USA 105 20647)。涉及通過納米孔運(yùn)輸核酸的多數(shù)研究都集中在α-HL。然而，a-HL(1.5納米) 和其他通道的有限的內(nèi)腔直徑已經(jīng)將它們的DNA和RNA用途限制到易位單鏈核酸(Song， 1996Science 274:1859)。對于MspA納米孔，也報(bào)道了類似的限制(Butler等，2008)。在少數(shù)其他膜孔系統(tǒng)中，已提出了橫過所述膜運(yùn)輸雙鏈DNA(dsDNA)的證據(jù) Gzabo 等，2002 Cell Physiol Biochem 12127 ;Mobasheri 等，2002Eur J Bipohys 31: 389 ;Carneiro 等，2003Biochim Biophys Acta 1612 :144)，但這些系統(tǒng)尚未健全，并且代表廣泛用途如生物醫(yī)學(xué)用途中的較差候選者，由于其不良的電壓門控性和相關(guān)信號波動(dòng)。因?yàn)檫@個(gè)原因，它們的潛力是有限的，代替地研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)向制作合成金屬或硅納米孔，以潛在用于 DNA 測序(Smeets 等，2006Nano Lett 6 :89 ;Wang 等，2001Nat. Biotechnol. 19 622 ；Iqbal等，2007Nat. Nano 2 243)。但是，這種合成的納米孔，由于難以在不同的批次可靠地生產(chǎn)具有一致性質(zhì)的重復(fù)結(jié)構(gòu)，而具有缺點(diǎn)，并且關(guān)于設(shè)計(jì)孔隙結(jié)構(gòu)的修飾和/或作為襯底用于通過廣泛的化學(xué)共軛進(jìn)行修飾，也缺乏多樣性。因此，對現(xiàn)有的蛋白納米孔的優(yōu)良替代物的尋找仍在進(jìn)行中。顯然需要改善的組合物和方法，所述組合物和方法將提供用于靈敏檢測和表征廣泛的分析物的多功能膜導(dǎo)電通道平臺(tái)，有能夠容納雙鏈DNA的內(nèi)腔，能可靠并可重復(fù)地組裝，在工作條件下不易受電壓門控影響，并可以容易地修飾以具有多種多樣的特定親和受體的特征用于檢測和表征不同分析物。目前公開的發(fā)明實(shí)施例滿足這種需要，并提供其他相關(guān)的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了，一種含導(dǎo)電通道膜，包括(a)膜層；和(b)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入到所述膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過該孔道導(dǎo)電。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白是人造的。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包括具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)連續(xù)的不帶電氨基酸的多肽，并融合至(a)中所述氨基端或所述羧基端中的至少一個(gè)，以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包括具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)連續(xù)的不帶電氨基酸的多肽，并融合至(a)中所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)，以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含式&a-xla-x2a-xlb-xlb-xlb-x3-x2b的多肽并融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域， 其中每個(gè))(la獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸或無氨基酸，每個(gè))(lb獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸，是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸，&是選自谷氨酸和天門冬氨酸的帶負(fù)電的氨基酸，以及)(2b是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :23所示的多肽序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly并融合至(a)中的所述羧基端，以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域選自(i)如SEQ ID NO 22 [WSHPQRFEK]所示的 Strep-II 標(biāo)簽,(ii)具有 3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 個(gè)連續(xù)組氨酸的多組氨酸多肽標(biāo)簽，(iii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)精氨酸的多精氨酸多肽，(vi)HIV Tat 多肽序歹Ij YGRKKRRQRR[SEQ ID NO :39]，和(ν)序列為 DRATPY 的多肽標(biāo)簽 [SEQ ID Ν0:40]。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，所述亞基中的每個(gè)選自(i)如SEQ ID N0:41所示的 C-His6-gplO/K234A，(ii)如 SEQ ID NO 42 所示的 C_His6-gplO/K234C，(iii)如 SEQ ID NO 43 所示的 C-His6~Rpl0/C76S/C265S/K234C, (iv)如 SEQ ID NO :44 所示的 Δ 1-14/ gplO-Str印-II，和(ν)如 SEQ ID NO 45 所示的Gpl0~ Δ 285-309-Strep-IL·在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包括選自下列的多肽(i)噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1[登錄號 ACE96033]所示的氨基酸序列，(ii)噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:7[登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列， (iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246, gi 15837315、gil6764273] 中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而12[登錄號？54309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 13 [登錄號ΑΑΑ72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體P2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:14[登錄號 NP_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而15[登錄號04々35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(χ)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號NP_041995]所示的氨基酸序列。 在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包含有雙鏈DNA噬菌體DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分。在一些實(shí)施例中，所述病毒連接器蛋白多肽選自(i)噬菌體 phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，(ii)噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:7 [登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246，gi 15837315， gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而12[登錄號即4309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而13[登錄號44々72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體P2 的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 14[登錄號NP_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而15[登錄號04々35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(χ)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID Ν0:20[登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包含一種多肽，所述多肽包括噬菌體Phi29的 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述病毒連接器蛋白多肽包含噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有可探測標(biāo)記，在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述可探測標(biāo)記可以選自比色指示劑、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用標(biāo)記化合物、熒光指示劑、發(fā)光指示劑、磷光指示劑、放射性指示劑、 染料、酶、酶的底物、能量傳遞分子、量子點(diǎn)、金屬粒子和親和標(biāo)記。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述親和標(biāo)簽選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、生物素、適體、抗體、凝集素、低聚糖、核酸、酶、金屬離子結(jié)合多肽、如SEQ ID NO :22[WSHPQRFEK]所示的Mi^p-II標(biāo)簽、具有3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的多組氨酸多肽標(biāo)簽、Strep-I標(biāo)簽、FLAG 多肽標(biāo)簽、Myc蛋白多肽標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金黃色葡萄球菌蛋白A、 蛋白G、HIV Tat蛋白多肽[SEQ ID NO :39]、具有氨基酸序列DRATPY[SEQ ID NO :40]的多肽、谷氧還蛋白_2、以及與親和配體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述抗體選自完整的免疫球蛋白、單鏈抗體、scFv、Fab和(Fab)' 2。在一些涉及上述含導(dǎo)電通道的膜的實(shí)施例中，所述膜層包括脂層。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述脂層包含兩親脂類，在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述兩親脂類包含磷脂類，并且所述脂層包含脂雙分子層。在一些其他實(shí)施例中，所述脂層選自平面膜層和脂質(zhì)體。 在一些實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體選自多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。在一些其他實(shí)施例中，所述嵌入的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白在所述膜層內(nèi)是可動(dòng)的。在一些其他實(shí)施例中，被施加電勢時(shí)，所述含導(dǎo)電通道膜能夠通過所述孔道易位雙鏈DNA。在一些實(shí)施例中，被施加電勢時(shí)，出現(xiàn)無電壓門控的導(dǎo)電性。根據(jù)本發(fā)明的一些其他實(shí)施例，提供一種制作含導(dǎo)電通道膜的方法，包括(a)通過使含有兩親脂類和有機(jī)溶劑的第一溶液與所述固體基質(zhì)接觸并除去大部分溶劑，而在固體基質(zhì)上制備干的兩親脂類；以及(b)將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒DNA組裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層的膜，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜。在一些其他實(shí)施例中，提供一種制作含導(dǎo)電通道膜的方法，包括(a)從含有兩親脂類和至少一種溶劑的混合物中除去大部分溶劑，以獲得干的兩親脂類；以及(b)將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒 DNA組裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜。在上述方法的一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述兩親脂類包含磷脂類。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述磷脂類包括選自下列的一種或多種磷脂類磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、1，2- 二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、 和1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。在一些實(shí)施例中，所述有機(jī)溶劑包括選自下列的至少一種溶劑氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、吡啶、和二異丙醚。在一些實(shí)施例中，所述滲透劑包括選自下列至少一種試劑蔗糖、甘油、甘露醇和葡聚糖。在一些實(shí)施例中，所述DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基包含上述DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽中的任何一種。在一些實(shí)施例中，所述脂雙分子層存在于脂質(zhì)體中，在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體選自多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。在一些實(shí)施例中，所述嵌入的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白在所述膜層內(nèi)是可動(dòng)的。在一些實(shí)施例中，當(dāng)對所述膜施加電勢時(shí)，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白能夠通過所述孔道易位雙鏈DNA。在一些實(shí)施例中，當(dāng)施加電勢時(shí)，在所述含導(dǎo)電通道膜內(nèi)出現(xiàn)無電壓門控的導(dǎo)電性。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述外加電勢選自⑴在-IOOmV和IOOmV之間的電勢，(ii)在_400mV和400mV之間的電勢， (iii)在-300mV和300mV之間的電勢，(iv)在_200mV和200mV之間的電勢，(ν)在_150mV 和150mV之間的電勢，(vi)在-75mV和75mV之間的電勢，和(vii)在-50mV和50mV之間的電勢。根據(jù)本發(fā)明的一些其他實(shí)施例，提供了一種在含導(dǎo)電通道膜的一側(cè)濃縮核酸分子的方法，包括(a)通過以下方法制作含導(dǎo)電通道的膜，所述方法包括(i)從含有兩親脂類和至少一種溶劑的混合物中除去大部分溶劑，以獲取干的兩親脂類，及(ii)將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層的膜，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜；以及(b)使(a)中的含導(dǎo)電通道膜與一個(gè)或多個(gè)核酸分子接觸并橫過所述膜施加電勢，在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)過足夠長的時(shí)間后，所述核酸通過電泳轉(zhuǎn)移經(jīng)過所述連接器蛋白的孔道，因此在所述含導(dǎo)電通道膜的一側(cè)濃縮核酸分子。 在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，核酸轉(zhuǎn)移導(dǎo)致所述核酸在所述膜的一側(cè)并逆著核酸濃度梯度積聚。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種含核酸的脂質(zhì)體，其包括含導(dǎo)電通道的膜和在所述膜的一側(cè)濃縮的核酸分子，其中所述脂質(zhì)體根據(jù)剛剛描述的方法制備。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體是納米粒子，并且在其他一些實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體是生物反應(yīng)器。根據(jù)一些實(shí)施例，提供了一種向細(xì)胞傳遞核酸分子的方法，包括將一種或多種以上描述的脂質(zhì)體引入所述細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，使細(xì)胞在體外引入到所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)體，并且在另一個(gè)實(shí)施例中，使細(xì)胞在體內(nèi)弓丨入到所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種分離的蛋白，包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)連續(xù)的不帶電的氨基酸的多肽， 并融合至(a)中的所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)；以及(c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a) 孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)連續(xù)的不帶電的氨基酸的多肽，并融合至(a)中的所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)；以及(c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含具有式&a-xla-x2a-xlb-xlb-xlb-x3-x2b的多肽并融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè))(la獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸或無氨基酸，每個(gè))(113獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸，&a是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸，&是選自谷氨酸和天門冬氨酸的帶負(fù)電的氨基酸，以及)(2b是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :23所示的多肽序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，并融合至(a)中的所述羧基端；以及 (c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域。 在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽(i)如SEQ ID NO 22[WSHPQRFEK]所示的 Mi^p-II 標(biāo)簽，(ii)具有 3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 個(gè)連續(xù)組氨酸的多組氨酸多肽標(biāo)簽，(iii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)精氨酸的多精氨酸多肽，(vi)HIV Tat 多肽序列 YGRKKRRQRR[SEQ ID NO :39]，和(ν)序列為 DRATPY 的多肽標(biāo)簽[SEQ ID NO 40]。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包括選自下列的多肽(i)如SEQ ID NO 41 所示的 C-His6-gplO/K234A，(ii)如 SEQ ID NO :42 所示的 C_His6-gplO/K234C，(iii) 如 SEQ ID NO 43 所示的 C-His6-gpl0/C76S/C265S/K234C, (iv)如 SEQ ID NO :44 所示的 Δ Ι-14/gplO-Str印-II，和(ν)如 SEQ ID NO 45 所示的Gpl0~ Δ 285-309-Strep-IL·在一些實(shí)施例中，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽(i)噬菌體phi29的DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，(ii)噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:7 [登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列， (iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246、gi 15837315、gil6764273] 中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而12[登錄號？54309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 13 [登錄號ΑΑΑ72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體P2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:14[登錄號 NP_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而15[登錄號04々35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(χ)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含多肽，所述多肽包含雙鏈DNA噬菌體DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白的全部或跨膜孔道部分。在一些實(shí)施例中，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽(i)噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分， 所述多肽具有如SEQ ID NO :1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，(ii)噬菌體T4的DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:7[登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295,gi 6723246, gi 15837315、gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl 的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 12[登錄號P54309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體P22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而13[登錄號44々72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體P2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分， 所述多肽具有如SEQ ID而14[登錄號呢_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:15[登錄號CAA35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NOS :16-19(登錄號AAX12078 ；YP_006980 ； AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(χ)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID Ν0:20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述病毒連接器蛋白多肽包含噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，上述分離的蛋白能夠(i)自組裝形成十二聚體病毒連接器蛋白，以及(ii)在嵌入病毒原殼體之后包裝病毒雙鏈DNA。在一些實(shí)施例中，所述分離的蛋白包含至少一個(gè)可探測標(biāo)記，在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述可探測標(biāo)記選自比色指示劑、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用標(biāo)記化合物、熒光指示劑、發(fā)光指示劑、磷光指示劑、放射性指示劑、染料、酶、酶的底物、能量傳遞分子、量子點(diǎn)、金屬粒子和親和標(biāo)記。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述親和標(biāo)簽選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、生物素、適體、抗體、凝集素、低聚糖、 核酸、酶、金屬離子結(jié)合多肽、如SEQ ID NO :22[WSHPQRFEK]所示的Mi^p-II標(biāo)簽、具有3、 4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的多組氨酸多肽標(biāo)簽、Str印-I標(biāo)簽、FLAG 多肽標(biāo)簽、Myc蛋白多肽標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金黃色葡萄球菌 (S. aureus)蛋白A、蛋白G、HIV Tat蛋白多肽[SEQ ID NO 39]、具有氨基酸序列DRATPY[SEQ ID NO 40]的多肽、谷氧還蛋白_2、以及與親和配體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽。在一些實(shí)施例中，所述抗體選自完整的免疫球蛋白、單鏈抗體、scFv.Fab和(Fab) ‘ 2。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種檢驗(yàn)分析物分子是否存在的方法，包括 (a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；以及(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合，以此檢驗(yàn)所述分析物分子存在。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)到本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了一種識(shí)別分析物的方法，包括(a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合；以及(c)將(b)中的電導(dǎo)信號分布與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布比較，以此識(shí)別所述分析物分子。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。根據(jù)上述方法的一些實(shí)施例，所述接觸步驟重復(fù)一次或多次。在一些實(shí)施例中，所述比較步驟包括下列中的一個(gè)或多個(gè)(i)將(b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅進(jìn)行比較，以及(ii)將(b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較。在上述方法的一些實(shí)施例中，所述外加電勢導(dǎo)致離子在所述孔道結(jié)構(gòu)域中沿著電化學(xué)梯度遷移。在一些實(shí)施例中，所述分析物包含核酸分子。在一些實(shí)施例中，所述分析物包含核酸分子，并且所述比較步驟包括識(shí)別所述核酸分子中存在的至少一種核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述方法包括確定所述核酸分子的核酸序列。在一些實(shí)施例中，所述方法包括確定所述核酸分子中的單核苷酸多態(tài)性。在一些實(shí)施例中，電壓門控不存在，在一些實(shí)施例中，當(dāng)所述外加電勢選自(i)在-IOOmV和IOOmV之間的電勢，(ii)在_400mV和400mV 之間的電勢，(iii)在_300mV禾口 300mV之間的電勢，(iv)在_200mV禾口 200mV之間的電勢， (ν)在-150mV和150mV之間的電勢，(vi)在_75mV和75mV之間的電勢，禾口 (vii)在_50mV 和50mV之間的電勢時(shí)，電壓門控不存在。在剛剛描述的方法的一些實(shí)施例中，所述含導(dǎo)電通道膜是以上描述的含導(dǎo)電通道膜。在剛剛描述的方法的一些實(shí)施例中，根據(jù)以上描述的方法制作所述含導(dǎo)電通道膜。在剛剛描述的方法的一些實(shí)施例中，所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包括如以上所描述的分離的蛋白。本發(fā)明的這些和其他方面和實(shí)施例參考以下詳細(xì)說明和附圖將是顯而易見的。在本說明書中提到和/或在申請數(shù)據(jù)表中列出的所有的美國專利、美國專利申請的出版物、 美國的專利申請、外國專利、國外專利申請和非專利出版物的全部內(nèi)容都通過參照并入本文，好像每個(gè)單獨(dú)地結(jié)合。


圖1顯示了 ？11口9連接器和DNA包裝馬達(dá)的結(jié)構(gòu)。a，所述phU9連接器的側(cè)視圖， 示出了酸性(陰影的)、堿性(斑點(diǎn)狀的)、和其他(白色)氨基酸。(Simpson等，Acta Cryst D57,1260-1269(2001), Guasch 等，J. MoI. Biol. 315,663-676 (2002), Guo 等，J. Nanosci. Nanotechnol. 5，856-863 000 ) b，所述連接器的俯視圖，顯示了所述通道的狹窄部分和寬部分的直徑。c，整個(gè)phi29DNA包裝馬達(dá)的示意圖，示出了通過所述連接器的DNA的易位。 d_e，在(c)前具有C-末端修飾的純化連接器的透射電鏡圖像，并且在(d)后形成陣列。f， 考馬斯染藍(lán)色的SDS-凝膠顯示連接器。
圖2顯示了質(zhì)粒構(gòu)建的示例，用于過度表達(dá)通過兩步PCR具有C-末端修飾的病毒 DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，以包括6-Gly柔性結(jié)構(gòu)域和鏈球菌二型(Str印-11)標(biāo)簽親和/ 對齊結(jié)構(gòu)域。a，在第一 PCR中所述連接器通過引物對Fl-Rl連接到GPlO基因的3'端。在第二 PCR中，氨基酸使用引物對F1-R2被結(jié)合在下游，其分別包含Ndel和)(h0l限制酶切位點(diǎn)。b，將第二 PCR產(chǎn)物用Ndel和Biol消化，并配位到載體pET_21a (+)的NdelAhol位點(diǎn)。 c，引物序列。圖3顯示了原殼體的DNA包裝活動(dòng)，所述原殼體含有重新設(shè)計(jì)的phU9gplO病毒 DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，所述連接器具有C-末端6-Gly柔性結(jié)構(gòu)域和鏈球菌二型標(biāo)簽親和/對齊結(jié)構(gòu)域。泳道1，Ikb的DNA梯；泳道2，正常原殼體；泳道3，具有重新設(shè)計(jì)的連接器的原殼體；泳道4，陰性對照，無ATP的DNA的包裝。圖4顯示了包含重新設(shè)計(jì)的連接器的原殼體的phU9病毒組裝活動(dòng)，所述連接器具有C-末端6-Gly柔性結(jié)構(gòu)域和鏈球菌二型標(biāo)簽親和/對齊結(jié)構(gòu)域。重新設(shè)計(jì)的原殼體的體外病毒組裝活動(dòng)與在PRNA存在下的天然原殼體的體外病毒組裝活動(dòng)相比。圖5顯示了包含修飾的phU9gplO連接器的巨大的脂質(zhì)體的圖像。a_c，脂質(zhì)體的表面熒光圖像無連接器的標(biāo)記有NBD-PE的脂(a)；由FITC標(biāo)記的連接器重組的蛋白脂質(zhì)體(b)；與脂質(zhì)體非特異性混合的FITC連接器(c)。d-f，分離大部分自由連接器的膜過濾。 g，通過蔗糖濃度梯度沉降法分離脂質(zhì)體/FITC連接器絡(luò)合物。自由連接器出現(xiàn)在上部餾分中，而蛋白脂質(zhì)體留在下部餾分中。餾分#1-12未示出。h，由FRAP(光褪色后熒光復(fù)現(xiàn)) 證明的熒光(紅色)脂雙分子層的流動(dòng)性，示出了由于脂擴(kuò)散，光漂白區(qū)(黑)的熒光強(qiáng)度容易地間推移逐漸增加。i，示意圖，顯示了將連接器插入平面脂雙分子層。圖6顯示了用于確認(rèn)修飾的phU9gplO連接器插入雙層類脂膜(BLM)的電導(dǎo)試驗(yàn)。a，只有連接器(頂部)或只有脂質(zhì)體(底部)的BLM。b，含連接器的蛋白脂質(zhì)體的加入導(dǎo)致多次插入。OOO多個(gè)實(shí)驗(yàn)中再現(xiàn)。)插入插入一個(gè)連接器(頂部)和同時(shí)插入兩個(gè)連接器(底部)。c，在正電壓(頂部)和負(fù)電壓(底部)下插入一個(gè)連接器。d，多次連接器插入后電流跳變的分布。e，單一連接器通道的電流電壓關(guān)系。誤差線代表在4個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中從共38個(gè)插入的連接器在每個(gè)外加電壓下3-5次插入。f_g，l、2或3個(gè)連接器(f)和在雙鏈DNA(反式室(trans-chamber))存在下的1個(gè)連接器(g)的電流跟蹤的斜坡。d_f， 5mM的Tris緩沖液，pH 7. 9，具有0. 5M氯化鈉。g，具有IM氯化鈉的TMS0圖7顯示了由具有C末端的6-Gly柔性結(jié)構(gòu)域和鏈球菌二型標(biāo)簽親和/對齊結(jié)構(gòu)域的經(jīng)修飾的phi29DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的插入所造成的電導(dǎo)步驟大小的直方圖。該數(shù)據(jù)是在40次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中從共213次插入得到的。圖8顯示了雙鏈DNA通過修飾的phU9gplO連接器通道在雙層膜(BLM)內(nèi)易位。 a,當(dāng)時(shí)包含連接器而沒有DNA時(shí)的典型電流跟蹤(對照)。b，由45pM雙鏈圓形和線性DNA 所造成的代表性的封鎖，在含3個(gè)連接器的BLM中沒有用DNA酶消化和用DNA酶消化。c， d，直方圖，顯示了在_40mV和_75mV下由線性質(zhì)粒雙鏈DNA造成的當(dāng)前封鎖(c)和停留時(shí)間(d)的百分比。DNA易位實(shí)驗(yàn)重復(fù)45次。圖9顯示了連續(xù)電流跟蹤，顯示了修飾的phi29DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入和在-75mV下DNA易位。a，以下情況4 μ M 35-bp的DNA預(yù)混合在緩沖液中(在示例2中的 “雙鏈DNA易位實(shí)驗(yàn)”方法2) ；b-f，以下情況在將連接器插入到雙層類脂膜后加入4 μ M35-bp的DNA (在示例2中的“雙鏈DNA易位實(shí)驗(yàn)”方法1)。當(dāng)前跟蹤連續(xù)記錄修飾的連接器和DNA的加入。(每次跟蹤以50秒增量記錄)。圖10顯示了通過導(dǎo)電跨膜通道易位35-bp的DNA，所述導(dǎo)電跨膜通道由修飾的 DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的孔道形成。a，典型電流跟蹤，在4 μ M的DNA(在10千赫頻率下過濾和在200kHz采樣頻率下獲得的低通)存在下從所述雙層記錄；b-c，由35-bp的雙鏈 DNA(b)和5.5-吐？的雙鏈0嫩((3)的易位造成的通道封鎖的駐留時(shí)間的比較。b-c，具有IM 氯化鈉的TMS緩沖液，-75mV。圖11顯示了 DNA易位事件的定量PCR^hPCR)分析。a，重復(fù)運(yùn)行三次的稀釋系列的Q-PCR放大曲線。b，對每個(gè)稀釋，CT與起始數(shù)量的模板繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。c，通過從反式室到順式室(cis-chamber)(頂部)的脂質(zhì)膜內(nèi)的一個(gè)連接器的DNA的總數(shù)的定量分析。陰性對照(底部)在相同條件下進(jìn)行但是沒有連接器。誤差線表示9個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)和4個(gè)陰性對照實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖12顯示了在不同條件下DNA易位的定量PCR(Q-PCR)分析。a，通過不同數(shù)量的嵌入膜的形成有導(dǎo)電通道的修飾的DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的DNA易位的Q-PCR分析。誤差線代表在相同Q-PCR條件下每個(gè)樣品的測量誤差。b，當(dāng)發(fā)生泄漏時(shí)DNA分子的Q-PCR分析。誤差線代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。圖13顯示了圖8(A)緩沖液電導(dǎo)與連接器通道電導(dǎo)的關(guān)系。(B)連接器通道電導(dǎo)與含有不同濃度NaCl的緩沖液中插入的連接器數(shù)量的關(guān)系。(C)含有IM氯化鉀和氯化鈉的緩沖液中的電導(dǎo)比較。圖14顯示了㈧通過連接器易位DNA的示意圖。⑶由雙鏈DNA誘導(dǎo)的當(dāng)前封鎖的直方圖。(C)隨著時(shí)間的推移用不同數(shù)量的通道易位DNA的Q-PCR分析。圖15顯示了折疊構(gòu)象DNA的易位。單個(gè)事件在離散目前的水平的當(dāng)前封鎖的直方圖，具有5-7個(gè)修飾的phi29gplODNA包裝馬達(dá)連接器通道㈧和12-14個(gè)通道(B)。(C) 通過修飾的連接器通道易位折疊DNA的示意圖。(D)在pH 8下51Λρ的雙鏈DNA的記錄事件的例子。圖16顯示了通過修飾的phi29gplODNA包裝馬達(dá)蛋白連接器易位DNA的單向交通。(A)在不存在DNA下控制。(B)在正電勢下插入連接器(頂部)和在負(fù)電勢下(底部) 易位DNA。(C)在負(fù)電勢下插入連接器(頂部)和在正電勢下(底部)易位DNA。(D)在負(fù)電勢下插入連接器(頂部)和在負(fù)電勢下(底部)易位DNA。(E-F)含有單個(gè)連接器的雙層在從-IOOmV到+IOOmV的斜坡電勢(2. 2mV/s)下的電流跟蹤，表現(xiàn)出在(E)只有負(fù)電勢和(F)只有正電勢下的DNA易位。圖17顯示了在多次修飾的phU9gplO連接器插入事件下的DNA易位?！柏北硎具B接器插入的一個(gè)方向并且“丨”表示連接器插入的相反方向。(A)所有三個(gè)連接器都是面向同一方向的，并且DNA易位速率隨著連接器數(shù)量的增加而增加。(B)所述第一連接器是面向相反方向的，沒有觀察到易位。隨后，分別在第二次插入和第三次插入后觀察到DNA易位和速率的增加。(C)在前兩個(gè)連接器插入后，沒有觀察到易位。接下來的兩個(gè)插入后，兩者都積極地易位DNA。(D)只有第一連接器易位DNA，由于當(dāng)插入第二連接器和第三連接器時(shí) DNA易位速率保持不變。圖18顯示了(A)嵌入到膜層中的突變體(K234A)修飾的phU9gplO的DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的電導(dǎo)的直方圖。(B)野生型phi29連接器的電導(dǎo)的直方圖。圖19顯示了將抗His標(biāo)簽抗體以逐步方式加入阻斷的室的一側(cè)，所述導(dǎo)電通道由修飾phU9gplO的DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的孔道組成，所述連接器包括具有C末端六聚組氨酸(六聚組氨酸)[SEQ ID NO 25]親和/對齊結(jié)構(gòu)域的SEQ ID NO :1。
具體實(shí)施例方式這里公開的本發(fā)明的一些實(shí)施例是基于以下驚人的發(fā)現(xiàn)的分離的雙鏈DNA的噬菌體DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白可以，出乎意料地，被修飾并被嵌入膜層如磷脂雙分子層膜， 以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過所述孔道導(dǎo)電，并通過所述孔道可易位種類繁多的分析物分子包括雙鏈DNA(dsDNA)。這些病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器以前已經(jīng)被鑒定為涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA相互作用的雙鏈DNA病毒原殼體組合的組分(例如，Simpson等，2000Nature 408 745 ；Robinson等，2006Nucl. Ac. Res. 34 :2698)，但本披露之前，它們從未被視為有潛力作為脂質(zhì)膜的組成部分。本文中所描述的實(shí)施例從而利用這種連接器蛋白的迄今未識(shí)別的分子屬性來提供具有大量優(yōu)越性能的跨膜孔道形成的生物傳感器。來自噬菌體phi29的示例性的未修飾的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白已被純化，并且其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了結(jié)晶學(xué)表征(例如，Guasch等，1998FEBS Lett. 430 :283 ；也見 Marais 等，2008Mructure 16 :1洸7)。其他雙鏈 DNA 病毒(例如，T4，λ，Ρ22, Ρ2, Τ3, Τ5 和Τ7)的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，盡管與所述phU9連接器共享很少的序列同源性，并且與所述phU9連接器具有不同的分子量，表現(xiàn)出巨大潛在結(jié)構(gòu)相似性(例如，Bazinet等.， 1985Ann Rev. Microbiol. 39 :109-29)。因此，這里描述的大量優(yōu)選實(shí)施例涉及phU9DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白(例如，Genbank Acc. No. ACE96033，[SEQ ID NO :1])和/或包括片段、變異及其衍生物的它的多肽亞基(例如，Acc. Nos. gi 29565762，gi 31072023，gi 66395194， gi 29565739，gi 157738604，[SEQ ID NOS :2_6])，但本發(fā)明不打算這么限制。 代替地，在一些其他實(shí)施例中，設(shè)想來自其他雙鏈DNA病毒的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，包括但不限于，來自噬菌體λ、P2、P3、P22、T3J4、T5、SPP1和T7中的任何一種的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，或另一種分離的雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白(例如，T4(Acc. No. NP_049782) (Driedonks 等.，1981J Mol Bioll52 :641)， λ (Acc. Nos. gi 549295，gi 6723246，gi 15837315，gi 16764273)(Kochan 等·，1984 J Mol Biol 174:433)，SPPl (Acc. No. P54309)，P22 (Acc. No. AAA72961)(Cingolani 等.，2002 JStruct Biol 139 46)，P2 (Acc. No. NP_046757)，P3(Acc. No. CAA35152)(Carazo 等.，1986 Jl. Ultrastruct Mol Struct Res 94 :105)，T5 (Accession numbers AAX12078,YP_006980 ； AAS77191 ；AAU05287), Τ7(Acc. No. NP_041995)(Cerritelli 等.,1996J Mol Biol 285 299 ；Agirrezabala 等·，2005 J Mol Biol 347 :895)) [SEQ ID NOS :7_20])。
不希望受理論的約束，認(rèn)為在這方面，像本文例證的phi29DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，這些和其他雙鏈DNA病毒包裝馬達(dá)連接器蛋白，已經(jīng)進(jìn)行了大量結(jié)構(gòu)表征，可以根據(jù)本文的教義進(jìn)行修飾，以獲得一種分離的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述分離的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白可嵌入到膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過所述孔道導(dǎo)電。因此，關(guān)于 Phi29連接器蛋白的這里的披露的目的是，對于一些實(shí)施例，說明考慮使用任何這樣的其他
24分離的雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白的相關(guān)的實(shí)施例，所述雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白可以進(jìn)行修飾以根據(jù)這里發(fā)現(xiàn)的教導(dǎo)用于這樣的實(shí)施例中。如這里更詳細(xì)的描述，分離的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽，包括已人為設(shè)計(jì)以具備膜嵌入(如，在膜層中穩(wěn)定的跨膜一體化)和功能性導(dǎo)電跨膜孔道形成的前所未有的性能的這樣的多肽，顯示出不可預(yù)測和有利的優(yōu)良性狀，以提供新一類的導(dǎo)電生物傳感器， 并且在具體實(shí)施例中，能夠響應(yīng)電勢橫過膜層易位雙鏈DNA(dsDNA)的生物傳感器。因此， 一些實(shí)施例考慮這些生物傳感器用于DNA測序的用途。簡要地并且通過背景的方式，線性雙鏈DNA病毒的基因組被包裝成預(yù)制原殼體 (Black, Ann Rev Microbiol 43,267-292(1989), Guo, Seminars in Virology (Editor' s Introduction)5(1)，1-3(1994)，Guo 等·，Mol. Microbiol. 64,886-903(2007), Rao 等·， Annu. Rev. Genet. (2008))。這個(gè)熵不利的過程是由ATP驅(qū)動(dòng)馬達(dá)實(shí)現(xiàn)的(Guo等.J Mol Biol 197,229-236(1987)，Chemla 等.，Cell. 122，683-692 (2005)，Hwang 等.， Biochemistry 35,2796-2803(1996), Sabanayagam φ . ， Biophys. J 93, L17—U9 (2007))。 在噬菌體phi29中，所述馬達(dá)使用一個(gè)ATP包裝2bp (Guo等，1987)或2. 5bp的 DNA(Mofffitt等.，Nature 457,446-4U2 (2009)) 這種馬達(dá)的蛋白樞紐是截錐結(jié)構(gòu)，稱為連接器(圖1A)，所述連接器允許雙鏈DNA在成熟過程中進(jìn)入并在感染過程中退出(Kochan 等.，JMol Biol 174,433-447(1984),Rishovd 等.，Virology 245，11-17(1998)，Simpson 等·，Acta Cryst D57,1260-1269 (2001)，Guasch 等·，J. Mol. Biol. 315，663-676 (2002)， Agirrezabala 等·，J. Mol Biol. 347,895-902 (2005)) 所述連接器有由十二個(gè) GPlO 蛋白亞基形成的中央通道(圖1B)。雖然病毒的連接器蛋白共享小的序列同源性并具有不同的分子量，但是顯著的潛在結(jié)構(gòu)相似性(Bazinet&King, Ann. Rev. Microbiol. 39， 109-129(1985))。通過展示病毒DNA包裝和原殼體轉(zhuǎn)化為傳染性病毒粒子，phi29DNA包裝馬達(dá)首次在體外組裝在確定的系統(tǒng)中，并仍然是最廣泛研究之一(Guo等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83，3505-3509 (1986))。所述馬達(dá)采用六個(gè) pRNA (包裝 RNA)分子(Guo 等， Science 236，690-694 (1987)，Guo 等.，Mol. Cell. 2，149-155 (1998)，Zhang,等·，Mol. Cell. 2，141-147(1998)，Shu 等，EMBO J. 26, 527-537 (2007)),以開動(dòng)所述機(jī)器(圖 1C)。如這里第一次描述的，phU9和其他分離的雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，包括它們的設(shè)計(jì)和突變的版本例如融合蛋白，它們的設(shè)計(jì)和突變的版本保留其孔道結(jié)構(gòu)域并包括親和/對齊結(jié)構(gòu)域和柔性結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)或兩者，可有效地嵌入膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)允許它們作為導(dǎo)電通道使用。經(jīng)修飾的分離的雙鏈DNA病毒 DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器如phU9連接器，可以設(shè)計(jì)成具有需要的結(jié)構(gòu)以用于目前披露的實(shí)施例中(Jiminez 等·，1986Science 232 :1113 =Donate 等·，1994Prot. Sci. 3 :2378 ； Bradley 等.,Science 309 1868-1871(2005) ；SchueIer-Furman 等.,Science 310 638(2005) ；Dietz 等·，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103 :1244(2006) ；Dodson 等·，Nature 450 =176(2007) ；Qian等.，Nature 450 :259 Q007))，其中蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可容易地獲得(例如，Simpson 等·，Acta Cryst D57,1260-1269 (2001)，Guasch 等·，J. Mol. Biol. 315，663-676(2002)，Cai 等.，Nanomedicine 4，8-18 (2008)，Guo 等.，J. Nanosci. Nanotechnol. 5,856-863 (2005)) 0此外，已經(jīng)開發(fā)了大規(guī)模生產(chǎn)和純化phU9連接器的方法(Guo 等·，2005 ；Ibanez 等·，Nucleic Acids Res. 12，2351-2365 (1984)，Robinson 等·，Nucleic Acids Res. 34，2698-2709(2006)，Xiao 等·，ACS Nano 3,100-107(2009)) 因此，這里描述的實(shí)施例將用于多種分子分析領(lǐng)域，包括，例如，用于生物醫(yī)學(xué)、臨床、工業(yè)、化工、制藥、環(huán)保、司法、國家安全、毒理學(xué)及其他目的的化學(xué)和生物化學(xué)分析物的靈敏檢測和表征，包括以下任何情況可以需要快速、特異、靈敏檢測和/或表征分析物(例如，優(yōu)選地在溶液中提供了可溶性分析物)而定。明確考慮的是以下實(shí)施例其中目前披露的組合物和方法用于以下更詳細(xì)描述的DNA測序，包括雙鏈DNA測序、高通量DNA測序、基因組學(xué)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測、分子診斷和其他DNA測序應(yīng)用。因此，示例性的分析物包括核酸如DNA和RNA (包括雙鏈DNA和雙鏈RNA)，包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和/或在這樣的核酸中的突變的檢測和識(shí)別、和/或核酸序列測定。 可使用這里所描述的組分和方法檢測和/或表征的其他示例性的分析物包括其他生物聚合物(如，蛋白質(zhì)類、糖蛋白類、肽類、糖肽類、低聚糖類、多糖類、脂類、糖脂類、磷脂類，等) 和其他生物大分子(例如，可溶性介質(zhì)、輔助因子、維生素、生物活性脂類、代謝產(chǎn)物、等)， 藥物和其他藥物和藥理學(xué)試劑，包括天然和合成化合物，食品和化妝品例如抗菌藥物制劑， 調(diào)味料、增味劑、防腐劑、抗氧化劑、抗微生物劑、穩(wěn)定劑、載體、賦形劑、經(jīng)修飾的劑等等，天然和合成的毒素、染料和其他化合物。因此，在一些實(shí)施例中，可以使用需要檢測和/或表征的任何分析物，在那里將從這里的披露認(rèn)識(shí)到分析物優(yōu)選溶于這樣的溶劑，所述溶劑不破壞特殊膜層完整性，所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入所述膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過所述孔道導(dǎo)電。因此分析物的選擇可以作為正在使用的特殊膜層的組成的函數(shù)改變，因此可以影響溶劑的選擇。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉溶劑的選擇條件，所述溶劑與具有任何特定的組成的膜層兼容。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述膜層包括磷脂雙分子層，并且在其中提供分析物的溶劑包括含水溶劑，例如包含水的溶劑。目前披露的組分和方法可以包括在一些實(shí)施例中通過采用已建立的電生理學(xué)儀器裝備和方法橫過膜層測量電導(dǎo)，這里描述的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入所述膜層。例如，并且如以下更詳細(xì)地描述的，可對膜片鉗或平面膜技術(shù)進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生跨膜電勢并測量橫過這種膜的電導(dǎo)。這些方法的示例性描述也可發(fā)現(xiàn)于，例如，Kasianowicz 等，1996Proc Nat. Acad. Sci USA 93 :13770 ;Gu 等，1999Nature 398 686 ；Kasianowicz 等，2001Anal. Chem. 73 :2268 ；Henrickson 等，2000Phys. Rev. Lett. 85 :3057 ；Hromada 等， 2008Lab Chip. 8 :602 ；Robertson 等，2007Proc. Nat. Acad. Sci. USA 104 :8207 ；美國專利號6，267，872 ；6，746，594 ；和6，936，433。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解來自這些和類似的參考文獻(xiàn)的一般方法學(xué)的方法，并且將可以進(jìn)一步理解的是，這里所描述的優(yōu)勢可以首次部分來自新型含導(dǎo)電通道膜的本披露，所述新型含導(dǎo)電通道膜包括嵌入的分離的病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白形成了比許多迄今描述蛋白質(zhì)納米孔更大的內(nèi)腔，并且作為跨廣泛施加的電勢的導(dǎo)電通道，而不會(huì)由于電壓門控行為造成的不良導(dǎo)電中斷，所述電壓門控行為在前面描述的蛋白質(zhì)納米孔通道看到。因此，例如，通過例證并且不限制地， 使用已知的電生理學(xué)方法，如上面提到的和這里描述的，當(dāng)施加的電勢在選定的實(shí)施例中在-IOOmV和IOOmV之間，在_400mV和400mV之間，在_300mV和300mV之間，在_200mV和 200mV之間，在-150mV和150mV之間，在_75mV和75mV之間，在_50mV和50mV之間，或者可以根據(jù)使用的具體電導(dǎo)條件改變的另一個(gè)電壓范圍，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于本披露將明白的時(shí)，電導(dǎo)無電壓門控地發(fā)生在目前披露的含導(dǎo)電通道膜中。此外，并且按照非限制理論，目前的含導(dǎo)電通道膜提供了可部分從由目前的病毒 DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器形成的孔道獲得的有利的檢測靈敏度，也提供了可部分從蛋白質(zhì)導(dǎo)電通道的穩(wěn)定的膜嵌入獲得的有利的分析物表征能力，所述蛋白質(zhì)導(dǎo)電通道可設(shè)計(jì)或突變以具有需要的功能特性，如各種分析物可訪問的親和相互作用結(jié)構(gòu)域中的任何一種，通過所述結(jié)構(gòu)域以特異性結(jié)合相互作用結(jié)合分析物。對于檢測分析物的方法，這些和有關(guān)的實(shí)施例考慮靈敏度，所述靈敏度是通過觀測相對于不存在這樣的特異性結(jié)合相互作用時(shí)的電導(dǎo)水平通過所述含導(dǎo)電通道膜內(nèi)的孔道的電導(dǎo)的改變(例如，以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式增加或減少)水平，橫過所述含導(dǎo)電通道膜施加電勢，當(dāng)所述嵌入的連接器蛋白與所述分析物以特異性結(jié)合相互作用結(jié)合時(shí)。因此，在一些優(yōu)選實(shí)施例中，提供了一種檢驗(yàn)分析物分子是否存在的方法，包括(a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；以及(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號， 其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合，以此檢驗(yàn)所述分析物分子存在。在一些相關(guān)的進(jìn)一步實(shí)施例中，所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。通過舉例而不是限制的方式，當(dāng)分析物存在并結(jié)合到所述通道導(dǎo)電膜時(shí)，由嵌入膜的連接器蛋白形成的孔道被認(rèn)為是至少部分阻塞或閉塞的，造成橫過所述膜的改變的， 并且典型地下降的，電導(dǎo)。在沒有結(jié)合的分析物的情況下，通過所述通道的電導(dǎo)沒有這樣的限制，這樣當(dāng)觀察到所述分析物的結(jié)合狀態(tài)和非結(jié)合狀態(tài)時(shí)，可以容易地檢測到電導(dǎo)的改變水平。如以下在示例中示出的，根據(jù)非限制理論本含導(dǎo)電通道膜被認(rèn)為提供在檢測分析物時(shí)的精密的靈敏度，通過允許在單一分析物分子結(jié)合到已形成導(dǎo)電跨膜孔道的嵌入單一膜的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白的水平上觀察這樣的分析物結(jié)合相關(guān)的電導(dǎo)變化。在其他一些實(shí)施例中，電導(dǎo)信號可以從由這里描述的連接器的多個(gè)跨膜孔道形成的多個(gè)導(dǎo)電通道檢測。在一些概念上相關(guān)的實(shí)施例中，可以獲得超出僅僅檢測分析物的缺乏或存在的信息，其中產(chǎn)生電導(dǎo)信號分布，例如，通過收集反映電導(dǎo)振幅的記錄，包括如這里所描述的在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的改變的電導(dǎo)，和電導(dǎo)的持續(xù)時(shí)間，包括如這里所描述的在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的改變的電導(dǎo)。這種信號分布可以反映分析物在它與所述連接器蛋白的相互作用的過程中的任何數(shù)量的性質(zhì)，例如，親和力和/或有約束力的親和力(例如，如果分析物為多價(jià)的)，并且也可以，分析物的理化性質(zhì)，如相對分子質(zhì)量、電荷和/或疏水性，所述分析物的理化性質(zhì)可以作為特定分析物、特定的連接器蛋白、膜組成、溶劑條件、施加的電勢和其他因素的函數(shù)而變化。
在一些特別優(yōu)選實(shí)施例中，可以使用已知分子結(jié)構(gòu)的分析物產(chǎn)生參考電導(dǎo)信號分布，由包含需要結(jié)構(gòu)信息的分析物的相互作用產(chǎn)生的電導(dǎo)信號分布可與此參考電導(dǎo)信號分布進(jìn)行比較。因此，在這些和相關(guān)的實(shí)施例中，提供了一種識(shí)別分析物的方法，包括(a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合；以及(c)將(b)中的電導(dǎo)信號分布與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布比較，以此識(shí)別所述分析物分子。在一些進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。在以上所述的檢測分析物和確定分析物的方法中的任何一種中，所述接觸步驟可以重復(fù)一次或多次，例如，以產(chǎn)生電導(dǎo)信號分布。如上所述，將已知分析物的參考電導(dǎo)信號分布與測試分析物的測試電導(dǎo)信號分布比較可允許識(shí)別測試分析物，可使用的方法，例如，在核酸分子的表征中，例如識(shí)別核酸分子中的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性，或者序列測定核酸分子(包括雙鏈DNA)通過當(dāng)線性DNA分子通過所述孔道易位時(shí)確定一系列特征電導(dǎo)的變化。在這些和相關(guān)實(shí)施例中，可以理解的是基于這里的披露，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以，容易地并且沒有過度實(shí)驗(yàn)，確定可以產(chǎn)生參考電導(dǎo)信號分布的條件(如， 膜、連接器蛋白、溶液條件、施加的電勢、等的選擇)，并由此生成測試電導(dǎo)信號分布，它可以與所述參考電導(dǎo)信號分布進(jìn)行比較。因此，在一些實(shí)施例中，所述比較步驟包括下列中的一個(gè)或多個(gè)⑴將(b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅進(jìn)行比較，以及(ii)將(b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較。在一些實(shí)施例中，例如那些在其中完全或部分通過所述孔道實(shí)現(xiàn)所述分析物的易位，外加電勢可以會(huì)導(dǎo)致在所述孔道結(jié)構(gòu)域內(nèi)沿電化學(xué)梯度的離子遷移。因此，在即時(shí)方法的一些有關(guān)實(shí)施例中，所述分析物包括核酸分子，并在一些其他有關(guān)實(shí)施例中，所述比較步驟包括確定在所述核酸分子中存在的至少一個(gè)核苷酸，在一些進(jìn)一步實(shí)施例中所述方法包括確定所述核酸分子的核酸序列?？梢岳斫獾氖?，如這里所描述的一些優(yōu)選實(shí)施例涉及一種分離的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白包括嵌合或融合的多肽亞基的十二聚體，即，非天然存在的多肽，其是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉的基因重組基因工程技術(shù)的產(chǎn)物。在這些和相關(guān)的實(shí)施例中，所述融合多肽包括(i)孔道結(jié)構(gòu)域，其可以是雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器多肽例如那些以上和本文其他地方討論的多肽(例如，如SEQ ID NOS :1-20所示的任何多肽或其他相關(guān)的DNA包裝馬達(dá)蛋白多肽，包括變種、片段和衍生物)的所有或孔道形成部分；和(ii)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)或兩者。示例性連接器可以包括，病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，例如那些具有如 SEQ ID NOS 31-35和41-45所示的氨基酸序列的。典型地，所述柔性結(jié)構(gòu)域和/或所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域可作為連接到所述孔道結(jié)構(gòu)域的C-末端和/或N-末端的肽序列存在，但本發(fā)明并不打算如此限制，也設(shè)想在所述連接器多肽序列內(nèi)在其他位置包括所述柔性結(jié)構(gòu)域和/或所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。如本文其他地方提到的，可獲得即時(shí)病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器多肽的詳細(xì)的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并且復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)模型的軟件程序在本領(lǐng)域是公知的，用于預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾的效果。根據(jù)非限制理論，這里所披露的分離的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白可以是穩(wěn)定的， 用于保留并功能嵌入膜層例如磷脂雙分子層，通過修飾所述連接器多肽的那些部分，所述連接器多肽分別與親水磷脂極性頭基和疏水磷脂脂肪酰基鏈以積極有利所述連接器在所述膜內(nèi)的整合的方式相互作用，以形成跨膜孔道。用于將蛋白質(zhì)引入膜，并確定將其嵌入膜，并進(jìn)一步確定它們作為整體或跨膜蛋白在所述膜內(nèi)的布置，的組分和方法，在本領(lǐng)域中是已知的病在這里舉例說明，用于確定這些蛋白作為導(dǎo)電跨膜通道功能嵌入的方法在本領(lǐng)域中也是已知的病在這里舉例說明。因此，并如這里提出的，例如，C-末端修飾，包括具有不帶電的氨基酸，如4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個(gè)或更多的連續(xù)的不帶電氨基酸(如，Gly6SEQ ID NO 23)的柔性結(jié)構(gòu)域和C-末端連接到其上的親和/對齊結(jié)構(gòu)域例如具有式I的肽Xla-Xla-X2a-Xlb-Xlb-Xlb-X3-X2b, [I]其中每個(gè))(la獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸或無氨基酸，每個(gè))(lb獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸，)(2a是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸，X3是選自谷氨酸和天門冬氨酸的帶負(fù)電的氨基酸，以及)(2b是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸， 例如，肽WSHPQFEK(SEQ ID NO :22)，有時(shí)稱作“鏈球菌二型”的標(biāo)簽，被認(rèn)為有利地以下面方式影響雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的物理化學(xué)性質(zhì)有利于其作為跨膜通道保留在脂雙分子層內(nèi)，并且也有利地使所述標(biāo)簽暴露到周圍環(huán)境用于與溶質(zhì)例如分析物發(fā)生相互作用。因此，舉例來說，并且作為一個(gè)非限制性說明性的例子，在適當(dāng)?shù)臈l件如由在或接近生理PH值下的緩沖溶液提供并且在橫過所述膜施加電勢下，電荷的相互作用可以有利于DNA通過所述導(dǎo)電通道結(jié)合在溶液中，并且電擴(kuò)散力(electrodiffusive force)可以促進(jìn)通過所述導(dǎo)電通道孔道的DNA易位，如這里所提到的，所述導(dǎo)電通道孔道可以容納雙鏈 DNA。因此，所述孔道結(jié)構(gòu)域可以由如這里所描述的任何雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器多肽提供，并從這種蛋白質(zhì)的可獲得的結(jié)構(gòu)表征，考慮到本披露關(guān)于所述修飾后的連接器的膜嵌入和它們的功能測試，兩者用于膜一體化和孔道建立，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過所述孔道導(dǎo)電，可以理解的是，孔道形成部分包括這些連接器多肽亞基的足夠部分， 如組裝的連接器展示這些特性可以需要的。如上所述，在一些實(shí)施例中，具有約4-18個(gè)連續(xù)的不帶電的氨基酸的柔性結(jié)構(gòu)域可以有利地融合到如這里提供的病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器序列。也如上所述，親和/對齊結(jié)構(gòu)域可以是可融合到病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器多
29肽亞基序列的任何肽或多肽結(jié)構(gòu)域，在存在或不存在插入的柔性結(jié)構(gòu)域的情況下，其促進(jìn)所述連接器保留在所述膜層內(nèi)和/或提供親和相互作用結(jié)構(gòu)域，如受體、配體、結(jié)合位點(diǎn)、 反受體等等，所述親和相互作用結(jié)構(gòu)域可以用來參與分析物的特異性結(jié)合和/或鼓勵(lì)分析物與所述導(dǎo)電通道的相互作用和/或兩者兼而有之。在一些實(shí)施例中，這里描述的示例性親和/對齊結(jié)構(gòu)域是“鏈球菌二型”肽標(biāo)簽， WSHPQFEK[SEQ ID NO :22]，通過非限制的例子，位于構(gòu)造為C-末端親和標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)， (例如，Schmidt 等，Protein Eng. 1993 ；6 :109-22 ；Schmidt 等，J. Mol. Biol. 1996 ；255 753-6)，或許多其他已知肽或多肽或其他結(jié)構(gòu)中的任何一種，所述其他結(jié)構(gòu)已被確定能夠參與同源的結(jié)合配偶子，例如，如，抗體或其抗原結(jié)合部分(也如以下所描述的)，的特異性親和結(jié)合相互作用，所述“AviD”標(biāo)簽具有序列DRATPY[SEQ ID NO 40] (Gaj等，2007Prot. Expr. Purif. 56 :54)，谷氧還蛋白-2(Lundberg 等，2006Prot Expr Purif 45:37)，或其他已知的部分，例如，凝集素，金屬基等抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、凝集素、抗體、受體、 細(xì)胞粘附分子識(shí)別組分、凝集素、金屬離子結(jié)合多肽(如，多組氨酸如六聚組氨酸或具有 3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)精氨酸殘基的多精氨酸多肽)，F(xiàn)LAG肽標(biāo)簽，具有抗體定義的表位的Myc肽標(biāo)簽，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白，免疫球蛋白恒定區(qū)域結(jié)合金黃色葡萄球菌(S. aureus)蛋白A或蛋白G，HIV Tat肽(例如，SEQ ID NO 39)，與親和配體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，適體，或本領(lǐng)域已知的任何其他大量公知的親和相互作用分子，如那些這里引用的參考文獻(xiàn)中所描述的。其他受體、結(jié)合結(jié)構(gòu)域、配體、反受體等等，全部或部分可用于制備親和/對齊結(jié)構(gòu)域，包括那些在WCV2005/097997、 W0/2002/056910、W0/2005/017148 和 W0/2005/037989 中公開的。一些實(shí)施例考慮如這里提供的進(jìn)一步包括可探測標(biāo)記的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，可以理解的是，所述可探測標(biāo)記可以是允許使用已建立的技術(shù)和儀器裝備檢測的種類繁多的化學(xué)、生物化學(xué)、放射化學(xué)或納米分子部分中的任何一種。示例性可探測標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已知的，并包括那些在 W0/2007/075253 和 US/2008/0176209 中所描述的。如在下面的例子中更詳細(xì)地描述的，根據(jù)一些優(yōu)選實(shí)施例，目前描述的含導(dǎo)電通道膜可以通過將如這里提供的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入脂質(zhì)體膜中而形成，所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包括由多肽亞基組成的連接器，所述多肽亞基包括融合蛋白，所述融合蛋白具有如這里所描述的孔道結(jié)構(gòu)域以及柔性結(jié)構(gòu)域和親和 /對齊結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)或兩者。所述膜典型地包括兩親脂類例如磷脂類(如，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、1，2- 二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)很熟悉的其他磷脂類中的一種或多種)，所述磷脂類當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下暴露于水環(huán)境時(shí)傾向于形成雙分子層?？梢岳斫獾氖?，如下所述，病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器可通過以下步驟有效地嵌入膜中首先提供兩親脂類，已從所述兩親脂類中除去(例如，可以通過目視檢查檢測到很少或沒有殘留溶劑，并且優(yōu)選地這樣的脂制劑被視為干的)大部分溶劑(如，有機(jī)溶劑， 如氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、吡啶、二異丙醚中的一種或多種)，然后將所述干的兩親脂類重懸于溶液中，所述溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒 DNA組裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒馬達(dá)連接器蛋白。不希望受理論的約束，認(rèn)為，滲透劑的加入有利地促進(jìn)功能的DNA包裝馬達(dá)連接器作為導(dǎo)電通道嵌入所述膜，通過影響在大體球形脂質(zhì)體內(nèi)的形成和大小、和/或分子間動(dòng)力學(xué)，雖然人們認(rèn)識(shí)到，用于生產(chǎn)含導(dǎo)電通道膜的其他方法不應(yīng)該被排除在外?？梢栽谶@些和相關(guān)的實(shí)施例中使用的滲透劑的非限制例子包括蔗糖或其他二糖類、甘油、甘露醇和葡聚糖。在一些實(shí)施例中，包括含導(dǎo)電通道膜的脂質(zhì)體可以脂質(zhì)體的形式使用，例如， 作為載體用于將已濃縮或集中在所述脂質(zhì)體內(nèi)核酸分子在體外或體內(nèi)傳遞到細(xì)胞，如通過電勢驅(qū)動(dòng)的易位，逆著核酸的濃度梯度，否則將限制按照公認(rèn)的平衡原則可達(dá)到的核酸濃度，通過所述連接器孔道，以獲得含核酸的脂質(zhì)體。這種脂質(zhì)體可有利地用作治療藥物，例如在基因治療和相關(guān)策略中。廣泛的制劑可用于含核酸的脂質(zhì)體的體外和體內(nèi)治療給予，并可以被修飾以與根據(jù)本披露制備的脂質(zhì)體一起使用。見，例如， W0/2002/034236W0/2002/036767 ；TO/2003/094963 ；TO/2005/034979 ；TO/2005/120461 ； W0/2000/03683 ；Lasic, Liposomes in Gene Delivery, 1997, CRC Press, Boca Raton, FL, WO 96/40964 ；WO 1998/51278 ；W02009/086558；US 2007/0042031 ；US 2006/0240093 ；US 2006/0083780 ；US 2004/0142025。設(shè)想多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體，其中在一些實(shí)施例中單層脂質(zhì)體是優(yōu)選的。還考慮的是以下實(shí)施例其中由目前描述的含導(dǎo)電通道膜確定的膜結(jié)合室可以有利地用作生物反應(yīng)器。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的，根據(jù)目前的教導(dǎo)，這里描述的導(dǎo)電通道可用于選擇性地易位大量的分析物、生物分子、合成小分子、離子種類和/或其他溶質(zhì)中的任何一種，取決于對這些化合物和正在使用的特殊的導(dǎo)電通道的性質(zhì)(例如， 親和/對齊結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)、連接器結(jié)構(gòu)、膜組成、連接器的方向、施加的電勢、等)。因此，在所述膜結(jié)合室內(nèi)，所述膜結(jié)合室可以是脂質(zhì)體或納米顆?；蛟谶m當(dāng)?shù)膬x器內(nèi)的平面膜的一側(cè)，一種或多種所需的分子種可以積累，(例如，在所需的濃度下，其可以逆著濃度梯度電擴(kuò)散地積累，否則將限制作為平衡動(dòng)力學(xué)可得到的濃度)，在有利于所需的生物分子或生化反應(yīng)例如用于下列的反應(yīng)的條件下核酸測序、單核苷酸多態(tài)性測定、核酸擴(kuò)增、核酸合成、接合或分裂、大分子組裝、分析物的檢測或任何其他所需的生化或綜合設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)。也如這里所述，一些實(shí)施例考慮將這里所描述的分離的病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器嵌入膜層，以形成脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體然后可以將膜集成連接器捐贈(zèng)給平面膜系統(tǒng)，如平面雙層膜(BLM)系統(tǒng)，通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法的人工膜融合操作。因此，如這里首次描述的含導(dǎo)電通道膜，可配置為所需的特定目的和/或以適應(yīng)一些儀器的使用，包括但不限于，脂質(zhì)體和/或納米粒子(包括載體粒子)傳遞、平面膜層、微流體腔、微孔和納米孔導(dǎo)電室，膜片鉗儀器、以及任何其他配置，所述任何其他配置與基于本披露并根據(jù)本領(lǐng)域的知識(shí)可改裝的即時(shí)含導(dǎo)電通道膜的一起使用兼容。也如這里其他地方描述的，一些優(yōu)選實(shí)施例考慮本含導(dǎo)電通道膜用于核酸測序和SNP鑒定的用途，包括DNA測序并優(yōu)選包括雙鏈DNA 測序，并在特別實(shí)施例中包括雙鏈DNA的實(shí)時(shí)指紋法，當(dāng)所述雙鏈DNA通過目前描述的導(dǎo)電通道易位時(shí)，通過由檢測伴隨的電勢驅(qū)動(dòng)的易位并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄改變的電導(dǎo)振幅和/ 或持續(xù)時(shí)間，以生成可以與參考電導(dǎo)分布比較的電導(dǎo)分布?？贵w。如上所述，本發(fā)明的一些實(shí)施例也設(shè)想親和/對齊結(jié)構(gòu)域，其包括抗體，所述抗體包括抗-分析物結(jié)合分子，所述抗-分析物結(jié)合分子為特異性結(jié)合到分析物的肽、多肽和其他分子，其檢測和/或分析是需要的。這種結(jié)合分子可用于檢測分析物存在的方法中，或用于識(shí)別分析物(例如，在試液中)，如這里所描述的。抗體，或如本文所提供的其他的親和/對齊結(jié)構(gòu)域，據(jù)說是可以特異性結(jié)合特定的同源抗原或分析物(例如感興趣的分析物)，如果所述抗體在可探測到的水平上與抗原/分析物發(fā)生反應(yīng)(如結(jié)合)，而且不與結(jié)構(gòu)不同或不相關(guān)的分子發(fā)生可檢測水平的反應(yīng)。因此，優(yōu)選的結(jié)合分子包括抗體，所述抗體可以是多克隆的、單克隆的、單鏈的、嵌合的、人源化的、抗個(gè)體基因型的、或者 CDR移植免疫球蛋白，或者其他抗原結(jié)合片段，如蛋白水解產(chǎn)生的或重組產(chǎn)生的免疫球蛋白 F(ab' )2, Fab, Fab'、Fv 和 / 或 Fd 片段，單結(jié)構(gòu)域抗體(〃 dAbs 〃，Holt 等，2003Trends Biotech. 21 :484)以及雙抗體(Hudson 等，1999J. Immunol. Meth. 231 :177)。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以屬于任何免疫球蛋白類，例如IgG、IgM、IgD、IgE、或IgA?？贵w可以獲得自或來源于動(dòng)物，例如禽類(如雞)或哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包括但不僅限于小鼠、大鼠、倉鼠、兔、 或其他嚙齒動(dòng)物、牛、馬、羊、山羊、駱駝、人、或其他靈長類動(dòng)物。所述抗體可以是整合的抗體，或者所述抗體可以被修飾以便易于跨細(xì)胞膜運(yùn)輸。為了確定和準(zhǔn)備如本文所提供的所需的抗體或親和/對齊結(jié)構(gòu)域，抗體(在這里以示例和不限制的方式作為親和/對齊結(jié)構(gòu)域的例子)對特異抗原(在這里以示例和不限制的方式作為分析物的例子)的結(jié)合特性一般可以用常規(guī)的免疫檢測方法，包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫沉淀法、放射免疫測定、免疫印跡法等等，來估計(jì)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行常規(guī)的免疫檢測方法。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也會(huì)熟悉這樣的免疫檢測方法，當(dāng)用于檢測結(jié)合到抗原/配體的構(gòu)象表位的抗體時(shí)，所述免疫檢測方法可以優(yōu)選避免使用可以會(huì)使所述抗原變性，從而改變或破壞所述配體的構(gòu)象表位的任何試劑或條件。本領(lǐng)域眾所周知且在這里描述的方法可用于產(chǎn)生抗體，包括多克隆抗血清或單克隆抗體，所述抗體專門用于特定的抗原，就如同可以需要的那樣?？贵w也可以制備為設(shè)計(jì)以具有需要的特性的基因工程修飾過的免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白片段。例如，舉例說明而非僅限于此，抗體可以包括重組IgG，它是嵌合的融合蛋白，所述融合蛋白具有來自第一哺乳動(dòng)物種的至少一個(gè)可變(V)區(qū)結(jié)構(gòu)域和來自第二不同的哺乳動(dòng)物種的至少一個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(見 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :6851-55(1984)； Shin 等，Methods Enzymol. 178 :459-76(1989) ；178 :459-76(1989) ；Walls 等，Nucleic Acids Res. 21 :2921-29(1993) ；U. S. Patent No. 5，482，856)。最常見的是，嵌合抗體含有小鼠的可變區(qū)序列和人的恒定區(qū)序列。這種鼠/人嵌合免疫球蛋白可以通過將來自小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其給予抗原結(jié)合專一性，嫁接到來源于人的V區(qū)框架區(qū)和來源于人的恒定區(qū)而“人源化”(見，Jones 等，Nature321 :522-25(1986) ；Riechmann 等， Nature 332:323-27(1988) ；PadIan 等，F(xiàn)ASEB 9:133-39(1995) ；Chothia 等，Nature，342 377-383(1989) ；Bajorath 等，Ther. Immunol. 2 :95-103(1995) ；EP-0578515-A3)。這些分子片段可以來自蛋白質(zhì)分解消化，或任意地，蛋白質(zhì)分解消化，接著是二硫鍵的溫和還原和烷基化。可選地，這些片段也可以來自基因工程重組技術(shù)(例如Harris，W. J.，Adair, J. R.， (Eds. ) 1997Antibody Therapeutics, CRC Press, Boca Raton, FL)。如本文所提供的具有免疫特異性(或特異的親和/對齊結(jié)構(gòu)域)或特異性結(jié)合到同源抗原(或分析物)的抗體在可檢測水平上與抗原/分析物發(fā)生反應(yīng)，而不與具有不同或不相關(guān)結(jié)構(gòu)的分子反應(yīng)，優(yōu)選地親和常數(shù)Ka大于或等于約IO4M4,更優(yōu)選大于或等于IO5M4,更優(yōu)選大于或等于約IO6M4,并且還要更優(yōu)選大于或等于107ΜΛ抗體對其同源抗原的親和通常也表示為解離常數(shù)KD，抗體特異性結(jié)合到抗原，如果Kd小于或等于10_4 M，小于或等于10_5M，小于或等于10、，小于或等于10_7M，或小于或等于10_%。結(jié)合配偶子或抗體的親和性可以容易地使用常規(guī)技術(shù)確定，例如，通過katchard等描述的方法 (Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51 :660(1949))或者表面等離子體共振(BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)。見 Wolff 等，Cancer Res. 53 :2560-2565 (1993)，或可根據(jù)這里所述的其他方法確定。抗體一般可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任何一種制備。見 Harlow 等，Antibodies :ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。 在一種這樣的技術(shù)中，動(dòng)物通過免疫原的形式被接種抗原/分析物，例如，根據(jù)已建立的方法作為在適當(dāng)載體上的半抗原，作為抗原以產(chǎn)生多克隆抗血清。適當(dāng)?shù)膭?dòng)物包括，例如，兔子、綿羊、山羊、豬、牛，也可以包括小型哺乳動(dòng)物種，如小鼠、大鼠、和倉鼠、或其他物種。免疫原可包括純化或部分純化的抗原或感興趣的分析物，或可以包含表達(dá)抗原的細(xì)胞(例如，抗原是多肽或多核苷酸或代謝物)，或所述抗原以增強(qiáng)其免疫原性的方式引入。肽或多肽抗原可以使用標(biāo)準(zhǔn)基因重組的方法制備，或通過天然存在的蛋白質(zhì)的溶蛋白性裂解而制備，或者也可以是化學(xué)合成的。肽可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)被分離，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或各種其他分離方法如液相色譜法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ械娜魏我环N。為了提高抗體對抗原的親和性，所述抗原為多肽或肽，作為免疫原的肽典型地可以有至少4個(gè)或5個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽序列，并且優(yōu)選地有至少6、7、8、9、10、11、12、14、 15、16、18、19或20個(gè)連續(xù)的氨基酸的多肽序列。一些其他優(yōu)選肽免疫原可包括21-25、 26-30,31-35,36-40,41-50或更多的連續(xù)的氨基酸的多肽序列。用于免疫的多肽或肽也可以根據(jù)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法通過分析感興趣的多肽抗原/分析物的一級、 二級和三級結(jié)構(gòu)而得到，為了確定更有可以在宿主動(dòng)物上產(chǎn)生抗原反應(yīng)的氨基酸序列。見 Novotny,1991Mol. Immunol. 28 :201-207 ；Berzofsky,1985Science 229 :932-40 ；Chang 等， J. Biochem. 117 :863-68(1995) ；Kolaskar 等，Viology 261 :31-42 (1999))。優(yōu)選地，多肽或肽含有足夠數(shù)量的氨基酸，使其以接近多肽/分析物生物活性形式的構(gòu)象的方式折疊。可根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法接種動(dòng)物制備免疫原。見Harlow等，Antibodies ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。免疫反應(yīng)可通過定其月對動(dòng)物抽血而監(jiān)測，分離收集的血液中的血清，并對所述血清進(jìn)行免疫測定，如ELISA或 Ouchterlony擴(kuò)散試驗(yàn)等等，以確定特異性抗體效價(jià)。一旦確定抗體效價(jià)，這些動(dòng)物可以被定期抽血以積累多克隆抗血清。然后，對所述抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體，可從這種抗血清中純化，例如，通過親和層析使用金黃葡萄球菌蛋白A或蛋白G，所述金黃葡萄球菌蛋白A 或蛋白G特異性結(jié)合到抗體的恒定區(qū)(重或輕鏈)以被純化，或使用固定在適當(dāng)?shù)墓腆w載體上的抗原/分析物。也可以制備特異性結(jié)合到所述抗原的單克隆抗體、和雜交瘤，所述雜交瘤是可以產(chǎn)生有所需親和專一性的單克隆抗體的永生的真核細(xì)胞系，例如，使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉的 Kohler 和 Milstein 的技術(shù)(Nature, 256 :495-497 ；1976，Eur. J. Immunol. 6 511-519(1975))及其改進(jìn)方法。動(dòng)物——例如大鼠、倉鼠、或小鼠——被接種免疫原；淋巴
33細(xì)胞，包括抗體形成細(xì)胞，典型地脾細(xì)胞，從免疫的動(dòng)物獲得；而這些細(xì)胞可通過與選擇試劑敏化的骨髓瘤(例如，漿細(xì)胞瘤)細(xì)胞融合配偶子融合而永生化。單克隆抗體可從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中分離出來，或者從已處理的(例如，姥鮫烷預(yù)處理的)小鼠中分離出來，以促進(jìn)形成含單克隆抗體的腹水流體?？贵w可以通過使用適當(dāng)?shù)呐潴w進(jìn)行親和層析而純化，所述配體可以根據(jù)單克隆抗體的特性(例如，重或輕鏈同型、結(jié)合專一性、等)選擇。固定在固體載體上的適當(dāng)?shù)呐潴w的例子，包括蛋白A、 蛋白G、抗恒定區(qū)(輕鏈或重鏈)抗體、抗特異型抗體以及特定抗體需要的抗原/分析物。 人類單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的任何數(shù)量的技術(shù)進(jìn)行制備?？贵w和其他親和/對齊結(jié)構(gòu)域多肽也可以使用眾所周知的噬菌體展示技術(shù)，例如從人免疫球蛋白噬菌體庫，從兔免疫球蛋白噬菌體庫，和/或從雞免疫球蛋白噬菌體庫(見 Winter 等，1994Annu. Rev. Immunol. Burton 等，1994Adv. Immunol. 57 :191-280 ；U. S. Patent No. 5，223，409 ；Huse 等，1989Science 246 :1275-81 ；Schlebusch 等，1997Hybridoma 16 47-52 and refefences cited therein ；Rader 等，J. Biol. Chem. 275 :13668—76 UOOO)； Popkov 等，J. Mol. Biol. 325 :325-35 (2003) ；Andris-ffidhopf 等，J. Immunol. Methods 242 159-31 (2000))，或者通過其他方法如核糖體展示(例如Hanes等，1998Proc. Nat. Acad. Sci.USA 95 :14130)或酵母展示(Colby 等，2004Meths. Enzymol. 388 :348)或其他類似方法，確認(rèn)和分離。從非人類物種或非人免疫球蛋白庫分離的抗體可以根據(jù)這里所描述和本領(lǐng)域中已知的方法而進(jìn)行基因工程，例如，以優(yōu)化親和力，或者嵌合(chimerize)，或“馴化” 所述抗體或其片段。在一些實(shí)施例中，選擇來自生產(chǎn)具有所需的特異性的抗體的被接種動(dòng)物的B細(xì)胞，并且輕鏈和重鏈可變區(qū)根據(jù)本領(lǐng)域(W0 92/02551 ；US patent 5, 627, 052 ；Babcook 等· , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7843-48(1996))中已知的和這里所述的分子生物學(xué)技術(shù)從B細(xì)胞克隆。優(yōu)選地來自接種動(dòng)物的B細(xì)胞從脾臟、淋巴結(jié)、或外周血樣中通過選擇產(chǎn)生能特異性結(jié)合到感興趣的抗原/分析物的抗體的細(xì)胞而分離出。B細(xì)胞也可從人，例如， 從外周血樣中分離出?？贵w片段也可以是任何人工合成或基因工程抗體的蛋白質(zhì)，像抗體一樣與特定的抗原結(jié)合以形成復(fù)合物。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)組成的分離的片段；“Fv”由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的片段；重組單鏈多肽分子，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)與肽鍵(scFv 蛋白)相連；以及由模仿高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單元。這種抗體片段優(yōu)選包括至少一個(gè)可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，(見 Bird 等，Science 242 :423-26(1988) ；Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879-5883(1988) ；USA 85:5879-5883(1988) ；EP-B1-0318554 ；美國專利號5，132，405 ；美國專利號5，091，513 ；和美國專利號5，476，786) ·在一些實(shí)施例中，特異性結(jié)合到抗原/分析物的抗體可以是作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的抗體。這種細(xì)胞內(nèi)抗體也被稱為胞內(nèi)抗體(intrabodies)，并可以包括Fab片段，或者優(yōu)選包括 scFv 片段(見，例如 Lecerf 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA98 :4764-49 (2001)) 該框架區(qū)域側(cè)翼的CDR區(qū)域可以進(jìn)行修飾以提高表達(dá)水平和在細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境中胞內(nèi)抗體的溶解性(見，Worn等.，J. Biol. Chem. 275 :2795-803 (2000))。胞內(nèi)抗體可指向特定的細(xì)胞內(nèi)位置或細(xì)胞器，例如，通過構(gòu)建載體，所述載體含有編碼胞內(nèi)抗體的可變區(qū)的多核苷酸序列，所述胞內(nèi)抗體人工融合到編碼細(xì)胞內(nèi)特定目標(biāo)抗原的多核苷酸編碼序列(見，例如，Graus-Porta 等，Mol. Cell Biol. 15 :1182-91 (1995) ；Lener 等，Eur. J. Biochem. 267 1196-205(2000)) 0胞內(nèi)抗體可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可用的多種技術(shù)被引入到細(xì)胞內(nèi)，包括通過基因治療載體、或脂質(zhì)混合物(例如，Liigenex Corporation制造的 Provectin(TM)，San Diego, CA)，或根據(jù)光化學(xué)內(nèi)化方法。編碼抗體或特異性結(jié)合到感興趣的抗原/分析物的片段的聚核苷酸類，如本文所述，可以被傳播并表達(dá)，根據(jù)用于核酸切割、連接、轉(zhuǎn)化、和轉(zhuǎn)染的各種公知的方法中的任何一種，使用任何數(shù)量的已知的表達(dá)載體。因此，在一些實(shí)施例中，抗體片段的表達(dá)可以在原核宿主，如大腸桿菌(見，Pluckthun等，1989Methods Enzymo 1. 178 :497-515)中是優(yōu)選的。 在一些其他實(shí)施例中，抗體或其片段的表達(dá)可以是在真核宿主細(xì)胞，包括酵母(例如，釀酒酵母，裂殖酵母菌絲和畢赤酵母)、真菌(例如鏈孢霉(Neurospora)細(xì)胞如那些N. crassa) 動(dòng)物細(xì)胞(包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或植物細(xì)胞中進(jìn)行。適當(dāng)?shù)膭?dòng)物細(xì)胞的例子包括但不限于骨髓瘤、C0S、CH0、或雜交瘤細(xì)胞。植物細(xì)胞的例子包括煙草、玉米、大豆、和水稻細(xì)胞。特異性結(jié)合到感興趣的抗原/分析物的抗體可以在用于確定如上所述的抗體親和性的試驗(yàn)中篩選，例如用于確定抗體的Kd值的試驗(yàn)。病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽本發(fā)明的多肽包括突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽，以及具有與本領(lǐng)域中已知的序列相同或相似的氨基酸序列區(qū)域的融合蛋白，或其片段或部分。舉例說明而非僅限于此，突變的噬菌體phU9病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白[例如，SEQ ID NO :1， Genbank Acc. No. ACE96033]或設(shè)計(jì)的噬菌體phU9病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽融合蛋白(例如SEQ ID NOS :31-35和41-45)可根據(jù)本發(fā)明使用，像以下多肽一樣相對于所報(bào)道的多肽，至少有80%的相似性(優(yōu)選80%相同)并更優(yōu)選90%的相似性(更優(yōu)選90%相同)的多肽，并且更優(yōu)選地相對于本文公開的多肽以及這些多肽的部分具有95% 的相似性(更優(yōu)選95%相同)的多肽，其中突變或設(shè)計(jì)的噬菌體phU9病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的這些部分通常包含至少150，175，200，225，250，275或更多的氨基酸，并且更優(yōu)選地包含至少 240，260，280，285，290，295，296，297，298，299，300，301,302, 303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321， 322，323，324，325，326，327，328，329，330 或更多的氨基酸。以類似方式，一些其他實(shí)施例考慮其他突變雙鏈DNA噬菌體病毒馬達(dá)連接器蛋白，例如下列的突變形式噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID N0:7]，噬菌體 λ 的 DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NOS :8-11] (Accession number gi549295, gi6723246, gi 15837315，gi 16764273)，噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽 [SEQ ID NO :12] (P54309)，噬菌體P22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NO 13] (Accession number AAA7^61)，噬菌體P2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NO: 14] (Accession number NP_046757)，噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽(Nutter 等，1972J. Virol. 10(3) :560-2)，噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NO: 15 (Accession number CAA35152)，噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NOS 16-19] (Accession number AAX12078, YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)，和噬菌體 Τ7 的 DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽[SEQ ID NO 20] (Accession number NP_041995)。本發(fā)明的一些實(shí)施例涉及病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽、突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽和設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器多肽融合蛋白，并且一些實(shí)施例涉及構(gòu)建體，所述構(gòu)建體編碼病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白如突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽和設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器多肽融合蛋白，例如病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白融合多肽，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白融合多肽含有如本文所提供的馬達(dá)蛋白連接器孔道結(jié)構(gòu)域，并包含也如本文所提供的柔性結(jié)構(gòu)域和親和/對齊結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種，并特別涉及用于制作含導(dǎo)電通道膜的方法，使用編碼這些蛋白的重組構(gòu)建體，所述蛋白能夠自組裝形成均十二聚體的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，并且可以被表達(dá)，例如并且在一些相關(guān)實(shí)施例中，為這些多肽的片段、類似物和衍生物。也考慮并將在下文詳細(xì)討論這樣的突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的變形、片段、衍生物、截?cái)嗟鹊?，包括用于它們的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)表征(例如，存在孔道結(jié)構(gòu)域以及如本文所提供的柔性結(jié)構(gòu)域和親和/對齊結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種)和功能測試(例如， 當(dāng)嵌入脂膜中時(shí)它們的孔道形成性質(zhì)，也如本文所述的)的常規(guī)的方法。根據(jù)一些優(yōu)選實(shí)施例，用于本文公開的組分和方法中的突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器多肽，可以包括氨基酸序列，所述氨基酸序列與雙鏈DNA噬菌體DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽，如病毒DNA包裝馬達(dá)連接蛋器白多肽亞基，例如，通過說明而不是限制的方式，包括如SEQ ID NOS :1-20, 31-35和41-45中的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多肽，具有至少有百分之80、百分之85、百分之90、百分之95、96、97、98、百分之99或以上的序列同一性。術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”，在提到病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白或多肽時(shí)，是指這里所描述的任何突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽，或含有這種多肽的融合蛋白，所述融合蛋白基本上保留與這種多肽相同的生物學(xué)功能或活性。因此，類似物包括前蛋白，所述前蛋白可以通過使所述前蛋白部分裂解而被活化，以產(chǎn)生活性的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器多肽，在優(yōu)選實(shí)施例中，所述多肽可以嵌入膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，和/或所述多肽能夠自組裝形成均十二聚體病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，如可以形成這樣的孔道，以獲得含導(dǎo)電通道膜。如本文所述的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的片段、衍生物或類似物，包括由本文所提到的cDNAs編碼的多肽或融合蛋白或結(jié)構(gòu)域或其部分，且對于cDNAs， 核苷酸編碼序列可以是本領(lǐng)域已知的和/或可從本文所公開的多肽序列推導(dǎo)出，可以是 (i) 一種片段、衍生物或類似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或不保守的氨基酸殘基 (優(yōu)選地保守的氨基酸殘基)取代并且這種取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼所編碼的殘基，或(ii) 一種片段、衍生物或類似物，其中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基包括取代基，或(iii) 一種片段、衍生物或類似物，其中另外的氨基酸融合到突變的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽，包括用于檢測或特定功能改變突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽或前蛋白序列的氨基酸。這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從本文的教導(dǎo)可知的范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域已知的，兩個(gè)多肽之間的“相似性”通過將多肽的氨基酸序列和到其上的保守的氨基酸取代基與第二多肽的序列進(jìn)行比較而確定。根據(jù)目前公開的實(shí)施例編碼多肽的核酸的片段或部分，可用于合成全長核酸，所述核酸編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽。如本文所用的，“％相同”指的是位于相應(yīng)的氨基酸殘基位置的相同氨基酸的百分比，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)多肽對齊并采用空隙BLAST算法(例如，Altschul等，1997Nucl.Ac. Res. 25 :3389)分析它們的序列時(shí)，所述空隙BLAST算法根據(jù)國家衛(wèi)生研究院 /NCBI WiMf^ (National Center for Biotechnology Information,Bethesda,MD) 共白勺默認(rèn)權(quán)重加權(quán)序列空隙和序列錯(cuò)配。術(shù)語“分離的”指該材料從原來的環(huán)境(例如，自然環(huán)境，如果它是天然存在的)中除去。例如，在活的動(dòng)物或完整的天然存在的病毒中存在的天然存在的核酸或多肽不是分離的，但同樣的核酸或多肽，與在自然系統(tǒng)中共存的部分或全部材料都分開，就是分離的。 這種核酸可以是載體的一部分和/或這種核酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍然是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是其自然環(huán)境的一部分。術(shù)語“基因”是指與生產(chǎn)多肽鏈有關(guān)的DNA片段，它包括編碼區(qū)“前導(dǎo)區(qū)和尾部”之前和之后的區(qū)、以及各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間隔序列(內(nèi)含子)。如本文所描述的，一些發(fā)明實(shí)施例提供由核酸編碼的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽和融合蛋白，所述核酸具有在框架內(nèi)融合到另外的融合多肽編碼序列的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼序列，以提供表達(dá)融合到另外的功能融合多肽序列的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼序列，其允許，以供說明而非限制，檢測、功能性改造、分離和/或純化產(chǎn)生的融合蛋白。這種融合蛋白可允許突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的功能改變，通過包含額外的多肽序列，所述額外的多肽序列影響所述融合產(chǎn)物的行為，例如，通過改變蛋白表面暴露的帶電和/或疏水氨基酸側(cè)鏈的利用率，以此方式以改變(例如，與適當(dāng)對照相比以統(tǒng)計(jì)相關(guān)方式增加或減少)蛋白與膜的相互作用，例如與兩親膜成分如膜雙分子層中的磷脂的相互作用。根據(jù)非限制理論，在這些和相關(guān)實(shí)施例中，所述突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的融合多肽可以更穩(wěn)定地嵌入所述膜和/或可以形成孔道，在膜兩側(cè)外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，以這樣的方式提供具有所需特性的孔道結(jié)構(gòu)，如增加的孔道尺寸和/或改變的親水性、疏水性、中性和/或帶電的氨基酸側(cè)鏈的分布和/或保存導(dǎo)電孔道結(jié)構(gòu)，盡管截?cái)嗖《綝NA包裝馬達(dá)連接器多肽序列或加入多肽序列(如，如本文所提供的柔性結(jié)構(gòu)域或親和/對齊結(jié)構(gòu)域)，所述多肽序列在野生型 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白中未發(fā)現(xiàn)。代表性多肽(例如，如本文所提供的突變或設(shè)計(jì)的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基， 例如，具有如本文所提供的具有柔性結(jié)構(gòu)域和/或親和/對齊結(jié)構(gòu)域的多肽融合蛋白)的三維結(jié)構(gòu)的測定可通過常規(guī)方法進(jìn)行，以便用選定的天然或非天然氨基酸取代、添加、缺失或插入一種或多種氨基酸，可以模擬，用于確定如此衍生的結(jié)構(gòu)變異是否保持目前公開的物種的空間填充性能。見，例如，Donate 等，1994Prot. Sci. 3 :2378 ；Bradley 等·，Science 309 :1868-1871(2005) ；Schueler-Furman 等，Science 310 :638(2005) ；Dietz 等·，Proc. Nat. Acad. Sci. USA103 :1244(2006) ；Dodson 等·，Nature 450 :176(2007) ；Qian 等·， Nature 450 :259 Q007)?？捎糜谶@些和相關(guān)的實(shí)施例的計(jì)算機(jī)算法的一些額外的非限制性的例子，如用于如本文所提供的柔性結(jié)構(gòu)域或親和/對齊結(jié)構(gòu)域的合理設(shè)計(jì)，包括桌面分子建模(見，例如，Agboh等，J.Biol. Chem.，279，40 =41650-57(2004))模式，其允許從能量最小的構(gòu)象的空間填充模型(范德華半徑)確定原子尺寸；網(wǎng)格，其目的是確定不同化學(xué)基團(tuán)的高親和力區(qū)域，從而提高約束力；蒙特卡羅搜索，其計(jì)算數(shù)學(xué)對齊，和CHARMM (Brooks等· (1983)J. Comput. Chem. 4 :187-217)和 AMBER(Weiner 等(1981)J. Comput. Chem. 106 765)，其評估力場計(jì)算和分析(另見，Eisenfield等.(1991) Am. J. Physiol. 261 :C376_386 ； Lybrand(1991)J. Pharm. Belg. 46 :49-54 ；Froimowitz (1990)Biotechniques 8 :640-644 ； Burbam 等.(1990)Proteins 7 :99-111 ；Pedersen (1985)Environ. Health Perspect. 61 185-190 ；and Kini 等· (1991)J. Biomol. Struct. Dyn. 9 :475-488))。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了截短的組分(例如，突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的片段)用于突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽融合蛋白，而在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了編碼具有這種截短的組分的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽融合蛋白的核酸。截短的分子可以是包括長度小于分子的全長版本的任何分子，例如，截短的病毒 DNA包裝馬達(dá)蛋白多肽亞基。本發(fā)明提供的截短的分子可以包括截短的生物聚合物，并且在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中這種截短的分子可以是截短的核酸或截短的多肽。截短的核酸分子具有比已知或描述的核酸分子的全長核苷酸序列小的核苷酸序列，其中這樣的已知的或描述的核酸分子可以是天然的、合成的或重組的核酸分子，只要本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)視它為全長分子。因此，例如，與基因序列對應(yīng)的截短的核酸分子包含比全長基因小的序列， 其中所述基因包括編碼和非編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他調(diào)節(jié)序列、側(cè)翼序列等等、以及公認(rèn)為基因的一部分的其它功能和非功能序列。在另一個(gè)示例中，與mRNA序列對應(yīng)的截短的核酸分子包含小于全長mRNA轉(zhuǎn)錄物，其可以包括各種翻譯和非翻譯區(qū)域以及其他功能和非功能序列。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，截短的分子是包括特定的蛋白質(zhì)或多肽成分的全長氨基酸序列要短的多肽。如本文所使用的，“缺失”對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有共同的含義，并可以指的是從任一末端或從非末端區(qū)缺少一個(gè)或多個(gè)序列的一部分的分子，相對于相應(yīng)的全長分子，例如，本文提供的截短的分子。截短的分子，其是線性生物聚合物如核酸分子或多肽，可以有從任一末端的缺失或者從所述分子的非末端區(qū)的缺失中的一個(gè)或多個(gè)，其中這樣的缺失可以缺失1-1500個(gè)連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基，優(yōu)選地1-500個(gè)連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基，更優(yōu)選地1-300個(gè)連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基，包括缺失1，2，3，4，5，6，7，8， 9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31-40，41-50， 51-74，75-100，101-150，151-200，201-250或251-299個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。在一些特別優(yōu)選實(shí)施例中，截短的核酸分子可以缺失3-75個(gè)連續(xù)的核苷酸。在一些其他特別優(yōu)選實(shí)施例中，截短的多肽分子可以缺失 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31-40 或 41-50 連續(xù)的氨基酸。天然氨基酸序列的改變可以通過任意一種常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^合成含突變序列的寡核苷酸，兩側(cè)加入限制酶切位點(diǎn)以允許在天然序列中連接片段，而在特定位點(diǎn)引入突變。連接之后，生成的重建序列編碼具有所需的氨基酸插入、取代、或缺失的類似物?？蛇x地，寡核苷酸定向的位點(diǎn)專一誘變過程可以被用來提供改變的基因，其中預(yù)定的密碼子可通過取代、缺失或插入而改變。進(jìn)行這些改變的方法的范例披露于 Walder 等(Gene42 133，1986) ；Bauer 等· (Gene 37:73,1985) ；Craik(BioTechniques, January 1985,12-19) ；Smith 等.(Genetic Engineering-Principles and Methods BioTechniques,January 1985,12-19) ；Smith等· (Genetic Engineering-Principles andMethods, Plenum Press,1981) ；Kunkel(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488,1985) ；Kunkel 等· (Methods in Enzymo 1. 154 :367,1987)；和美國專利號 4，518，584 和 4，737，462。作為一個(gè)例子，對DNA的修飾可以通過定點(diǎn)突變編碼蛋白質(zhì)的DNA與使用DNA擴(kuò)增方法結(jié)合，用引物引入并擴(kuò)增DNA模板中的改變，如PCR重疊延伸剪接(SOE)。定點(diǎn)突變典型地使用噬菌體載體而實(shí)現(xiàn)，所述噬菌體載體有單鏈和雙鏈的形式，如M13噬菌體載體， 其是眾所周知的和可商購的。其他適當(dāng)?shù)妮d體，其包含單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起始點(diǎn)，可以使用 (見，例如，Veira等，Meth. Enzymol. 75 :3，1987)。一般情況下，定點(diǎn)突變是通過制備編碼感興趣的蛋白質(zhì)的單鏈載體而進(jìn)行的。寡核苷酸引物，其包含在所述單鏈載體中的DNA同源的區(qū)域內(nèi)的所需突變，退火到所述載體，接著是加入DNA聚合酶，如大腸桿菌DNA聚合酶 I (Klenow片段)，其使用雙鏈區(qū)域作為引物以產(chǎn)生異源雙鏈體，其中一鏈編碼改變的序列， 并且另一鏈編碼原來的序列。將異源雙鏈體引入適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞，并且選擇包括所需的突變的克隆。產(chǎn)生的改變DNA分子可在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中重組表達(dá)以產(chǎn)生修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一些實(shí)施例也包括等效DNA構(gòu)建體，其編碼的氨基酸殘基或序列的各種增加或取代，或?qū)τ谏锘钚圆⒉恍枰脑谀┒嘶騼?nèi)部殘基或序列的缺失。例如，根據(jù)一些設(shè)想的實(shí)施例，可以使對于生物活性并不需要或重要的編碼半胱氨酸殘基的序列改變，以使所述半胱氨酸殘基缺失或被其他氨基酸替代，在核酸復(fù)正時(shí)防止不正確或不需要的分子內(nèi)二硫鍵的形成。修飾的多肽可通過相關(guān)領(lǐng)域中已知的任何方法實(shí)現(xiàn)。本文的優(yōu)選方法依賴于編碼所述融合蛋白的DNA的修飾和所述修飾的DNA的表達(dá)。編碼以上所討論的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽融合中的一種的DNA，可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法誘變，包括下述方法。例如，半胱氨酸殘基，其以其他方式促進(jìn)多聚體形成，或者調(diào)節(jié)與分析物上的反應(yīng)基團(tuán)的相互作用，以通過本文所述的含導(dǎo)電通道膜檢測，或者促進(jìn)特別的分子構(gòu)象，可以從多肽中刪除或替換，例如，引起不需要的聚集體形成的半胱氨酸殘基。如果必要，有助于形成這種聚集體的半胱氨酸殘基，可由經(jīng)驗(yàn)決定，通過刪除和/或替換半胱氨酸殘基以及確定生成的蛋白質(zhì)是否在含有生理可接受的緩沖液和鹽的溶液中形成聚集體。此外，可構(gòu)建和使用突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽融合，其在一些優(yōu)選實(shí)施例中包括片段，所述片段包括這種多肽的跨膜形成部分。這樣的片段的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和測試可基于本披露并使用常規(guī)的方法實(shí)現(xiàn)，包括，例如，計(jì)算機(jī)模擬多肽設(shè)計(jì)、重組表達(dá)、功能嵌入膜層、和電導(dǎo)檢測，如本文所討論的。氨基酸的保守的取代是眾所周知的，并一般可在不改變突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽分子的生物活性的情況下進(jìn)行。例如，這種替換一般是在極性殘基、帶電殘基、疏水殘基、小型殘基、等的組內(nèi)互換。如果必要，這種替換可以由經(jīng)驗(yàn)來確定，僅僅通過檢測產(chǎn)生的修飾的蛋白的改變(例如，以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式增加或減少)下列的能力例如，十二聚體自組裝，嵌入膜層，導(dǎo)電孔道形成和/或分析物檢測，在體外試驗(yàn)中，如本文所描述的那些。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如本文所提供的編碼多核苷酸序列的與突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽序列雜交的核酸，或它們的補(bǔ)充，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)容易明白的，如果在所述序列之間有至少70 %、優(yōu)選80-85 %、更優(yōu)選至少90 %、并且還要更優(yōu)選至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。本發(fā)明特別是涉及編碼本文所
39提到的核酸的在嚴(yán)格的條件下與突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽雜交的核酸。本文中所使用的術(shù)語“嚴(yán)格的條件”是指雜交僅僅在所述序列之間有至少 90-95%，并優(yōu)選地至少97%的同一性的條件下發(fā)生。編碼本文所提到的核酸的與突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽雜交的核酸，編碼多肽，所述多肽保持與本文所描述的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽大體相同的生物功能或活性(例如，十二聚體自組裝，嵌入膜層，導(dǎo)電孔道形成，檢測分析物的能力)。如本文所用的，在指定的嚴(yán)格條件下“雜交”用來描述兩個(gè)單鏈核酸分子之間形成的雜交種的穩(wěn)定性。雜交的嚴(yán)格性典型地表現(xiàn)在離子強(qiáng)度和這些雜交種退火并洗滌的溫度條件。典型地“高”，“中等”和“低”嚴(yán)格性包括下列或等價(jià)條件高嚴(yán)格性0. IXSSPE 或 SSC, 0. 1 % SDS, 65 0C ；中嚴(yán)格性0. 2 X SSPE 或 SSC,為 0. 1 % SDS, 50 °C ；和低嚴(yán)格性 1.0XSSPE或SSC，0. 1%SDS，50°C。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的，雜交條件的嚴(yán)格性的變化可通過改變預(yù)雜交、雜交和清洗步驟中使用的時(shí)間、溫度和/或溶液濃度而實(shí)現(xiàn)，并適當(dāng)?shù)臈l件也可以部分取決于使用的探針、和沾上污漬的先證核酸樣品的特定核苷酸序列。 因此，可以理解的是，適當(dāng)嚴(yán)格的條件可以容易地選擇，而不需要不必要的實(shí)驗(yàn)，其中識(shí)別所述探針的所需的選擇性，根據(jù)其與一個(gè)或多個(gè)一些先證序列雜交而不與一些其他先證序列雜交的能力。本發(fā)明的核酸，本文也稱為聚核苷酸，可以RNA的形式或DNA的形式存在，DNA包括cDNA、基因組DNA、和人工合成的DNA。所述DNA可以是雙鏈或單鏈的，并且如果是單鏈的可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼序列，其編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽用于根據(jù)一些發(fā)明實(shí)施例的用途，可以含有與本領(lǐng)域中已知的病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白的部分的相同的序列區(qū)，或可以因?yàn)檫@些原因有不同的編碼序列， 其，因?yàn)檫z傳密碼的冗余或簡并，編碼這種病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的相同區(qū)域。核酸，其編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽用于根據(jù)一些發(fā)明實(shí)施例的用途，可以包括但不限于，僅僅用于突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的編碼序列；用于突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的編碼序列和另外的編碼序列；用于突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的編碼序列(和任選地另外的編碼序列)和非編碼序列，例如用于突變或設(shè)計(jì)的病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的編碼序列的內(nèi)含子或非編碼序列5'和/或3'，例如其可進(jìn)一步包括但不必限于一個(gè)或多個(gè)的調(diào)控核酸序列，其可以是調(diào)控或可調(diào)控的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，抑制結(jié)合序列、翻譯調(diào)控序列或任何其他調(diào)控核酸序列。因此，術(shù)語“核酸編碼”或“多核苷酸編碼”突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽包括，只包含用于突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的編碼序列的核酸，和包括額外的編碼和/或非編碼序列的核酸。用于如本文所描述的用途的核酸和寡核苷酸，可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何方法合成(見，例如，U. S. Application Serial No. 07/723，454 ；U. S. Patent No. 5, 218, 088 ；U. S. Patent No. 5, 175, 269 ；U. S. Patent No. 5，109，124)。用于當(dāng)前披露的實(shí)施例的寡核苷酸和核酸序列的確定包括本領(lǐng)域中眾所周知的方法。例如，有用的寡核苷酸的所需的性質(zhì)、長度和其他特性是眾所周知的。在一些實(shí)施例中，合成寡核苷酸和核酸序列可以設(shè)計(jì)成抵抗由內(nèi)源宿主細(xì)胞溶核酶引起的降解，通過包含以下連接硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、砜、硫酸酯、羰基(ketyl)、二硫代磷酸酯、磷酸酯、和已被證明在反義引物用途中有用的其他這樣的連接(見Agrwal等，Tetrehedron Lett. 28 :3539-3542(1987)； Miller 等.，J. Am. Chem. Soc. 93 :6657-6665(1971) ；Stec 等.，Tetrehedron Lett.26 2191-2194(1985) ；Moody 等·，Nucl. Acids Res. 12 :4769-4782(1989) ；Uznanski 等·， Nucl.Acids Res. (1989) ；Letsinger 等·， Tetrahedron40 :137-143(1984) ；Eckstein, Annu.Rev. Biochem. 54 :367-402(1985) ；Eckstein, Trends Biol. Sci. 14 :97-100(1989)； Stein In :01igodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp.97-117(1989) ；Jager 等，Biochemistry 27 7237-7246(1988))。宿主生物包括在該生物中由一些目前披露的發(fā)明實(shí)施例的重組構(gòu)建體編碼的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽產(chǎn)物的重組生產(chǎn)可以發(fā)生，如細(xì)菌 (如大腸桿菌)、酵母(例如，釀酒酵母和畢赤酵母)、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物，包括體外和體內(nèi)的表達(dá)。宿主生物從而可以包括用于在生產(chǎn)本文所提供的組合物中的構(gòu)建、傳播、表達(dá)或在其他步驟的生物。目前優(yōu)選的宿主生物是大腸桿菌菌株。編碼所需的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的DNA構(gòu)建體引入用于在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)的質(zhì)粒。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述宿主是細(xì)菌宿主。編碼所述配體或核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列優(yōu)選是為表達(dá)特定的宿主進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。因此，舉例來說，如果突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽在細(xì)菌中表達(dá)，密碼子需要針對細(xì)菌使用優(yōu)化。對于小的編碼區(qū)，該基因可作為單一寡核苷酸合成。對于較大的蛋白質(zhì)，可以使用多個(gè)核苷酸的剪接、誘變、或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)。在質(zhì)粒中的核苷酸序列，其為調(diào)控區(qū)域，如啟動(dòng)子和操縱子，在操作時(shí)相互協(xié)同用于轉(zhuǎn)錄。編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的核苷酸序列可以還包括編碼分泌信號的DNA， 由此所產(chǎn)生的肽是前體蛋白。產(chǎn)生的處理的蛋白質(zhì)可以在周質(zhì)空間或發(fā)酵培養(yǎng)基中恢復(fù)活性。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述DNA質(zhì)粒還包括轉(zhuǎn)錄終止序列。如本文所使用的，“轉(zhuǎn)錄終止區(qū)”是表示轉(zhuǎn)錄終止信號的序列。整個(gè)轉(zhuǎn)錄終止可從蛋白質(zhì)編碼基因獲得，其可以與突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼基因或啟動(dòng)子的來源相同或不同。 轉(zhuǎn)錄終止子是本文的表達(dá)系統(tǒng)的可選組分，但在優(yōu)選實(shí)施例中使用。本文使用的質(zhì)粒，包括啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與編碼感興趣的蛋白或多肽的DNA在操作時(shí)協(xié)作，并設(shè)計(jì)用于如以上所描述的在適當(dāng)?shù)乃拗?如細(xì)菌，小鼠或人)中表達(dá)蛋白， 取決于質(zhì)粒的所需的用途。用于表達(dá)本文的蛋白質(zhì)和多肽的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子有多種并在本領(lǐng)域中是眾所周知的。連接到調(diào)控區(qū)域的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或構(gòu)成啟動(dòng)子是優(yōu)選的。這樣的啟動(dòng)子包括但不限于，噬菌體T7啟動(dòng)子和其他類似噬菌體T7啟動(dòng)子，如T3、T5和SP6的啟動(dòng)子， trp、lpp、以及Iac啟動(dòng)子，如來自大腸桿菌的lacUV5 [ δ ]，桿狀病毒群/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的PlO或多角體蛋白基因啟動(dòng)子(見，例如，U. S. Patent Nos. 5243041，5242687，5266317， 4745051，和5169784)和來自其他真核生物表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了表達(dá)所述蛋白， 這些啟動(dòng)子插入質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒與控制區(qū)域如乳糖操縱子操作上關(guān)聯(lián)。優(yōu)選的啟動(dòng)子區(qū)域是指那些在大腸桿菌中可誘導(dǎo)并功能的。適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)啟動(dòng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的例子包括但不限于響應(yīng)異丙基β-D-半乳糖硫吡喃糖苷類的大腸桿菌乳糖操縱子(IPTG，見Nakamura等，Cell 18 :1109-1117,1979)；響應(yīng)重金屬(如鋅)誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子的金屬調(diào)控元素(見，例如，Evans等，U. S. Patent No. 4870009)；相應(yīng)IPTG 的噬菌體 T71ac 啟動(dòng)子(見，U. S. Patent No. 4952496 ；及 Mudier 等.，Meth. Enzymol. 185 60-89，1990)以及TAC啟動(dòng)子。所述質(zhì)粒可以任選地包含可選擇的標(biāo)記基因或在宿主中有功能的基因?？蛇x擇的標(biāo)記基因包括任何導(dǎo)致細(xì)菌表型改變的基因，使改變的細(xì)菌細(xì)胞能從大多數(shù)未改變的細(xì)胞中辨認(rèn)并選擇性生長。細(xì)菌宿主的適當(dāng)?shù)目蛇x擇的標(biāo)記基因，例如，包括氨芐青霉素抗性基因(Amp1O、四環(huán)素抗性基因(IV)和卡那霉素抗性基因(KarO。所述質(zhì)粒還可以包括編碼用于可操作連接的蛋白的分泌信號的DNA。適合使用的分泌信號可廣泛獲得，且在本領(lǐng)域中是眾所周知的。可以使用在大腸桿菌中發(fā)揮功能的原核和真核分泌信號。目前優(yōu)選的分泌信號，包括但不限于由以下大腸桿菌基因編碼的那些信號0mpA、ompT、ompF、ompC、β -內(nèi)酰胺酶、堿性磷酸酶、等等(von Heijne， J. Mol.Biol. 184 :99-105,1985) ο此外，可以使用細(xì)菌pdlB基因分泌信號(Lei等·， J. Bacteriol. 169 :4379，1987)、phoA分泌信號、以及在昆蟲細(xì)胞中發(fā)揮功能的cek2。最優(yōu)選的分泌信號是大腸桿菌ompA分泌信號。也可使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他原核和真核分泌信號(見，例如，von Heijne, J. Mol.Biol. 184 :99_105，1985)，也可使用包括大腸桿菌^bF載體蛋白的融合區(qū)域(Siang等，2006Nat. Biotechnol. M :100)。使用本文所述的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可代替在酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的分泌信號，以從這些細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)。用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的優(yōu)選質(zhì)粒包括pET表達(dá)載體(例如，pET-lla, pET-12a-c, pET-15b ；見美國專利號 4952496 ；可購自 Novagen, Madison, WI)。其他優(yōu)選質(zhì)粒包括PKK質(zhì)粒，特別是ρΚΚ223-3，其包含tac啟動(dòng)子(Brosius等，Proc. Natl. Acad. Sci. 81 :6929,1984 ；Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology ； U. S. Patent Nos. 5，122，463，5，173，403，5，187，153，5，204，254，5，212，058，5，212，286， 5，215，907，5，220，013，5，223，483，and 5，229，279)。質(zhì)粒 pKK 已通過用卡那霉素抗性基因代替氨芐青霉素抗性基因而被修飾。(可從Wiarmacia獲得；從pUC4K獲得， 見，例如，Vieira 等，Gene 19 :259_268，1982 ；和 U. S. Patent No. 4，719，179)。桿狀病毒載體，如PBlueBac (也稱為ρJVETL及其衍生物)，特別是pBlueBac III (見，例如， U. S. Patent Nos. 5，278，050，5，244，805，5，243，041，5，242，687，5，266，317,4, 745，051， and 5，169，784 ；可從hvitrogen，San Diego獲得)也可用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多肽。其他質(zhì)粒包括pIN-IIIompA質(zhì)粒(見美國專利號4575013 ；又見Duffaud等，Meth. Enz. 153 492-507，1987)，如 pIN-IIIompA2.優(yōu)選地，所述DNA分子在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制，優(yōu)選在大腸桿菌中。優(yōu)選DNA分子還包括細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)，以確保DNA分子能夠在一代到下一代的細(xì)菌中維持。以這種方式， 大量的DNA分子可以通過在細(xì)菌中復(fù)制而產(chǎn)生。優(yōu)選的細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)包括但不限于， Π-ori和col El復(fù)制起始點(diǎn)。優(yōu)選的宿主含有編碼T7RNA聚合酶的DNA的染色體復(fù)制品，所述T7RNA聚合酶操作上連接至可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如IacUV啟動(dòng)子(見美國專利號 4952496)。這些宿主包括但不限于溶原菌大腸桿菌菌株HMS174(DE3)pLysS，BL21(DE3) pLysS,HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是優(yōu)選的。pLys菌株提供低水平的T7
42溶菌酶，T7RNA聚合酶的天然抑制劑。提供的DNA分子可以還包含編碼抑制子蛋白的基因。所述抑制子蛋白可以抑制含有所述抑制子蛋白結(jié)合的核苷酸序列的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子可以通過改變所述細(xì)胞的生理?xiàng)l件而去抑制。例如，所述改變可以通過在所述生長培養(yǎng)基中添加抑制與操縱子或與調(diào)控蛋白或所述DNA的其他區(qū)域的相互作用的分子，或通過改變生長介質(zhì)的溫度而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的抑制子蛋白包括但不限于響應(yīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌Iacl抑制子、溫度敏感的 λ cl857抑制子、等等。所述大腸桿菌Iacl抑制子是優(yōu)選的。一般情況下，實(shí)施例的重組構(gòu)建體也將包含轉(zhuǎn)錄和翻譯需要的元件。在特別情況下，這些元件是優(yōu)選的，其中含有核酸序列的重組表達(dá)構(gòu)建體打算用于在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)，所述核酸序列編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的細(xì)胞類型優(yōu)選或細(xì)胞類型特定表達(dá)可通過在啟動(dòng)子的調(diào)控下安置所述基因而實(shí)現(xiàn)。所述啟動(dòng)子的選擇將取決于將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型和所需的控制程度或類型。啟動(dòng)子可以組成型的或活動(dòng)的，并可以進(jìn)一步是細(xì)胞類型特異性的，組織特異性的，個(gè)體細(xì)胞特異性的，事件特異性的， 時(shí)間特定的或可誘導(dǎo)的。細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子和事件類型特異性啟動(dòng)子是優(yōu)選的。組成型或非特異性啟動(dòng)子的例子包括SV40早期啟動(dòng)子(美國專利號5118627)、SV40的晚期啟動(dòng)子(美國專利號5118627)、巨細(xì)胞病毒早期基因啟動(dòng)子(美國專利號5168062)、和腺病毒啟動(dòng)子。除了病毒啟動(dòng)子，細(xì)胞啟動(dòng)子也屬于本發(fā)明的范圍。特別地，所謂的看家基因的細(xì)胞啟動(dòng)子是有用的。病毒啟動(dòng)子是優(yōu)選的，因?yàn)橐话愕厮鼈儽燃?xì)胞啟動(dòng)子效果強(qiáng)。在許多真核生物包括高等真核生物的基因中已確定啟動(dòng)子區(qū)，這樣本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地選擇在特定的宿主中使用的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。也可使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括MMTV LTR(PCT WO 91/13160)，可由地塞米松誘導(dǎo)；金屬硫蛋白啟動(dòng)子，可由重金屬誘導(dǎo)；以及與環(huán)單磷酸腺苷反應(yīng)元件的啟動(dòng)子， 可由cAMP誘導(dǎo)。通過使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的核酸序列可通過本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體被遞送入細(xì)胞并且保持靜止，直到加入誘導(dǎo)劑。這允許對基因產(chǎn)物生產(chǎn)的時(shí)間的進(jìn)一步控制。事件類型特異性啟動(dòng)子只在事件如致瘤性或病毒感染發(fā)生時(shí)活動(dòng)或正調(diào)節(jié)。艾滋病毒LTR是事件特異性啟動(dòng)子的公知的例子。所述啟動(dòng)子是不活動(dòng)的，除非tat基因產(chǎn)物存在，這在病毒感染時(shí)發(fā)生。一些事件類型啟動(dòng)子還是組織特異性的。此外，可以使用與特定的細(xì)胞基因協(xié)同調(diào)控的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)特定的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼基因的表達(dá)需要與一種或多種額外的內(nèi)源性或外源性引入的基因的表達(dá)一致時(shí)，可以使用協(xié)調(diào)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。除了所述啟動(dòng)子，抑制子序列、負(fù)調(diào)控物、或組織特異性沉默子可以被插入以減少突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼基因的非特異性表達(dá)，例如， 宿主或宿主細(xì)胞，其中可以需要短暫地和/或細(xì)胞類型特異或組織特異或位點(diǎn)特異地改變跨膜導(dǎo)電性，作為實(shí)驗(yàn)或治療策略的一部分。多個(gè)抑制子元件可以被插入到所述啟動(dòng)子區(qū)。 轉(zhuǎn)錄的抑制獨(dú)立于抑制子元件的方向或其與所述啟動(dòng)子的距離。抑制子序列的類型之一是絕緣子序列。這種序列抑制轉(zhuǎn)錄(Dunaway等.，Mol Cell Biol 17 :182-9,1997 ；Gdula等.， Proc Natl Acad Sci USA 93 :9378_83，1996，Chan 等·，J Virol 70 :5312-28,1996 ；Scottand Geyer, EMBO J14 :6258-67,1995 ；Kalos and Fournier, Mol Cell Biol 15 :198-207, 1995 ；Chung等.，Cell 74 =505-14,1993)，并將抑制沉默背景轉(zhuǎn)錄。抑制子元件在下列的基因的啟動(dòng)子區(qū)域已被確定11型(軟骨)膠原、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、白蛋白(Hu 等.，J. Cell Growth Differ. 3(9) :577_588，1992)、磷酸甘油酸激酶 (PGK-2) (Misuno 等.，Gene 119(2):四3_四7，1992)，以及 6-磷酸果糖-2-激酶 / 果糖-2， 6 二磷酸酶基因。(Lemaigre 等·，Mol. Cell Biol. 11 (2) :1099-1106)。此外，負(fù)調(diào)控元件 Tse-I在大量肝臟特異基因中已被確定，并已被證明可阻止在肝細(xì)胞基因激活的cAMP反應(yīng)元件(CRE)介導(dǎo)的誘導(dǎo)。(Boshart 等，Cell 61(5) :905_916，1990)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將能夠增加需要的產(chǎn)物的表達(dá)的元件嵌入所述構(gòu)建體。這些元件包括內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES ;Wang and Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Immunol 203 :99,1995 ；Ehrenfeld and Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203 :65,1995 ；Rees 等.，Biotechniques20 :102,1996 ；Sugimoto 等.，Biotechnology 12 :694,1994)。IRES 提高翻譯效率。同樣，其他序列可以提高表達(dá)。對于一些基因，序列尤其是在5'末端的序列抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。這些序列通常是可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的回文序列。任何這樣的序列在將被遞送的核酸中一般都被刪除。轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的表達(dá)水平經(jīng)過試驗(yàn)，以確認(rèn)或確定哪些序列影響表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平可以通過任何已知的方法試驗(yàn)，包括Northern印跡雜交、核糖核酸酶探針保護(hù)等等。蛋白質(zhì)水平可以通過任何已知的方法試驗(yàn)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、 免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)或其他公知的技術(shù)。其他元件可以嵌入本發(fā)明的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼構(gòu)建體。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述構(gòu)建體包括轉(zhuǎn)錄終止序列，包括聚腺苷酸化序列、 剪接給體和受體位點(diǎn)、和增強(qiáng)子。也可以嵌入在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或真核細(xì)胞中用于所述構(gòu)建體的表達(dá)和維持的其他元件(例如，復(fù)制起始點(diǎn))。因?yàn)樵诩?xì)菌細(xì)胞中方便產(chǎn)生所述構(gòu)建體，所以嵌入細(xì)菌繁殖必需的或提高細(xì)菌繁殖的元件。這些元件包括復(fù)制起始點(diǎn)、可選擇標(biāo)
記、等等。如本文所提供的，使用本發(fā)明的實(shí)施例的構(gòu)建體控制核酸的額外的表達(dá)水平可以通過同時(shí)傳遞兩種或多種差異調(diào)節(jié)核酸構(gòu)建體而提供，所述核酸編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽。這樣的多核酸構(gòu)造方法的使用可允許病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白表達(dá)的協(xié)同調(diào)控。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)理解，調(diào)控的基因表達(dá)的多個(gè)水平可以類似的方式通過選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列實(shí)現(xiàn)，包括但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他公知的基因調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及載體，并涉及從包括本發(fā)明的核酸的已知載體制備的構(gòu)建體，并特別涉及“重組表達(dá)構(gòu)建體”，其包括任何核酸，所述核酸編碼如本文所提供的根據(jù)一些本發(fā)明的實(shí)施例的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽； 并涉及宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體和/或構(gòu)建體通過基因方法設(shè)計(jì)。突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽可在幾乎任何宿主細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下表達(dá)，取決于所述構(gòu)建體的性質(zhì)(例如，啟動(dòng)子的類型，如上所述)，并取決于所需的宿主細(xì)胞的性質(zhì)(例如，是否分裂后末端分化或積極分裂，例如，是否所述表達(dá)構(gòu)建體作為附加體出現(xiàn)在宿主細(xì)胞中或整合到所述宿主細(xì)胞基因組)。Sambrook，等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, NY, (2001)描述了用于與原核和真核宿主一起使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體。典型地，所述構(gòu)建體來自質(zhì)粒載體。優(yōu)選的構(gòu)建體是修飾后的pNASS載體 (Clontech公司，帕洛阿爾托，加利福尼亞州)，它具有編碼氨芐青霉素抗性基因的核酸序列、多腺苷酸化信號和T7啟動(dòng)子位點(diǎn)。其他適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體是眾所周知的(例如，見 Ausubel 等.,1995 ；Sambrook 等.,supra ；還見,例如，Invitrogen, San Diego, CA ； Novagen, Madison, WI ；Pharmacia, Piscataway, NJ ；及其它)。在適當(dāng)?shù)恼{(diào)控控制下可以制備目前優(yōu)選的結(jié)構(gòu)，其包括二氫葉酸還原酶(DHFR)編碼序列，用于促進(jìn)突變或設(shè)計(jì)的病毒 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的提高了的生產(chǎn)水平，它由在使用適當(dāng)?shù)倪x擇劑(如甲氨蝶呤)后的基因放大產(chǎn)生。一般來說，重組表達(dá)載體將包括復(fù)制起始點(diǎn)和允許所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記、和從高表達(dá)基因獲得的到下游結(jié)構(gòu)序列的直接轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，如以上所描述的。異源結(jié)構(gòu)序列在適當(dāng)相中與翻譯起始和終止序列組裝。因此，例如，如本文所提供的突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼核酸可以包括在各種表達(dá)載體構(gòu)建體中的任何一種中作為用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組表達(dá)構(gòu)建體。所述適當(dāng)?shù)腄NA序列可以通過各種程序插入所述載體中。一般來說，所述DNA序列通過本領(lǐng)域中已知的程序插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶位點(diǎn)。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，對于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶類等等的酶反應(yīng)， 以及各種分離技術(shù)，是那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知并常用的技術(shù)。許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于，例如，Ausubel 等(2004Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, Inc. ,Boston,MA) ；Sambrook等(2001Molecular Cloning,Third Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,NY) ；Maniatis 等(1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ；Glover (Ed.) (1985DNA Cloning Vol. I and II， IRL Press, Oxford,UK) ；Hames and Higgins(Eds. ), (1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK)，和其他地方。在所述表達(dá)載體中的DNA序列，操作上連接到至少一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(例如，組成型啟動(dòng)子或調(diào)控啟動(dòng)子)以指導(dǎo)mRNA的合成。這種表達(dá)控制序列的代表性的例子包括真核細(xì)胞或它們的病毒的啟動(dòng)子，如上所述。啟動(dòng)子區(qū)域可以從任何所需的基因使用具有可選擇標(biāo)記的CAT (氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其他載體選擇。真核生物啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒立即早期、單純皰疹病毒胸苷激酶、早期和晚期猿猴病毒40、來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs、 和鼠金屬硫蛋白-1。適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子的選擇恰好在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平內(nèi)， 并且本文描述了一些特別優(yōu)選的重組表達(dá)構(gòu)建體的制備，所述構(gòu)建體包括操作上連接到核酸的至少一種啟動(dòng)子或調(diào)控的啟動(dòng)子，所述核酸編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽。編碼本發(fā)明的多肽的DNA由高等真核生物的轉(zhuǎn)錄可以通過將增強(qiáng)子序列插入所述載體而增加。增強(qiáng)子是DNA的反式/順式作用的元件，通常約從10到300bp，其作用在啟動(dòng)子上，以增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括在所述復(fù)制起始點(diǎn)bp 100到270的后側(cè)上的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在所述復(fù)制起始點(diǎn)的后側(cè)上的多瘤增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。如本文所提供的，在一些實(shí)施例中，所述載體可以是病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。(Miller等·，1989BioTechniques 7 980 ；Coffin and Varmus, 1996Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratory I^ressJY.)。例如，從所述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，其可以復(fù)制并通過DNA中間體整合到宿主細(xì)胞的基因組。 這種DNA中間體、或前病毒可以穩(wěn)定地整合到所述宿主細(xì)胞的DNA。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施，表達(dá)構(gòu)建體可以包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，編碼異種蛋白的外源基因代替正常逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA 嵌入所述逆轉(zhuǎn)錄病毒。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA與感染同時(shí)進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，所述外源基因也引入所述細(xì)胞，然后可以整合入宿主細(xì)胞的DNA，好像它是由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分。 這種外源基因在所述宿主內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致所述外源蛋白的表達(dá)。已開發(fā)用于基因治療的大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)是基于小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒存在于兩種形式，作為自由病毒粒子稱為病毒粒子，或作為整合到宿主細(xì)胞的DNA的原病毒。所述病毒的病毒粒子的形式包含所述逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括所述酶逆轉(zhuǎn)錄酶)的結(jié)構(gòu)和酶蛋白、病毒基因組的兩個(gè)RNA復(fù)制品、和含有病毒包膜糖蛋白的源細(xì)胞質(zhì)膜的部分。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組組織成四個(gè)主要區(qū)域長末端重復(fù)序列(LTR)，其包含轉(zhuǎn)錄的起始和終止所需的反式/順式作用元件并位于所述編碼基因的5'和3'，和三種編碼基因gag、pol、和env。這三種編碼基因gag、pol、和env分別編碼內(nèi)部病毒結(jié)構(gòu)、酶蛋白(如整合酶)、和包膜糖蛋白(指定gp70和pl5e)，包膜糖蛋白賦予了病毒感染性和宿主范圍特異性，以及具有未確定功能的“R”肽。已開發(fā)了單獨(dú)包裝細(xì)胞系和載體生產(chǎn)細(xì)胞系，因?yàn)殛P(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的用途的安全考慮，包括其在如由本發(fā)明所提供的表達(dá)構(gòu)建體中使用。簡單地說，這種方法采用了兩個(gè)組件，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及包裝細(xì)胞系(PCL)。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有長末端重復(fù)序列 (LTRs)、要轉(zhuǎn)移的外源DNA和包裝序列(y)。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將不會(huì)自身復(fù)制，因?yàn)榫幋a結(jié)構(gòu)和包膜蛋白的基因不包括在所述載體基因組中。所述PCL包含編碼所述gag、p0l、和 env蛋白的基因，但不包含所述包裝信號“y”。因此，PCL只能自身形成空病毒粒子。在這種一般方法中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入到所述PCL，從而創(chuàng)造載體生產(chǎn)細(xì)胞系(VCL)。這種VCL生產(chǎn)只含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(外源)的基因組的病毒粒子，因此以前被認(rèn)為是用于治療用途的安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?！澳孓D(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體”是指組裝體，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述組裝體能夠指導(dǎo)感興趣的序列或基因的表達(dá)，例如突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽。簡單地說，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體必須包括5'端LTR、tRNA的結(jié)合位點(diǎn)、包裝信號、第二鏈DNA合成的起始點(diǎn)和3'端LTR。種類繁多的異種序列可以包括在所述載體構(gòu)建體中，包括例如，以下序列編碼蛋白質(zhì)(例如，所需的補(bǔ)充基因或替換基因)的序列，或本身用作轉(zhuǎn)錄分子(例如，作為核酶或反序列)的序列。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體，可以容易地從多種多樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)造， 包括例如，B、C、和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒以及泡沫病毒(spumaviruses)和慢病毒(見，例如， RNATumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory,1985)。這禾中逆轉(zhuǎn)錄病毒可以容易地從儲(chǔ)藏所或收集所，例如美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所(“ATCC”;R0Ckville，Maryland)獲得，或從已知來源使用常用的技術(shù)分離。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒中任何一種可以容易地利用，以組裝或構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體、包裝細(xì)胞、或本文所提供的披露給出的本發(fā)明的生產(chǎn)者細(xì)胞、和標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)(如，Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 ；Kunkle, PNAS 82 :488, 1985)。用于病毒載體的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子一般可包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR ；SV40的啟動(dòng)子；在Miller，等.，Biotechniques 7 =980-990(1989)中描述的人類巨細(xì)胞病毒(CMV) 啟動(dòng)子，或任何其他啟動(dòng)子(如，細(xì)胞啟動(dòng)子，如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于，組蛋白、 聚合酶III、和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)?？梢允褂玫钠渌《締?dòng)子包括但不限于，腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子、和Β19細(xì)小病毒的啟動(dòng)子。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的選擇對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從本文所包含的教導(dǎo)將是顯而易見的，并可從調(diào)控啟動(dòng)子或以上所描述的啟動(dòng)子中進(jìn)行。如上所述，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系，以形成生產(chǎn)細(xì)胞系。 可以轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括，但不僅于，Miller, Human Gene Therapy, 1 :5-14(1990) 中描述的 PE501，PA317, y-2, y-AM, PA12, T19—14X，VT-19-17-H2, yCRE, yCRIP, GP+E—86， GP+envAml2，和DAN細(xì)胞系。所述載體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)所述包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于，電穿孔、脂質(zhì)體利用、和CaPO4沉淀。在一個(gè)可選實(shí)施例中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以被包裝成脂質(zhì)體，或連接到脂質(zhì)，然后給予宿主。所述生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子，其包括核酸序列，所述核酸序列編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽或融合蛋白。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子然后可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞，在體外或體內(nèi)。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼突變或設(shè)計(jì)的多肽或融合蛋白的核酸序列?？梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括，在優(yōu)選實(shí)施例中， 平滑肌細(xì)胞(例如，血管平滑肌細(xì)胞，包括動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和靜脈平滑肌細(xì)胞，胃腸道平滑肌細(xì)胞，呼吸道平滑肌細(xì)胞，泌尿生殖道平滑肌細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞，肌纖維母細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，周細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和血管內(nèi)皮細(xì)胞，但該項(xiàng)發(fā)明不打算如此限制，這樣將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在一些實(shí)施例中還可以包括，例如，胚胎干細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，循環(huán)外周血單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞包括骨髓單核細(xì)胞性細(xì)胞(myelomonocytic cell)，淋巴細(xì)胞，成肌細(xì)胞，組織巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，枯否細(xì)胞，淋巴結(jié)和脾的淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞(reticuloendothelia cell)，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，支氣管上皮細(xì)胞。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的另一個(gè)示例，其中病毒載體用來制備所述突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼表達(dá)構(gòu)建體，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，由指導(dǎo)突變或設(shè)計(jì)的多肽的表達(dá)的重組病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，可以產(chǎn)生含有表達(dá)的突變或設(shè)計(jì)的多肽的病毒粒子，所述多肽衍生自宿主細(xì)胞膜的部分，所述病毒粒子在病毒出芽過程中嵌入所述宿主細(xì)胞膜。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及含有以上描述的重組突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞用這些和相關(guān)發(fā)明的實(shí)施例的載體和/或表達(dá)構(gòu)建體通過基因方法設(shè)計(jì)(轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)變或轉(zhuǎn)染)，所述載體和/或表達(dá)構(gòu)建體可以是，例如，克隆載體、穿梭載體或表達(dá)構(gòu)建體。所述載體或構(gòu)建體可以，例如，以質(zhì)粒、病毒粒子、噬菌體等形式存在。所述設(shè)計(jì)的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述常規(guī)培養(yǎng)基適當(dāng)修飾用于激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體或放大特定基因，如編碼突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽的基因。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易明白用于表達(dá)選擇的特定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件，如溫度、PH值等等。所述宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的代表性的例子包括，但不必限于，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、沙門氏菌tvphimurium;真菌細(xì)胞，如酵母、昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和斜紋夜蛾(Spodoptera) Sf9 ；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO，COS或 293細(xì)胞；腺病毒；植物細(xì)胞，或已經(jīng)適應(yīng)體外繁殖或從頭建立的任何適當(dāng)?shù)募?xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇被視為在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從本文的教導(dǎo)的范圍內(nèi)。不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以被用來表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括Gluzman，Cell 23 :175(1981)所述的猴腎成纖維細(xì)胞的C0S-7株、和能表達(dá)兼容載體的其他細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包括復(fù)制起始點(diǎn)，適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化的位點(diǎn)， 剪接給體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，例如本文所述有關(guān)突變或設(shè)計(jì)的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白衍生的多肽編碼表達(dá)構(gòu)建體的制備。來自SV40的剪接、和多聚腺苷酸化的位點(diǎn)的DNA序列可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。將所述構(gòu)建體引入所述宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的多種方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于， 例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，二乙氨乙基葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis等，1986Basic Methods in Molecular Biology)。如本文所使用的和在所附權(quán)利要求中，單數(shù)形式的“一”，“和”和“所述”包括復(fù)數(shù)的參照物，除非文意另有明確規(guī)定。因此，例如，參考“多肽”或“所述多肽”包括參考一種或多種多肽(即，多種多肽)和本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其等同物，等等，除非另有明確說明。在整個(gè)說明書中，參考“一個(gè)實(shí)施例”或“一個(gè)實(shí)施例”，或者“在另一個(gè)實(shí)施例中” 或“在一些實(shí)施中”是指與所述實(shí)施例有關(guān)描述的特定的指示物特征、結(jié)構(gòu)或特性包含在至少一個(gè)實(shí)施例中。因此，在整個(gè)說明書中的各處出現(xiàn)的詞組“在一個(gè)實(shí)施例中”，或“在一個(gè)實(shí)施例中”，或者“在另一個(gè)實(shí)施例中”不一定都是指相同的實(shí)施例。此外，特定的特征、結(jié)構(gòu)或特性可以任何適當(dāng)?shù)姆绞浇M合在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中。在整個(gè)說明書中，除文意另有所指外，將“包括”，“包括”和“包括”理解為意味著包括說明的步驟或元素或者一組步驟或元素，但不排除任何其他步驟或元素或者一組步驟或元素?！坝?..組成”是指包括并只限于，無論短語“由...組成”后是什么。因此，短語 “由...組成”表示列出的元素是必須的和強(qiáng)制性的，并且其他因素不可以存在。“基本上由...組成”是指包括所述短語后列出的任何元素，而且限于其他元素，所述其他元素對于列出的元素不干擾或促進(jìn)在本披露中指定的活動(dòng)或行動(dòng)。因此，短語“基本上由...組成” 表示列出的元素是必須的和強(qiáng)制性的，但其他元素不是必需的，可以存在或可以不存在，取決于它們是否影響列出的元素的活動(dòng)或行動(dòng)。除非另有明確表示，本發(fā)明的實(shí)施將使用本領(lǐng)域內(nèi)的化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、 分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞協(xié)議、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的傳統(tǒng)方法，其中許多在下面描述用于說明的目的。這些技術(shù)完全解釋在所述文獻(xiàn)中。見，例如 Sambroo k，等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd Edition，2001) ；Sambrook，等·，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2nd Edition， 1989) ；Maniatis 等.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(1982) ；Ausubel 等.， Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons,updated July 2008)； Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience ； Glover, DNA Cloning :A Practical Approach，vol. I&II(IRL Press，Oxford,1985)； Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes， (Academic Press,New York， 1992) ；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press，New York，1991) ；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed.，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B. Hames&S. Higgins, Eds.，1985) ；Transcription and Translation(B. Hames&S. Higgins, Eds.，1984) ；Animal Cell Culture(R. Freshney, Ed.，1986) ；Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984) ；Fire 等·，RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development (Cambridge University Press，Cambridge，2005) ；Schepers，RNA Interference in Practice (Wiley-VCH,
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50緩沖液中的鎂離子促進(jìn)PRNA與原殼體的結(jié)合。這些富集pRNA的原殼體與3微升反應(yīng)緩沖液(TMS中含有IOmM三磷酸腺苷/6mM亞精胺/3mM β -巰基乙醇)，100納克DNA-GP3和6微升0. 5微克/微升的DNA包裝酶gpl6混合?；旌衔镌谑覝叵路跤?0分鐘。DNA的包裝效率通過脫氧核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的方法驗(yàn)證(Guo等，Virologyl85, 395-400(1991))。由原殼體保護(hù)的包裝的DNA在凝膠上顯示出來。DNA填充的衣殼生物活性可以測試其被轉(zhuǎn)換成感染性phU9病毒的能力。經(jīng)過30 分鐘的DNA包裝，頸部，尾部和成形的蛋白質(zhì)被加入，完成感染性病毒粒子組裝，可以通過標(biāo)準(zhǔn)噬斑形成進(jìn)行試驗(yàn)(Guo 等，1986 ；Lee 等，J. Virol. 69，5018-5023 (1995))。連接器的熒光標(biāo)記。連接器用氟標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)共軛試劑盒(Sigma 公司，圣路易斯，密蘇里州)。使用柱層析，緩沖液E改為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。FITC 溶液加入連接器溶液，輕輕攪拌，孵育2小時(shí)。多余的FITC通過柱層析去除，F(xiàn)ITC標(biāo)記的連接器用PBS洗脫。FITC標(biāo)記連接器通過SDS-PAGE驗(yàn)證。標(biāo)記效率由熒光素/蛋白摩爾比決定，通過紫外可見分光光度法測定。包含改造的連接器巨脂囊泡的制備。為了制備熒光巨脂囊泡，有1毫升1毫克/ 毫升DOPC或DPhPC和(摩爾比)的NBD-PE在一小瓶中混合。氯仿由氮?dú)廨p輕吹干，脂質(zhì)小瓶放入干燥器進(jìn)一步干燥過夜。為了再水化脂質(zhì)膜，2毫升200mM-300mM蔗糖作為模范滲透劑來使囊泡脫離玻璃和進(jìn)入溶液。接著該小瓶用石蠟?zāi)じ采w，儲(chǔ)存過夜。整個(gè)試樣從溶液中間提出，然后轉(zhuǎn)移到一個(gè)培養(yǎng)皿。經(jīng)過沉淀，囊泡可以用外延熒光顯微鏡觀察(圖 5)。將病毒DNA的包裝的馬達(dá)蛋白連接器嵌入巨型囊泡可通過上述方法完成，除了將 NBD-PE省略。IOOyL FITC標(biāo)記的重新設(shè)計(jì)的連接器添加到上面脫水脂質(zhì)，最后脂質(zhì)與連接器的摩爾比為75 1(或以低至4000 1到16000 1作BLM實(shí)驗(yàn))(圖5)。連接器嵌入平面脂雙分子層一種兩步的方法用于將連接器嵌入平面雙層類脂膜 (BLM組)。第一步是制備包含重新設(shè)計(jì)的連接器單層脂質(zhì)囊泡，如上所述。接下來的步驟是，融合擠壓脂質(zhì)體成一個(gè)平面脂雙分子層(圖幻。該脂雙分子層的流動(dòng)性可由FRAP(熒光漂白后恢復(fù))證明(圖5D)。激發(fā)光照射到雙分子層來漂白染料。光漂白區(qū)域出現(xiàn)黑暗。 但是，當(dāng)光關(guān)閉后，由于由熒光脂質(zhì)擴(kuò)散到光漂白區(qū)域后導(dǎo)致熒光逐漸恢復(fù)。利用標(biāo)準(zhǔn)脂雙分子層箱(BCH-1A購自 Eastern Scientific LLC, Rockville, MD) 來構(gòu)建水平脂雙分子層。用孔徑為70-120微米(TP-01購自festern Sci. LLC)或180-250 微米(TP-02購自festern Sci. LLC)的薄聚四氟乙烯薄膜將箱分為成順(工作容積250微升)和順式(工作容積250毫升)分隔室。孔徑先用0. 5微升3% (w/v)的DPhPC的-正癸烷溶液噴涂兩次，以確保孔周圍邊緣完全被覆蓋，這些分隔裝滿電導(dǎo)緩沖液(5mM Tris/ pH 值 7. 9，TMS,或 5mMHEPES/pH 值 7. 9，及濃度變化的 NaCl 或 KCl)。在分離層上形成雙層膜是病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器嵌入到雙層膜的首要步驟(圖5E)。在研究中(約280個(gè)獨(dú)立脂雙分子層實(shí)驗(yàn))，病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入的成功率約47-83%。對于單電導(dǎo)測量，先前制備的巨脂質(zhì)體/連接器復(fù)合物用孔徑為200nm和400nm 的聚碳酸酯膜擠出產(chǎn)生小單層脂質(zhì)體。這種脂質(zhì)體原液在使用前進(jìn)一步稀釋10-20倍用于脂雙分子層實(shí)驗(yàn)。為插入病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，0. 5-2 μ L的稀釋液脂質(zhì)體被裝入順/反分隔室。電導(dǎo)測量方法有兩種第一種是在特定但很定的電壓下進(jìn)行，第二種是在嵌入 phU9GP10病毒DNA包裝的馬達(dá)蛋白連接器到脂質(zhì)膜中后，通過開始于-IOOmV至IOOmV的掃描電壓下誘導(dǎo)的痕跡斜率(圖6)。Q-PCR分析。為，連接器/脂質(zhì)體復(fù)合物加入反式方(工作容積500微升)。加入順式方25nM的141-bpDNA。作為陰性對照，沒有連接器/脂質(zhì)體復(fù)合物情況下加入DNA。 加-95毫伏電壓，分析樣品收集反式方30分鐘間隔用于Q-PCR分析。DNA濃度用而530紫外/可見分光光度計(jì)(Beckman Coulter公司，富勒頓，加利福尼亞州)測定。絕對定量用來確定在收集的樣本中DNA的復(fù)制數(shù)。用已知濃度的10倍稀釋(圖11)的141-bpDNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)稀釋做三次試驗(yàn)。iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad公司，Hercules，加利福尼亞州)用于Q-PCR反應(yīng)。的Q-PCR技術(shù)進(jìn)行了 iCycler iQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng) (Bio-Rad公司)。相對應(yīng)的DNA模板的正向反向寡核苷酸底物序列分別為5' -TAA TAC GAC TCA CTA TTA GM CGG CAT CM GGT GM CTC AAG ATT TTG TAT GTT GGG GAT TA-3' [SEQ ID NO 48]禾口 5' -AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATA ATT GAC AGC AGG CAA TCA AC-3' [SEQ ID N0:49](少數(shù)購自 htegrated DNA Technologies, Inc. (〃 IDT")， Coralville, ΙΑ)。示例二將獨(dú)立病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入脂質(zhì)體形成含導(dǎo)電通道的膜本示例描述將改良的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入脂質(zhì)體和脂雙分子層，設(shè)計(jì)和制備如上所述，包括示例1，以及由此產(chǎn)生的導(dǎo)電通道表征。經(jīng)地面的，是由連接器蛋白形成的貫穿脂質(zhì)雙層的通道的存在可以通過單通道電導(dǎo)測量和雙鏈DNA易位來證實(shí)。通過蔗糖梯度沉淀分離和檢測脂質(zhì)體/連接器復(fù)合物。利用5-20%的線性蔗糖梯度沉淀在TMS(50mM的Tris，pH值為8. 0，氯化鈉lOOmM，IOmM氯化鎂)(Guo等，，1986)中將脂質(zhì)體/連接器復(fù)合物從自由連接器中分離出來。一份0. 1毫升樣品裝在5mL的離心管的頂部。經(jīng)過在貝克曼L-80超高速離心器中在SW55轉(zhuǎn)子中，27000轉(zhuǎn)數(shù)/分，20°C轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn) 30分鐘，分離物采自試管底部，用10%的SDS-PAGE分析(圖2)。過濾。脂蛋白體用0. 45微米的醋酸纖維素膜(生命科學(xué)產(chǎn)品公司Life Science Products, Inc.)過濾，將自由連接器從脂質(zhì)體/連接器復(fù)合物中分離。將500微升200mM 包含連接器的DOPC脂質(zhì)體囊泡的蔗糖溶液加入濾管，并用一樣的溶液裝滿。經(jīng)過15分鐘 3000 Xg旋轉(zhuǎn)，小于200微升的液體后被保留。微濾過程重復(fù)五次。用熒光顯微鏡顯示脂質(zhì)體/連接器復(fù)合物保留在過濾器的頂部。制備雙鏈DNA用于易位實(shí)驗(yàn)。一個(gè)35-bp的雙鏈DNA是由兩個(gè)單鏈DNA5' -TTA TAG GGA TAG TTG TAA GCT AM GM TAC GTT AC-3' (Integrated DNA Technologies, Inc. ("IDT" )， Coralville, IA)和 5<1>_GTA ACG TAT TCT TTA GCT TAC AAC TAT CCC TAT AA-3' (IDT)退火制備。退火在65°C下進(jìn)行3分鐘，樣品在室溫孵育2小時(shí)。16% PAGE凝膠用于純化雙鏈DNA。從凝膠內(nèi)釋放出DNA后，用乙醇沉淀濃縮。線性5. 5千堿基對的質(zhì)粒DNA的制備來自于一個(gè)內(nèi)部構(gòu)造的環(huán)狀質(zhì)粒，Cx43的， 由一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRV，鈍端剪切。用QIAGEN袖珍洗提反應(yīng)凈化裝備包OiIAGEN)進(jìn)行純化，DNA被添加到順式方直接進(jìn)行DNA易位實(shí)驗(yàn)。
電生理學(xué)測量。直接連接到電流放大器頭部一對銀/氯化銀電極的用來測量跨雙層類脂膜的電流曲線，并使用Axopatch 200B膜片鉗放大器加上Axon DigiData 1322A或 Axon DigiData 1440 模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Axon Instruments, Inc.，Union City, CA)跟蹤記錄。所有報(bào)道的電壓均是順式腔室。如果沒有指出，數(shù)據(jù)在IkHz的頻率進(jìn)行了低通濾波，和采樣頻率為2kHz。PClamp 9. 1軟件(Axon Instruments)用于收集數(shù)據(jù)，并使用Clampfit 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。雙鏈DNA易位實(shí)驗(yàn)。如果沒有特別指出，在DNA易位實(shí)驗(yàn)中DNA被添加到順式方。 的C-His6標(biāo)記的連接器(具有C端六組氨酸修飾的病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器)被用來評價(jià)易位實(shí)驗(yàn)。TMS/1M氯化鈉緩沖液作為DNA易位緩沖液。兩種方法用于加DNA到室內(nèi)進(jìn)行易位實(shí)驗(yàn)。方法1:DNA連接器插入后0毫伏電壓添加。當(dāng)電壓切換回來，通過自由擴(kuò)散的DNA和施加的電壓DNA向連接器通道移動(dòng)；方法2 在連接器嵌入前DNA與緩沖液在箱內(nèi)完全混合。DNA的運(yùn)動(dòng)主要依靠外加電壓。所有實(shí)驗(yàn)均使用方法1，除非另有說明。修飾phi29DNA的包裝馬達(dá)連接器蛋白。一般來說，膜孔和離子通道包含一個(gè)疏水區(qū)，將蛋白質(zhì)固定帶細(xì)胞膜。分析ph^9連接器表面電荷發(fā)現(xiàn)，與在寬和窄端的兩個(gè)側(cè)面層相比其中心區(qū)域的表現(xiàn)較輕微疏水(圖1) (Simpson等，2001Acta Crys. D57 1260-69 ;Guasch 等，2002J MoI Biol 315:663-676)。為了方便連接器純化，一包含一個(gè) C 端His (His6) or Strep-II (WSHPQFEK)標(biāo)記的親和/對齊結(jié)構(gòu)域，插入包含一個(gè)六甘氨酸連接器的一個(gè)柔性域，以提高親和性標(biāo)記的靈活性。六甘氨酸連接器都包括在內(nèi)，可以提供端到端的靈活性(圖2)。純化到均一態(tài)后，使用透射電子顯微鏡TEM(圖1D，E)觀測發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)后的DNA的封裝馬達(dá)蛋白連接肽GPlO自組裝為十二聚體馬達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，與野生型連接器的12聚體結(jié)構(gòu)非常類似(圖1F).其原本和真實(shí)的馬達(dá)構(gòu)型的存在通過其成立后打包成雙鏈DNA的衣殼體(圖幻，并裝配所產(chǎn)生的DNA填充衣殼到病毒的傳染性phU9進(jìn)行驗(yàn)證(圖4)。連接器重組為脂質(zhì)體。一種連接器重組為脂質(zhì)體的過程是蔗糖作為模范滲透劑， 連接器和脂質(zhì)一起共同孵化。這種培養(yǎng)提供了一個(gè)連接器的疏水層與脂質(zhì)分子的疏水區(qū)相互作用的機(jī)會(huì)。脫水-補(bǔ)液方法(Lasic, D.D.，Liposomes in Gene Delivery. CRC Press LLC.，(1997)，Boca Raton, FL)可生產(chǎn)直徑可達(dá)50微米的巨脂質(zhì)體(圖5)。蛋白連接器在脂質(zhì)膜中的嵌入通過熒光顯微鏡、滲濾試驗(yàn)和沉降分析得到了證實(shí)(圖幻。該連接器在膜的存在用熒光顯微鏡可見，在脂質(zhì)體周圍呈現(xiàn)出明顯的熒光環(huán)(圖幻。熒光環(huán)在外觀上與熒光脂質(zhì)NBD-PE生成的脂質(zhì)體非常相似(圖fe)。當(dāng)把熒光標(biāo)記的連接器與未嵌入連接器的脂質(zhì)體非特異性混合時(shí)，沒有環(huán)形熒光出現(xiàn)(圖幻。通過使用0. 45微米膜孔大小的膜過濾或5-20%蔗糖梯度離心除去自由連接器(圖5)。連接器嵌入平面脂質(zhì)膜。由于上述實(shí)驗(yàn)沒有一個(gè)可以區(qū)分連接器松散附著雙層表面和緊密附著雙層膜，當(dāng)其與雙層膜成為一體后其孔徑保留以形成通道，可進(jìn)行單通道電導(dǎo)法。研究結(jié)果顯示，將連接器蛋白直接與脂質(zhì)體或平面脂雙分子層混合并未導(dǎo)致雙層膜中通道的形成(圖6A)。連接器插入雙層膜只發(fā)生在連接器蛋白質(zhì)重組脂酶與雙層膜融合的情況下(圖6B-C)。該通道通過觀察在直流電流中一個(gè)離散逐步增加的電導(dǎo)(圖6)，在無論是正還是負(fù)跨膜電壓下。通常，在0. 5/5mM Tris (pH值7. 9)/0. 5M氯化鈉溶液中，在_40mV電壓下，在一個(gè)雙層插入連接器將導(dǎo)致電流增加約65pA(相當(dāng)于1. 6納秒)。由于兩個(gè)連接器插入到膜中， 偶爾觀察到130. 9pA的猛增(圖六D)。在TMS/1M氯化鈉中測量通道電導(dǎo)得到類似的結(jié)果 (圖7)。在這種情況下，兩個(gè)連接器和三個(gè)連接器同時(shí)插入的發(fā)生率分別為4. 7%和1. 9%。為進(jìn)行電導(dǎo)測量，在不同的電壓下獲得IV曲線圖，(圖6E)。在5mM Tris單導(dǎo)孔平均電導(dǎo)為1. 57 士0. 16納秒/孔(一共有38個(gè)嵌入連接器)(圖6E)，在TMS/1M氯化鈉緩沖液中為3. 21 士0. 51納秒/孔(一共有213個(gè)嵌入連接器)(圖7)。作為比較，在一個(gè)斜線電壓下也進(jìn)行了連接器通道電導(dǎo)測量(圖6F，G)。在5mM Tris/0. 5M氯化鈉中形成的通道電導(dǎo)擬合曲線的斜率分別為1. 59納秒/單孔隙，3. 40納秒/兩孔，和4. 98納秒/三個(gè)孔。 當(dāng)NaCl濃度達(dá)到IM(TMS緩沖液與IM氯化鈉)，曲線斜率為3. 12納秒/單孔。5mMHEPES/lM 氯化鉀緩沖液也用于電導(dǎo)測量(見表1)。表1 :GP-10連接器3達(dá)蛋白連接器)和α -溶血素的單通道導(dǎo)電性比較
^L電導(dǎo)(ns/孔)一
孔直徑截面積-
蛋白質(zhì),2)在0.5 M 在IM氯
nm(nm
_氯化鈉中化鉀中連接器3.63.2.1.57 ±0.16 4.84 ±0.15
a-HL1.111.110.31 ± 0.05 b 0.94 ±0.01 9
比值
18.45.15.15.1
(連接器/a-HL)a在0. 5M NaCl，和IM KCl中連接器的電導(dǎo)分別分別從總數(shù)為38和36個(gè)插入中獲得，在0. 5M氯化鈉和IM氯化鉀中的α -HL電導(dǎo)都是從總計(jì)4個(gè)插入中獲得。b α -HL在IM氯化鈉中的電導(dǎo)報(bào)道為0. 68納秒/孔(Braha等，1997Chem. Biol. 4 497) ^M氯化鉀 α "HL 電導(dǎo)報(bào)道為 0. 80 (Wong 等，2006Nanotechnol. 17 :3710)或 1. 0 (Vercoutere 等，2001Nat. Biotechnol. 19 :248) nS/ 孑L。使用不同離子強(qiáng)度的溶液，比較與金黃色葡萄球菌α -溶血素(α-HL)的連接通道電導(dǎo)(見表1)。據(jù)報(bào)道，連接器通道的窄端直徑為3. 6nm，而a-HL形成的通道直徑只有 1. 5納米(Song等·，1996Science 274 :1859)。因此，連接器和a -HL之間的通道截面積比為5.7。所測連接器與a-HL的電導(dǎo)率比為5.1(表2).由于通道電導(dǎo)正比于它的橫截面面積，可以得出結(jié)論病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白質(zhì)連接器在緩沖溶液中形成的孔徑截面積比約a -HL的5. 1倍，這與來自于兩蛋白質(zhì)晶體學(xué)數(shù)據(jù)的截面積比率一致。此外，相比其他跨膜蛋白質(zhì)或有較大通道的離子通道蛋白，如鏈球菌溶血素(Gilbert 等，1999Cell 97 :647)，Kir (Lopatin 等，1996Biophys J 71:682)， VDAC (Szabo 等，1998FASEB J12 :495)，細(xì)菌孔蛋白(Iqbal 等，2007Nat. Nanotechnol. 2 M3)，連接器通道有更多的優(yōu)勢。例如，病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器通道很穩(wěn)定，而且不像前面描述的跨膜通道，并沒有在報(bào)道的條件下表現(xiàn)出電壓門控。該通道電導(dǎo)均勻，表明對-IOOmV和IOOmV之間外加電壓的線性響應(yīng)(圖6F，G)。
54
雙鏈DNA的易位。線性和環(huán)狀質(zhì)粒Cx43DNA(5. 5kb)被用來研究通過病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器通道形成的孔徑進(jìn)行雙鏈DNA易位。對于線性DNA質(zhì)粒來說，DNA易位引起許多電流阻斷而導(dǎo)致的單連接器插入電流激增暫時(shí)減少了 25-45% (圖8)在35-bp的雙鏈DNA易位實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖9)。然而，當(dāng)線性Cx43的加入c/s室后，直到電壓轉(zhuǎn)換到正電壓也沒有觀察到這樣的阻斷(圖6G)。短暫的阻斷可以是由于DNA易位的發(fā)生。與此相反，當(dāng)DNA不存在的情況下，電流軌跡是靜態(tài)的(圖8，9)。有時(shí)，在最低檢測時(shí)間內(nèi)觀察到非特異性阻斷。與DNA的易位相比這些非特異性阻斷很少發(fā)生。他們的通常特征是檢測時(shí)間與采樣頻率的限制非常接近(圖8B，6G)。當(dāng)使用環(huán)形質(zhì)粒雙鏈DNA Cx4, 沒有觀察到環(huán)形質(zhì)粒易位(圖8B，左上角)。有趣的是，當(dāng)同樣數(shù)量脫氧核糖核酸酶I分解的環(huán)形質(zhì)粒加到室內(nèi)，突然有短暫的阻斷發(fā)生(圖8b的左下角)。當(dāng)使用被脫氧核糖核酸酶分解的線性Cx43時(shí)，也觀察到同樣的結(jié)果(圖8B條右下)。所有上述結(jié)果證實(shí)，只有線性雙鏈DNA通過連接器通道。偶爾，阻斷在5-15%范圍內(nèi)觀察到(圖8C右)，停留時(shí)間從幾到數(shù)百毫秒。這些是由于非特異性阻斷不是DNA易位引起的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)他們沒有DNA的情況下出現(xiàn)(圖9B)。 非特異性阻斷可以是由于病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器孔(導(dǎo)電通道)與脂質(zhì)或脂質(zhì)膠囊發(fā)生相互作用，因?yàn)橛^察到加更多的脂質(zhì)體到腔內(nèi)后，發(fā)生率增加。當(dāng)使用稀釋的連接器重組脂質(zhì)體，和/或當(dāng)施加更低的跨膜電壓，非特異性阻斷可減少發(fā)生(圖8C左)。有趣的是，偶然發(fā)現(xiàn)同時(shí)阻斷(圖8B，右上，圖9)。這些在多孔隙的條件下記錄。加入DNA之前和之后顯示連續(xù)電流痕跡(圖9B)。有時(shí)觀察到當(dāng)?shù)谌齻€(gè)病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入后，突然發(fā)生阻斷。相比之下，當(dāng)DNA在連接器插入前與緩沖液混合，第一次發(fā)生插入后立刻觀察到的DNA阻斷(圖9A)。此結(jié)果顯示在箱中缺乏攪拌設(shè)施導(dǎo)致DNA易位延遲。阻斷率受兩個(gè)因素影響DNA濃度和跨膜電壓。45pM DNA在3病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入的條件下，阻斷率約為0. 8-1阻斷/s (圖8B右上方)。相同數(shù)量的病毒DNA 包裝馬達(dá)蛋白連接器插入，當(dāng)4 μ MDNA放置在箱內(nèi)時(shí)，阻斷率率約為5-5. 8阻斷/秒(圖 9Α-Β)的。對于線性Cx43DNA，阻斷率隨著施加的斜線電壓增加而增加。為計(jì)算的DNA易位停留時(shí)間(Tp)，將阻斷超過32%的分組，因?yàn)檫@個(gè)阻斷率好像與雙鏈DNA和孔隙橫截面積之間比率一致。柱狀圖見圖8D。還應(yīng)指出的是，6(在-75mV) 和20 (低于零下40毫伏)在120毫秒到9800之間的個(gè)別外圍分散點(diǎn)為了清晰并沒有包括在圖中。在低于零下40mV的停留時(shí)間分布似乎是在_75mV的較廣泛。為DNA阻斷在_75mV 和-40mV的平均停留時(shí)間下分別為9. 2ms和22. Ims (在-40毫伏只有小于50毫秒的事件用于計(jì)算)。作為比較，35-bp的雙鏈DNA的停留時(shí)間分布也包括在圖內(nèi)(圖10)。在這種情況下，停留時(shí)間平均為0. 53毫秒。因此，可以得出結(jié)論，DNA易位的駐留時(shí)間受施加電壓和DNA大小的影響。為了驗(yàn)證雙鏈DNA通過由病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器形成的孔建立導(dǎo)電通道， 用定量PCR(Q-PCR)技術(shù)來量化在一固定電壓下的141-bp DNA的易位。DNA被添加到順式面，樣品間隔30分鐘從反式面取出來量化。為了便于比較，進(jìn)行了沒有病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的對照實(shí)驗(yàn)(圖11)。連接器插入雙層脂質(zhì)膜(BLMs)的實(shí)驗(yàn)顯示在順/反室隨著時(shí)間過去DNA分子數(shù)量增加^ = 9次實(shí)驗(yàn))。與此相反，在沒有連接器存在的情況下， 的DNA分子數(shù)目在90分鐘的時(shí)間過程中保持恒定G例實(shí)驗(yàn))。此外，DNA的易位率受病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入的數(shù)目影響(圖12)。要驗(yàn)證反式室內(nèi)DNA復(fù)制數(shù)目增加，是由于DNA易位通過由病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白質(zhì)連接器的孔形成導(dǎo)電通道而不是膜漏出物，另外三個(gè)實(shí)驗(yàn)在已知的雙層脂質(zhì)膜或分離層的條件下進(jìn)行。當(dāng)泄漏發(fā)生后，在反式室中每微升溶液DNA復(fù)制的數(shù)目約為沒有泄漏的實(shí)驗(yàn)的IO4至IO5倍)(圖12B)。示例 3重新設(shè)計(jì)的雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的連接器用于核酸易位雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器，孔徑大小和電導(dǎo)通過工程更改孔徑尺寸， 表面疏水性輪廓，自由運(yùn)動(dòng)的柔性結(jié)構(gòu)域和/或親和/對齊結(jié)構(gòu)域與雙層膜相互作用，特別親和力結(jié)合位點(diǎn)的性質(zhì)，所有如上所述。改良的連接器的電生理學(xué)、化學(xué)和力學(xué)性質(zhì)成為導(dǎo)電層的一部分以形成導(dǎo)電通道，在不同條件下描述，如離子強(qiáng)度，PH值和溫度等。用于 DNA定向跨膜運(yùn)輸?shù)倪B接器通道的方向根據(jù)本文所描述的確定，加載于巨脂質(zhì)體的濃縮雙鏈DNA是在施加跨膜電位下進(jìn)行的。核酸到脂質(zhì)體腔的單向跨膜易位先于傳遞遺傳信息到體外和/或體內(nèi)受體細(xì)胞，也先于脂質(zhì)體或其他薄膜限制的生物反應(yīng)器的產(chǎn)生。示例 4加入經(jīng)修飾的膜的病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器導(dǎo)電通道作為隨機(jī)傳感器用于在單分子分析中聯(lián)合分析物采集和指紋圖譜一對組氨酸標(biāo)記/反組氨酸標(biāo)記抗體，鏈球菌標(biāo)記/鏈霉親和素，生物素/鏈霉親和素，鏈球菌標(biāo)標(biāo)記/反鏈球菌抗體，組氨酸標(biāo)記/鎳-NTA對等都用作模型體系來證明包含膜的修飾雙鏈DNA病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器跨膜孔徑的作為基于導(dǎo)電通道的單分子探測器效用。連接器的修飾是在N-和/或C-末端與一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域融合，它是一個(gè)單鏈抗體或與有需要親和結(jié)合特異性的肽，接著在抗菌素顯示或與一個(gè)RNA契合寡聚物中鑒定，如上述設(shè)計(jì)能夠捕獲分析物(即具體的待檢物結(jié)合時(shí)，可觀察到的電導(dǎo)變化)和分析物指紋圖譜(例如，振幅和/或依賴持續(xù)時(shí)間變化的電導(dǎo)的電導(dǎo)輪廓的產(chǎn)生，在一個(gè)多重時(shí)間點(diǎn)上對一個(gè)測試分析物做出反應(yīng)，在規(guī)定的參照一個(gè)已知分析物的基準(zhǔn)導(dǎo)電輪廓的條件下來描述測試分析物)。將通過捕獲進(jìn)行分析物的探測和通過指紋表征識(shí)別進(jìn)行分析物的表征組合可以提高靈敏度(例如，在統(tǒng)計(jì)上顯著的方法中，能夠檢測和/或描述比如果只捕獲實(shí)用性存在的能力更大)，能夠在很低濃度鑒定分子。待檢物的檢測與表征發(fā)生在疾病較早階段，用于診斷目的，待檢物的環(huán)境監(jiān)測的敏感性得到增強(qiáng)。示例 5雙鏈DNA的傳感與指紋圖譜多肽序列造成的各種突變，影響尺寸，疏水性，電荷和導(dǎo)電性能，溶劑可到達(dá)的孔域(腔)和/或N-和/或C-末端，包括能夠形成一個(gè)跨膜導(dǎo)電通道的DNA的包裝馬達(dá)蛋白連接器的修正來提供不同的柔性域和/或親和/對齊域，來調(diào)整通道性質(zhì)以提高分析物檢測靈敏度和分辨率。幾種類型和形狀的核酸聚合物的易位是通過電導(dǎo)測量表征，包括電導(dǎo)輪廓產(chǎn)生，比如振幅的多重時(shí)間點(diǎn)和改變的電導(dǎo)的持續(xù)時(shí)間概況。在腫瘤細(xì)胞中檢測DNA 錯(cuò)配突變是通過癌癥細(xì)胞衍生DNA與含導(dǎo)電通道的膜接觸試驗(yàn)的。降低DNA易位速度的步驟是通過改變實(shí)驗(yàn)條件(例如，溫度，PH值，離子狀態(tài)，施加電壓大小)和不同修飾的DNA包裝馬達(dá)連接器的組成。導(dǎo)電通道是通道修飾的化學(xué)制品在一種控制方式下衍生的，來減緩雙鏈DNA跨膜通過(易位)，產(chǎn)生的電導(dǎo)輪廓能夠高識(shí)別精度單核苷酸。包含導(dǎo)電通道膜成為高通量雙鏈DNA測序儀的一部分。示例 6離子作為分析物在雙層膜(BLM)中的一個(gè)單個(gè)改良的病毒DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的電導(dǎo)隨鹽的濃度形成了很強(qiáng)的線性關(guān)系(圖13)。此外，在雙層膜(BLM)中的連接器的電導(dǎo)似乎依賴于離子，當(dāng)使用相同的鹽濃度(圖13BB，C)，在氯化鉀中的電導(dǎo)比在氯化鈉中的電導(dǎo)高。脂雙層連接通道的這種特性使其能夠有可以測試緩沖液濃度和區(qū)分離子種類，以及調(diào)整電導(dǎo)。示例 7DNA作為分析物線性和環(huán)狀質(zhì)粒雙鏈DNA (5. 5kb的)被用來研究雙鏈DNA易位通過由包含改良的 DNA修改包裝馬達(dá)蛋白連接器的膜形成的導(dǎo)電通道，如示例1和2中描述。線性DNA易位引起約30%電流阻斷(圖8)。當(dāng)使用環(huán)形質(zhì)粒雙鏈DNA，沒有觀察到易位發(fā)生(圖8)。然而， 經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I分解，線性和圓形質(zhì)粒DNA都產(chǎn)生大量短暫的阻斷(圖8C，D)。結(jié)果表明，只有通過線性雙鏈DNA通過連接器通道，而環(huán)狀DNA沒有。使用試劑盒(STOR Green kit)，DNA樣品通過孔隙的定量PCR(圖14)證實(shí)了 DNA易位。脂雙層的導(dǎo)電通道連接器孔徑與基于特征保留時(shí)間線性雙鏈DNA的尺寸不同，線性雙鏈DNA與折疊雙鏈DNA有區(qū)別。當(dāng)51Λρ雙鏈DNA在一個(gè)施加電壓下通過導(dǎo)電通道易位時(shí)，觀察到不同類型的電流阻斷(圖15)。在IM離子強(qiáng)度存在時(shí)雙鏈DNA的持續(xù)長度為 150bp (Baumann 等，1997Proc. Nat. Acad. Sci USA 94 :6185)，通過合成納米孔觀察到 DNA 易位(Storm等，2005Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matt Phys 71 (5Pt 1) :51903 ;Chen等·， 2004Nano Lett. 4 :2293)本文介紹的改良的phi29DNA的包裝馬達(dá)蛋白連接器通道類似的觀察數(shù)據(jù)，通過由于單個(gè)易位事件引起的電流阻斷中的分離水平證實(shí)(單個(gè)線性情況類型一，二和三)(圖15)。雙(和三)情況歸因于兩個(gè)(三)DNA分子同時(shí)易位通過兩(三)通道(圖15D)。采用500bp的雙鏈DNA作為分析物觀察到類似的情況。觀察到單向DNA易位通過在脂雙層中改良phi29DNA的包裝馬達(dá)蛋白連接器通道。 單個(gè)改良的DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器插入一個(gè)脂雙層，事先在順反室中與DNA預(yù)混。當(dāng)外加電壓正、負(fù)電位之間交替時(shí)，只在一個(gè)方向上觀察到DNA的易位(無論是正電壓還是負(fù)電壓)，如圖16所示。根據(jù)非限制理論，似乎DNA只能一個(gè)方向通過連接器形成的導(dǎo)電通道孔，與雙鏈DNA的易位試驗(yàn)結(jié)果一致的一種解釋說多個(gè)連接器插入形成的(圖17)。進(jìn)一步修飾改良phi29DNA的包裝馬達(dá)連接器通道的氨基酸序列，導(dǎo)致通道電導(dǎo)變化。當(dāng)連接器通道(孔徑)內(nèi)位置234的賴氨酸替換為半胱氨酸(K234C) [SEQ ID NO 42]或丙氨酸(K234A) [SEQ ID NO :41]，插入脂雙層膜的單個(gè)改良連接器導(dǎo)致的電流激增比野生型連接器小(圖18)。示例 8特異性結(jié)合多肽(抗體)為分析物本示例描述了特異捕獲待分析物分子肽(抗體)導(dǎo)電輪廓“指紋圖譜”的產(chǎn)生，繼而與本文描述的改良DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器的親和/對齊結(jié)構(gòu)域相互作用。所述phi29DNA的包裝馬達(dá)蛋白連接器按上面所述被重新設(shè)計(jì)，在其碳末端His6
57標(biāo)簽作為親和/對齊結(jié)構(gòu)域。如上所述，重新設(shè)計(jì)的連接器插入到脂雙層，在實(shí)驗(yàn)條件下在一個(gè)外加電壓下表現(xiàn)出典型的電流阻斷。當(dāng)一種特異的anti-His-tag抗體加入樣品室時(shí)， 觀察到電流逐步下降，一個(gè)單獨(dú)連接器孔的總電流變化每一小步約為20% (圖19)。電流逐步下降，是由于一個(gè)抗體分子與十二連接器上的十二個(gè)His-tags標(biāo)記每一個(gè)順序結(jié)合， 順序結(jié)合減小孔徑形成的導(dǎo)電通道的總尺寸。單分子鑒定可以考慮這種方法，通過將(一) 通過這種類型的抗體-抗原特異性結(jié)合作用捕獲分析物于(二)通過產(chǎn)生分析物的特征電導(dǎo)輪廓“指紋識(shí)別”分析物(例如，如圖19所示一種阻斷形式)。上述各種實(shí)施例可以結(jié)合起來，以提供進(jìn)一步的實(shí)施例。本說明書提及和/或在申請數(shù)據(jù)表中列出所有的美國專利、美國專利申請的出版物、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利出版物，整體上通過參照并入本文。如果有必要可以對實(shí)施例方面進(jìn)行修改，以使用各種專利、申請和出版物的概念，以提供更進(jìn)一步的實(shí)施例?？梢愿鶕?jù)上述詳細(xì)描述對實(shí)施例進(jìn)行這些和其他的變化。一般來說，在下面的權(quán)利要求中，所使用的術(shù)語不應(yīng)該被理解為將權(quán)利要求限制在本說明書和權(quán)利要求中所披露的具體實(shí)施例，而應(yīng)理解為包括所有可能的實(shí)施例連同在權(quán)利要求書中限定的等同物的全部范圍。因此，權(quán)利要求不是由本披露限制的。
權(quán)利要求
1.一種含導(dǎo)電通道膜，包括(a)膜層；和(b)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白嵌入到所述膜層以形成孔道，外加跨膜電勢時(shí)可以經(jīng)過所述孔道導(dǎo)電。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白是人造的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包括具有4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17或18個(gè)連續(xù)的不帶電氨基酸的多肽，并融合至(a)中所述氨基端或所述羧基端中的至少一個(gè)，以及( )至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包括具有4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13或14個(gè)連續(xù)的不帶電氨基酸的多肽，并融合至(a)中所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)，以及( )至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含式 Xia-Xia-X2a-Xib-Xib-Xib-X3-X2b的多肽并融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)Xla獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸或無氨基酸，每個(gè))(lb獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸，X2a是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸，X3是選自谷氨酸和天門冬氨酸的帶負(fù)電的氨基酸，以及 X2b是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包含病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包含分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽含有氨基端和羧基端；以及(b)以下兩者之一或全部(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID N0:23所示的多肽序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly并融合至(a)中的所述羧基端，以及( )至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求5所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域選自(i)如SEQ ID NO :22[WSHPQRFEK]所示的 Str印-II 標(biāo)簽，(ii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸的多組氨酸多肽標(biāo)簽，(iii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)精氨酸的多精氨酸多肽，(vi)HIV Tat 多肽序歹Ij YGRKKRRQRR[SEQ IDNO :39]，和(ν)序列為DRATPY的多肽標(biāo)簽[SEQ ID NO 40]。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，所述亞基中的每個(gè)選自(i)如SEQ ID NO 41 所示的 C_His6-gplO/K234A，(ii)如SEQ ID NO :42 所示的 C-His6-gplO/K234C，(iii)如SEQ ID NO 43 所示的 C-His6-gpl0/C76S/C265S/K234C,(iv)如SEQ ID NO :44 所示的 Δ Ι-14/gplO-Str印-II，和(ν)如 SEQ ID NO 45 所示的Gpl0~ Δ 285-309-Strep-IL·
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包括選自下列的多肽(i)噬菌體phU9WDNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，(ii)噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :7 [登錄號NP 049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246, gi 15837315、 gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 12 [登錄號PM309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :13[登錄號ΑΑΑ72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體Ρ2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 14[登錄號ΝΡ_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體Ρ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體Τ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 15 [登錄號CAA35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP 006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(x)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包含有雙鏈DNA噬菌體DNA 包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5中的任一項(xiàng)所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒連接器蛋白多肽選自(i)噬菌體phU9 WDNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，( )噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :7 [登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246, gil5837315, gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID而12[登錄號1^4309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :13[登錄號ΑΑΑ72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體Ρ2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 14[登錄號ΝΡ_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體Ρ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體Τ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 15 [登錄號CAA35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(x)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，每個(gè)亞基包含一種多肽，所述多肽包括噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5中的任一項(xiàng)所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒連接器蛋白多肽包含噬菌體Phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :1 [登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白含有可探測標(biāo)記。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述可探測標(biāo)記選自比色指示劑、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用標(biāo)記化合物、熒光指示劑、發(fā)光指示劑、磷光指示劑、放射性指示劑、染料、 酶、酶的底物、能量傳遞分子、量子點(diǎn)、金屬粒子和親和標(biāo)記。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述親和標(biāo)簽選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、生物素、適體、抗體、凝集素、低聚糖、核酸、酶、金屬離子結(jié)合多肽、如SEQ ID NO 22 [WSHPQRFEK]所示的Str印-II標(biāo)簽、具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的多組氨酸多肽標(biāo)簽、如SEQ ID NO 所示的Str印-I標(biāo)簽、FLAG 多肽標(biāo)簽、Myc蛋白多肽標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金黃色葡萄球菌蛋白A、蛋白G、HIV Tat蛋白多肽[SEQ ID NO 39]、具有氨基酸序列DRATPY[SEQ ID NO 40]的多肽、谷氧還蛋白_2、 以及與親和配體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述抗體選自完整的免疫球蛋白、單鏈抗體、scFv、Fab 和(Fab) ‘ 2。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述膜層包括脂層。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述脂層包含兩親脂類。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述兩親脂類包含磷脂類，并且所述脂層包含脂雙分子層。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述脂層選自平面膜層和脂質(zhì)體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述脂質(zhì)體選自多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述嵌入的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白在所述膜層內(nèi)是可動(dòng)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，被施加電勢時(shí)，所述含導(dǎo)電通道膜能夠通過所述孔道易位雙鏈DNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含導(dǎo)電通道膜，其中被施加電勢時(shí)，出現(xiàn)無電壓門控的導(dǎo)電性。
25.一種制作含導(dǎo)電通道膜的方法，包括(a)通過使含有兩親脂類和有機(jī)溶劑的第一溶液與所述固體基質(zhì)接觸并除去大部分溶劑，而在固體基質(zhì)上制備干的兩親脂類；以及(b)將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒DNA組裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層的膜，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜。
26.一種制作含導(dǎo)電通道膜的方法，包括(a)從含有兩親脂類和至少一種溶劑的混合物中除去大部分溶劑，以獲得干的兩親脂類；以及(b)將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒DNA組裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述兩親脂類包含磷脂類。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述磷脂類包括選自下列的一種或多種磷脂類磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、1，2_ 二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、和1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。
29.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑包括選自下列的至少一種溶劑氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、吡啶、和二異丙醚。
30.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述滲透劑包括選自下列至少一種試劑蔗糖、甘油、甘露醇和葡聚糖。
31.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基包含根據(jù)權(quán)利要求3-13中的任一項(xiàng)的多肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述脂雙分子層存在于脂質(zhì)體中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述脂質(zhì)體選自多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
34.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述嵌入的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白在所述膜層內(nèi)是可動(dòng)的。
35.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中當(dāng)對所述膜施加電勢時(shí)，所述病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白能夠通過所述孔道易位雙鏈DNA。
36.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求沈所述的方法，其中當(dāng)施加電勢時(shí)，在所述含導(dǎo)電通道膜內(nèi)出現(xiàn)無電壓門控的導(dǎo)電性。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述外加電勢選自(i)在-IOOmV和IOOmV之間的電勢，( )在_400mV和400mV之間的電勢，(iii)在_300mV禾口 300mV之間的電勢，(iv) 在-200mV和200mV之間的電勢，(ν)在_150mV和150mV之間的電勢，(vi)在_75mV和75mV 之間的電勢，和(vii)在-50mV和50mV之間的電勢。
38.一種在含導(dǎo)電通道膜的一側(cè)濃縮核酸分子的方法，包括(a)通過以下方法制作含導(dǎo)電通道的膜，所述方法包括(i)從含有兩親脂類和至少一種溶劑的混合物中除去大部分溶劑，以獲取干的兩親脂類，及( )將所述干的兩親脂類重懸于第二溶液中，所述第二溶液含有水性溶劑、滲透劑和多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白亞基多肽，所述多肽可自行組裝形成均十二聚體病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，以獲取包括脂雙分子層的膜，在足以使所述連接器蛋白形成孔道的條件和時(shí)間下在所述脂雙分子層中嵌入病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，當(dāng)膜兩側(cè)外加電勢時(shí)會(huì)有電流通過所述孔道，因此得到含導(dǎo)電通道的膜；以及(b)使(a)中的含導(dǎo)電通道膜與一個(gè)或多個(gè)核酸分子接觸并橫過所述膜施加電勢，在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)過足夠長的時(shí)間后，所述核酸通過電泳轉(zhuǎn)移經(jīng)過所述連接器蛋白的孔道， 因此在所述含導(dǎo)電通道膜的一側(cè)濃縮核酸分子。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中核酸轉(zhuǎn)移導(dǎo)致所述核酸在所述膜的一側(cè)并逆著核酸濃度梯度積聚。
40.一種含核酸的脂質(zhì)體，其包括含導(dǎo)電通道的膜和在所述膜的一側(cè)濃縮的核酸分子， 其中所述脂質(zhì)體根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法制備。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的脂質(zhì)體，其是納米粒子。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的脂質(zhì)體，其是生物反應(yīng)器。
43.一種向細(xì)胞傳遞核酸分子的方法，包括將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求40的脂質(zhì)體引入所述細(xì)胞中。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中使細(xì)胞在體外引入到所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)體。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中使細(xì)胞在體內(nèi)引入到所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)體。
46.一種分離的蛋白，包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含具有4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17或18個(gè)連續(xù)的不帶電的氨基酸的多肽，并融合至(a)中的所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)；以及(c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域。
47.一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含具有4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13或14個(gè)連續(xù)的不帶電的氨基酸的多肽，并融合至(a)中的所述氨基端和所述羧基端中的至少一個(gè)；以及(c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含具有式 Xia-Xia-X2a-Xib-Xib-Xib-X3-X2b的多肽并融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)Xla獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸或無氨基酸，每個(gè))(lb獨(dú)立地是任何不帶電的氨基酸，X2a是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸，X3是選自谷氨酸和天門冬氨酸的帶負(fù)電的氨基酸，以及 X2b是選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的帶正電的氨基酸。
48.一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包含融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)孔道結(jié)構(gòu)域，所述孔道結(jié)構(gòu)域包括分離的病毒連接器蛋白多肽，所述分離的病毒連接器蛋白多肽具有氨基端和羧基端；(b)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域包含如SEQID N0:23所示的多肽序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，并融合至(a)中的所述羧基端；以及(c)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，所述至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域融合至所述柔性結(jié)構(gòu)域。
49.根據(jù)權(quán)利要求46或權(quán)利要求48所述的分離的蛋白，其中所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽(i)如SEQ ID NO :22[WSHPQRFEK]所示的 Str印-II 標(biāo)簽，(ii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸的多組氨酸多肽標(biāo)簽，(iii)具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)精氨酸的多精氨酸多肽，(vi)HIV Tat 多肽序列 YGRKKRRQRR[SEQ ID NO :39]，和(ν)序列為DRATPY的多肽標(biāo)簽[SEQ ID NO 40]。
50.一種分離的蛋白，其包括病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)包括選自下列的多肽(i)如SEQ ID NO 41 所示的 C_His6-gplO/K234A，(ii)如SEQ ID NO :42 所示的 C-His6-gplO/K234C，(iii)如SEQ ID NO 43 所示的 C-His6-gpl0/C76S/C265S/K234C,(iv)如SEQ ID NO :44 所示的 Δ Ι-14/gplO-Str印-II，和 (ν)如 SEQ ID NO 45 所示的Gpl0~ Δ 285-309-Strep-IL·
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的蛋白，其中所述孔道結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽 (i)噬菌體phU9 WDNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，( )噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :7 [登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246, gi 15837315、 gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 12 [登錄號PM309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :13[登錄號ΑΑΑ72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體Ρ2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 14[登錄號ΝΡ_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體Ρ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體Τ3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 15 [登錄號CAA35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(x)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離的蛋白，其中所述孔道結(jié)構(gòu)域包含多肽，所述多肽包含雙鏈DNA噬菌體DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白的全部或跨膜孔道部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48所述的分離的蛋白，其中所述孔道結(jié)構(gòu)域包含選自下列的多肽(i)噬菌體phU9 WDNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列，( )噬菌體T4的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :7 [登錄號NP_049782]所示的氨基酸序列，(iii)噬菌體lambda的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :8-11 [Acc. Nos. gi 549295, gi 6723246, gi 15837315、 gi 16764273]中的任何一種所示的氨基酸序列，(iv)噬菌體SPPl的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 12 [登錄號PM309]所示的氨基酸序列，(ν)噬菌體Ρ22的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :13[登錄號AAA72961]所示的氨基酸序列，(vi)噬菌體P2的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 14 [登錄號NP_046757]所示的氨基酸序列，(vii)噬菌體P3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，(viii)噬菌體T3的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 15 [登錄號CAA35152]所示的氨基酸序列，(ix)噬菌體T5的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如 SEQ ID NOS :16-19(登錄號 AAX12078 ；YP_006980 ；AAS77191 ；AAU05287)所示的氨基酸序列，以及(x)噬菌體Τ7的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的所有或跨膜孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO :20 [登錄號ΝΡ_041995]所示的氨基酸序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的含導(dǎo)電通道膜，其中所述孔道結(jié)構(gòu)域包含噬菌體phi29的 DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID N0:1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求46或48中的任一項(xiàng)所述的分離的蛋白，其中所述病毒連接器蛋白多肽包含噬菌體phi29的DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽的全部或孔道形成部分，所述多肽具有如SEQ ID NO 1[登錄號ACE96033]所示的氨基酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求46-48中的任一項(xiàng)所述的分離的蛋白，其能夠(i)自組裝形成十二聚體病毒連接器蛋白，以及(ii)在嵌入病毒原殼體之后包裝病毒雙鏈DNA。
57.根據(jù)權(quán)利要求46-48和50中的任一項(xiàng)所述的分離的蛋白，其包含至少一個(gè)可探測標(biāo)記。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的分離的蛋白，其中所述可探測標(biāo)記選自比色指示劑、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用標(biāo)記化合物、熒光指示劑、發(fā)光指示劑、磷光指示劑、放射性指示劑、染料、酶、 酶的底物、能量傳遞分子、量子點(diǎn)、金屬粒子和親和標(biāo)記。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的分離蛋白，其中所述親和標(biāo)簽選自抗生物素蛋白、鏈霉親和素、生物素、適體、抗體、凝集素、低聚糖、核酸、酶、金屬離子結(jié)合多肽、如SEQ ID NO 22 [WSHPQRFEK]所示的Str印-II標(biāo)簽、具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的多組氨酸多肽標(biāo)簽、Str印-I標(biāo)簽、FLAG 多肽標(biāo)簽、Myc蛋白多肽標(biāo)簽、谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金黃色葡萄球菌蛋白A、蛋白G、HIV Tat蛋白多肽[SEQ ID NO :39]、 具有氨基酸序列DRATPY[SEQ ID NO 40]的多肽、谷氧還蛋白_2、以及與親和配體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的分離的蛋白，其中所述抗體選自完整的免疫球蛋白、單鏈抗體、scFv、Fab 和(Fab) ‘ 2。
61.一種檢驗(yàn)分析物分子是否存在的方法，包括(a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域， 所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；以及(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合，以此檢驗(yàn)所述分析物分子存在。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。
63.一種識(shí)別分析物的方法，包括(a)使含有所述分析物分子的試液與含導(dǎo)電通道膜接觸，所述含導(dǎo)電通道膜含有膜層以及嵌入所述膜層中的一個(gè)或多個(gè)分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白，所述蛋白能夠形成孔道，在橫過所述膜外加電勢時(shí)可以通過所述孔道導(dǎo)電，并且每個(gè)蛋白含有病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白多肽亞基的均十二聚體，其中所述亞基中的每個(gè)含有(1)孔道結(jié)構(gòu)域， 所述孔道結(jié)構(gòu)域包含具有氨基端和羧基端的分離的病毒連接器蛋白多肽，以及O)以下兩者中的一個(gè)或兩個(gè)(i)至少一個(gè)柔性結(jié)構(gòu)域、以及(ii)至少一個(gè)親和/對齊結(jié)構(gòu)域，在條件適合而且時(shí)間足夠使所述分析物分子與所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合；(b)在所述接觸步驟前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及所述接觸步驟后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，確定由外加電勢產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，其中所述電導(dǎo)信號在所述接觸步驟后相對所述接觸步驟前的電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子與所述連接器蛋白的結(jié)合；以及(c)將(b)中的電導(dǎo)信號分布與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布比較，以此識(shí)別所述分析物分子。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述電導(dǎo)信號的變化表明所述分析物分子結(jié)合至所述親和/對齊結(jié)構(gòu)域。
65.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中所述接觸步驟重復(fù)一次或多次。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述比較步驟包括下列中的一個(gè)或多個(gè)(i)將 (b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號振幅進(jìn)行比較，以及(ii)將(b)中的電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間與所述分析物的參考電導(dǎo)信號分布中的電導(dǎo)信號持續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較。
67.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中所述外加電勢導(dǎo)致離子在所述孔道結(jié)構(gòu)域中沿著電化學(xué)梯度遷移。
68.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中所述分析物包含核酸分子。
69.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述分析物包含核酸分子，并且所述比較步驟包括識(shí)別所述核酸分子中存在的至少一種核苷酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其包括確定所述核酸分子的核酸序列。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其包括確定所述核酸分子中的單核苷酸多態(tài)性。
72.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中電壓門控不存在。
73.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中所述含導(dǎo)電通道膜是根據(jù)權(quán)利要求I-M中的任一項(xiàng)所述的含導(dǎo)電通道膜。
74.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求25-35中的任一項(xiàng)所述的方法制作所述含導(dǎo)電通道膜。
75.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求63所述的方法，其中所述分離的病毒DNA包裝馬達(dá)連接器蛋白包括根據(jù)權(quán)利要求101-115中的任一項(xiàng)所述的分離的蛋白。
全文摘要
公開了組合物和方法，其利用對雙鏈DNA病毒的DNA包裝馬達(dá)蛋白連接器多肽進(jìn)行新的修飾，使其能夠以自組裝十二聚體的形式穩(wěn)定地嵌入脂膜層中形成孔道，這樣在外加跨膜電勢時(shí)，可通過其導(dǎo)電。該孔道允許使用經(jīng)修飾的蛋白可用作生物傳感器，進(jìn)行雙鏈DNA測序，單核苷酸多態(tài)性檢測，分析物的高敏感親和吸附以及指紋分析，以及還可以用于電勢驅(qū)動(dòng)的溶質(zhì)易位，例如使脂質(zhì)體裝載治療用納米顆粒(如基因遞送)以及生物反應(yīng)器，及其他應(yīng)用。
文檔編號G01N33/68GK102203618SQ200980143053
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者郭培瑄 申請人:郭培瑄