本發(fā)明涉及
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種嗜水氣單胞菌耐藥基因的檢測方法。
背景技術(shù)：
：嗜水氣單胞菌為革蘭氏陰性短桿菌，是一種條件性致病菌，廣泛分布于自然界中，不僅能夠給水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物帶來嚴(yán)重的危害，導(dǎo)致淡水養(yǎng)殖魚類大面積爆發(fā)出血性敗血癥和潰瘍性感染，同時(shí)能引起人類腸道感染以及敗血癥等。嗜水氣單胞菌較其他革蘭氏陰性菌引起的敗血癥的死亡率高。臨床上常用一些抗生素等抗菌類藥物來預(yù)防和治療由氣單胞菌引起的疾病。近年來關(guān)于抗菌類藥物的盲目以及過度使用導(dǎo)致氣單胞菌耐藥性急劇上升的案例被大量報(bào)道。四環(huán)素、磺胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類等都存在一定程度的耐藥性。由于質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移是喹諾酮類藥物的耐藥性在臨床上傳播的主要途徑，通常質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物那藥性表現(xiàn)為敏感性細(xì)菌，很難用表型檢測，常常被忽視，而逐步積累或偶聯(lián)協(xié)同其他機(jī)制，奠定了多重耐藥的高水平的耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)。所以，我們有必要采取pcr或雜交等分子生物學(xué)手段，對(duì)臨床上的菌株、醫(yī)院附近或者養(yǎng)殖場等常用喹諾酮類抗菌藥物的地方進(jìn)行監(jiān)控或者實(shí)時(shí)普查，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究及時(shí)發(fā)現(xiàn)新型的喹諾酮耐藥基因或者機(jī)制，開發(fā)新型藥物來破壞或消除喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)的qnr蛋白，以免耐藥性的傳播或擴(kuò)散，防止產(chǎn)生喹諾酮類藥物的高耐受型細(xì)菌。因此建立一種特異、快捷、靈敏常規(guī)pcr檢測耐藥質(zhì)控基因的檢測方法是非常有必要的。在中國專利申請(qǐng)cn201480055468.9，申請(qǐng)日期：2014-10-07，用于擴(kuò)增細(xì)菌dna的pcr中使用的引物組、用于檢出及/或鑒定細(xì)菌菌種的試劑盒及檢出及/或鑒定細(xì)菌菌種的方法的專利中，使用了其的用于pcr的試劑盒及檢出或鑒定被檢樣品中的細(xì)菌菌種的方法，以及通過使細(xì)菌來源的核酸的混入量為最小限度、并進(jìn)行使用了上述的引物組的pcr法，從而達(dá)成檢出或鑒定被檢樣品中的細(xì)菌菌種的方法的靈敏度的進(jìn)一步的提高。中國專利申請(qǐng)cn201610840288.2，申請(qǐng)日期：2016-09-21，一種同步檢測五種動(dòng)物源性成分的多重pcr引物體系及檢測方法，以待檢樣品的總dna為模板，利用引物對(duì)i、引物對(duì)ii、引物對(duì)iii、引物對(duì)iv和引物對(duì)v組成的多重pcr引物體系進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果；其中，所述樣品總dna模板為牛、豬、羊、雞、鴨物種肉產(chǎn)品中的一種或多種。利用此發(fā)明檢測牛豬羊雞鴨肉制品的真?zhèn)渭笆欠裼袚郊伲瑱z測快速、特異性高、靈敏度高，能大大提高檢測效率，節(jié)約時(shí)間，而且節(jié)省檢測成本，特別適用于牛豬羊雞鴨制品的快速防偽鑒定。此外，本發(fā)明的多重pcr引物體系配合相關(guān)試劑可制成試劑盒，方便使用，同時(shí)為工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了可能。本專利將提供一種用魚嗜水氣單胞菌耐藥基因的常規(guī)pcr檢測方法，此方法快捷，靈敏，準(zhǔn)確度高，為生產(chǎn)實(shí)踐以及實(shí)驗(yàn)中檢測耐藥基因的檢測提供更準(zhǔn)確、靈敏的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于檢測嗜水氣單胞菌耐藥基因的引物對(duì)。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種嗜水氣單胞菌耐藥基因的檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種用于檢測嗜水氣單胞菌耐藥基因的引物對(duì)，所述的引物對(duì)的上游引物如seqidno:1所示；所述的引物對(duì)的下游引物如seqidno:2所示。所述的引物對(duì)的上游引物如seqidno:3所示；所述的引物對(duì)的下游引物如seqidno:4所示。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種嗜水氣單胞菌耐藥基因的檢測方法，所述的檢測方法包括以下步驟：1)提取菌株中的質(zhì)粒；2)質(zhì)粒dnapcr反應(yīng)。步驟1)提取菌株中的質(zhì)粒的方法為：在含抗生素的培養(yǎng)基中接種目標(biāo)菌株搖床培養(yǎng)，取菌液于試管，離心收集菌體，倒進(jìn)培養(yǎng)基；在菌體沉淀中加入bufferp1，吹打均勻使菌體徹底懸?。患尤隻ufferp2，立即溫和顛倒離心管混勻，靜置；加入bufferp3，立即溫和顛倒離心管充分混勻；于離心機(jī)中離心，將上清液全部移入吸附柱；倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入去蛋白液bufferdw1，離心，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中；向吸附柱中加入washsolution，離心，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中，重復(fù)上一步驟；將空的吸附柱和收集管離心；最后，在吸附膜中央加入elutionbuffer，室溫靜置，離心。步驟2)中的pcr反應(yīng)的上游引物如seqidno:1所示；所述的引物對(duì)的下游引物如seqidno:2所示。步驟2)中的pcr反應(yīng)的上游引物如seqidno:1所示；所述的引物對(duì)的下游引物如seqidno:2所示。步驟2)的pcr反應(yīng)體系：reactioncomponent單位μl2×gcbuffer112.5f(10μm)0.5r(10μm)0.5dntp(10mm)0.2ddh2o10.1template1taq酶0.2total25步驟2)的pcr反應(yīng)條件：程序溫度時(shí)間預(yù)變性95℃3min變性94℃30s退火55℃60s延伸72℃45s修復(fù)延伸72℃7min步驟2)：取2μlpcr產(chǎn)物與2μl6×loadingbuffer、1μl10000×核酸染料混合，加入2％(w/v)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，同時(shí)以1000bp的dnamarker作為對(duì)照，120v電壓下電泳25min，在投射紫外燈下觀察、照像。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明的方法是一種用魚嗜水氣單胞菌耐藥基因的常規(guī)pcr檢測方法，此方法快捷，靈敏，準(zhǔn)確度高，為生產(chǎn)實(shí)踐以及實(shí)驗(yàn)中檢測耐藥基因的檢測提供更準(zhǔn)確、靈敏的方法。2、本發(fā)明選用了合適的引物對(duì)、合適的pcr反應(yīng)條件。3、本發(fā)明采用了合適的質(zhì)粒dna提取方法。附圖說明附圖1是嗜水氣單胞菌qnrs耐藥基因pcr檢測的電泳圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。1材料與方法1.1材料：質(zhì)粒提取小試劑盒以及2×gcbuffer1、dntp(10mm)、ddh2o、taq酶、引物(由上海生工公司提供及合成)。1.2方法1.2.1質(zhì)粒提取提取菌株中的質(zhì)粒在含適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中接種目標(biāo)菌株37℃搖床培養(yǎng)16h，取2ml菌液于試管，8000×g離心2min收集菌體，倒進(jìn)培養(yǎng)基。在菌體沉淀中加入250μl的bufferp1，吹打均勻使菌體徹底懸浮。加入250μl的bufferp2，立即溫和顛倒離心管5次混勻，靜置2min。加入350μlbufferp3，立即溫和顛倒離心管5次充分混勻。于離心機(jī)中12000×g離心10min，將上清液全部移入吸附柱，9000×g離心30sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入500μl去蛋白液bufferdw1，9000×g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。向吸附柱中加入500μlwashsolution，9000×g離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中，重復(fù)上一步驟。將空的吸附柱和收集管離心1min。最后，在吸附膜中央加入50μlelutionbuffer，室溫靜置2min，9000×g離心1min。將所得的質(zhì)粒dna溶液置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2質(zhì)粒dnapcr檢測體系：利用上海生工合成的引物：rt302-aac-f:tgaccttgcgatgctctatg(seqidno:1),rt302-aac-r:cgtttggatcttggtgacct(seqidno:2),預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為361bp；rt302-qnrs-f:acgacattcgtcaactgcaa(seqidno:3),rt302-qnrs-r:taaattggcaccctgtaggc(seqidno:4),預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為417bp。pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)條件：程序溫度時(shí)間預(yù)變性95℃3min變性94℃30s退火55℃60s延伸72℃45s修復(fù)延伸72℃7min1.2.3pcr取2μlpcr產(chǎn)物與2μl6×loadingbuffer、1μl10000×核酸染料混合，加入2％(w/v)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，同時(shí)以1000bp的dnamarker作為對(duì)照，120v電壓下電泳25min，在投射紫外燈下觀察、照像。2結(jié)果8株菌株耐藥基因的pcr擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過pcr，凝膠電泳得出的結(jié)果如附圖1，引物302-aac(361)在8株菌株中均未檢測到目的條帶。302-qnrs(417)在rs、ss、42、43、45、47、48菌株中均能檢測出目的條帶，但s2未能檢測出，說明8株菌株均沒有aac(6’)-ib-cr。由上述結(jié)果可以看出，運(yùn)用常規(guī)pcr方法來檢測耐藥基因是可行的。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>上海海洋大學(xué)<120>一種嗜水氣單胞菌耐藥基因的檢測方法<130>/<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tgaccttgcgatgctctatg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cgtttggatcttggtgacct20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3acgacattcgtcaactgcaa20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4taaattggcaccctgtaggc20當(dāng)前第1頁12