一種多重pcr腸道致病菌檢測(cè)引物組、試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多重PCR腸道致病菌檢測(cè)引物組、試劑盒，屬于涉及PCR應(yīng)用技 術(shù)領(lǐng)域。更具體是涉及14種腸道致病菌檢測(cè)，包括：霍亂弧菌（01群、0139群、非01/0139 群）、單核增生李斯特菌、腸致病性大腸桿菌（EPEC)、腸出血性大腸桿菌（EHEC)、腸產(chǎn)毒性 大腸桿菌（ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC)、腸聚集性大腸桿菌（EAEC)、志賀菌、腸道病毒 EV71、腸出血性大腸桿菌0157 :H7、艱難梭菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏 菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道致病菌引起的傳染病是危害公共衛(wèi)生安全的主要因素。多數(shù)國(guó)家都采取了相 應(yīng)的措施檢測(cè)腸道致病菌和控制疫情的傳播。腸道致病菌主要包括單核增生李斯特氏菌、 副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢 桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌0157 : H7、耶爾森氏菌和霍亂弧菌等。
[0003] 國(guó)際公認(rèn)的李斯特菌有10種，其中與人的李斯菌癥相關(guān)的通常只有單核增生李 斯特氏菌。據(jù)報(bào)道，有1-10%的人類(lèi)腸道中存在單核增生李斯特氏菌，該菌造成的腦膜炎的 致死率可高達(dá)70 %，敗血癥的死亡率達(dá)50 %，圍產(chǎn)期或新生兒感染的死亡率超過(guò)80 %。李 斯特菌溶血素（GGH)是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的主要毒力因子，由hlyA基因編碼。
[0004] 腸病毒71型（EV71)是腸病毒的一種，多見(jiàn)于東南亞地區(qū)的夏季期間，主要病征是 手足口病的一系列征狀上包括發(fā)燒、食欲不振、喉嚨痛及口腔潰瘍等。也可能導(dǎo)致神經(jīng)感 染。目前在我國(guó)有逐漸增加的傾向。EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白由VP1基因編碼，通過(guò)鑒定VP1的 有無(wú)判斷是感染腸病毒71型。
[0005]志賀菌屬的細(xì)菌，通稱痢疾桿菌，是人類(lèi)細(xì)菌性痢疾的病原菌，以病人和帶菌者為 傳染源，無(wú)動(dòng)物宿主。其致病物質(zhì)主要是侵襲力和內(nèi)毒素，有的菌株尚產(chǎn)生外毒素。
[0006] 霍亂弧菌是霍亂的病原體，根據(jù)血清型的不同可以分為01群、0139群、非01/0139 群。01群、0139群霍亂弧菌產(chǎn)生的霍亂腸毒素（也稱霍亂毒素）是產(chǎn)生霍亂的主要原因， 也只有01群和01群霍亂弧菌可引起霍亂，而其他群的霍亂弧菌毒性不高。霍亂弧菌的致 病因子主要有CTX元件（其中的CtxA基因編碼霍亂腸毒素）、TcpA致病島（編碼TcpA菌 毛）和toxR(毒力調(diào)控基因，調(diào)節(jié)編碼CtxA和TcpA的基因）?；魜y弧菌ompW基因編碼外 膜蛋白，是所有霍亂弧菌所共有的。研究表明，01群和0139群在許多基因和組成上高度相 似，一些毒力基因CtxA和TcpA基因相同，而通過(guò)比對(duì)兩種血清型霍亂弧菌的糖基轉(zhuǎn)移酶基 因（LPSgt)，發(fā)現(xiàn)它們序列存在較大差異。
[0007] 致病性大腸桿菌感染的主要癥狀是致瀉。根據(jù)其致病機(jī)理不同主要分為腸致病性 大腸埃希菌（EPEC)、腸出血性大腸埃希菌（EHEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC)、腸侵襲性 大腸埃希菌（EIEC)、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC)。eae基因編碼一個(gè)被稱為緊密粘附素的 外膜蛋白，此蛋白能使細(xì)菌黏附于宿主腸壁上，是EPEC的重要毒力基因。EHEC的stxl和 stx2基因編碼志賀樣毒素I和志賀樣毒素II。EIEC的invE基因（又稱virB)編碼蛋白介 導(dǎo)侵襲。ETEC有兩種腸毒素不耐熱腸毒素（由LT基因編碼）和耐熱腸毒素基因（可分兩 種，分別由ST1和ST2)。EAEC的毒力基因編碼蛋白介導(dǎo)集聚性黏附上皮細(xì)胞，阻止液體吸 收，其特異性基因?yàn)橹修D(zhuǎn)錄激活因子基因（aggR)。大腸桿菌0157 :H7是腸出血性大腸桿菌 一種主要致病菌，其中rfbE基因編碼大腸桿菌0157菌體0抗原（多糖）特異性轉(zhuǎn)移酶，參 與脂多糖的生物合成。
[0008]艱難梭菌（Clostridiumdifficile)為革蘭陽(yáng)性產(chǎn)芽孢厭氧桿菌。艱難梭菌 本身沒(méi)有侵襲性，部分產(chǎn)毒細(xì)菌通過(guò)分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相關(guān) 性腹瀉、結(jié)腸炎甚至致死性假膜性腸炎，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridiumdifficile infection，CDI)。醫(yī)院獲得感染性腹瀉所明確的病原中，以艱難梭菌最為常見(jiàn)；在抗生素相 關(guān)性腹瀉病因中，艱難梭菌亦占20%?30% ;而假膜性腸炎則幾乎100%由艱難梭菌所致。 在美國(guó)，艱難梭菌感染是引起醫(yī)院感染性腹瀉的第一位原因。
[0009]腸炎弧菌（Vibrioparahaemolyticus,VP)，又稱副溶血性弧菌是革蘭氏陰性多形 態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌，屬于弧菌屬，是一種常見(jiàn)的病原菌。腸炎弧菌是一種嗜鹽性的革蘭氏 陰性菌，廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中，是我國(guó)沿海地區(qū)常見(jiàn)的食物中毒病原菌。副溶血弧 菌分離株都含有不耐熱溶血毒素（tlH)，這種溶血素是副溶血弧菌所特有的，因此它的編碼 基因tlH基因常被用作檢測(cè)副溶血弧菌的靶基因。而tlH并不是一個(gè)毒素基因，真正與致 病相關(guān)的是副溶血弧菌的耐熱直接溶血素（tdH)和溶血相關(guān)溶血素（trH)。
[0010] 沙門(mén)氏菌（Salmonella)屬腸桿菌科，革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，是一種廣泛分布于自 然界的危害極大的腸道致病菌，有其引起的食物中毒數(shù)量為世界食物中毒病例之首。按其 抗原成份可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒 甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷 寒桿菌和腸炎桿菌等。沙門(mén)菌具有侵襲宿主上皮細(xì)胞的能力，其侵襲力和毒力與invA基 因相關(guān)。sefA是腸炎沙門(mén)菌SEF14菌毛操縱子的亞單位。鞭毛是沙門(mén)氏菌的重要毒力基 因，鞭毛提供了的動(dòng)力可能是細(xì)菌侵入細(xì)胞的重要因素，而且鞭毛可以作為黏附素，決定了 細(xì)菌在細(xì)胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居過(guò)程。fliC是鼠傷寒沙門(mén)菌的鞭毛抗原，為 該菌所特有的保守基因。
[0011] 檢測(cè)和鑒定多種腸道致病菌對(duì)于傳染病預(yù)防控制工作提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和 可靠的技術(shù)保障。目前，采用的生化鑒定、定量PCR和ELISA等方法均是對(duì)少數(shù)細(xì)菌進(jìn)行鑒 另IJ，不能達(dá)到短時(shí)間內(nèi)對(duì)多種致病菌平行檢測(cè)和鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：常規(guī)的腸道致病菌檢測(cè)方法一次性只能檢測(cè)較少 腸道致病菌，本申請(qǐng)能夠同時(shí)檢測(cè)14種腸道致病菌共26個(gè)基因，提出了一種多重PCR腸道 致病菌檢測(cè)引物組、試劑盒。
[0013] 技術(shù)方案：
[0014] 一種多重PCR腸道致病菌檢測(cè)引物組，所述的引物組包括有如下的引物對(duì)中的至 少兩對(duì)：
[0015]用于擴(kuò)增單核增生李斯特菌的特異性基因溶血素A基因（hlyA)的引物對(duì)、
[0016] 用于擴(kuò)增腸道病毒EV71的特異性基因結(jié)構(gòu)蛋白基因（VP1)的引物對(duì)、
[0017] 用于擴(kuò)增志賀菌的特異性基因的侵襲性質(zhì)?？乖璈基因（ipaH)的引物對(duì)、
[0018] 用于擴(kuò)增腸出血性大腸桿菌0157 :H7編碼脂多糖基因（rfbE)的引物對(duì)、
[0019] 用于擴(kuò)增霍亂弧菌外膜蛋白基因（ompW)的引物對(duì)、
[0020] 用于擴(kuò)增霍亂毒素基因（CtxA)的引物對(duì)、
[0021] 用于擴(kuò)增霍亂弧菌的毒素協(xié)同菌毛基因（TcpA)的引物對(duì)、
[0022] 用于擴(kuò)增霍亂糖基轉(zhuǎn)移酶基因（LPSgt)的引物對(duì)、
[0023] 用于擴(kuò)增腸致病性大腸桿菌（EPEC)的緊密黏附素基因（eae)的引物對(duì)、
[0024] 用于擴(kuò)增腸出血性大腸桿菌（EHEC)的志賀樣毒素I基因（stxl)的引物對(duì)、
[0025] 用于擴(kuò)增腸出血性大腸桿菌（EHEC)的志賀樣毒素II基因（stx2)的引物對(duì)、
[0026] 用于擴(kuò)增腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC)的不耐熱熱腸毒素基因（LT)的引物對(duì)、
[0027] 用于擴(kuò)增腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC)的耐熱腸毒素ST1基因的引物對(duì)、
[0028] 用于擴(kuò)增腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC)的耐熱腸毒素ST2基因的引物對(duì)、
[0029] 用于擴(kuò)增腸侵襲性大腸桿菌（EIEC)的invE基因（又稱virB)的引物對(duì)、
[0030] 用于擴(kuò)增腸聚集性大腸桿菌（EAEC)的轉(zhuǎn)錄激活因子基因（aggR)的引物對(duì)、
[0031] 用于擴(kuò)增艱難梭菌毒素A基因（tcdA)的引物對(duì)、
[0032] 用于擴(kuò)增艱難梭菌毒素B基因（tcdB)的引物對(duì)、
[0033] 用于擴(kuò)增艱難梭菌二元毒素A基因（cdtA)的引物對(duì)、
[0034] 用于擴(kuò)增艱難梭菌二元毒素B基因（cdtB)的引物對(duì)、
[0035] 用于擴(kuò)增副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素基因（tlH)的引物對(duì)、
[0036] 用于擴(kuò)增副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因（tdH)的引物對(duì)、
[0037] 用于擴(kuò)增副溶血性弧菌溶血相關(guān)溶血素基因（trH)的引物對(duì)、
[0038] 用于擴(kuò)增沙門(mén)氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的基因（invA)的引物對(duì)、
[0039] 用于擴(kuò)增腸炎沙門(mén)菌的sefA基因的引物對(duì)、
[0040] 用于擴(kuò)增傷寒沙門(mén)氏菌的編碼鞭毛抗原基因（flic)的引物對(duì)。
[0041] 所述的引物對(duì)中的引物堿基序列如下