本發(fā)明涉及一種生物毒素的檢測(cè)方法，尤其涉及一種檢測(cè)與篩選產(chǎn)毒素菌的原位免疫方法，屬于化學(xué)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的生物毒素TTX檢測(cè)方法主要有生物測(cè)定法、儀器分析法、傳感器法和免疫測(cè)定法等，但沒(méi)有一種方法是針對(duì)TTX產(chǎn)生菌進(jìn)行檢測(cè)的；目前市場(chǎng)上出現(xiàn)了TTX快速檢測(cè)產(chǎn)品，如ELISA試劑盒、免疫層析試紙條，普遍存在檢測(cè)靈敏度低、線性范圍窄、易出現(xiàn)假陽(yáng)性、價(jià)格高等問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提出一種檢測(cè)與篩選產(chǎn)毒素菌的原位免疫方法，該檢測(cè)方法更易防干擾，不易產(chǎn)生假陽(yáng)性，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)毒菌種的高通量快速篩選，為開(kāi)發(fā)相應(yīng)微生物源毒素產(chǎn)品助力。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提出了一種檢測(cè)與篩選產(chǎn)毒素菌的原位免疫方法，主要包含樣品處理、菌落轉(zhuǎn)印、抗原包被、封閉、洗滌加一抗、洗滌加二抗、斑點(diǎn)顯色七個(gè)步驟，具體為：
步驟一、樣品處理：主要為用無(wú)菌水清洗河豚魚(yú),無(wú)菌條件下取出河豚魚(yú)卵巢,加無(wú)菌水研磨,取勻漿后的組織液進(jìn)行10倍系列稀釋涂板法分離,然后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)；
步驟二、菌落轉(zhuǎn)?。喝∨c培養(yǎng)皿同等大小的NC膜用乙酸鈉溶液(1N，Ph7.4)浸潤(rùn),將長(zhǎng)有菌落LB平板置于4℃，然后將無(wú)菌NC膜鋪于長(zhǎng)有菌落的平板上，并與菌落接觸，直至NC膜完全浸濕，在3個(gè)或更多不對(duì)稱位置上做好標(biāo)記，用平口鑷子將濾膜從瓊脂面上揭下；26℃培養(yǎng)原平板，以便后期挑取產(chǎn)TTX陽(yáng)性菌株；
步驟三、抗原包被：將NC膜的菌落面向下,倒置于一塊新的空平皿蓋子上,平皿內(nèi)加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振蕩器上，1hr,37℃。
步驟四、封閉：將膜，用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，然后用牛血清封閉；
步驟五、洗滌，加一抗：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，將膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；
步驟六、洗滌，加二抗：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，將膜置于平皿中用酶標(biāo)二抗溶液10ml孵育；
步驟七、斑點(diǎn)顯色：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑點(diǎn)可見(jiàn)。若用于定量檢測(cè)，可置酶聯(lián)免疫分析儀系統(tǒng)根據(jù)斑點(diǎn)亮度計(jì)算TTX含量。
在本發(fā)明的步驟一中，恒溫培養(yǎng)的溫度為26℃。
在本發(fā)明的步驟三中，置振蕩器設(shè)置時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟四中，用牛血清封閉的時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟六中，將膜置于平皿中用酶標(biāo)二抗溶液10ml孵育時(shí)間為,溫度為37℃。
采用上述方法后，本發(fā)明的具體優(yōu)點(diǎn)如下：
1、和其他檢測(cè)方法比如熒光PCR、蛋白質(zhì)芯片、儀器分析技術(shù)比較，具有成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)；
2、與市場(chǎng)有售的ELISA檢測(cè)試劑盒比較，原理雖然也是基于酶聯(lián)免疫檢測(cè)，但可以說(shuō)是第二代升級(jí)版本，針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度更高，經(jīng)驗(yàn)證可高2-3數(shù)量級(jí)；采用間接法比現(xiàn)在市售產(chǎn)品的直接法競(jìng)爭(zhēng)法更易防干擾，不易產(chǎn)生假陽(yáng)性；
3、不依賴特定儀器，若定性檢測(cè)，只需肉眼觀測(cè)膜上斑點(diǎn)即可；
4、更可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)毒菌種的高通量快速篩選，為開(kāi)發(fā)相應(yīng)微生物源毒素產(chǎn)品助力。
具體實(shí)施方式
下面采用具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
一種檢測(cè)與篩選產(chǎn)毒素菌的原位免疫方法，主要包含樣品處理、菌落轉(zhuǎn)印、抗原包被、封閉、洗滌加一抗、洗滌加二抗、斑點(diǎn)顯色七個(gè)步驟，具體為：
步驟一、樣品處理：主要為用無(wú)菌水清洗河豚魚(yú),無(wú)菌條件下取出河豚魚(yú)卵巢,加無(wú)菌水研磨,取勻漿后的組織液進(jìn)行10倍系列稀釋涂板法分離,然后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)；
步驟二、菌落轉(zhuǎn)?。喝∨c培養(yǎng)皿同等大小的NC膜用乙酸鈉溶液(1N，Ph7.4)浸潤(rùn),將長(zhǎng)有菌落LB平板置于4℃，然后將無(wú)菌NC膜鋪于長(zhǎng)有菌落的平板上，并與菌落接觸，直至NC膜完全浸濕，在3個(gè)或更多不對(duì)稱位置上做好標(biāo)記，用平口鑷子將濾膜從瓊脂面上揭下；26℃培養(yǎng)原平板，以便后期挑取產(chǎn)TTX陽(yáng)性菌株；
步驟三、抗原包被：將NC膜的菌落面向下,倒置于一塊新的空平皿蓋子上,平皿內(nèi)加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振蕩器上，1hr,37℃。
步驟四、封閉：將膜，用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，然后用牛血清封閉；
步驟五、洗滌，加一抗：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，將膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；
步驟六、洗滌，加二抗：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，將膜置于平皿中用酶標(biāo)二抗溶液10ml孵育；
步驟七、斑點(diǎn)顯色：用PBS-T洗滌3次，每次3分鐘，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑點(diǎn)可見(jiàn)。若用于定量檢測(cè)，可置酶聯(lián)免疫分析儀系統(tǒng)根據(jù)斑點(diǎn)亮度計(jì)算TTX含量。
在本發(fā)明的步驟一中，恒溫培養(yǎng)的溫度為26℃。
在本發(fā)明的步驟三中，置振蕩器設(shè)置時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟四中，用牛血清封閉的時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟五中，用膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育時(shí)間為一小時(shí)，溫度為37℃。
在本發(fā)明的步驟六中，將膜置于平皿中用酶標(biāo)二抗溶液10ml孵育時(shí)間為,溫度為37℃。
總的來(lái)說(shuō)，本品采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及間接非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理，菌落中可能含有的生物毒素TTX首先通過(guò)與菌體蛋白偶聯(lián)到NC膜上，通過(guò)生物毒素TTX單克隆抗體和酶標(biāo)的抗抗體結(jié)合從而使底物顯色，而在膜上呈現(xiàn)肉眼看見(jiàn)的斑點(diǎn)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。