一種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素b1含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素B1含量的方法，屬于飼料技術(shù)領(lǐng)域。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌毒素是霉菌在飼料、飼料原料等上生長的過程中所產(chǎn)生的有毒的次級代謝產(chǎn) 物，包括霉菌使飼料的成分轉(zhuǎn)變而形成的有毒物質(zhì)。霉菌毒素能夠干擾許多靶器官和系統(tǒng)， 尤其是肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，引發(fā)人類和動物疾病。研究表明當(dāng) 植物受到霉菌毒素的侵害時，會進(jìn)行自我保護(hù)，將非極性的毒素與糖、氨基酸或硫酸鹽等結(jié) 合，轉(zhuǎn)化為極性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，儲存在液泡中或結(jié)合在器官、組織、細(xì)胞器等的生物大分 子上，從而產(chǎn)生霉菌毒素的結(jié)合態(tài)。常規(guī)的霉菌毒素檢測方法只能檢測到游離態(tài)的霉菌毒 素，不能檢測結(jié)合態(tài)的霉菌毒素，因而這部分結(jié)合態(tài)的毒素也被稱為隱蔽性毒素?，F(xiàn)有的 研究表明，結(jié)合態(tài)的霉菌毒素經(jīng)動物消化后會被部分或全部釋放出來，危害畜禽的健康，因 此，建立一種將結(jié)合態(tài)霉菌毒素釋放，準(zhǔn)確地評定飼料及飼料原料中霉菌毒素含量的方法 具有重要的意義。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素B1含量的方法， 目的是提供一種通過體外酶消化與ELISA測定相結(jié)合的準(zhǔn)確測定玉米黃曲霉毒素B1含量 且適于生產(chǎn)應(yīng)用的方法，可以為養(yǎng)殖生產(chǎn)中飼料質(zhì)量的保障提供支持。
[0004] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：將粉碎后玉米樣品進(jìn)行體外消化，取消化后的消化液以 ELSIA方法進(jìn)行其中黃曲霉毒素B1含量的測定，從而確定玉米樣品中黃曲霉毒素B1的含 量。
[0005] -種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素B1含量的方法，包括以下步驟：
[0006] (1)將玉米樣品粉碎，過60目篩；
[0007] (2)準(zhǔn)確稱取步驟1)所述樣品1. 0g(精確到0· OOOlg)，加入濃度為1. Omg/mL的 胃蛋白酶水溶液10~15mL(pH = 2)，密封，35~40°C水浴恒溫振蕩（160~200r/min)消 化3h ;
[0008] (3)向步驟2)所述消化3h后的樣品中加入濃度為1. 0m〇l/L NaOH溶液0. lmL中 和；
[0009] (4)向步驟3)所述中和后的樣品中加入濃度為2. 5mg/mL胰酶水溶液10~15mL， 混合均勻后轉(zhuǎn)移到12000~14000D的透析袋中，封口；
[0010] (5)將步驟4)所述封口后的透析袋放入200ml磷酸鹽緩沖液（pH = 7. 6)中，35~ 40°C水浴恒溫振蕩（180~200r/min)消化4h ;
[0011] (6)取步驟5)所述消化4h后、透析袋外消化液，以ELISA方法檢測消化液中黃曲 霉毒素B1的含量，檢測操作按市售黃曲霉毒素B1檢測試劑盒說明書方法進(jìn)行。
[0012] 本發(fā)明的使用效果是：作為一種通過體外酶消化方法將玉米原料中結(jié)合態(tài)霉菌毒 素有效釋放，可綜合評定結(jié)合態(tài)和游離態(tài)霉菌毒素含量的方法，適用于生產(chǎn)中飼料原料和 飼料中黃曲霉毒素B1含量的準(zhǔn)確測定，能真實地反映飼料原料及飼料中黃曲霉毒素B1的 實際含量，可以有效保障飼料質(zhì)量。 (三）【具體實施方式】
[0013] 實施例1
[0014] (1)采集發(fā)霉玉米樣品1個，粉碎機(jī)粉碎，過60目篩；
[0015] (2)準(zhǔn)確稱取步驟（1)所述樣品1. 0362g，加入濃度為1. Omg/mL胃蛋白酶水溶液 10mL(pH = 2)，密封，37°C水浴恒溫振蕩（180r/min)消化3h ;
[0016] (3)向步驟⑵所述消化3h后的樣品中加入濃度為1. Omol/L NaOH溶液0. lmL中 和；
[0017] (4)向步驟⑶所述中和后的樣品中加入濃度為2. 5mg/mL胰酶水溶液10mL，混合 均勻后轉(zhuǎn)移到12000~14000D的透析袋中，封口；
[0018] (5)將步驟⑷所述封口后的透析袋放入200ml磷酸鹽緩沖液（pH = 7. 6)中，37 °C 水浴恒溫振蕩（180r/min)消化4h ;
[0019] (6)取步驟（5)所述消化4h后、透析袋外消化液，以ELISA方法檢測消化液中黃曲 霉毒素B1的含量（黃曲霉毒素B1檢測試劑盒購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司），檢測 操作按試劑盒說明書方法進(jìn)行；使用試劑盒測定消化液中的黃曲霉毒素B1的含量，根據(jù)消 化液中黃曲霉毒素B1的含量通過簡單的消化液體積的換算折算成每克玉米中的量，即可 得到每g玉米樣品中黃曲霉毒素B1的含量。
[0020] (7)檢測得到所采集發(fā)霉玉米樣品黃曲霉毒素B1的含量為875. 4ng/g。
[0021] 實施例2
[0022] (1)采集的6份不同來源的發(fā)霉玉米樣品，按照上述本發(fā)明的方法分別進(jìn)行玉米 樣品體外消化和黃曲霉毒素B1含量的測定，同時以黃曲霉毒素B1檢測試劑盒直接檢測對 應(yīng)的未經(jīng)體外消化玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量。檢測所用黃曲霉毒素B1檢測試劑盒均 購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司。
[0023] (2)試驗結(jié)果
[0024] 試驗結(jié)果表明，玉米樣品按本發(fā)明方法進(jìn)行體外消化后再經(jīng)ELISA方法檢測的黃 曲霉毒素B1含量較未經(jīng)體外消化、直接ELISA方法檢測的黃曲霉毒素B1含量顯著升高（表 1)，結(jié)果證明黃曲霉毒素B1在玉米內(nèi)存在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式，結(jié)合態(tài)霉菌毒素經(jīng)消 化后會被釋放出來，從而轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)的霉菌毒素。
[0025] 表1本發(fā)明方法與直接ELISA檢測方法測定玉米樣品黃曲霉毒素B1含量，ng/g
[0026]
【主權(quán)項】
1. 一種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素B1含量的方法，其特征在于利用體外消化的方法有 效釋放玉米中的結(jié)合態(tài)黃曲霉毒素B1，結(jié)合ELISA方法準(zhǔn)確評定黃曲霉毒素B1的含量；包 括以下步驟： (1)將玉米樣品粉碎，過60目篩； ⑵準(zhǔn)確稱取步驟1)所述樣品1. 〇g，加入濃度為1. 0mg/mL、pH= 2的胃蛋白酶水溶液 10~15mL，密封，35~40°C水浴、160~200r/min恒溫振蕩消化3h; (3)向步驟2)所述消化3h后的樣品中加入濃度為1.Omol/LNaOH溶液0.lmL中和； ⑷向步驟3)所述中和后的樣品中加入濃度為2. 5mg/mL胰酶水溶液10~15mL，混合 均勻后轉(zhuǎn)移到12000~14000D的透析袋中，封口； (5) 將步驟4)所述封口后的透析袋放入200mlpH= 7. 6的磷酸鹽緩沖液中，35~40°C 水浴180~200r/min恒溫振蕩消化4h; (6) 取步驟5)所述消化4h后、透析袋外消化液，以ELISA方法檢測消化液中黃曲霉毒 素B1的含量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確評定玉米黃曲霉毒素B1含量的方法，是將粉碎后玉米樣品進(jìn)行兩步酶法(胃蛋白酶—胰酶)體外消化，取消化后的消化液以ELSIA方法進(jìn)行其中黃曲霉毒素B1含量的測定，從而確定玉米樣品中黃曲霉毒素B1的含量。取消化液以ELSIA方法進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測定，確定玉米樣品中黃曲霉毒素B1的含量。目的是提供一種通過體外酶消化與ELISA測定相結(jié)合的快速準(zhǔn)確測定玉米黃曲霉毒素B1含量且適于生產(chǎn)應(yīng)用的方法，可以為養(yǎng)殖生產(chǎn)中飼料質(zhì)量的保障提供支持。
【IPC分類】G01N33/558
【公開號】CN105353120
【申請?zhí)枴緾N201510938305
【發(fā)明人】林海, 焦洪超, 范國燕, 趙景鵬, 王曉鵑
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月15日