本發(fā)明屬于馬哈利矮化植株技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法。

背景技術(shù)：

dna甲基化是一種表觀遺傳現(xiàn)象，是高等植物普遍存在的一種dna共價修飾方式，甲基化并不改變dna的堿基排列順序，但是可以抑制遺傳信息的傳遞，從而引起表觀性狀的變化，它可以遺傳，也可以通過去甲基化酶等作用發(fā)生去甲基化逆轉(zhuǎn)。dna甲基化的狀態(tài)對染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)座子活性以及基因的表達(dá)調(diào)控等至關(guān)重要，甲基化狀態(tài)的改變可以造成某些基因功能的喪失或發(fā)生亞功能化，miura等研究發(fā)現(xiàn)，dna甲基化水平降低可以導(dǎo)致具亞穩(wěn)態(tài)矮化表型的水稻向正常表型轉(zhuǎn)變，林如濤等研究發(fā)現(xiàn)，從江香豬血液和肝臟基因組的總甲基化程度隨體重的增加而下降，劉瓊瑤等發(fā)現(xiàn)矮生觀賞杉木中參與mapk級聯(lián)途徑的蛋白磷酸酶ibr5基因啟動子區(qū)域的甲基化水平上升，這些研究均表明甲基化與生物體的矮化有關(guān)。目前植物dna甲基化的研究方法很多，如hplc、rrbs、msap、cobra、和rlgs等，而msap技術(shù)不需要知道被測dna的序列信息，在不同生物上具有通用性，并且msap技術(shù)可以檢測植物不同品系的dna甲基化差異，對馬哈利的現(xiàn)有研究，多集中在砧穗互作、生長動態(tài)、激素處理等生理研究方面，生理研究表明植株在一定條件下可實(shí)現(xiàn)早果，但不能解決植株矮化的問題。masoud用srap分子標(biāo)記、pedro用rapd分子標(biāo)記等研究均發(fā)現(xiàn)馬哈利種群內(nèi)基因多態(tài)性豐富，但馬哈利的變異及其多樣性，在砧木繁育中，還沒有充分利用。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：目前植物dna甲基化的研究方法很多，如hplc、rrbs、msap、cobra、和rlgs等，而msap技術(shù)不需要知道被測dna的序列信息，在不同生物上具有通用性，并且msap技術(shù)可以檢測植物不同品系的dna甲基化差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鑒別櫻桃矮化砧木的引物，所述鑒別櫻桃矮化砧木的引物為15對；序列為：seqidno：1～seqidno：15。

進(jìn)一步，所述鑒別櫻桃矮化砧木的引物還包括：接頭引物seqidno：16；預(yù)擴(kuò)引物；seqidno：17；選擇性引物seqidno：18。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述鑒別櫻桃矮化砧木的引物的利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法，所述利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法包括以下步驟：

步驟一，采用改良ctab法提取dna，dna樣品純度和濃度用nano-drop檢測后，1％瓊脂糖凝膠電泳；

步驟二，msap分析，25μl酶切體系，37℃酶切6h，80℃滅活15min；30μl連接體系，16℃連接16h，80℃滅活15min；20μl預(yù)擴(kuò)增體系，94℃30s，56℃30s，72℃80s，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72℃延伸8min。產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果；20μl選擇性擴(kuò)增體系，第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每輪循環(huán)溫度-0.7℃，擴(kuò)增12輪；再按下列參數(shù)擴(kuò)增28輪：94℃30s，55℃30s，72℃80s，最后72℃延伸8min；

步驟三，msap條帶統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析，從64對引物中篩選條帶清晰、重復(fù)性及特異性良好的15對引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，統(tǒng)計范圍為150bp-500bp，計算甲基化頻率，并對統(tǒng)計結(jié)果利用spss進(jìn)行t測驗(yàn)和單因素方差分析做差異性顯著檢驗(yàn)。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將擴(kuò)增出的條帶分為3種，第一種為半甲基化型，記為(+，-)，即ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增有帶，而ecorⅰ+mspⅰ酶切后擴(kuò)增無帶，指5'-cmcgg-3'位點(diǎn)為外側(cè)胞嘧啶甲基化；第二種為全甲基化型，記為(-，+)，即ecorⅰ+mspⅰ酶切后擴(kuò)增有帶，而ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增無帶，指5'-mccgg-3'位點(diǎn)為內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化；第三種為非甲基化位點(diǎn)或內(nèi)側(cè)胞嘧啶單鏈甲基化，記為(+，+)，即ecorⅰ+mspⅰ和ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增都有帶。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述鑒別櫻桃矮化砧木的引物鑒定的櫻桃矮化砧木。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：利用msap技術(shù)對25株矮化馬哈利櫻桃和25株半矮化馬哈利櫻桃進(jìn)行甲基化水平和模式分析；從64對引物中篩選出15對重復(fù)性好、條帶清晰的引物，在半矮化組中共擴(kuò)增4577個條帶，其中半甲基化336個，全甲基化1274個，在矮化組中共擴(kuò)增4444個條帶，其中半甲基化349個，全甲基化1383個；半矮化組單態(tài)性位點(diǎn)23個，多態(tài)性位點(diǎn)136個，矮化組單態(tài)性位點(diǎn)17個，多態(tài)性位點(diǎn)142個。由此得出結(jié)論，矮化組的甲基化水平和多態(tài)性均高于半矮化組，進(jìn)而可以推測馬哈利砧木的矮化和甲基化有關(guān)，為馬哈利矮化植株的進(jìn)一步選育提供理論支撐。本發(fā)明通過從馬哈利cdr-1自然狀態(tài)下自交后代中選擇較矮化的植株，并與馬哈利cdr-1作對比，借助msap技術(shù)檢測它們的甲基化多態(tài)性，分析它們的甲基化水平和模式，進(jìn)而推測其矮化的表觀性狀與其基因組甲基化修飾的關(guān)系。本發(fā)明采用此方法對矮化組和半矮化組馬哈利櫻桃進(jìn)行甲基化檢測。msap是以aflp為基礎(chǔ)的進(jìn)行酶切位點(diǎn)的甲基化分析，分別用ecorⅰ/hpaⅱ和ecorⅰ/mspⅰ兩組內(nèi)切酶酶切基因組dna，檢測其甲基化修飾水平。西北農(nóng)林科技大學(xué)于1991年從匈牙利引進(jìn)馬哈利櫻桃，歷經(jīng)十年從中選出矮化緊湊的優(yōu)系，培育出了半矮化、高抗根癌病、抗寒、耐鹽堿的馬哈利cdr-1，在我國的西北地區(qū)種植推廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物對e+aag和h+tca在矮化組(25個樣本)的msap擴(kuò)增圖譜示意圖；

圖中：從左到右，依次為1號個體的h泳道、m泳道，2號h泳道、m泳道，一直到25號h泳道、m泳道。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的引物對e+aag和h+tca在半矮化組25個樣本中的msap擴(kuò)增圖譜示意圖；

圖中：從左到右，依次為1號個體的h泳道、m泳道，2號h泳道、m泳道，到25號h、m。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的鑒別櫻桃矮化砧木的引物為15對seqidno：1～seqidno：15。如表2所示。

本發(fā)明實(shí)施例提供的鑒別櫻桃矮化砧木的引物還包括：接頭引物seqidno：16；預(yù)擴(kuò)引物；seqidno：17；選擇性引物seqidno：18。如表1所示。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法包括以下步驟：

s101：采用改良ctab法提取dna，dna樣品純度和濃度用nano-drop檢測后，1％瓊脂糖凝膠電泳；

s102：msap分析，25μl酶切體系，37℃酶切6h，80℃滅活15min；30μl連接體系，16℃連接16h，80℃滅活15min；20μl預(yù)擴(kuò)增體系，94℃30s，56℃30s，72℃80s，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72℃延伸8min。產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果；20μl選擇性擴(kuò)增體系，第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每輪循環(huán)溫度-0.7℃，擴(kuò)增12輪；再按下列參數(shù)擴(kuò)增28輪：94℃30s，55℃30s，72℃80s，最后72℃延伸8min；

s103：msap條帶統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析，從64對引物中篩選條帶清晰、重復(fù)性及特異性良好的15對引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，統(tǒng)計范圍為150bp-500bp，計算甲基化頻率，并對統(tǒng)計結(jié)果利用spss進(jìn)行t測驗(yàn)和單因素方差分析做差異性顯著檢驗(yàn)。

下面結(jié)合試驗(yàn)對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

1材料與方法

1.1材料

所用馬哈利砧木均來自于西北農(nóng)林科技大學(xué)櫻桃試驗(yàn)站岐山苗圃。2014年12月，在馬哈利一年生砧木(種子為馬哈利cdr-1的自然授粉種)落葉后，按照節(jié)間密度較密、主干頂部直徑與基部直徑比約1:2、分叉較少或幾乎不分叉、植株高度較矮等條件，篩選一批矮化砧木，經(jīng)2015年和2016年再次選擇確定矮化特征后，對矮化趨勢明顯的25棵植株，采集葉片，記為矮化組，同時選擇馬哈利cdr-1普通高度植株25株，采集葉片，記為半矮化組。

1.2dna的提取

采用改良ctab法提取dna，dna樣品純度和濃度用nano-drop檢測后，1％瓊脂糖凝膠電泳。

1.3msap分析

msap分析程序使用xiong等的方法并適當(dāng)調(diào)改，接頭及引物參照evangellia等。

1.3.125μl酶切體系

37℃酶切6h，80℃滅活15min。

1.3.230μl連接體系

16℃連接16h，80℃滅活15min。

1.3.320μl預(yù)擴(kuò)增體系

94℃30s，56℃30s，72℃80s，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72℃延伸8min。產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.3.420μl選擇性擴(kuò)增體系

第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每輪循環(huán)溫度-0.7℃，擴(kuò)增12輪；再按下列參數(shù)擴(kuò)增28輪：94℃30s，55℃30s，72℃80s，最后72℃延伸8min。

1.4msap條帶統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析

從64對引物中篩選條帶清晰、重復(fù)性及特異性良好的15對引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(圖2，圖3)，將擴(kuò)增出的條帶分為3種，第一種為半甲基化型，記為(+，-)，即ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增有帶，而ecorⅰ+mspⅰ酶切后擴(kuò)增無帶，指5'-cmcgg-3'位點(diǎn)為外側(cè)胞嘧啶(單鏈)甲基化；第二種為全甲基化型，記為(-，+)，即ecorⅰ+mspⅰ酶切后擴(kuò)增有帶，而ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增無帶，指5'-mccgg-3'位點(diǎn)為內(nèi)側(cè)胞嘧啶(雙鏈)甲基化；第三種為非甲基化位點(diǎn)或內(nèi)側(cè)胞嘧啶單鏈甲基化，記為(+，+)，即

ecorⅰ+mspⅰ和ecorⅰ+hpaⅱ酶切后擴(kuò)增都有帶。統(tǒng)計范圍為150bp-500bp，計算甲基化頻率，并對統(tǒng)計結(jié)果利用spss進(jìn)行t測驗(yàn)和單因素方差分析做差異性顯著檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1dna甲基化水平分析與比較

2.1.1dna甲基化水平分析

25份矮化馬哈利砧木及25份半矮化馬哈利砧木擴(kuò)增條帶統(tǒng)計結(jié)果見表2，15對引物25株個體，矮化組共檢測到4444個位點(diǎn)，半甲基化位點(diǎn)349個，全甲基化位點(diǎn)1383個，平均每個體檢測到178個位點(diǎn)，半甲基化位點(diǎn)14個，全甲基化位點(diǎn)55個，半甲基化率7.85％，全甲基化率31.12％，半矮化組共檢測到4577個位點(diǎn)，半甲基化位點(diǎn)336個，全甲基化位點(diǎn)1274個，平均每個體檢測到183個位點(diǎn)，半甲基化位點(diǎn)13個，全甲基化位點(diǎn)51個，半甲基化率7.33％，全甲基化率27.83％，因此可以推測馬哈利砧木基因組“ccgg”位點(diǎn)雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化水平比單鏈外側(cè)甲基化水平高，基因組“ccgg”位點(diǎn)甲基化的主要方式為雙鏈內(nèi)側(cè)的全甲基化。

2.1.2dna甲基化水平差異分析

t測驗(yàn)結(jié)果表明，矮化組與半矮化組在全甲基化水平和總甲基化水平上差異極顯著，在半甲基化水平上差異達(dá)到顯著水平而未達(dá)極顯著水平，由此可知，矮化的馬哈利基因組的甲基化水平相比半矮化馬哈利高，尤其在全甲基化水平和總甲基化水平上變異率高。

為了進(jìn)一步明確區(qū)分組內(nèi)差異和組間差異，在t測驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步做了單因素方差分析，在全甲基化水平上，f測驗(yàn)和t測驗(yàn)結(jié)果一致，均差異極顯著，組間均方135.3，組內(nèi)均方0.46，證明差異顯著性主要來自組間；在總甲基化水平上，f測驗(yàn)和t測驗(yàn)結(jié)果一致，均差異極顯著，組間均方180.9，組內(nèi)均方1.3，表明差異顯著性主要來自組間；在半甲基化水平上，f測驗(yàn)和t測驗(yàn)結(jié)果一致，均差異顯著，組間均方3.3，組內(nèi)均方0.6，表明差異顯著性主要來自組間。據(jù)此可得出結(jié)論，矮化組與半矮化組馬哈利基因組的甲基化水平的確存在顯著差異。

2.2dna甲基化模式及多態(tài)性分析

2.2.1dna甲基化多態(tài)性分析

同一位點(diǎn)在不同個體基因組中甲基化模式可分為兩大類，單態(tài)性和多態(tài)性。單態(tài)性是指甲基化模式在不同個體中保持一致，多態(tài)性即一個樣品在甲基化模式上不同于另一個樣品，表明ccgg位點(diǎn)甲基化狀態(tài)在不同個體植株中表現(xiàn)不同，由表3可知，馬哈利半矮化組基因組甲基化多態(tài)性位點(diǎn)占擴(kuò)增總位點(diǎn)的85.53％，單態(tài)性位點(diǎn)占14.47％，馬哈利矮化組基因組多態(tài)性位點(diǎn)占擴(kuò)增總位點(diǎn)的89.31％，單態(tài)性位點(diǎn)占10.69％，從而可以得出推論：在msap所能檢測到的有效位點(diǎn)范圍內(nèi)，馬哈利砧木基因組甲基化多態(tài)性位點(diǎn)遠(yuǎn)多于單態(tài)性位點(diǎn)，且矮化組多態(tài)性位點(diǎn)高于半矮化組。

在25株馬哈利矮化砧木及25株半矮化馬哈利砧木中，共擴(kuò)增出現(xiàn)7種多態(tài)性類型(表3、表4)，多態(tài)性類型主要是a3(++、--)、a4(++、-+、--)、c1(-+、--)三種，(++、--)類型說明同一位點(diǎn)的非甲基化位點(diǎn)可以在某些個體中發(fā)生內(nèi)外側(cè)同時甲基化或外側(cè)雙鏈甲基化，(++、-+、--)類型說明同一位點(diǎn)的非甲基化位點(diǎn)可以在某些個體中發(fā)生單鏈外側(cè)甲基化或內(nèi)外側(cè)同時甲基化或外側(cè)雙鏈甲基化，(-+、--)類型說明同一位點(diǎn)的單鏈外側(cè)甲基化位點(diǎn)可以在某些個體中發(fā)生內(nèi)外側(cè)同時甲基化或外側(cè)雙鏈甲基化。可推測，馬哈利基因組甲基化多態(tài)性位點(diǎn)主要發(fā)生在非甲基化位點(diǎn)與雙鏈內(nèi)側(cè)全甲基化位點(diǎn)上，還有雙鏈內(nèi)側(cè)全甲基化位點(diǎn)與內(nèi)外側(cè)同時甲基化位點(diǎn)上。

2.2.2dna甲基化多態(tài)性類型比較分析

兩組之間的甲基化多態(tài)性主要差異類型是a2(++、-+)、a3(++、--)、a4(++、-+、--)，矮化組a2(++、-+)、a4(++、-+、--)類型較正常組高，a3(++、--)類型較正常組低，可以推出矮化組同一位點(diǎn)的非甲基化位點(diǎn)在某些個體中發(fā)生單鏈外側(cè)甲基化的概率高于正常組，發(fā)生內(nèi)外側(cè)同時甲基化或外側(cè)雙鏈甲基化概率較正常組低。

表1接頭及引物序列

表2

表3馬哈利基因組甲基化類型統(tǒng)計

表4甲基化多態(tài)性類型統(tǒng)計

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種利用msap方法鑒別櫻桃矮化砧木的方法

<160>18

<210>1

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+aacgactgcgtaccaattcaac

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+aacgactgcgtaccaattcaac

h/m+tgaatgagtctcgatcggtga

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+aacgactgcgtaccaattcaac

h/m+ttcatgagtctcgatcggttc

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+aaggactgcgtaccaattcaag

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>5

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+aaggactgcgtaccaattcaag

h/m+tgaatgagtctcgatcggtga

<210>6

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+atcgactgcgtaccaattcatc

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>7

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+atcgactgcgtaccaattcatc

h/m+tgaatgagtctcgatcggtga

<210>8

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+atcgactgcgtaccaattcatc

h/m+atcatgagtctcgatcggatc

<210>9

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+atcgactgcgtaccaattcatc

h/m+ttcatgagtctcgatcggttc

<210>10

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+agagactgcgtaccaattcaga

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>11

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+agagactgcgtaccaattcaga

h/m+tgaatgagtctcgatcggtga

<210>12

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+agagactgcgtaccaattcaga

h/m+atcatgagtctcgatcggatc

<210>13

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+agagactgcgtaccaattcaga

h/m+tgcatgagtctcgatcggtgc

<210>14

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+agggactgcgtaccaattcagg

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>15

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

e+atggactgcgtaccaattcatg

h/m+tcaatgagtctcgatcggtca

<210>16

<211>62

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'-ctcgtagactgcgtacc-3'5'-gacgatgagtctcgat-3'

5'-aattggtacgcagtc-3'5'-cgatcgagactcat-3'

<210>17

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'-gactgcgtaccaattca-3'

5'-atgagtctcgatcgg-3'

<210>18

<211>316

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

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