本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域中用于真菌基因敲除及互補(bǔ)的分子工具及實驗體系，尤其涉及一種真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法。

背景技術(shù)：

基因失活技術(shù)是通過改變生物的遺傳基因，令特定的基因序列發(fā)生改變，導(dǎo)致基因失活并喪失功能，進(jìn)而推測出該基因生物學(xué)功能的一種遺傳工程技術(shù)。基因互補(bǔ)是在基因缺失突變體中人工導(dǎo)入所缺失的基因從而實現(xiàn)恢復(fù)該基因功能的技術(shù)。基因失活和基因互補(bǔ)廣泛應(yīng)用于基因功能的研究。

根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，在自然條件下，它能夠在植物的受傷部位侵染植物細(xì)胞，將其染色體外遺傳物質(zhì)ti質(zhì)粒段dna(t-dna)大多以單拷貝形式隨機(jī)整合進(jìn)植物的基因組中。許多研究表明根癌農(nóng)桿菌不僅可以轉(zhuǎn)化植物而且可以轉(zhuǎn)化細(xì)菌、動物和真菌。因此，通過這一原理，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將外源dna片段轉(zhuǎn)化至靶細(xì)胞中已成為研究植物、真菌甚至動物功能基因的一種常用反向遺傳學(xué)技術(shù)。

crispr/cas是一種基因定點編輯技術(shù)，在該系統(tǒng)中通過形成具有引導(dǎo)作用的sgrna(singleguiderna)引導(dǎo)核酸酶cas9蛋白在靶位點切割雙鏈dna，再通過非同源末端連接進(jìn)行dna雙鏈斷裂修復(fù)，在此修復(fù)過程中可進(jìn)行序列編輯或小片段缺失而造成基因序列的改變從而起到對基因的編輯或敲除。

迄今為止，在許多病原真菌中尚無法通過轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法進(jìn)行有效的遺傳操作，只能依賴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源dna片段，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源dna片段轉(zhuǎn)化具有隨機(jī)性，無法對特定位點進(jìn)行精確插入。且在基因敲除后的基因互補(bǔ)驗證中，有的物種由于缺乏相應(yīng)的基因互補(bǔ)技術(shù)而無法進(jìn)行基因互補(bǔ)驗證；目前在病原真菌中均采取隨機(jī)插入互補(bǔ)基因片段的方法進(jìn)行基因互補(bǔ)，若基因互補(bǔ)時互補(bǔ)片段隨機(jī)插入在另一功能基因的dna編碼區(qū)時則會影響其他基因功能而無法達(dá)到準(zhǔn)確恢復(fù)所敲除的基因功能來研究基因功能的目的。因此，有必要開發(fā)一套高效的定點插入基因互補(bǔ)技術(shù)，為研究病原真菌的基因功能及其致病機(jī)制提供便利。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法，以實現(xiàn)互補(bǔ)基因dna片段在設(shè)定的基因組位點的準(zhǔn)確插入，使目標(biāo)基因功能恢復(fù)，從而為研究病原真菌功能基因組學(xué)提供重要工具。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法，是將靶標(biāo)位點經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不變的互補(bǔ)基因片段和u6啟動子驅(qū)動攜帶抗性基因特異識別序列的sgrna表達(dá)盒與根癌農(nóng)桿菌t-質(zhì)粒整合，構(gòu)建以諾爾絲菌素為抗性篩選標(biāo)記的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病原真菌基因定點互補(bǔ)載體；用該互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化病原真菌基因插入失活突變體的孢子，依賴突變體內(nèi)所攜帶的cas9對靶標(biāo)位點進(jìn)行切割，從而實現(xiàn)將互補(bǔ)基因片段準(zhǔn)確插入突變體的抗性基因靶標(biāo)位點。

上述真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法，互補(bǔ)基因片段經(jīng)in-fusion技術(shù)重組至帶有攜帶抗性基因特異識別序列的sgrna表達(dá)盒及gapd基因啟動子驅(qū)動的諾爾絲菌素抗性基因的雙元載體中，再由攜帶該雙元載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化攜帶cas9基因的插入失活突變體的孢子，從而達(dá)到對真菌基因組的定點互補(bǔ)。

突變體所攜帶的抗性基因為潮霉素抗性基因，以及所有來源于敲除突變體所攜帶的作為選擇標(biāo)記的抗性基因。

病原真菌為甘蔗鞭黑穗菌。

互補(bǔ)基因片段為mfa2、prf或g827基因，以及其他所有基因敲除突變株的互補(bǔ)基因。

病原真菌基因插入失活突變體的孢子按以下方法制備：使用甘蔗鞭黑穗菌內(nèi)源snrna啟動子驅(qū)動sgrna表達(dá)盒，將crispr-cas9系統(tǒng)與根癌農(nóng)桿菌t-質(zhì)粒整合，構(gòu)建以潮霉素為抗性篩選標(biāo)記的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鞭黑穗菌基因定點插入載體失活系統(tǒng)；將目標(biāo)基因的特異識別序列克隆入sgrna表達(dá)盒，用于轉(zhuǎn)化甘蔗鞭黑穗菌擔(dān)孢子，從而將載體系統(tǒng)的可跳動dna片段準(zhǔn)確插入甘蔗鞭黑穗菌目標(biāo)基因靶標(biāo)序列；目標(biāo)基因為甘蔗鞭黑穗菌jg35野生型菌株的mfa2、prf或g827基因。

病原真菌基因插入失活突變體的孢子按以下方法制備：通過將甘蔗鞭黑穗菌內(nèi)源u6基因啟動子(sspu6，seq.id.no.17的堿基序列；ssu6rna，seq.id.no.18的堿基序列)與所插入位點靶標(biāo)序列以及sgrna序列經(jīng)overlappingpcr融合后，經(jīng)in-fusion技術(shù)重組至帶有由甘蔗鞭黑穗菌內(nèi)源gapd基因啟動子驅(qū)動的cas9基因及潮霉素抗性基因的雙元載體中；再由攜帶該雙元載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗鞭黑穗菌從而達(dá)到對甘蔗鞭黑穗菌基因組的定點插入；甘蔗鞭黑穗菌u6基因啟動子具有序列表seq.id.no.17的堿基序列。

發(fā)明人研究了crispr-cas9介導(dǎo)的基因插入失活及基因互補(bǔ)技術(shù)，計劃依靠靶向序列引導(dǎo)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)，在病原真菌基因組中定點插入外源片段高效地進(jìn)行基因敲除，構(gòu)建目標(biāo)基因的敲除突變株；并在所獲得的敲除突變株中，計劃依靠靶向序列引導(dǎo)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)定點互補(bǔ)所敲除基因在靶標(biāo)位點處經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不變的dna片段，構(gòu)建目標(biāo)基因的互補(bǔ)突變株。

為此，發(fā)明人建立了一套基因定點插入突變方法和基因定點互補(bǔ)方法，其中，基因定點插入突變方法為根癌農(nóng)桿菌和crispr-cas9介導(dǎo)的基因定點插入突變方法，該法使用u6基因啟動子驅(qū)動sgrna表達(dá)盒，將crispr-cas9系統(tǒng)與根癌農(nóng)桿菌t-質(zhì)粒整合，構(gòu)建以潮霉素為抗性篩選標(biāo)記的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病原真菌基因定點插入突變載體系統(tǒng)；將目標(biāo)基因的特異識別序列克隆入sgrna表達(dá)盒，將該表達(dá)盒連接至基因定點插入突變載體后，將該載體轉(zhuǎn)化真菌孢子，從而將載體系統(tǒng)的可跳動dna片段準(zhǔn)確插入目標(biāo)基因靶標(biāo)位點，達(dá)到破壞基因功能使目標(biāo)基因突變失活的目的?；蚨c互補(bǔ)方法為真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法，在對目標(biāo)基因進(jìn)行插入突變失活的過程中，cas9基因和潮霉素抗性基因隨t-dna一同插入到目標(biāo)基因中，因此在對目標(biāo)基因進(jìn)行互補(bǔ)時，可使用攜帶潮霉素抗性基因特異識別序列的sgrna表達(dá)盒與根癌農(nóng)桿菌t-質(zhì)粒整合構(gòu)建以諾爾絲菌素為抗性篩選標(biāo)記的基因互補(bǔ)載體系統(tǒng)；將在靶標(biāo)位點處經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不變目標(biāo)互補(bǔ)片段導(dǎo)入該定點互補(bǔ)載體中，用于轉(zhuǎn)化已攜帶cas9基因的敲除突變體的孢子，cas9基因在新導(dǎo)入的攜帶潮霉素抗性基因特異識別序列的sgrna的引導(dǎo)下對潮霉素抗性基因靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，從而將互補(bǔ)dna片段精確插入潮霉素抗性基因中實現(xiàn)基因定點互補(bǔ)的目的。通過將不同的靶標(biāo)序列克隆至sgrna表達(dá)盒即可將互補(bǔ)dna序列定點互補(bǔ)至特定位點中。

通過在甘蔗鞭黑穗菌基因組中進(jìn)行實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了具有功能的甘蔗鞭黑穗菌u6基因啟動子，其可在甘蔗鞭黑穗菌中轉(zhuǎn)錄出載體上位于u6啟動子下游sgrna序列，用于在上述基因定點插入失活方法中執(zhí)行基本的轉(zhuǎn)錄功能。

通過在甘蔗鞭黑穗菌jg35野生型菌株中分別對mfa2(mfa2cds，seq.id.no.21；mfa2，seq.id.no.22)、prf和g827等3個基因進(jìn)行基因失活，分別構(gòu)建三個基因的敲除突變株。在敲除mfa2基因時，對隨機(jī)挑選的具有潮霉素抗性的46個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr鑒定，其中發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子為18個，外源片段定點插入率為39％，即靶基因失活率為39％。在敲除prf基因時，對隨機(jī)挑選的具有潮霉素抗性的23個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr鑒定，其中發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子為5個，外源片段定點插入率為21.7％，即靶基因失活率為21.7％。在敲除g827基因時，對隨機(jī)挑選的具有潮霉素抗性的23個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr鑒定，其中發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子為3個，外源片段定點插入率為13％，即靶基因失活率為13％。實驗表明，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點插入技術(shù)可在病原真菌中對目標(biāo)基因進(jìn)行定點插入而達(dá)到基因失活的目的，進(jìn)而對基因功能進(jìn)行研究；而且基因失活效率顯著高于目前常用的同源雙交換基因打靶的效率。由農(nóng)桿菌t-dna/crispr/cas9組合介導(dǎo)的定點插入的這一現(xiàn)象在其他物種中尚無報道。上述高效基因失活系統(tǒng)的建立，為研究病原真菌的功能基因組學(xué)提供了重要工具，該系統(tǒng)具有高效性和準(zhǔn)確性，方便在病原真菌中進(jìn)行基因功能的研究。

以甘蔗鞭黑穗菌編碼信息素基因mfa2為例，發(fā)明人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點插入技術(shù)在mfa2基因中定點插入整合有crispr-cas9的t-dna序列，破壞了mfa2基因，從而導(dǎo)致該基因功能的缺失(圖4)。甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因編碼信息素，信息素在單倍體菌株配合過程中具有重要的作用。正負(fù)交配型的野生型甘蔗鞭黑穗菌jg35和jg36未配合是呈酵母狀(圖6b)，兩者可以通過配合在平板上形成白色絨毛狀菌落(圖6c)，而被外源片段插入后的mfa2基因功能喪失從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子無法與野生型jg36菌株配對形成白色絨毛狀菌落(圖6a)。發(fā)明人通過設(shè)計引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定(圖5)，可明確外源片段插入的方向(圖7)，由于甘蔗鞭黑穗菌無法通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入外源基因片段，且傳統(tǒng)的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化均是隨機(jī)插入。因此，發(fā)明人通過整合農(nóng)桿菌t-dna/crispr/cas9能夠?qū)崿F(xiàn)在病原真菌中定點插入外源dna片段使目標(biāo)基因失活，為研究病原真菌功能基因組學(xué)提供了重要工具。

以上述研究成果為基礎(chǔ)，發(fā)明人通過在甘蔗鞭黑穗菌δmfa2突變株中對mfa2基因進(jìn)行基因互補(bǔ)，構(gòu)建δmfa2的基因互補(bǔ)株，建立了一種基因定點互補(bǔ)方法。以甘蔗鞭黑穗菌編碼信息素基因mfa2為例，本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點互補(bǔ)技術(shù)在hph基因中定點插入整合有在靶標(biāo)位點處經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不改變的mfa2基因序列及其內(nèi)源啟動子的t-dna序列，破壞了hph基因的同時插入mfa2及其內(nèi)源啟動子，從而導(dǎo)致hph基因功能的缺失和mfa2基因的功能修復(fù)(圖10)。在互補(bǔ)mfa2基因及其內(nèi)源啟動子時，對隨機(jī)挑選的具有諾爾絲菌素抗性的190個回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行潮霉素及pcr鑒定，其中hph基因被互補(bǔ)片段定點插入失活的轉(zhuǎn)化子為160個，即靶基因失活率為84.2％。在這190個具有諾爾絲菌素抗性的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中，170個轉(zhuǎn)化子能恢復(fù)mating功能，互補(bǔ)效率為89.5％，其中外源片段定點插入至潮霉素靶標(biāo)位點且恢復(fù)mating功能的互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子為148個，定點互補(bǔ)率為77.9％。在δmfa2菌株中由于mfa2基因序列回補(bǔ)后mfa2基因功能得到修復(fù)從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子恢復(fù)與野生型jg36菌株配對形成白色絨毛狀菌落(圖13)。本發(fā)明通過潮霉素和諾爾絲菌素對互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗性篩選，并通過設(shè)計引物對互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定(圖10)，可明確回補(bǔ)片段插入的方向，而傳統(tǒng)的基因互補(bǔ)是通過互補(bǔ)片段隨機(jī)插入實現(xiàn)，但在隨機(jī)插入的同時具有破壞基因?qū)е缕渌蚴Щ畹目赡?。因此，本發(fā)明通過整合農(nóng)桿菌t-dna和目標(biāo)互補(bǔ)dna片段能夠?qū)崿F(xiàn)在攜帶cas9基因的基因插入失活突變體中定點互補(bǔ)dna片段，使目標(biāo)基因功能恢復(fù)，為研究病原真菌功能基因組學(xué)提供了重要工具。

附圖說明

圖1是pls-hcas9質(zhì)粒圖譜。

圖2是psgrna-ssu6質(zhì)粒圖譜。

圖3是psgrna-ssu6質(zhì)粒和pls-hcas-mfa2質(zhì)粒的電泳圖，圖中：a)psgrna-ssu6質(zhì)粒構(gòu)建，m：generuler1kbplus；1：線性psgrnavector；2：sspu6；3：psgrna-ssu6；b)pls-hcas-mfa2質(zhì)粒構(gòu)建，m：generuler1kbplus；1：線性pls-hcas9vector；2：sspu6-mfa2-sgrna；3：pls-hcas9-mfa2。

圖4是pls-hcas9-mfa2定點插入甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因的示意圖。

圖5是定點插入的pcr鑒定方法示意圖。

圖6是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點插入失活甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因結(jié)果圖。

圖7是轉(zhuǎn)化子的pcr驗證圖，圖中：a)以轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，m：generuler1kbplus；1-17：轉(zhuǎn)化子；b)以轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，m：generuler1kbplus；1-17：轉(zhuǎn)化子。

圖8是δmfa2、δprf及δg827轉(zhuǎn)化子pcr測序比對圖。

圖9是pngr-com質(zhì)粒圖譜。

圖10是pngr-com-mfa2定點互補(bǔ)目標(biāo)片段及pcr鑒定的示意圖。

圖11是互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的pcr驗證圖，圖中：a)分別以δmfa2和轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，以引物hphf和hph1-r擴(kuò)增，m：generuler1kbplus；b)分別以δmfa2和轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，以引物cmfa2f和cmfa2r擴(kuò)增，m：generuler1kbplus；c)分別以δmfa2和轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，以引物對gpdf/cmfa2r和natr01/hph1-r擴(kuò)增，m：generuler1kbplus；。d)分別以δmfa2和轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，以引物對gpdf/natr01和cmfa2r/hph1-r擴(kuò)增，m：generuler1kbplus。

圖12是互補(bǔ)mfa2轉(zhuǎn)化子pcr測序比對圖。

圖13是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點互補(bǔ)mfa2基因結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法，是將在靶標(biāo)位點處經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不變的互補(bǔ)基因片段和u6啟動子驅(qū)動攜帶抗性基因特異識別序列的sgrna表達(dá)盒與根癌農(nóng)桿菌t-質(zhì)粒整合，構(gòu)建以諾爾絲菌素為抗性篩選標(biāo)記的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病原真菌基因定點互補(bǔ)載體；用該互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化病原真菌基因插入失活突變體的孢子，依賴基因插入失活突變體內(nèi)所攜帶的cas9對靶標(biāo)位點進(jìn)行切割，從而實現(xiàn)將互補(bǔ)基因片段準(zhǔn)確插入突變體的抗性基因靶標(biāo)序列。其中，將在靶標(biāo)位點處經(jīng)過堿基更改但氨基酸序列不變的互補(bǔ)基因片段經(jīng)in-fusion技術(shù)重組至帶有攜帶抗性基因特異識別序列的sgrna表達(dá)盒及gapd基因啟動子驅(qū)動的諾爾絲菌素抗性基因的雙元載體中，再由攜帶該雙元載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化攜帶cas9基因的插入失活突變體的孢子，從而達(dá)到對真菌基因組的定點互補(bǔ)。

為進(jìn)一步闡明上述發(fā)明構(gòu)思，以甘蔗鞭黑穗菌信息素基因mfa2為例進(jìn)行說明。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；所用實驗材料和試劑，如無特別說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。實施例中的甘蔗鞭黑穗菌野生型菌株和農(nóng)桿菌菌株agl1從廣西大學(xué)獲得。

一、具體試驗操作步驟

1.u6啟動子驅(qū)動的攜帶目標(biāo)基因靶標(biāo)的sgrna的獲得

以psgrna-ssu6(seq.id.no.19)質(zhì)粒為模板，在一個反應(yīng)中使用4種引物：u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’，seq.id.no.1)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’，seq.id.no.2)各0.2μm，ssu6tmfa2-(5’-ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg-3’，seq.id.no.3)和grtmfa2+(5’-actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat-3’，seq.id.no.4)各0.1μm。30個循環(huán)：94℃10s，58℃15s，68℃20s。

2.將上步pcr產(chǎn)物稀釋10倍后取2微升為模板，使用引物對：u-fsbamhiin(5’-ctatgttactagaggatcccggaatgatctacaaagcgttcttc-3’，seq.id.no.5)和gr-rhindiiiin(5’-taaccatggtaccaagcttattccatccactccaagctcttg-3’，seq.id.no.6)，用高保真dna聚合酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2min，98℃變性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。電泳檢測：取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1μl的6×loadingbuffer混勻，點樣于0.8％的瓊脂糖凝膠(含0.05μl/mlgoldview)上樣孔中，用0.5×tbe緩沖液在3-5v/em電壓條件下電泳30min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析。pcr反應(yīng)液組成(50μl體系)如下：

3.采用膠回收試劑盒對第2步pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

4.采用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii酶切雙元載體pls-hcas9(seq.id.no.20)，采用片段純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。酶切反應(yīng)液組成(100μl體系)如下：

5.采用in-fusion方法對回收的sgrna表達(dá)盒片段與純化的線性雙元載體pls-hcas9進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

5×in-fusion1μl

回收sgrna表達(dá)盒片段3μl

純化的線性pls-hcas9載體1μl

50℃反應(yīng)30分鐘，立即置于冰上。

6.反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞：在超凈臺內(nèi)將第5步所得連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min后，于42℃熱擊45秒后立即置于冰上冷卻2分鐘。在超凈臺內(nèi)向ep管中加入1ml無菌soc液體培養(yǎng)基，將ep管置于37℃搖床，200rpm搖動1小時后，將菌體涂布到含壯觀霉素終濃度為100μg/ml的la平板中，置于37℃倒置培養(yǎng)過夜。

7.通過菌落pcr對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。采用引物對l1f(5’-gcatgacgttatttatgaggtggg-3’，seq.id.no.7)和l1r(5’-gttatctagctggcgaaagggg-3’，seq.id.no.8)，以轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增后，取1μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增出716bp大小的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測后將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序確保無堿基突變。pcr反應(yīng)液組成(20μl體系)：

8.提取序列完全正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒dna。

9.農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備：配制10％(w/v)的甘油，常規(guī)滅菌后置于4℃冰箱保存待用。在含利福平50μg/ml的lb培養(yǎng)基平板上劃線活化根癌農(nóng)桿菌菌株agl1，置于28℃培養(yǎng)，2天后長出單菌落，用無菌接種環(huán)將單菌落接種至含有5mllb液體培養(yǎng)基(利福平終濃度為50μg/ml)的50ml離心管中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2天。按1％的比例轉(zhuǎn)接至無菌三角瓶中，置于28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)4-6h至od6000.4-0.5左右，冰上冷卻10min使細(xì)胞停止生長后，于4℃、4000rpm離心收集菌體，用預(yù)冷的10％甘油輕輕地重新懸浮菌體，冰上放置5min后，4℃、4000rpm再次離心，棄上清，重復(fù)甘油懸浮、離心一次，最后用1-2ml預(yù)冷的10％甘油輕輕地重新懸浮菌體沉淀，分裝至無菌1.5mlep管中，每管50μl，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.電脈沖法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌：將上述甘油法制得的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化后，加入1-2μl質(zhì)粒dna，將加好dna的農(nóng)桿菌用微量移液器的吸頭輕混勻后加入到無菌脈沖杯中，將脈沖杯置于電脈沖儀上，電脈沖儀設(shè)定為2.5kv，電擊5ms后迅速將1ml的soc培養(yǎng)基加入脈沖杯中，混勻，轉(zhuǎn)入2ml的無菌離心管中，置于28℃、200rpm搖床培養(yǎng)1小時后，涂布到含有75μg/ml壯觀霉素和50μg/ml利福平的lb選擇性培養(yǎng)基平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2天。

11.陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選：采用引物對l1f(5’-gcatgacgttatttatgaggtggg-3’)和l1r(5’-gttatctagctggcgaaagggg-3’)，以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，取3μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增出716bp大小的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。pcr反應(yīng)液組成與第7步相同。

12.農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基(minimalmedia，mm)：2.05gk2hp04，1.45gkh2p04，0.5gnh4n03，0.01gcacl2，2gglucose，0.3g(nh4)s04，0.001gfes04，5mlz-buffer(每種成分各0.01％znso4·7h2o，cuso4·5h2o，h3bo3，mnso4·h2o和na2moo4·2h2o)，加雙蒸水定容至1000ml，ph6.7-7.0。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(inducemedia，im)：7.808gmes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)，1gglucose，1.45gkh2po4，0.5gnh4no3，0.01gcacl2，0.6gmgso4·7h2o，0.3gnacl，0.5g(nh4)so4，5mlz-buffer，調(diào)ph值到5.6，雙蒸水定容至1000ml。固體im培養(yǎng)基則加入2％的瓊脂。高溫滅菌后備用。

將活化后的攜帶雙元載體pls-hcas9-mfa2的根瘤農(nóng)桿菌agl1接種到含有75μg/ml壯觀霉素和50μg/ml利福平的mm培養(yǎng)基中，28℃、200rpm培養(yǎng)至od600為0.8-1.2。用im培養(yǎng)基將培養(yǎng)物稀釋至od600為0.15，加入200μm的as，于28℃、200rpm且避光的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至od600為0.5左右即可用于共培養(yǎng)。

13.甘蔗鞭黑粉菌的準(zhǔn)備

yeps培養(yǎng)基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，蔗糖20g，雙蒸水定容至1000ml，固體yeps培養(yǎng)基則加入2％的瓊脂，高溫滅菌后備用。將甘蔗鞭黑粉菌野生型單倍體菌株從-80℃冰箱中取出，在yeps平板上劃線活化，挑取菌體至yeps液體培養(yǎng)基中28℃、200rpm培養(yǎng)過夜，用yeps將培養(yǎng)物稀釋至od600為0.15后繼續(xù)培養(yǎng)10-12h至od600為1.0左右即可用于共培養(yǎng)。

14.根癌農(nóng)桿菌與甘蔗鞭黑粉菌的共培養(yǎng)

將于im誘導(dǎo)培養(yǎng)至od600為0.5的攜帶雙元載體pls-hcas9-mfa2的agl1菌液與等體積的od600為1.0的甘蔗鞭黑粉菌野生型單倍體菌株培養(yǎng)液混合，將混合好的菌液均勻涂布在預(yù)先鋪好混合纖維素微孔濾膜(孔徑為0.45μm)的im培養(yǎng)基平板(含有200μm的as)上，在28℃下避光共培養(yǎng)48-72h后，將濾膜轉(zhuǎn)移至含300μg/ml頭孢噻肟鈉和200μg/ml潮霉素的yeps選擇性平板上，于28℃倒置培養(yǎng)8-12天以獲得轉(zhuǎn)化子。

15.甘蔗鞭黑穗菌陽性轉(zhuǎn)化子的篩選：將濾膜上的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含300μg/ml頭孢噻肟鈉和200μg/ml潮霉素的yeps選擇性平板上，于28℃倒置培養(yǎng)1-2天后，挑取能正常生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr預(yù)處理。

16.向pcr管中加入20μlmithyprepfordna，用無菌槍頭挑取適量菌體加入裂解液中并混勻，95℃處理10分鐘后，12000rpm離心3分鐘。

17.取上步上清2μl作為pcr模板。分別用3對引物進(jìn)行擴(kuò)增：

1)mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’，seq.id.no.9)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’，seq.id.no.10)，

2)hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’，seq.id.no.11)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)，

3)hygr01和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)。

對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。篩選第一輪無法擴(kuò)增同時第二輪擴(kuò)增出大小約為1000bp的轉(zhuǎn)化子，或第一輪無法擴(kuò)增同時第3輪擴(kuò)增出大小約為100bp的轉(zhuǎn)化子。

pcr反應(yīng)液組成(20μl體系)：

18.將擴(kuò)增出的1000bp的片段進(jìn)行測序鑒定后則確定目標(biāo)基因敲除成功。

19.u6啟動子驅(qū)動的攜帶hph基因靶標(biāo)的sgrna的獲得：以psgrna-ssu6(seq.id.no.19)質(zhì)粒為模板，在一個反應(yīng)中使用4種引物：u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’，seq.id.no.1)和gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac-3’，seq.id.no.2)各0.2μm，ssu6thph-(5’-tccgagagctgcatcaggtcgagggtaaaatctgattgtatg-3’，seq.id.no.35)和grthph+(5’-acctgatgcagctctcggagttttagagctagaaatag-3’，seq.id.no.36)各0.1μm。用高保真dna聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增程序與第1步相同。

20.將上步pcr產(chǎn)物稀釋10倍后取2微升為模板，使用引物對：ngu-fsbamhiin(5’-cgactctagaggatcccttaagcggaatgatctacaaagcgttcttc-3’，seq.id.no.37)和nggr-rbamhiin(5’-aatcactaggggatccattccatccactccaagctcttg-3’，seq.id.no.38)，用高保真dna聚合酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序與pcr反應(yīng)液組成與第2步相同。

21.采用膠回收試劑盒對第20步pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

22.采用限制性內(nèi)切酶bamhi酶切雙元載體pngr，采用片段純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。酶切反應(yīng)液組成(100μl體系)如下：

23.采用in-fusion方法對回收的hph-sgrna表達(dá)盒片段與純化的線性雙元載體pngr進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

5×in-fusion1μl

回收hph-sgrna表達(dá)盒片段3μl

純化的線性pngr載體1μl

50℃反應(yīng)30分鐘，立即置于冰上。

24.反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞：具體實驗步驟與第6步相同。

25.通過菌落pcr對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。采用引物對n1f(5’-cacatacaaatggacgaacgg-3’，seq.id.no.39)和n1r(5’-ctagatctcgctgtttcttcggtc-3’，seq.id.no.40)，以轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增后，取1μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增出974bp大小的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測后將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序確保無堿基突變。pcr反應(yīng)液組成第7步相同

26.提取序列完全正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒dna即為真菌基因定點插入突變的近原位互補(bǔ)載體pngr-com(seq.id.no.33)。

27.互補(bǔ)片段的獲得：以甘蔗鞭黑穗菌野生型菌株jg35基因組為模板，分別以兩對引物cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’)和newmfa2r(5’-ttgcacacaggcagcaacagtttcgaagatgaacatggtgaattggtaaag-3’，seq.id.no.41)，newmfa2f(5’-gaaactgttgctgcctgtgtgcaagccattgtttctgttaacgagc-3’，seq.id.no.42)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’，seq.id.no.28)擴(kuò)增30個循環(huán)：94℃10s，58℃15s，68℃20s。對兩個目的片段進(jìn)行膠回收后，將兩個回收片段進(jìn)行融合pcr反應(yīng)，擴(kuò)增15個循環(huán)：94℃30s，58℃30s，68℃30s。所得產(chǎn)物中的mfa2基因cds中的13bp至36bp的序列由5’-gagactgttgctgcctccgtccag-3’更換為5’-gaaactgttgctgcctgtgtgcaa-3’，但氨基酸序列并未改變，防止被敲除mfa2基因時插入到基因組中的mfa2靶標(biāo)序列識別。

28.將上步pcr產(chǎn)物稀釋10倍后取2微升為模板，使用引物對：cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’，seq.id.no.23)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’，seq.id.no.24)，用高保真dna聚合酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2min，98℃變性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。電泳檢測與第2步相同。pcr反應(yīng)液組成與第7步相同。

29.采用膠回收試劑盒對第28步pcr產(chǎn)物即互補(bǔ)片段(seq.id.no.34)進(jìn)行膠回收純化。

30.采用限制性內(nèi)切酶psti酶切雙元載體pngr-com，采用片段純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。酶切反應(yīng)液組成(100μl體系)如下：

31.采用in-fusion方法將互補(bǔ)片段與純化的線性雙元載體pngr-com進(jìn)行連接，構(gòu)建pngr-com-mfa2反應(yīng)體系如下：

5×in-fusion1μl

回收互補(bǔ)片段1μl

純化pngr-com載體3μl

50℃反應(yīng)30分鐘，立即置于冰上。

32.反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞：具體實驗步驟與第6步相同。

33.通過菌落pcr對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。采用引物對cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’)，以轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，取1μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增出944bp大小的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測后將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序確保無堿基突變。pcr反應(yīng)液組成與第7步相同。

34.提取序列完全正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒dna。

35.電脈沖法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌：具體實驗步驟與第10步相同。

36.陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選：采用引物對cmfa2pstifin(5’-ctaagcttgcatgcctgcaggctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2pstirin(5’-cctctagagtcgacctgcagttaggccacggtgcagtagactgc-3’)，以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，取3μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增出944bp大小的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。pcr反應(yīng)液組成pcr反應(yīng)液組成與第11步相同。

37.農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將活化后的攜帶雙元載體pngrs-com-mfa2的根瘤農(nóng)桿菌agl1接種到含有75μl/ml壯觀霉素和50μg/ml利福平的mm培養(yǎng)基中，28℃、200rpm培養(yǎng)至od600為0.8-1.2。用im培養(yǎng)基將培養(yǎng)物稀釋至od600為0.15，加入200μm的as，于28℃、200rpm且避光的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至od600為0.5左右即可用于共培養(yǎng)。

38.甘蔗鞭黑粉菌δmfa2的準(zhǔn)備：將由根癌農(nóng)桿菌和crispr-cas9介導(dǎo)的基因定點插入失活方法獲得的甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因插入突變株甘蔗鞭黑粉菌菌株δmfa2從-80℃冰箱中取出，在yeps平板上劃線活化，挑取菌體至yeps液體培養(yǎng)基中28℃、200rpm培養(yǎng)過夜，用yeps將培養(yǎng)物稀釋至od600為0.15后繼續(xù)培養(yǎng)10-12h至od600為1.0左右即可用于共培養(yǎng)。

39.根癌農(nóng)桿菌與甘蔗鞭黑粉菌的共培養(yǎng)：將于im誘導(dǎo)培養(yǎng)至od600為0.5的攜帶雙元載體pngrs-com-mfa2的agl1菌液與等體積的od600為1.0的δmfa2擔(dān)孢子培養(yǎng)液混合，將混合好的菌液均勻涂布在預(yù)先鋪好混合纖維素微孔濾膜(孔徑為0.45μm)的im培養(yǎng)基平板(含有200μm的as)上，在28℃下避光共培養(yǎng)48-72h后，將濾膜轉(zhuǎn)移至含300μg/ml頭孢噻肟鈉和60μg/ml諾爾絲菌素的yeps選擇性平板上，于28℃倒置培養(yǎng)8-12天以獲得轉(zhuǎn)化子。

40.甘蔗鞭黑穗菌互補(bǔ)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選：將濾膜上的轉(zhuǎn)化子同時轉(zhuǎn)接至含300μg/ml頭孢噻肟鈉和60μg/ml諾爾絲菌素的yeps選擇性平板上以及轉(zhuǎn)接至含300μg/ml頭孢噻肟鈉和200μg/ml潮霉素的yeps選擇性平板上，于28℃倒置培養(yǎng)1-2天后，挑取在含諾爾絲菌素的yeps選擇性平板上能正常生長而不能在含潮霉素的yeps選擇性平板上正常生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr預(yù)處理。

41.向pcr管中加入20μlmithyprepfordna，用無菌槍頭挑取適量菌體加入裂解液中并混勻，95℃處理10分鐘后，12000rpm離心3分鐘。

42.取上步上清2μl作為pcr模板。pcr反應(yīng)液體系與第17步相同，分別用6對引物進(jìn)行擴(kuò)增，

1)hphf(5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcg-3’，seq.id.no.25)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’，seq.id.no.26)，

2)cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’，seq.id.no.27)和cmfa2r

(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’，seq.id.no.28)，

3)gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’，seq.id.no.29)和cmfa2r，

4)natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’，seq.id.no.30)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)，

5)gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)，

6)cmfa2rcmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)和hph1-r

(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)：

對pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。篩選第1對引物無法擴(kuò)增同時第2對引物擴(kuò)增出大小為924bp片段且第3、4對引物擴(kuò)增出大小為1686bp和1676bp片段的轉(zhuǎn)化子，或第1對引物無法擴(kuò)增同時第2對引物擴(kuò)增出大小為924bp片段且第5、6對引物擴(kuò)增出大小為1624bp和1738bp片段的轉(zhuǎn)化子。

二、試驗結(jié)果

如圖1至圖11。其中，

圖3a為psgrna-ssu6質(zhì)粒構(gòu)建，使用引物sspu6fin(5’-atcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgatgctc-3’，seq.id.no.12)和sspu6rin(5’-tcttcagaggtctctcgagggtaaaatctgattgtatgag-3’，seq.id.no.13)擴(kuò)增sspu6，使用引物psgrna-f(5’-agagacctctgaagataacatac，seq.id.no.14)和psgrna-r(5’-tcctttgctgccgattccacag-3’，seq.id.no.15)擴(kuò)增psgrnavector。

圖3b為pls-hcas-mfa2質(zhì)粒構(gòu)建，使用引物u-f(5’-ctccgttttacctgtggaatcg)、gr-r(5’-cggaggaaaattccatccac)、ssu6tmfa2-(5’-ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg)和grtmfa2+(5’-actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat)擴(kuò)增sspu6-mfa2-sgrna。

圖4顯示，pls-hcas9與基因mfa2(seq.id.no.21)靶標(biāo)序列的sgrna表達(dá)盒連接后構(gòu)建成pls-hcas9-mfa2雙元載體，該雙元載體轉(zhuǎn)化甘蔗鞭黑穗菌后，在菌株體內(nèi)表達(dá)cas9核酸酶，并由sgrna引導(dǎo)cas9核酸酶在與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的dna上切割雙鏈dna，雙元載體中的t-dna片段則插入該dna缺口，并通過非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)。最終導(dǎo)致t-dna片段插入mfa2基因中造成mfa2基因功能的缺失。

圖5顯示，雙元載體中的t-dna片段可以正向或反向兩種方式插入基因組中，均可以造成目標(biāo)基因失活。在轉(zhuǎn)化完成后需對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。通過裂解液處理轉(zhuǎn)化子后，離心取上清作為模板可直接進(jìn)行pcr驗證。未發(fā)生外源片段插入的轉(zhuǎn)化子和野生型菌株可由mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’，seq.id.no.31)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’，seq.id.no.32)為引物擴(kuò)增出1168bp大小片段，而發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子則無法擴(kuò)增；外源片段正向定點插入的轉(zhuǎn)化子可由引物hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)擴(kuò)增約1000bp大小片段，可由引物casr01(5’-ggataccgaccttccgcttcttc-3’，seq.id.no.16)和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)擴(kuò)增約1000bp大小片段，而未發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子和野生型菌株則無法擴(kuò)增；外源片段反向定點插入的轉(zhuǎn)化子可由引物hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)和mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)擴(kuò)增約1000bp大小片段，可由引物casr01(5’-ggataccgaccttccgcttcttc-3’)和mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)擴(kuò)增約1000bp大小片段，而未發(fā)生外源片段定點插入的轉(zhuǎn)化子和野生型菌株則無法擴(kuò)增。

圖6為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點插入失活甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因結(jié)果圖，a)部分轉(zhuǎn)化子喪失與異性菌株g36配合的能力；b)野生型甘蔗鞭黑穗菌jg35菌株呈酵母狀；c)野生型甘蔗鞭黑穗菌菌株jg35與jg36在培養(yǎng)基上配合可形成白色絨毛狀菌落。由甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因編碼的信息素與甘蔗鞭黑穗菌的有性配合密切相關(guān)，破壞甘蔗鞭黑穗菌mfa2基因后，突變體δmfa2不能與野生型jg36菌株配合，不能形成白色絨毛狀菌落。

圖7轉(zhuǎn)化子的pcr驗證中，a)以轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，引物mfa2c1f(5’-tgcctgaattgctccgcttgtc-3’)和hygro1(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)擴(kuò)增，外源片段正向插入的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出約1kb大小的片段，野生型菌株jg35和外源片段反向插入的轉(zhuǎn)化子則無法擴(kuò)增出該條帶。b)以轉(zhuǎn)化子基因組dna為模板，引物mfa2c1r(5’-tggctctgtttctcacgagatcacg-3’)和hygr01(5’-tgtatggagcagcagacgcgctac-3’)擴(kuò)增，外源片段反向插入的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出約1kb大小的片段，野生型菌株jg35和外源片段正向插入的轉(zhuǎn)化子則無法擴(kuò)增出該條帶。

圖8顯示，經(jīng)pcr產(chǎn)物測序比對，a)在δmfa2轉(zhuǎn)化子中，t-dna片段插入到mfa2基因的特異靶標(biāo)位點。b)在δprf轉(zhuǎn)化子中，t-dna片段插入到prf基因的特異靶標(biāo)位點。c)在δg827轉(zhuǎn)化子中，t-dna片段插入到g827基因的特異靶標(biāo)位點。

圖10顯示，pngr-com與由堿基修改過的mfa2及其啟動子序列組成的互補(bǔ)片段連接后構(gòu)建成pngr-com-mfa2雙元載體，該雙元載體轉(zhuǎn)化由根癌農(nóng)桿菌和crispr-cas9介導(dǎo)的基因定點插入失活方法獲得的δmfa2后，在菌株體內(nèi)表達(dá)cas9核酸酶，并由sgrna引導(dǎo)cas9核酸酶在與潮霉素靶標(biāo)序列互補(bǔ)的dna上切割雙鏈dna，互補(bǔ)雙元載體中的攜帶有互補(bǔ)dna片段的t-dna則插入該dna缺口，并通過非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)。最終導(dǎo)致互補(bǔ)dna片段插入潮霉素抗性基因hph中造成hph基因功能的缺失以及mfa2基因的互補(bǔ)。

圖11顯示，互補(bǔ)雙元載體中的t-dna片段可以正向或反向兩種方式插入缺失突變體基因組中，均可以造成hph基因失活及mfa2基因的互補(bǔ)。在轉(zhuǎn)化完成后需對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。通過裂解液處理轉(zhuǎn)化子后，離心取上清作為模板可直接進(jìn)行pcr驗證。δmfa2菌株可由hphf(5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcg-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)為引物擴(kuò)增出817bp大小片段，而發(fā)生外源片段定點互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子則無法擴(kuò)增，表明如h基因被互補(bǔ)片段插入失活；發(fā)生外源片段互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子可由引物cmfa2f(5’-gctagcccattgggcacaccag-3’)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)擴(kuò)增出924bp大小片段，而δmfa2則無法擴(kuò)增，表明互補(bǔ)dna片段插入到缺失突變體基因組中；互補(bǔ)dna片段正向定點互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子可由引物gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)擴(kuò)增1686bp大小片段，可由引物natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)擴(kuò)增1676bp大小片段，而δmfa2則無法擴(kuò)增；互補(bǔ)dna片段反向定點插入的轉(zhuǎn)化子可由引物gpdf(5’-gattagatcttgctgat-3’)和natr01(5’-cggactcccggacgttcgtc-3’)擴(kuò)增1624bp大小片段，可由引物cmfa2r(5’-ttaggccacggtgcagtagactg-3’)和hph1-r(5’-ggtcaagaccaatgcggagc-3’)擴(kuò)增1738bp大小片段，而δmfa2則無法擴(kuò)增；

圖12顯示，經(jīng)pcr產(chǎn)物測序比對，互補(bǔ)dna片段插入到潮霉素抗性基因的特異靶標(biāo)位點。

圖13為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的crispr-cas9定點互補(bǔ)mfa2基因結(jié)果圖，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子恢復(fù)與異性菌株jg36配合的能力，在培養(yǎng)基上配合可形成白色絨毛狀菌落。

sequencelisting

<110>廣西大學(xué)

<120>真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法

<130>真菌基因定點插入突變的近原位回補(bǔ)方法

<160>42

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctccgttttacctgtggaatcg22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cggaggaaaattccatccac20

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggacggaggcagcaacagtcgagggtaaaatctgattgtatg42

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

actgttgctgcctccgtccgttttagagctagaaat36

<210>5

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctatgttactagaggatcccggaatgatctacaaagcgttcttc44

<210>6

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

taaccatggtaccaagcttattccatccactccaagctcttg42

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gcatgacgttatttatgaggtggg24

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gttatctagctggcgaaagggg22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgcctgaattgctccgcttgtc22

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tggctctgtttctcacgagatcacg25

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tgtatggagcagcagacgcgctac24

<210>12

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

atcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgatgctc37

<210>13

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tcttcagaggtctctcgagggtaaaatctgattgtatgag40

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

agagacctctgaagataacatac23

<210>15

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tcctttgctgccgattccacag22

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ggataccgaccttccgcttcttc23

<210>17

<211>305

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cggaatgatctacaaagcgttcttctgcaccgaagtgaggcacttgtttgtggcactgaa60

acaggctgaacagcttacagcttcacaggtcaggtctggaaccggagatttttttggcgc120

gcgtctgtgttaggttgttatacctctcttcaaaaggatggaaaaagatgttgtgccggc180

gaatggccaggttattcacgattagcaagcttggcgaatcggaggccaattttcctcagc240

acccttctaagtcgtacaaggttttagacgcatacgtctactcatacaatcagattttac300

cctcg305

<210>18

<211>130

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gtcggccccgaaaggggcttgacatatgatctaacaaataaacgatacagagaagattag60

cattgtcctcagaatatggatggcaccgttgatcagaagagctgctctctccggagagca120

aatatgtttt130

<210>19

<211>3849

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

ggatccagcgtgggtctcggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc60

gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttcaagagcttggagtggat120

ggaattttcctccgttttacctgtggaatcggcagcaaaggatacgatcgtcccgacgat180

gctcgagaacgggcgcggaggcgggggtattgggtgttgatgaaagttgtggatggtggt240

tgacaagaaacgtgtggagcggcatgaagcgctgctcgaaggatctaaagtgcttgacgg300

cggatgacctgtgaagaggacgaggcaaagggggaaggagcggggaaggcactgtaccgg360

tttgggaggaacgcttgttgttcttgttccggtagccgagggtgatcttagcggagagcc420

aagttagctgtgctgcgctgcttgcaaggccgggcggttccagagacacaatgaattggc480

agtgcggagaagccgatctagctctttgttgttgctagttcagggcggtcggctttgccg540

tgttagcgagagcgttgtcgtcgtgaaaaaaggcggggtcaactcgcttggtgctgtgct600

gtacagtacagtagagtcgggtcagccttgccgcgtgttggtctttgtgaggaagagaga660

aggaatgcgcgcgcggctgaacgtgaaaacggcctaaccggttccaagcaaatttcattt720

ttctactccgcgcaactcctcaccgggcttcgttggttccggaggccgttgccagttgtc780

ccaaggcagctttgagatggccgacatccttcagatgcatcgtgctagaaacttctcagt840

aacaaggcgatcgtgtaatgctgccggaatgatctacaaagcgttcttctgcaccgaagt900

gaggcacttgtttgtggcactgaaacaggctgaacagcttacagcttcacaggtcaggtc960

tggaaccggagatttttttggcgcgcgtctgtgttaggttgttatacctctcttcaaaag1020

gatggaaaaagatgttgtgccggcgaatggccaggttattcacgattagcaagcttggcg1080

aatcggaggccaattttcctcagcacccttctaagtcgtacaaggttttagacgcatacg1140

tctactcatacaatcagattttaccctcgagagacctctgaagataacatactaagcttg1200

gcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaat1260

cgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgat1320

cgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctc1380

cttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctct1440

gatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgg1500

gcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatg1560

tgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgc1620

ctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcactttt1680

cggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtat1740

ccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatg1800

agtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtt1860

tttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacga1920

gtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaa1980

gaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgt2040

attgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggtt2100

gagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgc2160

agtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcgga2220

ggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgat2280

cgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcct2340

gtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcc2400

cggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcg2460

gcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgc2520

ggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacg2580

acggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctca2640

ctgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgattta2700

aaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacc2760

aaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa2820

ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaacca2880

ccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggta2940

actggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggc3000

caccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttacca3060

gtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagtta3120

ccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggag3180

cgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgctt3240

cccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgc3300

acgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac3360

ctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaac3420

gccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttc3480

tttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgat3540

accgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagag3600

cgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcac3660

gacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctc3720

actcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaatt3780

gtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctc3840

ggtacccgg3849

<210>20

<211>13925

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ctagtgattagatcttgctgataggcaggtttgcttggagaatggggggaaaagactgac60

cgaagaaacagcgagatctagaagtgataagcggaaagaatctgacttgctgtgatcagc120

agccaatttttttttcgttttttttttttcactccacatcgtcgtgcgtgcacggtctgc180

atgtgtaaattgtattcatcgaaagccacagttgaatacatcagcccgatgtggatttcg240

aaaaccaattaatcttggaattcacgcgctcagatcagtccatagagtcgacttcggctg300

tttccaagagcttcttctctgcgaggtggttgcccgtgtttctcgctgggaaaaaaggat360

cgattattattcgcttctacctcgctcgcacccttggcctgctgaaggaaacagcgccga420

gactcggtcacggttgctgggctccgtgttgatgctgggacggcgcaaagtggggcccgc480

gcactcttcgagccaaggacctcactcttcaagaacaagcgctgtcgccatcgtcttctt540

ctttctgctccaccatcgaatctttctttctcgtttcgaaaccaaaacactcttccaatg600

gactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatgac660

gataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgac720

aagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcacc780

gacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagc840

atcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacc900

cggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctg960

caagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaa1020

gagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatc1080

gtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactg1140

gtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatc1200

aagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggac1260

aagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaac1320

gccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctg1380

gaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgatt1440

gccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgcc1500

aaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatc1560

ggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctg1620

agcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatc1680

aagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcag1740

ctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctac1800

attgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaag1860

atggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcag1920

cggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccatt1980

ctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaag2040

atcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattc2100

gcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtg2160

gacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctg2220

cccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataac2280

gagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggc2340

gagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaag2400

cagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggc2460

gtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaag2520

gacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgacc2580

ctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctg2640

ttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctg2700

agccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttc2760

ctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctg2820

acctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgag2880

cacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaag2940

gtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaa3000

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tggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaag3420

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