一種檢測(cè)st251型致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒：a)PCR Premix；b)引物對(duì)；c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板；d）標(biāo)準(zhǔn)陰性DNA模板；e)滅菌雙蒸水，上游引物序列5’?GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC?3’，下游引物序列5’?CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT?3’，退火溫度為63℃，正確的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為826bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板為ST251型嗜水氣單胞菌XS91?4?1株的基因組DNA提取物，DNA濃度為500ng/μl；陰性DNA模板為維氏氣單胞菌IB340株的基因組提取物，DNA濃度500ng/μl，該試劑盒適用于所有類型的基因擴(kuò)增儀，檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高、快速而準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好?？捎糜诘~類暴發(fā)病和其它魚類由嗜水氣單胞菌引起的敗血癥的快速診斷、細(xì)菌快速檢測(cè)和鑒定，并繼而在疾病的預(yù)測(cè)、預(yù)報(bào)以及流行病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種檢測(cè)ST251型致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種快速檢測(cè)ST251型致病性嗜水氣單胞 菌的試劑盒，還涉及一種檢測(cè)ST251型致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒用途，可用于淡水養(yǎng)殖 魚類暴發(fā)病和其它淡水魚類由嗜水氣單胞菌引起的敗血癥的快速鑒別診斷和流行病學(xué)研 究，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。
【背景技術(shù)】
[0002] 氣單胞菌(aeromonads)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類中最常見(jiàn)的病原性細(xì)菌，幾乎可以侵 害各種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。它們存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的各個(gè)生態(tài)位，是健康水生動(dòng)物腸道的 主要常居菌之一。分類上屬于γ-變形菌綱、氣單胞菌科、氣單胞菌屬，已被認(rèn)可的種類至少 在25種以上，而且新種在不斷被報(bào)道。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是該屬的 代表種，也是最常被鑒定為魚類病原菌的氣單胞菌。一般認(rèn)為，多數(shù)嗜水氣單胞菌是條件致 病菌。嗜水氣單胞菌引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病有急性的，也有慢性的，癥狀會(huì)有不同表現(xiàn)，如體表 潰爛、腸炎、爛尾、爛鰭、紅皮炎、豎鱗，腹水病以及敗血癥等，所以嗜水氣單胞菌的不同菌株 之間其毒力(致病性)是不一樣的。然而，從上世紀(jì)80年代末開(kāi)始至今，發(fā)生在我國(guó)由嗜水氣 單胞菌引起的魚類暴發(fā)性出血癥卻是一個(gè)例外，經(jīng)常引起同一水體中多種養(yǎng)殖魚類同時(shí)大 規(guī)模暴發(fā)性死亡(又稱為運(yùn)動(dòng)型氣單胞菌敗血癥Motile Aeromonas Septicemia，MAS)，這 種嗜水氣單胞菌顯示出強(qiáng)大的致病性。成為我國(guó)危害最大的魚類細(xì)菌性疾病。這些嗜水氣 單胞菌菌株被認(rèn)為是致病性嗜水氣單胞菌(virulent Aeromonas hydrophi la)。由于嗜水 氣單胞菌間存在巨大的異質(zhì)性，不同的致病性菌株被發(fā)現(xiàn)攜帶不一樣的毒力基因組合，環(huán) 境中的無(wú)致病性菌株也常攜帶不止一種甚至多種毒力基因。
[0003] 氣單胞菌的分類和鑒定非常復(fù)雜，但近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)氣單 胞菌的分類鑒定和分型技術(shù)取得了重大突破。大量研究結(jié)果顯示，這些來(lái)自暴發(fā)病病例的 菌株其基因型都屬于ST251型。這些菌株在毒力基因譜、對(duì)斑馬魚的LD 5Q以及血清型等方面 也非常一致，可以認(rèn)為屬于同一克隆。從2009年開(kāi)始，一種由嗜水氣單胞菌引起的暴發(fā)性疾 病在美國(guó)的斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖地區(qū)發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)其病原也是 ST251型嗜水氣單胞菌。顯然，ST251型嗜水氣單胞菌與其他ST型嗜水氣單胞菌是不同的。
[0004] 分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)證明是最有效的細(xì)菌檢測(cè)、鑒定技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、 靈敏和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。結(jié)合傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)技術(shù)，已成為細(xì)菌學(xué)研究的基本技術(shù)。
[0005] 關(guān)于致病性嗜水氣單胞菌的檢測(cè)和鑒定，有許多文獻(xiàn)和專利技術(shù)都報(bào)道了相關(guān)的 PCR檢測(cè)技術(shù)。然而，這些技術(shù)都是針對(duì)該菌的某個(gè)或某些毒力基因而設(shè)計(jì)，如溶血素基因、 氣溶素基因，腸毒素基因等。正如前文所述，嗜水氣單胞菌具有很大的異質(zhì)性，雖然這些基 因在ST251型嗜水氣單胞菌普遍存在，但在許多非致病性菌株中也有分布，甚至在其它種類 的氣單胞菌中也同樣存在。所以，這樣的檢測(cè)技術(shù)無(wú)法區(qū)分ST251型嗜水氣單胞菌和其它類 群的嗜水氣單胞菌。
[0006] 傳統(tǒng)的基于表型的細(xì)菌鑒定和檢測(cè)技術(shù)存在明顯的技術(shù)劣勢(shì)，如費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和準(zhǔn) 確性不穩(wěn)定。很多文獻(xiàn)報(bào)道或?qū)＠夹g(shù)所介紹的PCR檢測(cè)方案，在甄別致病性嗜水氣單胞菌 方面是個(gè)空白，特別是還沒(méi)有專門針對(duì)ST251型致病性嗜水氣單胞菌的PCR檢測(cè)技術(shù)。而這 個(gè)類群的嗜水氣單胞菌是魚病學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注課題之一，對(duì)它的檢測(cè)和鑒定是相關(guān)疾病診 斷和流行病學(xué)研究等必要技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測(cè)ST251型致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒，這 個(gè)類群的嗜水氣單胞菌都具有強(qiáng)致病性，是淡水魚類暴發(fā)病(細(xì)菌性敗血癥）的病原菌。這 種致病菌在水產(chǎn)上的危害極大，侵害魚類的種類多，是最重要最常見(jiàn)的魚類病原細(xì)菌。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒在 制備治療或預(yù)防淡水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)病藥物中的應(yīng)用。在實(shí)施過(guò)程中無(wú)需特殊的試劑，并提 供了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照DNA模板，可以防止出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性擴(kuò)展。適用于目前市場(chǎng)上 所有類型的基因擴(kuò)增儀，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速而準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好?？捎糜谒a(chǎn)養(yǎng)殖 過(guò)程中淡水魚類暴發(fā)病和其它魚類(如斑點(diǎn)叉尾鮰，羅非魚、鱖魚等）由嗜水氣單胞菌引起 的敗血癥的快速診斷、細(xì)菌快速檢測(cè)和鑒定，并繼而在疾病的預(yù)測(cè)、預(yù)報(bào)以及流行病學(xué)研究 中得到廣泛應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0010]本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是:通過(guò)對(duì)多株ST251型嗜水氣單胞菌進(jìn)行基因組測(cè)序，另外從 Genbank數(shù)據(jù)中下載多個(gè)嗜水氣單胞菌全基因組序列，通過(guò)比較基因組學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)一 種脫氫酶編碼基因是ST251型致病性嗜水氣單胞菌所獨(dú)有的，在非致病性和其他類型致病 性嗜水氣單胞菌中均不存在。為此，我們針對(duì)這個(gè)基因設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)行試驗(yàn) 和不斷地優(yōu)化。通過(guò)對(duì)15株庫(kù)存的不同菌株和若干門診病例菌株的反復(fù)檢測(cè)，證實(shí)了這對(duì) 引物在檢測(cè)、鑒定ST251型致病性嗜水氣單胞菌中的高度特異性。在此基礎(chǔ)，我們建立了相 應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，用于淡水魚類細(xì)菌性敗血癥和斑點(diǎn)叉尾鮰敗血癥的快速診斷，病原的快 速檢測(cè)和鑒定。
[0011] 通過(guò)比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有哪種目前報(bào)道的所謂毒力基因是某個(gè)類群所獨(dú) 有，環(huán)境菌株的基因組上也含有毒力基因。相關(guān)的文獻(xiàn)分析也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，不難理 解針對(duì)毒力基因的檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而本發(fā)明就克服了這個(gè)缺點(diǎn)，而且經(jīng)過(guò)大量 的實(shí)驗(yàn)予以了證實(shí)。
[0012] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，不僅能夠應(yīng)用于已經(jīng)分離純化的細(xì)菌樣品的鑒定，也可 以應(yīng)用于病魚血液樣品、組織樣品、水樣、池塘底泥樣品以及飼料樣品中致病性嗜水氣單胞 菌的檢測(cè)。
[0013] 一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒，該試劑盒的內(nèi)容包括：
[0014] a.PCR premix：一種凍干的PCR預(yù)混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、反 應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑；
[0015] b.引物對(duì)；
[0016] c.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板；
[0017] d.標(biāo)準(zhǔn)陰性DNA模板；
[0018] e.滅菌雙蒸水。
[0019] 其特征在于:上游引物序列為5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 '，下游引物序列為 5' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3 '，退火溫度為63°C，正確的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為826bp。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng) 性DNA模板為ST251型嗜水氣單胞菌XS91-4-1株的基因組DNA提取物，DNA濃度為500ngAU; 陰性DNA模板為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii IB340株）的基因組提取物，DNA濃度為 500ngAU。陽(yáng)性和陰性對(duì)照菌株均為申請(qǐng)者所在實(shí)驗(yàn)室自己分離、鑒定和保存的菌株。所述 的引物對(duì)是借助DNAstar軟件中的引物設(shè)計(jì)板塊PimerSelect來(lái)完成的，從中選擇10對(duì)最理 想的引物再進(jìn)行Blast比對(duì)分析，篩選得到如下特異性最高的引物對(duì):上游引物序列為5'-GCGGCGTAAGCGGAITTGTAGC-3 ' ；下游引物序列為5 ' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3 '。
[0020] -種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒在制備治療或預(yù)防淡水養(yǎng)殖魚類暴 發(fā)病藥物中的應(yīng)用。其使用步驟是：
[0021] 1.需要對(duì)待檢樣品進(jìn)行前處理，以提取其中的總DNA用于采用本發(fā)明提供的試劑 盒進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，不僅能夠應(yīng)用于已經(jīng)分離純化的細(xì)菌樣品，也可以 應(yīng)用于病魚血液樣品、組織樣品、水樣、池塘底泥樣品以及飼料樣品中致病性嗜水氣單胞菌 的檢測(cè)。為了提取到高質(zhì)量的DNA供本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)，可以根據(jù)樣品類別，選用目前市 場(chǎng)上成熟的商品化DNA提取試劑盒（如QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit和QIAamp DNA Stool Mini Kit)。
[0022] 1)對(duì)于水樣:取1升水樣，無(wú)菌操作，在4°C條件下12800 X g離心20分鐘，將沉淀物 收集用于后續(xù)DNA提取。
[0023] 2)對(duì)于池塘底泥、飼料或動(dòng)物腸道等固體或半固體樣品：首先于無(wú)菌條件下充分 搗碎，然后取適量用無(wú)菌水進(jìn)行1:2~5稀釋，振搖2min，再用400 X g離心lmin，收集上清液， 按步驟1)離心并收集其沉淀物用于后續(xù)DNA提取。
[0024] 3)對(duì)于步驟1)和步驟2)獲得的離心沉淀物，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit提取其中的總DNA。
[0025] 4 )對(duì)于細(xì)菌菌落樣品，可以采用Pr omega公司的Wi/arcliSGenomi c DNA Purification Kit提取其基因組DNA，用于后續(xù)PCR檢測(cè)。對(duì)于菌落樣品，有時(shí)也可以用滅菌 牙簽挑取極少量的細(xì)菌直接置于PCR反應(yīng)體系中，而無(wú)需事先提取其DNA。不過(guò)，這種情況下 需要將PCR擴(kuò)增過(guò)程中的預(yù)變性時(shí)間由2min調(diào)整為5min。
[0026] 2.PCR反應(yīng)體系的建立。在每一個(gè)Premix管中，加入2μ1上游引物、2μ1下游引物，1μ 1DNA模板，以及45μ1滅菌雙蒸水，至總體積約為50μ1。輕度混勻后，閃離2s，使所有液體都集 中于管底。
[0027] 3.置于常規(guī)的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的程序按以下反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行:在 95 °C下預(yù)變性2min，進(jìn)入變性、退火和延伸的循環(huán)過(guò)程:在94 °C下持續(xù)30s發(fā)生變性過(guò)程，在 63°C下持續(xù)30s完成退火過(guò)程，在72°C下持續(xù)60s進(jìn)行延伸過(guò)程。上述的變性、退火和延伸的 循環(huán)過(guò)程進(jìn)行32次循環(huán)，最后在72°C再次延伸10min。
[0028] 4.擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析。使用1.5%濃度的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，溴化乙錠染色 后，置紫外燈下觀察和拍照。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的片段大小。
[0029] 5.結(jié)果判斷。如果擴(kuò)增的DNA條帶大小約為826bp，即認(rèn)為擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，也就是 說(shuō)樣品DNA中存在ST251型嗜水氣單胞菌的DNA。如果無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，或者條帶大小明顯與 826bp不符，則擴(kuò)增結(jié)果判定為陰性，說(shuō)明樣品DNA中不存在ST251型嗜水氣單胞菌的DNA。
[0030] 6.質(zhì)量控制：只有陽(yáng)性對(duì)照樣品中擴(kuò)增出正確條帶，而陰性對(duì)照樣品無(wú)條帶出現(xiàn) 的擴(kuò)增的結(jié)果才能被認(rèn)可。如果陽(yáng)性對(duì)照樣品沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，或條帶大小與預(yù)計(jì)的不符， 或者陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增出條帶，那說(shuō)明反應(yīng)體系或?qū)嶒?yàn)操作存在某種問(wèn)題，需要重新設(shè)置 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。
[0031] 一個(gè)優(yōu)選的方案是，將步驟5中獲得的與預(yù)期大小相似的DNA片段(826bp)，采用標(biāo) 準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行回收純化，然后進(jìn)行克隆和測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列。該序列相似度應(yīng)該在95%以上。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0033] 1.與傳統(tǒng)檢測(cè)和鑒定方法相比，本發(fā)明提供的PCR的檢測(cè)方法具有高靈敏性，高特 異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。
[0034] 2.本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒針對(duì)的是基因型為ST251的嗜水氣單胞菌這個(gè)特定細(xì) 菌類群，因此針對(duì)性強(qiáng)。這種致病菌在水產(chǎn)上的危害極大，侵害魚類的種類多，是最重要最 常見(jiàn)的魚類病原細(xì)菌，也是學(xué)術(shù)界研究的重要對(duì)象。預(yù)示著本發(fā)明的應(yīng)用范圍將會(huì)非常廣 泛。鑒于這個(gè)類群嗜水氣單胞菌的巨大危害性，以及從來(lái)沒(méi)有針對(duì)這個(gè)特定類群建立的檢 測(cè)或鑒定技術(shù)，應(yīng)該說(shuō)本發(fā)明具有明顯的創(chuàng)造性。
[0035] 3.本發(fā)明是在比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了這個(gè)類群嗜水氣單胞菌所特有 的酶類，并基于這種酶類設(shè)計(jì)特異性引物。比常規(guī)針對(duì)氣單胞菌毒力基因設(shè)計(jì)的引物，其可 靠性更高。不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，也就是說(shuō)不會(huì)對(duì)任何非ST251型嗜水氣單胞菌產(chǎn)生 陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)。這說(shuō)明其檢測(cè)的準(zhǔn)確性比現(xiàn)有的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)和先進(jìn)性。
[0036] 4.由于本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，因此其應(yīng)用價(jià)值將非常高。可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖 過(guò)程中淡水魚類暴發(fā)病和其它魚類(如斑點(diǎn)叉尾鮰，羅非魚、鱖魚等)細(xì)菌性敗血癥的快速 診斷、非生物樣品中（如飼料、底泥、水體樣品等)這個(gè)類群細(xì)菌的快速檢測(cè)和鑒定，并繼而 在疾病的預(yù)測(cè)、預(yù)報(bào)以及流行病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。
[0037] 5.本發(fā)明可以用于各種類型的樣品檢測(cè)，適用范圍廣。為不同的樣品提供了不同 的操作方案。
[0038] 6.將本發(fā)明提供的引物進(jìn)行nucleotide Blast搜索，結(jié)果與上游引物高度吻合 (100%query cover)的細(xì)菌類群主要是嗜水氣單胞菌和腸桿菌科的細(xì)菌(見(jiàn)圖1);與下游 引物高度吻合的細(xì)菌類群為嗜水氣單胞菌(見(jiàn)圖2)，而且均為ST251型菌株。所以，使用上下 游引物對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)采用本發(fā)明推薦的高退火溫度(63°C)，那么只有ST251型 嗜水氣單胞菌能被擴(kuò)增出來(lái)。這充分證明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，對(duì)這個(gè)類群的細(xì)菌具有 高度的特異性。
[0039] 7.在日常魚病診治過(guò)程中，本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒獲得了很好的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn) 表1)。表1檢測(cè)結(jié)果顯示，只有鰱、鳙、團(tuán)頭魴、鯽魚以及斑點(diǎn)叉尾鮰的暴發(fā)性出血性敗血癥 病魚中檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而且這個(gè)檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌分離的結(jié)果高度吻合。其它種類的病魚 中即使有敗血癥癥狀，也沒(méi)檢測(cè)出這個(gè)類群的嗜水氣單胞菌，說(shuō)明它的病原不是ST251型嗜 水氣單胞菌，其結(jié)果同樣與細(xì)菌分離的結(jié)果高度一致。池水、池塘底泥和飼料中有時(shí)也能檢 測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，證明了這種檢測(cè)技術(shù)的靈敏性。有些疾病（如草魚的腸炎和爛尾病)盡管其 病原經(jīng)分離鑒定確認(rèn)為嗜水氣單胞菌，但這種嗜水氣單胞菌不屬于ST251型，所以檢測(cè)結(jié)果 依然為陰性。
[0040]表1本發(fā)明提供的試劑盒用于日常病魚樣品中ST251型嗜水氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果 (2013-2016)

[0043] +表示樣品中含有ST251型嗜水氣單胞菌;-表示樣品中不含ST251型嗜水氣單胞菌
【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1為本發(fā)明提供的上游擴(kuò)增引物，經(jīng)Blast比對(duì)獲得的高覆蓋度（100%)序列所 對(duì)應(yīng)的細(xì)菌名稱，以展示引物的特異性。
[0045]圖2為本發(fā)明提供的下游擴(kuò)增引物經(jīng)Blast比對(duì)獲得的高覆蓋度（100%)序列所對(duì) 應(yīng)的細(xì)菌名稱，以展示引物的特異性。
[0046]圖3為一種試劑盒用于不同細(xì)菌、不同氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果。
[0047]以證明本檢測(cè)方面的特異性。第1泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)；往后依次是Aeromonas hydrophila IB101，團(tuán)頭魴血液分離株（ST251 型）；Aeromonas hydrophila LNB101，鰱血液 分離株（ST251 型）；Aeromonas veronii IH317,為團(tuán)頭妨腸道分離株;Aeromonas media 4pW15,為池塘水分離株;Aeromonas hydrophila XS91-4-1，為鰱血液分離株（ST251型）； Aeromonas sobria CR79-1-1，為病原菌株;Aeromonas media 4LNC204,為鏈腸道分離株； Streptococcus agalactiae 0718flz，為羅非魚肝臟分離株；Streptococcus agalactiae 0722XY，為羅非魚肝臟分離株；Citrobacter freudii HD00103,為舞魚病原菌；Aermonas schubertii HYL2,為烏體病原菌;Yersinia ruckeri SC90-2-4,為鰱I庸病原菌;Vibrio anguillarum E-3-11，為海水魚類病原菌;Aeromonas veronii IB340,為團(tuán)頭魴血液分離 株;Pseudomonas fluoresces 0704CC1，為斑點(diǎn)叉尾鮰血液分離株。
[0048]圖4為一種檢測(cè)試劑盒用于病魚樣品中ST251型嗜水氣單胞菌的檢測(cè)結(jié)果。
[0049] 第1泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2道為病原菌Aeromonas hydrophila XS91-4-l(ST251 型)DNA的擴(kuò)增結(jié)果;第3和第4道為2尾感染XS91-4-1的病魚肝臟樣品；第5道和第6道為感染 Aeromonas veronii IB340的病魚肝臟樣品。
[0050] 圖5為一種檢測(cè)試劑盒用于飼料、池水和池塘底泥樣品中ST251型嗜水氣單胞菌的 檢測(cè)的結(jié)果。
[0051] M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，第1和第2泳道為飼料樣品，第3和第4泳道分別為添加了病原菌嗜 水氣單胞菌Aeromonas hydrophila XS91-4-l(ST251型）菌液的飼料樣品；第5,6泳道為常 規(guī)的池塘水樣;第7和8泳道為常規(guī)的池塘底泥樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0052]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常 按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版）；商 品化試劑盒按其附帶的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。所有涉及DNA提取和PCR反應(yīng)體系配置的操作步 驟，均須采用無(wú)菌操作技術(shù)。
[0053]在本發(fā)明的說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"試驗(yàn)樣品"是指懷疑包含有待檢測(cè)細(xì)菌的所有對(duì)象 物。試驗(yàn)樣品不特別限定，只要可通過(guò)核酸擴(kuò)增法對(duì)染色體DNA的特定區(qū)域擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)細(xì)菌 的存在即可。優(yōu)選的實(shí)例包括養(yǎng)殖水體中的水，養(yǎng)殖水體中的底泥或其他固體附著物，餌料 和生物樣品等。生物樣品主要是指細(xì)菌樣品、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的血液、粘液、組織器官或腸道 內(nèi)容物等。
[0054] 本發(fā)明說(shuō)明書中的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒不僅限于QIAGEN公司和Promega公 司的產(chǎn)品，任何符合要求的其他公司的同類試劑盒均可。
[0055] PCR反應(yīng)體系除了可以使用本發(fā)明提供的PCR Premix之外，也可以選用商品化的 同類產(chǎn)品，只需在Premix中加入規(guī)定量的DNA模板和引物即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其前提是陽(yáng)性 對(duì)照樣品必須擴(kuò)增出正確條帶，陰性對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。
[0056] 實(shí)施例1:
[0057] -種檢測(cè)致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒，該試劑盒含有：
[0058] a. PCR premix: -種PCR預(yù)混合物凍干粉，包含高保真的DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、 反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑；
[0059] b.引物對(duì)；
[0060] c.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板；
[0061 ] d.標(biāo)準(zhǔn)陰性DNA模板；
[0062] e.滅菌雙蒸水。
[0063] 所述的引物對(duì)的上游引物為5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 ' ；
[0064] 所述的引物對(duì)的下游引物為5'-〇1^111^^11^611^661'11^1'-3'。
[0065] 具體操作過(guò)程如下：
[0066] 1) 15株細(xì)菌的基因組DNA抽提：采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，如Promega公司的 Wizard?Genomic DNA Purification Kit，按說(shuō)明書要求操作。
[0067] 2)PCR反應(yīng)體系采用PCR Master Mix，然后加入下列成分 上游引物（10 μΜ) 2μ1
[0068] 下游引物（ΙΟμΜ) 2μ1 DNA模板 ΙμL 雙蒸水 47μ1
[0069] 總體積 50μ丨
[0070] 以上各組分混勻后，閃離2s，使液體集中于管底。擴(kuò)增條件為:94°C2min，接著32個(gè) 循環(huán)：94°C30s，63°C30s，72°C60s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0071] 3)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的分析；
[0072] PCR產(chǎn)物用1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外 分析儀下觀察和拍照。
[0073] 4)結(jié)果：
[0074]有的泳道有DNA條帶的出現(xiàn)，其大小根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判斷為862bp，這說(shuō)明細(xì)菌培 養(yǎng)物為ST251型致病性氣單胞菌。未出現(xiàn)條帶的樣品所對(duì)應(yīng)的菌株不是ST251型致病性氣單 胞菌。陽(yáng)性樣品出現(xiàn)正確的擴(kuò)增條帶，而陰性對(duì)照樣品中未出現(xiàn)擴(kuò)增帶（圖3)。也就是說(shuō)沒(méi) 有出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果可信。此外，3次重復(fù)試驗(yàn)都獲得了相同的結(jié)果，說(shuō)明 方法的重現(xiàn)性好。
[0075] 實(shí)施例2:
[0076] -種快速檢測(cè)致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒，用于檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物組織樣品中 可能存在的目標(biāo)細(xì)菌。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，首先必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提取樣品中的總DNA， 然后采用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。
[0077] -種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒在制備治療或預(yù)防淡水養(yǎng)殖魚類暴 發(fā)病藥物中的應(yīng)用。其操作步驟是：
[0078] 1)無(wú)菌操作，取動(dòng)物的肝腎脾等內(nèi)臟組織，或動(dòng)物的血液。
[0079] 2)采用QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit提取組織中包括細(xì)菌基因組DNA 在內(nèi)的所有DNA，按說(shuō)明書要求操作。
[0080] 3)PCR反應(yīng)體系采用本發(fā)明的試劑盒中的PCR Premix，然后加入下列成分 上游引物（10 μΜ) 2μ1 下游引物（1〇μΜ) 2:μ1
[0081] 雙蒸水 47μ1 總體積 50μ1
[0082] 以上各組分混勻后，閃離2s，使液體集中于管底。擴(kuò)增條件為:94°C2min，接著32個(gè) 循環(huán)：94°C30s，63°C30s，72°C90s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0083] 4)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的分析及結(jié)果判斷。
[0084] PCR產(chǎn)物用1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外 分析儀下觀察和拍照。
[0085] 5)結(jié)果:有些待檢樣品所對(duì)應(yīng)的泳道中有DNA條帶出現(xiàn)，其大小根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判 斷為862bp。這說(shuō)明這些泳道所對(duì)應(yīng)的組織樣品中有ST251型致病性氣單胞菌存在。陽(yáng)性對(duì) 照和陰性對(duì)照樣品都呈現(xiàn)出預(yù)期結(jié)果（圖4)。也就是說(shuō)沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，檢測(cè) 結(jié)果可信。此外，3次重復(fù)試驗(yàn)都獲得了相同的結(jié)果，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性好。
[0086] 實(shí)施例3:
[0087] -種快速檢測(cè)致病性嗜水氣單胞菌的試劑盒，用于檢測(cè)非生物樣品（水樣、底泥 樣、飼料樣）中可能存在的目標(biāo)細(xì)菌。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，首先必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提取樣 品中的總DNA，然后采用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。
[0088] 一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒在制備治療或預(yù)防淡水養(yǎng)殖魚
[0089]類暴發(fā)病藥物中的應(yīng)用。其操作步驟是：
[0090] 1)對(duì)于水樣:取1升水樣，無(wú)菌操作，在4°C條件下12800 X g離心20分鐘，將沉淀物 收集用于DNA提取。
[0091] 2)對(duì)于池塘底泥、飼料或動(dòng)物腸道等固體或半固體樣品：首先于無(wú)菌條件下充分 搗碎，然后取適量用無(wú)菌水進(jìn)行1:2~5稀釋，振搖2min，再用400 X g離心lmin，收集上清液， 按步驟1)離心并收集其沉淀物用于后續(xù)DNA提取。
[0092] 3)對(duì)于步驟1)和步驟2)獲得的離心沉淀物，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit提取其中的總DNA，按說(shuō)明書要求操作，用于下面的PCR擴(kuò)增。
[0093] 4)PCR反應(yīng)體系采用本發(fā)明的試劑盒中的PCR Premix，然后加入下列成分 上游引物（ΙΟ μΜ) 2μ1 下游引物（ΙΟμΜ) 2μ1
[0094] DNA 模板 ΙμL 雙蒸水 47μ1 總體積 50μ1
[0095] 以上各組分混勻后，閃離2s，使液體集中于管底。擴(kuò)增條件為:94°C2min，接著32個(gè) 循環(huán)：94°C30s，63°C30s，72°C60s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0096] 5)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的分析及結(jié)果判斷。
[0097] PCR產(chǎn)物用1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結(jié)果在紫外 分析儀下觀察，發(fā)現(xiàn)有的樣品所對(duì)應(yīng)的泳道中有DNA條帶出現(xiàn)。其大小根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判斷 為862bp，說(shuō)明所對(duì)應(yīng)的樣品中有ST251型致病性氣單胞菌存在。陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品都呈 現(xiàn)出預(yù)期的結(jié)果（圖5)。也就是說(shuō)沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果可信。此外，3次 重復(fù)試驗(yàn)都獲得了相同的結(jié)果，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒，該試劑盒含有：a) PCR premix : - 種凍干的PCR預(yù)混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑 和穩(wěn)定劑;b)引物對(duì);c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板;d)標(biāo)準(zhǔn)陰性DNA模板;e)滅菌雙蒸水;其特征 在于：上游引物序列為5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 '，下游引物序列為5 ' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3'，退火溫度為63°C，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為826bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模 板為ST251型嗜水氣單胞菌XS91-4-1株的基因組DNA提取物，DNA濃度為500ngAU;陰性DNA 模板為維氏氣單胞菌IB340株的基因組提取物，DNA濃度為500ngAU。2. 權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)ST251型嗜水氣單胞菌的PCR試劑盒在制備治療或預(yù)防淡 水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105969907SQ201610604290
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月27日
【發(fā)明人】李愛(ài)華, 劉天強(qiáng), 彭波, 張倩倩
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所