本發(fā)明涉及病毒基因突變檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR引物及方法。

背景技術(shù)：

HCMV屬于皰疹病毒科 ,β皰疹病毒亞科, 巨細胞病毒屬, 人皰疹病毒 5 型。HCMV 基因組為線性雙股 DNA 分子 , 長約 230 kb ,由長單一序列( UL)和短單一序列(US) 構(gòu)成。HCMV 在自然界廣泛存在,正常人群中自然感染普遍。

人巨細胞病毒（HCMV）是一種免疫缺陷或免疫不成熟人群的條件致病菌，大多數(shù)感染者無明顯癥狀,但在先天感染的兒童中，或免疫功能受抑制的個體，如器官移植者，獲得性免疫缺陷病綜合征（艾滋?。┗颊咧?，容易激活感染，引發(fā)嚴重病變，危及生命。此外，巨細胞病毒宮內(nèi)感染還是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因之一。因此，巨細胞病毒的藥物干預(yù)和治療顯得尤為重要。

治療HCMV感染的抗病毒藥物為更昔洛韋（GCV），西多福韋（CDV）和膦甲酸（PFA）。巨細胞病毒耐藥突變主要是由于UL97和UL54基因發(fā)生突變導(dǎo)致。UL97 基因全長 2124 個堿基 ,編碼一種蛋白激酶相關(guān)的磷酸轉(zhuǎn)移酶，含有保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶功能域。HCMV感染細胞內(nèi)的磷酸化過程是UL97基因編碼的產(chǎn)物所完成。GCV是第一個被開發(fā)及應(yīng)用最普遍的治療 HCMV 感染的高效藥物, 必須在此酶作用下發(fā)生單磷酸化進一步三磷酸化發(fā)揮抗病毒作用, 因此，UL97基因的突變導(dǎo)致GCV不能發(fā)生磷酸化而獲得活性,導(dǎo)致GCV耐藥性的出現(xiàn)。GCV是目前預(yù)防和治療 HCMV病的一線藥物，長期治療后，GCV首先可發(fā)生UL97突變，因此 UL97通常是臨床檢測耐藥基因突變的首選基因。GCV耐藥突變主要集中在460、520、590至607位點（圖1），如M460V/I, H520Q, C592G, A594V, L595S和C603W出現(xiàn)在80%以上以GCV為首選藥物的病人體內(nèi)。UL54 基因全長3729個堿基, 編碼由1242個氨基酸組成的 DNA 聚合酶。與UL97基因突變只能導(dǎo)致更昔洛韋（GCV）耐藥不同，因為三種藥物都是針對編碼病毒DNA聚合酶的UL54基因的，因此該基因的突變可以導(dǎo)致這三種藥物耐藥。與UL97基因耐藥位點較為集中不同，UL54基因突變位點更多，其耐藥檢測只能通過測序，至少需覆蓋氨基酸300-1000位點（圖1）?？笻CMV藥物耐藥是免疫功能缺陷患者的一個嚴重的問題， UL54和UL97基因突變引起的多藥物耐藥對于異源干細胞移植病人可危及生命。

目前，傳統(tǒng)基因突變診斷方法包括限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP），基因芯片法，熒光定量PCR等，這些方法存在耗時費力或所需設(shè)備和耗材昂貴等缺點，導(dǎo)致不能在臨床大規(guī)模推廣，應(yīng)用受到限制。同時，巨細胞病毒（HCMV）UL54和UL97基因耐藥突變位點眾多，上述方法根本無法全部涵蓋這些位點。因此有必要建立一種高效率、使用方便的巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的方法，以實現(xiàn)臨床快速檢測和大規(guī)模人群篩查。用本專利申請的巢式PCR的方法進行檢測可以完全覆蓋所有的突變位點，且不需要貴重的專用儀器，對技術(shù)人員要求不高，只需要PCR實驗室常規(guī)的設(shè)備即可，適用于在國內(nèi)醫(yī)院推廣使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR引物，該巢式PCR引物可以高特異、高靈敏度和高效的檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR方法，該巢式PCR方法具有高度的特異性、靈敏度與準確性，所得到的PCR產(chǎn)物可直接送去測序，根據(jù)序列即可分析巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變情況。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR引物，該巢式PCR引物包括第一輪PCR擴增引物和第二輪PCR擴增引物（圖2）：

當(dāng)檢測巨細胞病毒UL54時，

第一輪PCR擴增引物為：

第一對引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；

第二輪PCR擴增引物為第二對引物和第三對引物：

第二對引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；

第三對引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；

當(dāng)檢測巨細胞病毒UL97時，

所述第一輪PCR擴增引物為：

第四對引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；

所述第二輪PCR擴增引物為：

第五對引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；

其中，UL54-SF1基因序列如SEQ ID No.1 所示，UL54-SR1基因序列如SEQ ID No.2所示，UL54-SF2基因序列如SEQ ID No.3 所示，UL54-SR2如SEQ ID No.4 所示，UL54-SF3基因序列如SEQ ID No.5所示，UL54-SR3如SEQ ID No.6 所示，UL97-SF1如 SEQ ID No.7 所示，UL97-SF1如 SEQ ID No.8 所示，UL97-SF2如SEQ ID No.9 所示，UL97-SR2如SEQ ID No.10 所示。

本發(fā)明提供的用于檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的引物，第一到第三對引物用來擴增UL54基因，第四到第五對引物用來擴增UL97基因。第一對引物中的正向引物（即上游引物）UL54-SF1選擇巨細胞病毒UL54基因nt731-747保守區(qū)域；反向引物(即下游引物)UL54-SR1主要部分選擇nt3223- 3239保守區(qū)域。第一對引物將擴增出2509bp大小的片段。第二對引物中的正向引物UL54-SF2選擇巨細胞病毒UL54基因nt779-796位保守區(qū)域；反向引物UL54-SR2選擇nt1924-1940位保守區(qū)域。第二對引物將擴增出1162bp大小的片段。第三對引物中的正向引物UL54-SF3選擇巨細胞病毒UL54基因nt1795- 1818位保守區(qū)域；反向引物UL54-SR3選擇nt3033-3048位保守區(qū)域。第三對引物將擴增出1254bp大小的片段。第四對引物中的正向引物UL97-SF1選擇巨細胞病毒UL97基因nt821-842位保守區(qū)域，第四對引物中的反向引物UL97-SR1選擇巨細胞病毒UL97基因nt1953-1972位保守區(qū)域，第四對引物將擴增出1152bp大小的片段。第五對引物中的正向引物UL97-SF2選擇巨細胞病毒UL97基因nt868-886位保守區(qū)域，第五對引物中的反向引物UL97-SR2選擇巨細胞病毒UL97基因nt1914-1933位保守區(qū)域，第五對引物將擴增出1066bp大小的片段。

本發(fā)明的另一目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種采用上述所述的巢式PCR引物檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR方法，其包括如下步驟：

（1）以第一輪PCR擴增引物對待檢測DNA進行第一輪PCR，得到第一輪PCR產(chǎn)物，進行50-150倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物；

（2）以第二輪PCR擴增引物對第一輪PCR稀釋產(chǎn)物進行第二輪PCR，得到第二輪PCR產(chǎn)物；

（3）對第二輪PCR產(chǎn)物進行檢測。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，待檢測DNA是從待檢血清或血漿中提取DNA而得。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為10-25μL。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，第一輪 PCR 的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 1-2μL，雙蒸水補齊至25μL。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，第一輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

優(yōu)選地，所述步驟（2）中，第二輪PCR反應(yīng)體系的體積為25-50μL。

優(yōu)選地，所述步驟（2）中，第二輪 PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR稀釋產(chǎn)物 1-2μL，雙蒸水補齊至50μL。

優(yōu)選地，所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

本發(fā)明還提供一種檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述第一輪PCR擴增引物和第二輪PCR擴增引物。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明的巢式PCR引物可以高特異、高靈敏度和高效的檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變。

本發(fā)明的巢式PCR方法具有高度的特異性、靈敏度與準確性，所得到的PCR產(chǎn)物可直接送去測序，根據(jù)序列即可分析巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的情況。

本發(fā)明限定了第一輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，同時還限定了第二輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，最終得到的條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定。

本發(fā)明通過選用特定的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，擴增巨細胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性，與其它方法比較無非特異性擴增出現(xiàn)，顯示高度擴增特異性，可以用于分析其耐藥基因突變，實用性強，符合臨床推廣的要求。

本發(fā)明在長期進行病毒研究的基礎(chǔ)上，對NCBI上巨細胞病毒序列進行比對分析，對相關(guān)引物、反應(yīng)體系進行優(yōu)化后，探索出一套特異、準確、操作簡便的檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR方法。

附圖說明

利用附圖對發(fā)明作進一步說明，但附圖中的實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)以下附圖獲得其它的附圖。

圖1為巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變位點（Nell S. Lurain et al, Clinical Microbiology Reviews, Oct. 2010），其中A為聚合酶 UL54 基因突變位點示意圖，B為UL97 基因的突變位點示意圖。圖2為巨細胞病毒UL54和UL97基因片段擴增示意圖，其中A為UL54 基因的擴增片段示意圖，B為UL97 基因的擴增片段示意圖。

圖3為本發(fā)明的電泳圖，其中，泳道M為DNA marker,泳道1為UL97基因擴增產(chǎn)物，泳道2和3為UL54基因擴增產(chǎn)物。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，見附圖1-3。實施例中未注明具體條件的，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均為可以通過市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

本實施例中，一種檢測巨細胞病毒UL54基因耐藥突變的巢式PCR引物，該巢式PCR引物包括第一輪PCR擴增引物和第二輪PCR擴增引物：

當(dāng)檢測巨細胞病毒UL54時，

第一輪PCR擴增引物為：

第一對引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；

第二輪PCR擴增引物為第二對引物和第三對引物：

第二對引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；

第三對引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；

本實施例， 第一對引物用于擴增UL54基因的第一輪，包括正向引物UL54-SF1 （SEQ ID No.1）和反向引物UL54-SR1（SEQ ID No.2）；第二對引物用于擴增UL54基因的第二輪，包括正向引物UL54-SF2（SEQ ID No.3）和反向引物UL54-SR2（SEQ ID No.4）；第三對引物用于擴增UL54基因的第二輪包括正向引物UL54-SF3（SEQ ID No.5）和反向引物UL54-SR3（SEQ ID No.6）；第一至第三對引物序列分別為:

正向引物UL54-SF1：5'-TGGTCATCGATCGGCGG-3'；

反向引物UL54-SR1：5'-ATGACGGCAATGTGCGG-3' ；

正向引物UL54-SF2：5'-GTTACGACTGGCGGCAGC-3'；

反向引物UL54-SR2：5'-GCAGATTGCAAGGGCGG-3'；

正向引物UL54-SF3：5'-AACCACTACAGCAAAGGTACGACG-3'；

反向引物UL54-SR3：5'-CGACAGGCGCACGGCT-3'；

每個模板DNA均采用以下PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序進行：

一種用于非治療目的采用上述所述的巢式PCR引物檢測巨細胞病毒UL54耐藥突變的方法，包括如下步驟：

（1）以第一輪PCR擴增引物對待檢測DNA進行第一輪PCR，得到第一輪PCR產(chǎn)物，進行100倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物；所述第一輪PCR擴增引物為第一對引物；

（2）以第二輪PCR擴增引物對第一輪PCR稀釋產(chǎn)物進行第二輪PCR，得到第二輪PCR產(chǎn)物；其中，當(dāng)檢測巨細胞病毒UL54基因耐藥突變時，所述第二輪PCR擴增引物為第二對引物和第三對引物；

（3）對第二輪PCR產(chǎn)物進行檢測。

如圖2（A）所示，采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1進行第一輪PCR擴增，采用正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2進行第二輪PCR擴增，得UL54-1片段；采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1進行第一輪PCR擴增，采用正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3進行第二輪PCR擴增，得UL54-2片段。

所述步驟（1）中，待檢測DNA均為從待檢血清或血漿中提取DNA而得。

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 2μL，雙蒸水補齊至25μL。

所述步驟（1）中，第一輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為50μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物2μL，雙蒸水補齊至50μL。

所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

所述步驟（3）中，檢測采用電泳檢測，將第二輪PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳配合凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。其中，檢測的第二輪PCR產(chǎn)物加樣量為3μL，其過程按照儀器標準操作程序進行。選擇DL2,000marker（TAKARA公司）作為對照，電泳結(jié)束后分析電泳圖像，第二輪PCR產(chǎn)物送去Invitrogen公司測序。

本實施例還提供一種檢測巨細胞病毒UL54耐藥突變的試劑盒，該試劑盒包括第一對引物，并且包括第二對引物或者第三對引物中的任一對引物。

實施例2

本實施例中，一種檢測巨細胞病毒UL97基因耐藥突變的巢式PCR引物，該巢式PCR引物包括第一輪PCR擴增引物和第二輪PCR擴增引物：

檢測巨細胞病毒UL97時，

第一輪PCR擴增引物為：

第四對引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；

第二輪PCR擴增引物為：

第五對引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；

本實施例，第四對引物用于擴增UL97基因的第一輪，包括正向引物UL97-SF1（SEQ ID No.7）和反向引物UL97-SR1（SEQ ID No.8）；第五對引物用于擴增UL97基因的第二輪，包括正向引物UL97-SF2（SEQ ID No.9）和反向引物UL97-SR2（SEQ ID No.10）；第四至第五對引物序列分別為:

正向引物UL97-SF1：5'-GTTCCAACGACCAGATCATCAC-3'；

反向引物UL97-SR1：5'-GCGAGCATTCGTGGTAGAAG-3'；

正向引物UL97-SF2：5'-GACCCGCGTATGTTCTTGC-3'；

反向引物UL97-SR2：5'-GACACGAGGACATCTTGGCC-3'；

每個模板DNA均采用以下PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序進行：

一種用于非治療目的采用上述所述的巢式PCR引物檢測巨細胞病毒UL97耐藥突變的方法，包括如下步驟：

（1）以第一輪PCR擴增引物對待檢測DNA進行第一輪PCR，得到第一輪PCR產(chǎn)物，進行100倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物；所述第一輪PCR擴增引物為第四對引物；

（2）以第二輪PCR擴增引物對第一輪PCR稀釋產(chǎn)物進行第二輪PCR，得到第二輪PCR產(chǎn)物；其中，當(dāng)檢測巨細胞病毒UL54基因耐藥突變時，所述第二輪PCR擴增引物為第五對引物；

（3）對第二輪PCR產(chǎn)物進行檢測。

如圖2（B）所示，采用正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1進行第一輪PCR擴增，采用正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2進行第二輪PCR擴增，得UL97片段。

所述步驟（1）中，待檢測DNA均為從待檢血清或血漿中提取DNA而得。

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 2μL，雙蒸水補齊至25μL。

所述步驟（1）中，第一輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸2min30s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為50μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物2μL，雙蒸水補齊至50μL。

所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)程序為：1）、94℃預(yù)變性2min；2）、98℃變性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min10s，共34個循環(huán)；3）、68℃后延伸5min。

所述步驟（3）中，檢測采用電泳檢測，將第二輪PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳配合凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。其中，檢測的第二輪PCR產(chǎn)物加樣量為3μL，其過程按照儀器標準操作程序進行。選擇DL2,000marker（TAKARA公司）作為對照，電泳結(jié)束后分析電泳圖像，第二輪PCR產(chǎn)物送去Invitrogen公司測序。

本實施例還提供一種檢測巨細胞病毒UL97耐藥突變的試劑盒，該試劑盒包括第四對引物和第五對引物。

實施例1-2的電泳圖像如圖3所示，泳道M為DNA marker,泳道1為UL97基因擴增產(chǎn)物，泳道2和3為UL54基因擴增產(chǎn)物。本實施例限定了第一輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，同時還限定了第二輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，最終得到的條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定。

實施例3

本實施例與實施例1的不同之處在于：

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 1μL，雙蒸水補齊至25μL。其中，所述第一輪PCR產(chǎn)物，進行50倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為50μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物1μL，雙蒸水補齊至50μL。

實施例4

本實施例與實施例1的不同之處在于：

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為10μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 1μL，雙蒸水補齊至10μL。其中，所述第一輪PCR產(chǎn)物，進行150倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物 1μL，雙蒸水補齊至25μL。

實施例5

本實施例與實施例2的不同之處在于：

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 1μL，雙蒸水補齊至25μL。其中，所述第一輪PCR產(chǎn)物，進行50倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR的反應(yīng)體系的體積為50μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物1μL，雙蒸水補齊至50μL。

實施例6

本實施例與實施例2的不同之處在于：

本實施例中，所述步驟（1）中，第一輪PCR反應(yīng)體系的體積為10μL。具體地，第一輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待檢測DNA 1μL，雙蒸水補齊至10μL。其中，所述第一輪PCR產(chǎn)物，進行150倍稀釋，得到第一輪PCR稀釋產(chǎn)物。

本實施例中，所述步驟（2）中，第二輪PCR反應(yīng)體系的體積為25μL。具體地，第二輪PCR的反應(yīng)體系為：KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一輪 PCR 稀釋產(chǎn)物 1μL，雙蒸水補齊至25μL。

本發(fā)明通過選用特定的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，擴增巨細胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性，與其它方法比較無非特異性擴增出現(xiàn)，顯示高度擴增特異性。

本發(fā)明限定了第一輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，同時還限定了第二輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，最終得到的條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定。

本發(fā)明在長期進行病毒研究的基礎(chǔ)上，對NCBI上巨細胞病毒序列進行比對分析，對相關(guān)引物、反應(yīng)體系進行優(yōu)化后，探索出一套特異、準確、操作簡便的檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR方法，可以用于分析其耐藥基因突變，實用性強，符合臨床推廣的要求。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。

<110>東莞市第八人民醫(yī)院東莞市兒童醫(yī)院 東莞市兒科研究所

<120>檢測巨細胞病毒UL54和UL97基因耐藥突變的巢式PCR引物及方法

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