專利名稱：Mek配體和編碼mek配體的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及哺乳動物激酶配體、底物和調(diào)節(jié)物。特別地，本發(fā)明涉及 多肽、多肽組合物和編碼為MEK的配體、底物和/或調(diào)節(jié)物的多肽的多核 苷酸。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)MEK活性的為同型多聚配體(hom叩olyligand)或 異型多聚配體(heteropolyligand)的多聚配體(polyligand)。本發(fā)明還涉及定位 于亞細胞區(qū)域的配體和多聚配體。
本申請的主題與申請第10/724,532 (現(xiàn)在的US 7,071,295)、 10/682,764 (US2004/0185556、 PCT/US2004/013517、 WO2005A)40336)、 11/233,246和 US20040572011P (WO2005116231)號有關(guān)。這些專利和申請各自通過引用 并入本文。
背景和現(xiàn)有才支術(shù)
激酶是催化向分子添加磷酸的酶。通過激酶添加磷酸稱為磷酸化。當 激酶底物是蛋白質(zhì)分子時，通常被磷酸化的氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸和酪 氨酸。磷酸酶是從分子去除磷酸的酶。磷酸的去除稱為去磷酸化。激酶和 磷酸酶通常代表細胞內(nèi)傳送、減弱或另外地調(diào)節(jié)細胞信號和細胞控制機制 的竟爭力量。激酶和磷酸酶具有既重疊又獨特的天然底物。由于受到激酶、 磷酸酶和其天然底物的調(diào)節(jié)，細胞信號和控制機制是研究工具設計和藥物 設計的耙標。
MAP/ERK激酶1、 MEK1、 PRKMK1、 MAPKK1、 MAP2K1 、 MKK1 是稱為MEK1的同 一個酶。MAP/ERK激酶2 、MEK2 、PRKMK2、MAPKK2、MAP2K2、 MKK2是稱為MEK2的同一個酶。MEK1和MEK2能磷酸化蛋 白質(zhì)或肽底物中的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。迄今為止，鑒定的MEK 同種型細胞底物很少。雖然已鑒定和研究了各個底物或配體，但是混合的 配體連接在一起作為調(diào)節(jié)MEK同種型活性的多聚配體在本發(fā)明之前則未 得到證實。
Ji等人(J Biol Chem (2003) 278:25063-7l)設計并合成了調(diào)節(jié)4丐/4丐調(diào)蛋 白依賴性蛋白質(zhì)激酶和定位于心肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)的多肽配體。Ji等人通過以 下實現(xiàn)了這一點通過將來自受磷蛋白的肌質(zhì)網(wǎng)定位信號與多肽配體融 合，產(chǎn)生了將鈣/釣調(diào)蛋白依賴性蛋白質(zhì)激酶的抑制性多肽配體定位于肌質(zhì) 網(wǎng)的表達構(gòu)建體。另請參見US 7，071,295。
多肽和多核苷酸序列詳述
SEQ ID NO: 1-36是示例性多聚配體和編碼它們的多核苷酸。
具體來"i兌，MEK多聚配體SEQ ID NO: 1由SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了 優(yōu)化，并且其中SEQIDNO:3-4含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限 制位點。SEQ ID NO:l是具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體的實施方 案，其中A是SEQ ID NO:41 ， B是SEQ ID NO:42 ， C是SEQ ID NO:49, D是SEQIDNO:43,其中Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸，并且其中SI是具有 氨基酸序列PGAAG的間隔子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子， S3是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子。具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的 多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4D。
SEQ ID NO:5是具有結(jié)構(gòu)X-S1-X-S2-Y-S3-Z的多聚配體的實施方案， 其中X是SEQ ID NO:44 ， Y是SEQ ID NO:42 ， Z是SEQ ID NO:43,其中 Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸，并且其中SI是具有氨基酸序列PGAAG的間隔 子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子，S3是具有氨基酸序列PGAAG 的間隔子。MEK多聚配體SEQ ID NO:5由SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO: 7 和由SEQ ID NO: 8編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQIDNO:7-8含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。具有結(jié)構(gòu)X-S1-X-S2-Y-S3-Z的多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4E。
SEQ ID NO:9由SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO: 12編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID NO:ll-12含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQIDNO:l是具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體的實施方案，其中A是SEQ ID NO:41, B是SEQ ID NO:42, C是SEQ ID NO:49， D是SEQ IDNO:43，其中Xaa是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，并且其中SI是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子，S3是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子。具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4D。
SEQ ID NO:13是具有結(jié)構(gòu)X-S1-X-S2-Y-S3-Z的多聚配體的實施方案，其中X是SEQIDNO:44， Y是SEQ ID NO:42, Z是SEQ ID NO:43，其中Xaa是絲氨酸、蘇氨酸或]0酪氨酸，并且其中SI是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子，S3是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子。MEK多聚配體SEQ ID NO: 13由SEQ ID NO: 14、 SEQID NO: 15和由SEQ ID NO: 16編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID NO: 15-16含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。具有結(jié)構(gòu)X-S1-X-S2-Y-S3-Z的多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4E。
SEQ ID NO: 17由SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID 20 NO: 19-20含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQ ID NO: 17是具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體的實施方案，其中A是SEQ ID NO:51 ， B是SEQ ID NO:43， C是SEQ ID NO:42, D是SEQIDNO:44,其中Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸，并且其中SI是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子，S3是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子。具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4D。
SEQ ID NO:21由SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24編
碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中
SEQ ID 30 NO:23-24含有適用于^t塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQ ID NO:21是具有結(jié)構(gòu)A-S1-A-S2-A的多聚配體的實施方案，其中A是SEQIDNO:45,其中Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸，并且其中SI是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子，S2是具有氨基酸序列PAGGA的間隔子，S3是具有氨基酸序列PGAAG的間隔子。具有結(jié)構(gòu)A-S1-A-S2-A的多聚配體在本文也稱為同型多聚配體，通常顯示于圖2D。
SEQ ID NO:25由SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID NO:27-28含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQIDNO:25是單體性配體的實施方案，其中Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸。
SEQ ID NO:29由SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32編
碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID NO:31-32含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQIDNO:29是單體性配體的實施方案，其中Xaa是丙氨酸。
SEQ ID NO:33由SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36編碼，其中密碼子已經(jīng)為哺乳動物表達和載體插入進行了優(yōu)化，并且其中SEQ ID NO:35-36含有適用于模塊化克隆方法的可選側(cè)翼限制位點。SEQID NO:33是具有結(jié)構(gòu)A-S4-B-S5-A-S4-B的多聚配體的實施方案，其中A是SEQIDNO:48, B是SEQ ID NO:50，其中Xaa是丙氨酸，并且其中S4是具有氨基酸序列RRPAAA的間隔子，S5是具有氨基酸序列PGGG的間隔子。具有結(jié)構(gòu)A-S4B-S5-A-S4-B的多聚配體在本文也稱為異型多聚配體，通常顯示于圖4C。
SEQ ID NO:37-40是全長MEK蛋白質(zhì)底物或抑制劑。由于MEK經(jīng)歷自身磷酸化，因此MEK被包括作為底物。這些序列具有以下公共數(shù)據(jù)庫登錄號NP—002746、 NP_002737、 XP_055766、 NP—002736、 NP_001744。這些登錄號代表的序列各自通過引用并入本文。在SEQIDNO:37-40中，可被MEK磷酸化的氨基酸位置表示為Xaa。在野生型蛋白質(zhì)中，Xaa是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸。在本發(fā)明配體中，Xaa是任一氨基酸。
SEQ ID NO:41-48是SEQ ID NO:37-39的部分序列，其代表包含激酶活性位點封閉劑肽配體序列的序列實例，其中天然多肽中可被MEK磷酸化的絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸位置指定為Xaa。
SEQ ID NO:49-51是SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40的部分序列，其代表肽激酶抑制劑實例。5 SEQ ID NO:41-51代表單體性多肽配體序列的實例。
含有Xaa的氨基酸序列包括其中Xaa是任一氨基酸的多肽。附圖詳述
圖IA-IC顯示不含間隔子的同型多聚配體的實例。
圖2A-2C顯示含間隔子的同型多聚配體的實例。
圖3A-3E顯示不含間隔子的異型多聚配體的實例。
圖4A-4F顯示含間隔子的異型多聚配體的實例。
圖5A-5G顯示連接于任選的表位標簽的配體和多聚配體的實例。
圖6A-6G顯示連接于任選的報道分子的配體和多聚配體的實例。
圖7A-7G顯示連接于任選的定位信號的配體和多聚配體的實例。
圖8A-8G顯示連接于任選的定位信號和任選的表位標簽的配體和多聚配體的實例。
圖9A-9G顯示其中配體和多聚配體連接于任選的定位信號、任選的表位標簽和任選的報道分子的基因構(gòu)建體的實例。


圖10A-10D顯示含有配體基因構(gòu)建體的載體的實例。
圖11顯示用于組合合成多聚配體的順序克隆過程的實例。
圖12-24顯示本發(fā)明含有針對配體-P-半乳糖香酶融合蛋白的基因構(gòu)建體的載體的圖示。圖25顯示轉(zhuǎn)染的HT-1080細胞的溶解產(chǎn)物中配體-P-半乳糖苷酶融合 蛋白的平均蛋白質(zhì)濃度。
圖26顯示配體-(3-半乳糖苷酶融合蛋白針對MEK1和MEK2蛋白質(zhì)靶 標的蛋白質(zhì)斑點印跡結(jié)合測定的圖像分析結(jié)果。
發(fā)明簡述
本發(fā)明涉及MEK的多肽配體和多聚配體。本發(fā)明的一個方面是通過 修飾一種或多種天然底物或抑制劑提供新的、模塊化的MEK(在下文，術(shù) 語MEK指MEK1和/或MEK2) 30活性抑制劑，所述修飾是通過截短和/ 或通過氨基酸置換。本發(fā)明的進一步方面是通過連接于亞細胞定位信號的 MEK抑制劑、配體或多聚配體的亞細胞定位。MEK配體和多聚配體的各 種實施方案以SEQ ID NO: 1-51表示。更具體來說，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO:41-51的任何一個或多個的配體、同型多聚配體和異型多聚配體。另外， 本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO:37-40的一個或多個的部分序列或其任何部分 的配體和多聚配體。此外，本發(fā)明涉及與包含SEQlDNO:41-51的一個或 多個或其任何部分的多聚配體具有至少約80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%和99%序列同 一性的多聚配體。此外，本發(fā)明涉及與包含SEQ ID NO:37-40的一個或多個的部分序列的多聚配體具有至少約80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97 /0、 98%和99%序列同一性的多聚配體。
多聚配體是包括兩個或多個單體性多肽配體的嵌合配體，其可以是同 型多聚配體或異型多聚配體。如本文所用，術(shù)語嵌合指含有來自兩種不同 多肽或來自同一多肽的不同區(qū)域的氨基酸序列的人工雜合或融合多肽。單 體性配體的實例是SEQ ID NO:43表示的多肽，其中Xaa是任一氨基酸。 SEQIDNO:43是野生型全長SEQIDNO:39的選定部分序列，其中野生型 序列中對應于Xaa的氨基酸是可被MEK磷酸化的絲氨酸、酪氨酸或蘇氨 酸。同型多聚配體的實例是包含SEQIDNO:43的二聚體或多聚體的多肽， 其中Xaa是任一氨基酸。異型多聚配體的實例是包含SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:41-50的一個或多個的多肽，其中Xaa是任一氨基酸。有許多方式 將SEQIDNO:41-51組合成同型多聚配體或異型多聚配體。此外，有許多方式將另外的SEQ ID NO:37-40的部分序列彼此組合和與SEQ ID NO:41-51組合以制成多聚配體。
本發(fā)明的多聚配體任選地在單體之前、之后或之間包含間隔子氨基 酸。SEQ ID NO:l是具有結(jié)構(gòu)A-S1-B-S2-C-S3-D的多聚配體的實施方案， 其中A是SEQIDNO:41， B是SEQ ID NO:42, C是SEQ ID NO:49, D是 SEQ ID NO:43,其中Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸，并且其中Sl、 S2和S3 是間隔子。本發(fā)明意在捕獲同型多聚配體和異型多聚配體的所有組合，而 不限于上下文所給出的實例。在本說明書中，所使用的術(shù)語"配體"包括單 體性配體、多聚配體、同型多聚配體和/或異型多聚配體。
單體性配體能分類為不同類型。 一種類型的單體性配體是其中多肽的 至少一個部分能夠被mek識別為底物或假底物(活性位點封閉劑)的多肽。 能夠-故識別的多肽部分稱為識別基序。在本發(fā)明中，識別基序能是天然的 或合成的。識別基序的實例是本領域公知的，并且包括但不限于，天然存 在的MEK底物和假底物基序(SEQ ID NO:41-48和含有識別基序的SEQ ID NO:37-39的部分序列)。另 一種類型的單體性配體是其中多肽的至少一個 部分能夠在不同于MEK活性位點的位置與MEK締合并抑制MEK的多肽。
多聚配體包含連接在一起以生成嵌合體的兩個或多個單體性配體。
同型多聚配體是除一個或多個單體性配體的磷酸化殘基可被置換或 修飾外，其中每個單體性配體的氨基酸序列相同的多聚配體。
異型多聚配體是其中一些單體性配體不具有相同氨基酸序列的多聚 配體。
本發(fā)明的配體任選地連接于提供表位標簽、報道分子和/或細胞定位信 號的另外的分子或氨基酸。細胞定位信號將配體靶向細胞的某區(qū)域。表位 標簽和/或報道分子和/或定位信號可以是同一分子。表位標簽和/或報道分 子和/或定位信號還可以是不同分子。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其包含編碼配體、同型多聚配體和異型多聚 配體的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸任選地連接于編碼具有另外的特征諸如 表位標簽、報道分子和/或細胞定位信號的多肽的另外的核苷酸序列。 述多核苷酸任選地側(cè)翼于包含限制性核酸內(nèi)切酶位點和限制性核酸內(nèi)切酶 活性所需的其它核苷酸的核苷酸序列。側(cè)翼序列任選地提供載體內(nèi)的獨特 克隆位點，和任選地提供后續(xù)克隆的方向性。此外，本發(fā)明的核酸任選地 并入載體多核普酸中。本發(fā)明的配體、多聚配體和多核普酸具有作為研究 工具和/或治療劑的用途。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及為MEK調(diào)節(jié)物的配體和多聚配體。本發(fā)明的一個方面是 通過修-飾一種或多種天然底物或抑制劑提供新的、單體性和嵌合的、；溪塊 化的MEK活性抑制劑，所述修飾是通過截短和/或通過氨基酸置換。本發(fā) 明的進一步方面是通過連接于亞細胞定位信號的MEK抑制劑、配體或多 聚配體的亞細胞定位。配體和多聚配體的各種實施方案以SEQIDNO: 1-51 表示。多聚配體是包含兩個或多個單體性多肽配體的嵌合配體。單體性配 體的實例是SEQIDNO:42表示的多肽，其中Xaa是任一氨基酸。SEQ ID NO:42是母體全長SEQ ID N〇:37的選定部分序列，其中母體序列中對應 于Xaa的氨基酸是可被MEK磷酸化的絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸。單體性 配體的另 一實例是SEQ ID NO:49表示的多肽。單體性配體的另一實例是 SEQ ID NO:46表示的多肽。SEQ ID NO:41-51各自代表單體形式的具體多 肽配體，其中Xaa是任一氨基酸。SEQ ID NO:4]-54是SEQ ID NO:37-40 的部分序列的選定實例，不過，含有識別基序或結(jié)合締合基序的SEQ ID NO:37-40的其它部分序列也可用作單體性配體。SEQ ID NO:37-40的單體 性配體部分序列可以是野生型部分序列。另外，SEQ ID NO:37-40的單體 性配體部分序列可具有被其它氨基酸取代的可被MEK磷酸化的氨基酸。 此外，單體性配體和多聚配體可與包含SEQTDNO:41-51的一個或多個的 氨基酸序列的配體具有至少約80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98% 或99%序列同一性。此外，單體性配體和多聚配體可與SEQ ID NO:37-40 的部分序列具有至少約80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%和99% 序列同一性。
同型多聚配體的實例是包含SEQ ID NO:50的二聚體或多聚體的多肽。
14同型多聚配體的另 一 實例是包含SEQ ID NO: 51的二聚體或多聚體的多肽。 異型多聚配體的實例是包含SEQ TD NO:41和SEQ ID NO:42-51的一個或 多個的多肽，其中Xaa是任一氨基酸。有許多方式將SEQ IDNO:41-51組 合成同型多聚配體或異型多聚配體。此外，有許多方式將SEQ ID NO:37-40 的另外的部分序列彼此組合和與SEQ ID NO:41-51組合以制成多聚配體。 多聚配體可包含SEQIDNO:41-51的任何兩種或多種，其中Xaa是任一氨 基酸。SEQ ID NO:41-51是SEQ ID NO:37-40的部分序列的選定實例，但 是，另外的部分序列，野生型或突變的，可用于形成多聚配體。本發(fā)明涉 及同型多聚配體和異型多聚配體的所有可能組合而沒有限制。
SEQ ID NO:41-48顯示含有至少一個可被MEK磷酸化的絲氨酸或蘇 氨酸殘基的蛋白質(zhì)，其位置表示為Xaa。由于MEK自身磷酸化，因此MEK 自身被包括作為底物。SEQ ID NO:41-48是SEQ ID NO:37-39的部分序列， 其中可被MEK磷酸化的殘基的位置同樣表示為Xaa。天然地，Xaa通常來 說是絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，Xaa可以是 任何氨基酸。其中Xaa是絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的配體能用作多聚配體 的一部分；不過，在一個實施方案中，至少一個可磷酸化的絲氨酸、酪氨 酸或蘇氨酸被另 一氨基酸取代，所述另 一氨基酸諸如天然存在的氨基酸之 一，包括丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、 苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯 氨酸、精氨酸、纈氨酸或色氨酸。Xaa還可以是非天然存在的氨基酸。在 另一實施方案中，可被MEK磷酸化的一個或多個殘基是被丙氨酸取代。 在另一實施方案中，可被MEK磷酸化的一個或多個殘基是被苯丙氨酸取 代。本發(fā)明的配體和多聚配體4皮i殳計為調(diào)節(jié)MEK的內(nèi)源作用。
一般而言，基于天然MEK底物的配體單體是通過鑒定MEK底物中推 定的MEK磷酸化識別基序構(gòu)建的。有時期望將可磷酸化的殘基修飾成不 同于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸。另外的單體包括MEK識別基序 以及所述MEK識別基序任一側(cè)的鄰近氨基酸和連續(xù)氨基酸。因此單體性 配體可以是任何長度，只要所述單體包括MEK識別基序。例如，所述單 體可包含MEK識別基序和鄰近所述識別基序的至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、200880017643.X
8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30-100或更多氨基酸。
例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包含MEK的多肽抑制劑，所述多 肽抑制劑包含選自由以下組成的組的肽的至少一個拷貝
a) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基165-203的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ 1D NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基是不同于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘
基；
b) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基169-200的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基是不同于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘
基；
c) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基174-196的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基是不同于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘
基；和
d) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基179-194的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基是不同于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘 基。
如本文所用，術(shù)語"對應于(correspond(s) to)，，和"對應于(corresponding to)"當其涉及序列比對時，意在指參考蛋白質(zhì)如ERK1 (SEQIDNO:38)內(nèi)的 列舉位置和與參考蛋白質(zhì)上的位置比對的那些位置。因此，當所試肽的25 氨基酸序列與參考肽如SEQ ID NO:38的羞\基酸序列比對時，"對應于"參 考肽序列的某些列舉位置的所試肽序列的氨基酸是與所述參考肽序列的 這些位置比對的那些，但不必是參考序列中的這些精確編號位置。比對序 列以確定序列之間的對應氨基酸的方法如下所述。
本發(fā)明另外的實施方案包括基于MEK的任何推定或真實底物的單體(如上所述)，所述底物諸如通過SEQ ID NO:37-39鑒定的底物。此外，如 果底物具有多于一種識別基序，則可從其中鑒定多于一種單體。
本發(fā)明的另一實施方案是包含編碼至少一個拷貝的配體肽的多核苷 酸序列的核酸分子。
本發(fā)明的另 一 實施方案是分離的多肽同型多聚配體，其中所述同型多 聚配體調(diào)節(jié)MEK活性。
本發(fā)明的另 一實施方案是分離的多肽異型多聚配體，其中所述異型多 聚配體調(diào)節(jié)MEK活性。
本發(fā)明的另一實施方案是核酸分子，其中多核苷酸序列15編碼一種 或多種肽配體的一個或多個拷貝。
本發(fā)明的另 一實施方案是核酸分子，其中多核苷酸序列編碼至少一定 數(shù)目拷貝的肽，所述數(shù)目選自由2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10組成的組。
本發(fā)明的另一實施方案是包含核酸分子的載體，所述核酸分子編碼配 體或多聚配體的至少一個拷貝。
本發(fā)明的另一實施方案是包含載體的重組宿主細胞，所述載體包含編 碼配體或多聚配體的至少一個拷貝的25核酸分子。
本發(fā)明的另一實施方案是抑制細胞中MEK的方法，其包括將包含編 碼配體或多聚配體的至少一個拷貝的核酸分子的載體轉(zhuǎn)染入宿主細胞，并 在適于產(chǎn)生所述配體或多聚配體的至少一個拷貝的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)染的 宿主細胞。
本發(fā)明還涉及與參考抑制劑具有至少約80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%同一性的修飾的抑制劑。"修飾的抑制劑"用于指能通過 在抑制劑蛋白質(zhì)或多肽的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)中添加、缺失或置換一個 或多個氨基酸而生成的肽。"修飾的識別基序"是已通過在基序的一級結(jié)構(gòu) (氨基酸序列)中添加、缺失或置換一個或多個氨基酸而修飾的天然存在的 MEK識別基序。例如，修飾的MEK識別基序可以是其中可磷酸化的氨基 酸已被修飾為非可磷酸化氨基酸的基序。術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"肽"和"多肽"在 本文可互換地使用。參考抑制劑不必是野生型蛋白質(zhì)或其部分。因此，參考抑制劑可以是其序列先前在野生型蛋白質(zhì)上被修飾的蛋白質(zhì)或肽。參考 抑制劑可以是或不是來自特定生物體的野生型蛋白質(zhì)。
具有與參考氨基酸序列具有至少例如約95% "同一性"的氨基酸序列 的多肽理解為指，所述多肽的氨基酸序列與參考序列具有同一性，除了所
述氨基酸序列可包括編碼所述參考肽的參考氨基酸序列的每100個氨基酸 最多約5個的修飾。換言之，為了獲得具有與參考氨基酸序列具有至少約 95%同一性的氨基酸序列的肽，參考序列的氨基酸殘基最多有約5%可被缺 失或被另一氨基酸置換，或參考序列總氨基酸的最多約5%數(shù)目的氨基酸 可插入?yún)⒖夹蛄?。參考序列的這些修飾可在參考氨基酸序列的N-末端或 C-末端位置或這些末端位置之間的任何位置發(fā)生，單獨地散布于參考序列 的氨基酸之中或散布于在參考序列內(nèi)的一個或多個連續(xù)組之中。
如本文所用，"同一性"是核苷酸序列或氨基酸序列與參考核苷酸或氨 基酸序列相比的同一性量度。 一般而言，將序列比對以便獲得最高等級的 匹配。"同一性"本身具有領域認可的含義，并能使用公布的技術(shù)計算。(參 見，如Computational Molecular Biology (計算分子生物學)，Lesk, A. M. 編，Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics And Genome Projects(生物計算信息與基因組計劃)，Smith, D.W.編，Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data (序列凄l(xiāng)才居的 計算機分析)，第I部分，Griffin, A. M.，和Griffiri, H. G.編，Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje， G. ， Sequence Analysis In Molecular Biology (分子生物學中的序列分析)，Academic Press (1987);和Sequence Analysis Primer (序列分4斤引物)，Gribskov, M.和Devereux， J.編，M Stockton Press, New York (1991))。雖然存在測量兩個多核苷酸或多肽序列之間的同一性的 幾種方法，術(shù)語"同一性"是本領域技術(shù)人員公知的(Carillo, H. & Lipton, D.， Siam J Applied Math 48:1073 (1988))。通常應用于確定兩個序列之間的同一 性或相似性的方法包括但不限于如下公開的方法Guide to Huge Computers (巨型計算才幾指南)，Martin J. Bishop編，Academic Press, San Diego (1994)和Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)。計算機程序也可含有計算同一性和相似性的方法和算法。確定兩
1個序列之間同一'f生和相似性的計算機程序方法的實例包括但不限于，GCG
程序包(Devereux, .T.等人，Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984))、 BLASTP、 ExPASy、 BLASTN、 FASTA (Atschul, S. F.等人，J Molec Biol 215:403 (1990))和FASTDB 。確定同 一 性和相似性的方法的實例討論于 Michaels, G.禾口 Garian, R. ， Current Protocols in Protein Science (蛋白質(zhì)科學 最新方案)，第1巻，John Wiley & Sons， Inc. (2000)，其通過引用并入本 文。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于確定兩種或多種多肽之間的同一性 的算法是BLASTP。
在本發(fā)明的另 一實施方案中，用于確定兩種或多種多肽之間的同 一性 的算法是FASTDB,其是基于Brutlag等人的算法(Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990),通過引用并入)。在FASTDB序列比對中，查詢序列和 所試序列是氨基酸序列。序列比對結(jié)果是百分比同一性?？捎糜诎被嵝?列的FASTDB比對以計算百分比同一性的參數(shù)包括但不限于矩陣-PAM， k-元組-2，錯配罰分H,接縫罰分(JoiningPenalty^20,隨機化組長度=0， 截留值H,缺口罰分=5,缺口大小罰分0.05，窗口大小=500或較短的所試 氨基酸序列的長度。
如果所試序列短于或長于查詢序列是因為N-末端或C-末端添加或缺 失，而不是由于內(nèi)部添加或缺失，可進行手動校正，因為FASTDB程序在 計算百分比同一性時不考慮所試序列的N-末端和C-末端截短或添加。對 于相對查詢序列在兩端截短的所試序列，百分比同一性通過計算處于不匹 配或比對的參考序列的N-和C-末端的查詢序列氨基酸的數(shù)目為查詢序列 的總氨基酸的百分比來校正。FASTDB序列比對的結(jié)果確定匹配/比對。然 后從通過上述FASTDB程序使用指定參數(shù)計算的百分比同一性中減去比 對百分比，以得到最終的百分比同一性分值。此校正分值能用于確定比對 如何彼此"對應"以及百分比同一性的目的。出于手動調(diào)整百分比同一性分 值目的，可考慮分別延伸經(jīng)過參考或所試序列的N-或C-末端的查詢(所試) 序列或參考序列的殘基。就是說，可在手動調(diào)整百分比同一性分值或比對 編號時計數(shù)不與比較序列的N-或C-末端匹配/比對的殘基。
例如，90氨基酸殘基的所試序列與100殘基參考序列比對以確定百分
19比同一性。缺失發(fā)生在所試序列的N-末端，因此FASTDB比對不顯示N-末端前10個殘基的匹配/比對。10個未配對殘基代表10%的序列(N-和 C-末端不匹配的殘基數(shù)/查詢序列中的殘基總數(shù))，所以從FASTDB程序計 算的百分比同一性分值中減去10%。如果剩余90個殘基完全匹配，則最 終的百分比同一性將是卯％。在另一實例中，90殘基的所試序列與100參 考序列進行比較。這次缺失是內(nèi)部缺失，所以沒有與查詢序列不匹配/比對 的所試序列的N-或C-末端殘基。
在此情形中，不手動校正FASTDB計算的百分比同 一性。
本發(fā)明的多聚配體任選地在單體之前、之后或之間包含間隔子氨基 酸。間隔子的長度和組成可以變化。間隔子的實例是甘氨酸、丙氨酸、聚 甘氨酸或聚丙氨酸。SEQ TD NO:l中單體之間使用的間隔子的具體實例是 五氨基酸間隔子PGAAG和PAGGA。在SF;Q ID NO: 1的情況中，含有脯 氨酸的間隔子意在打破二級結(jié)構(gòu)。間隔子氨基酸可以是任何氨基酸，而不 限于這些含有丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸的實例。本發(fā)明涉及含或不含間隔 子的同型多聚配體和異型多聚配體的所有組合，而不限于上下文給出的實 例。
本發(fā)明的配體和多聚配體任選地連接于提供表位標簽、報道分子和/ 或?qū)⑴潴w定位于細胞區(qū)域的另外的分子或氨基酸(參見圖5A-5G、圖 6A-6G、圖7A-7G和圖8A-8G)。
表位標簽的一^限制性實例是FLAG 、 HA(血凝素)、c-Myc和His6 。 報道分子的非限制性實例是堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、過氧化物酶、熒光 素酶和熒光蛋白。細胞定位的非限制性實例是肌質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、 高爾基體、核、質(zhì)膜、頂膜和基底外側(cè)膜。表位、報道分子和定位信號是 給出的實例并且不限于此。表位標簽、報道分子和/或定位信號可以是同一 分子。表位標簽、報道分子和/或定位信號也可以是不同分子。
配體和多聚配體以及連接于其上的任選氨基酸能使用本領域已知的 技術(shù)化學地或重組地合成?；瘜W合成技術(shù)包括但不限于肽合成，其通常使 用自動化肽合成儀進行。還能利用本領域已知的非自動化肽合成方法合成 肽。重組技術(shù)包括將編碼配體的核酸插入表達載體，其中核酸表達產(chǎn)物是
20使用細胞的因子和過程合成的。
細胞定位信號、表位標簽或報道分子與配體或多聚配體的連接能包括 與配體的共價連接或酶連接。當定位信號包含不同于多肽的材料諸如脂質(zhì) 或糖類時，可利用化學反應來連接分子。
另外，非標準氨基酸和用脂質(zhì)、糖、磷酸或其它分子修飾的氨基酸可 用作肽合成的前體。
含或不含定位信號的本發(fā)明配體具有治療用途。不過，連接于定位信 中的25個配體代表具有作為亞細胞工具或治療劑用途的配體。還經(jīng)由基
因治療遞送含有MEK配體的基因構(gòu)建體。圖10B和10C描繪用于遞送多 肽和控制多肽體內(nèi)表達的基因治療載體的實施方案。圖IOB和10C中連接 于基因構(gòu)建體的多核苷酸序列包括基因組整合結(jié)構(gòu)域，以利于轉(zhuǎn)基因向病 毒基因組和/或宿主基因組的整合。
圖IOA顯示含有MEK配體基因構(gòu)建體的載體，其中所述配體基因構(gòu) 建體作為用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的單元可從載體釋放。例如，配體基因構(gòu)建 體或轉(zhuǎn)基因通過限制性核酸內(nèi)切酶消化從載體主鏈釋放。然后將釋放的轉(zhuǎn) 基因注射入受精小鼠卵的原核；或所述轉(zhuǎn)基因用于轉(zhuǎn)化胚胎干細胞。圖10A 的含有配體基因構(gòu)建體的載體還可用于轉(zhuǎn)基因的瞬時轉(zhuǎn)染，其中所述轉(zhuǎn)基 因的啟動子和密碼子已經(jīng)針對宿主生物體進行了優(yōu)化。圖IOA的含有配體 基因構(gòu)建體的載體還可用于可發(fā)酵生物體中多肽的重組表達，所述可發(fā)酵 生物體適于小規(guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)，其中所述轉(zhuǎn)基因的啟動子和密碼子已經(jīng) 針對發(fā)酵宿主生物體進行了優(yōu)化。圖10D顯示含有MEK配體基因構(gòu)建體 的載體，其可用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其包含編碼配體、同型多聚配體和異型多聚 配體的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸任選地連接于編碼表位、報道分子 和/或定位信號的另外的核苦酸序列。此外，本發(fā)明的核酸任選地并入載體 多核苷酸。所述多核苷酸任選地側(cè)翼于包含限制性核酸內(nèi)切酶位點和限制 性核酸內(nèi)切酶活性所需的其它核苷酸的核苷酸序列。側(cè)翼序列任選地提供 載體內(nèi)的克隆位點。限制位點能包括但不限于，大多數(shù)商業(yè)可得克隆載體中通常使用的位點中的任一個。此類位點的實例是被BamHI、 Clal、 EcoRI、 EcoRV、 Spel、 AflTI、 Ndel、 NheTf、 XbaT、 XhoT、 SpM、 Nael、 SexAI、 HindIII、 Hpal和Pstl限制性核酸內(nèi)切酶識別的那些。被其它限制性酶包括回歸內(nèi)切 核酸酶切割的位點也用于此目的。多核苷酸側(cè)翼序列還任選地提供部分序 列克隆的方向性。優(yōu)選5'和3'限制性核酸內(nèi)切酶位點彼此不同，以使雙鏈 DNA能方向性地克隆入克隆載體的對應互補位點。
含或不含定位信號、表位或報道分子的配體和多聚配體可選地通過重 組技術(shù)合成。多核苷酸表達構(gòu)建體制備為含有期望組分，并插入表達載體。 然后將表達載體轉(zhuǎn)染入細胞，并且表達和分離多肽產(chǎn)物。根據(jù)重組DNA 技術(shù)制備的配體具有作為研究工具和/或治療劑的用途。
下面是如何產(chǎn)生編碼配體和多聚配體的多核苦酸的實例。合成并退火 互補的編碼配體的寡核苦酸和側(cè)翼序列。使用本領域已知的技術(shù)將得到的 雙鏈DNA分子插入克隆載體。當將配體和多聚配體與轉(zhuǎn)基因基因構(gòu)建體 內(nèi)被翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列符合讀框地鄰近放置時，它們在細胞或轉(zhuǎn)基 因動物中表達時形成融合蛋白的一部分。
本發(fā)明的另 一 實施方案涉及期望的細胞或生物體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達的選 擇性控制。重組基因的啟動子部分能是組成型啟動子、非組成型啟動子、
擇性控制啟動子受不同的機制控制。例如，RheoSwitchR是可從New England Biolabs獲得的誘導型啟動子系統(tǒng)。
溫度敏感型啟動子也能用于增加或減少基因表達。本發(fā)明的一個實施 方案包含其中表達受誘導型啟動子控制的配體或多聚配體基因構(gòu)建體。在 一個實施方案中，所述誘導型啟動子是四環(huán)素可控制的。
多聚配體本質(zhì)上是模塊化的。本發(fā)明的一個方面是所公開的多聚配體 的組合模塊性。本發(fā)明的另 一方面是容易和方便地制備這些模塊化多聚配 體的方法。在這方面，本發(fā)明的實施方案包括遺傳表達組分的;f莫塊化部分 序列克隆的方法。當通過重組合成配體、同型多聚配體、異型多聚配體和 任選的氨基酸表達組分時，技術(shù)人員能考慮將每個可克隆的元件作為模 塊。為了克隆的速度和方便性，期望制備在黏性末端相容并易于順序插入和克隆的^f莫塊化元件。這通過探索限制性核酸內(nèi)切酶位點識別和切割的天 然性質(zhì)實現(xiàn)。本發(fā)明 一 個方面包括在模塊的 一 端用于被限制性酶消化一 次，而在另一端用于被限制性酶根據(jù)需要消化盡可能多次的模塊側(cè)翼序 列。換言之，模塊一端的限制位點被利用并破壞，以實現(xiàn)模塊化元件的順 序克隆。側(cè)翼于編碼區(qū)模塊的限制位點的實例是被限制性酶NgoM IV和
Cla I;或Xma I和Cla I識別的序列。用NgoM IV和Ca I切割第 一環(huán)狀 DNA,以產(chǎn)生具有5' NgoM IV突出端和3' Cla I突出端的線狀DNA;和用 Xma I和Cla I切割第二環(huán)狀DNA,以產(chǎn)生具有5' Cla I突出端和3' Xma I 突出端的線狀DNA,這樣產(chǎn)生了具有相容黏性末端的第 一和第二 DNA片 段。當這些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并連接以形成第三環(huán) 狀DNA片段時，第一 DNA中的NgoM IV位點和第二 DNA中的Xma I 位點在第三環(huán)狀DNA中被破壞。現(xiàn)在DNA的此殘留區(qū)域被保護免于進一 步的Xma I或NgoM IV消化，但是第三環(huán)狀DNA中剩余的側(cè)翼序列仍含 有完整的5' NgoM IV和3' Cla 1位點。此過程能重復許多次以實現(xiàn)定向的、 順序的、才莫塊化克隆事件。NgoMIV、 Xmal和Clal內(nèi)切核酸酶識別的限 制位點代表用作側(cè)翼序列時容許順序克隆的一組位點。
定向和順序組裝編碼區(qū)模塊的另一方式除了利用環(huán)狀DNA之外還利 用線狀DNA。例如，像上文所迷的順序克隆過程，側(cè)翼于編碼區(qū)模塊的限 制位點是被限制性酶NgoM IV和Cla I;或Xma I和Cla I識別的序列。用 NgoM IV和Cla 1切割第一環(huán)狀DNA以產(chǎn)生具有5' NgoM IV突出端和3' Clal突出端的線狀DNA。通過PCR擴增或通過合成并退火互補寡核苷酸 產(chǎn)生第二線狀雙鏈DNA。所述第二線狀DNA具有5' Cla I突出端和3' Xma I突出端，它們是與線狀化的第一DNA相容的黏性末端。當這些第一和第 二 DNA片段混合在一起、退火并連接形成第三環(huán)狀DNA片段時，第一 DNA中的NgoM IV位點和第二 DNA中的Xma I位點在第三環(huán)狀DNA中 #皮>破壞。第三環(huán)狀DNA中剩余的側(cè)翼序列仍含冇完整的5' NgoM IV和3' Clal位點。此過程能重復許多次以實現(xiàn)定向的、順序的、模塊化克隆事件。 NgoMIV、 Xmal和C]al內(nèi)切核酸酶識別的限制位點代表用作側(cè)翼序列時 容許順序克隆的一組位點。此過程描繪于圖1L本領域普通技術(shù)人員理解，其他限制位點組也能實現(xiàn)如本文所述的順 序的、定向的克隆。限制性核酸內(nèi)切酶選擇的優(yōu)選標準是，選擇產(chǎn)生相容 的私性末端的一對內(nèi)切核酸酶，^旦是其位點在彼此連4妻后,皮石皮壞。另一標 準是選擇不產(chǎn)生與前兩個黏性末端中的任一個相容的黏性末端的第三核 酸內(nèi)切酶位點。當此類標準用作順序、定向克隆系統(tǒng)時，能根據(jù)需要組合 地裝配配體、多聚配體和其他編碼區(qū)或表達組分。同樣的順序過程能用于 5表位、報道分子和/或定位信號。
公開了調(diào)節(jié)MEK活性的多聚配體和制備多聚配體的方法。治療包括 遞送含或不含定位信號的純化的配體或多聚配體至細胞?？蛇x地，含或不 含定位信號的配體和多聚配體經(jīng)由腺病毒、慢病毒、腺伴隨病毒或在細胞 中表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物的其他病毒構(gòu)建體遞送。
實施例1
合成了包含異型多聚配體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞定位信號和His6表位的多肽。 此類多肽的實例通常通過圖8A、 8B、 8D、 8E和8F表示。所述多肽在自 動化肽合成儀上合成，或重組表達并純化。純化的多肽溶解于介質(zhì)中并添 加至細胞。所述多肽被細胞內(nèi)吞并運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。通過使用抗-His6抗體的 免疫組織化學染色進行-驗證。
實施例2
使用巨細胞病毒(CMV)啟動子構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因以指導融合蛋白的表達， 所述融合蛋白包含SEQ IDNO:49、 SEQIDNO:48、 SEQIDNO:41，其中 Xaa是丙氨酸(多聚配體)、綠色熒光蛋白(報道分子)和質(zhì)膜定位信號(定位 信號)。此轉(zhuǎn)基因通常通過圖9C表示。所述轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)染入細胞進行瞬時 表達。通過共聚焦顯微術(shù)顯現(xiàn)綠色熒光蛋白來進行表達和定位的驗證。
實施例3
構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體以產(chǎn)生表達受組織特異性啟動子驅(qū)動的蛋白質(zhì) 產(chǎn)物。所述轉(zhuǎn)基因包^i殳計為編碼三個結(jié)構(gòu)域的合成基因表達單元。這三個結(jié)構(gòu)域的每一個均作為一對互補多核苷酸合成，所述互補多核苷酸在溶 解狀態(tài)下退火、連接并插入載體。從氨基末端開始，表達單元中的三個結(jié)
構(gòu)域是編碼MEK配體、FLAGTM表位和核定位信號的核苷酸序列。所述 MEK配體是如本文所述的單體性配體、同型多聚配體或異型多聚配體。編 碼FLAGTM表位的核苷酸序列被置于編碼MEK配體的核苷酸序列的下游。 最后，編碼定位信號的核苷酸序列被置于編碼FLAGTM表位的核苷酸序列 的下游。裝配的基因表達單元隨后被亞克隆至諸如圖IOA中顯示的表達載 體，并用于瞬時轉(zhuǎn)染細胞。通過使用抗-FLAGTM抗體的免疫組織化學染色 進行驗證。
實施例4
說明了亞細胞定位的MEK多聚配體對MEK細胞功能的調(diào)節(jié)。制備了 含有編碼多聚配體融合蛋白、表位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號的核酸的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建 體。表達單元含有編碼SEQ ID NO:25 (多聚配體)、c-Myc表位(表位)和核 定位信號(定位信號)的核苷酸。此表達單元隨后^1亞克隆至載體的EFl a 啟動子和SV40多聚腺苷酸化信號之間。然后使用含有完整轉(zhuǎn)基因的表達 載體轉(zhuǎn)染細胞。通過相對于對照測量內(nèi)源底物的磷酸化和/或觀察表型來證 實MEK活性的抑制。
實施例5
通過制備轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在體內(nèi)證實配體功能和定位，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建 體用于產(chǎn)生表達靶向核的配體融合蛋白的小鼠。所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體通常顯 示于圖IOB。表達單元含有編碼SEQ ID NO:33的四聚體、血凝素表位和 核定位信號的核苷酸。此表達單元隨后被亞克隆至載體的包括誘導型啟動 子和SV40多聚腺苷酸化信號的核苷酸序列之間。然后將完整的轉(zhuǎn)基因注 射入受精小鼠卵母細胞的原核。通過PCR篩選所得幼畜中轉(zhuǎn)基因的存在。 轉(zhuǎn)基因建立者小鼠與野生型小鼠雜交。使用來自至少第三代的雜合轉(zhuǎn)基因 動物進行下列檢驗，使用它們的非轉(zhuǎn)基因同窩出生動物作為對照。
檢驗1:進行Southern印跡分析以確定拷貝數(shù)。將Southern印跡與產(chǎn) 生自轉(zhuǎn)基因片段的放射標記探針雜交。所述探針檢測含有來自轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA的條帶，但不檢測含有來自非轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA的條帶。測量轉(zhuǎn) 基因小鼠條帶的強度，并與轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒對照條帶比較以估計拷貝數(shù)。這證 實了實施例5中的小鼠在其基因組中含有轉(zhuǎn)基因。檢驗2:制備組織勻漿物用于蛋白質(zhì)印跡分析。此實驗證實轉(zhuǎn)基因表 達于轉(zhuǎn)基因小鼠的組織，因為在轉(zhuǎn)基因勻漿物中但未在非轉(zhuǎn)基因勻漿物中 檢測到血凝素表位。檢驗3:誘導表達后相對對照通過表型觀察或分析評估功能。這些實例證實配體遞送至細胞的定位區(qū)域以用于治療或?qū)嶒災康摹＜?化的多肽配體能配制為用于經(jīng)口或腸胃外施用、局部施用，或制備為片劑、 膠囊或液體形式、鼻內(nèi)或吸入氣霧劑、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他注射； 靜脈內(nèi)滴注；或任何其他施用途徑。此外，編碼所述配體的核苷酸序列允 許并入設計用于遞送和在細胞中表達基因產(chǎn)物的載體。此類載體包括質(zhì) 粒、黏粒、人工染色體和改良的病毒。向真核細胞的遞送能在體內(nèi)或活體 外實現(xiàn)?；铙w外遞送方法包括分離目標接受者的細胞或供體細胞，并將所 述載體遞送至這些細胞，然后用所述細胞治療所述接受者。實施例6構(gòu)建本發(fā)明配體融合于p-半乳糖苷酶的融合蛋白。圖12代表包含編碼多聚配體SEQIDNO:33的多核苷酸的載體。在圖 12的載體中，編碼配體SEQ ID NO:33的多核苷酸連接于編碼|3-半乳糖苷 '酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖13代表包含多核苷酸SEQ ID NO:2的載體，所述多核苷酸編碼配 體SEQ ID NO:l。在圖13的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:2連接于編碼卩-半乳糖苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖14代表包含多核香酸SEQ ID NO: 6的載體，所述多核普酸編碼配 ; 體SEQ ID NO:5。在圖14的載體中，多核苷酸SEQ ID NO: 6連接于編碼 P-半乳糖苷酶的多核普酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖15代表包含多核苷酸SEQ ID NO: 10的載體，所述多核苷酸編碼配體SEQIDNO:9。在圖15的載體中，多核芬酸SEQ ID NO: 10連接于編碼 P-半乳糖香酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖16代表包含多核苷酸SEQ ID NO: 14的載體，所述多核普酸編碼配 體SEQIDNO:13。在圖]6的載體中，多核苷酸SEQ ID NO: 14連接于編 碼P-半乳糖苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖17代表包含多核苷酸SEQ ID NO: ]8的載體，所述多核苷酸編碼配 體SEQIDNO:17。在圖17的載體中，多核苷酸SEQ ID NO: 18連接于編 碼P-半乳糖苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖18代表包含多核苷酸SEQ ID NO: 22的載體，所述多核普酸編碼配 體SEQ ID NO: 21。在圖18的載體中，多核苷酸SEQ ID NO: 22連接于編 碼P-半乳糖普酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖19代表包含SEQ ID NO:26的載體，SEQ TD NO:26編碼配體SEQ ID NO:25。在圖19的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:26連接于編碼|3-半乳糖 苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖20代表包含SEQ ID NO:26的另 一載體，SEQ ID NO:26編碼配體 SEQ ID NO:25。在圖20的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:26連接于編碼|B-半乳糖苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖21代表包含SEQ ID NO:30的載體，SEQ ID NO:30編碼配體SEQ ID NO:29。在圖21的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:30連4妄于編碼(3-半乳糖 香酶的多核香酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖22代表包含SEQ ID NO:30的另 一載體，SEQ ID NO:30編碼配體 SEQIDNO:29。在圖22的載體中，多核香酸SEQ ID NO:30連接于編碼卩-半乳糖苷酶的多核苷酸，以生成融合蛋白編碼序列。圖23代表包含SEQ ]D NO:34的載體，SEQ ID NO:34編碼配體SEQ ID NO:33。在圖23的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:34連接于編碼卩-半乳糖 苷酶的多核苷酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。圖24代表包含SEQ ID NO:34的另 一載體，SEQ ID NO:34編碼配體 SEQIDNO:33。在圖24的載體中，多核苷酸SEQ ID NO:34連接于編碼卩-半乳糖苷酶的多核普酸，以生成配體融合蛋白編碼序列。將圖12-24的載體轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞系HT1080。將包含編碼MEK 底物ERK的多核芬酸的載體也轉(zhuǎn)染入HT1080細胞。使用購自Roche (Basel, Switzerland)的Fugene6試劑根據(jù)生產(chǎn)說明書進行轉(zhuǎn)染。簡要而言， 將細胞以300,000/孔的密度于2ml含10% FBS的DMEM中接種于6孔板。 24小時后，每孔的轉(zhuǎn)染復合體通過將lug質(zhì)粒DNA與3ul Fugene6混合 來制備，這得到100ul溶解于無血清DMEM的DNA/脂質(zhì)復合體。孵育30 分鐘以允許正確形成所述復合體后，將100 ul所述混合物添加至在2ml培 養(yǎng)基中生長的每孔的細胞。細胞接觸DNA/脂質(zhì)復合體24小時，隨后裂解 細J包以用于RNA和蛋白質(zhì)分4斤。圖25顯示對配體融合蛋白的溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)分析結(jié)果，所述配體 融合蛋白由圖12-18和圖20、 22和24的載體編碼。所述配體融合蛋白使 用Roche (針1539426001)的P-半乳糖苷酶ELISA試劑盒根據(jù)試劑盒方案定 量。除VVN-40647代表1個重復的值外，值代表兩個重復的平均值。在蛋白質(zhì)斑點印跡結(jié)合測定中測定含有配體融合蛋白的溶解產(chǎn)物，以 檢測與MEK1蛋白質(zhì)或MEK2蛋白質(zhì)的結(jié)合，使用下列方案1. 將硝酸纖維素膜在TBS中浸泡5分鐘。2. 將預浸泡的硝酸纖維素膜放入斑點印跡設備，施加真空并通過檸緊 螺絲來密封設備。3. 通過向每個孔添加100jiL TBS再水化硝酸纖維素。短暫地施加真 空，但不要完全干燥所述孔。4. 確認斑點印跡設備的流量閥/真空室與空氣相通，并向孔中加入 100pL 0.5ng4iL MEK1或MEK2靶蛋白質(zhì)溶液，以使每孔最后的測定量為 50ng靶蛋白質(zhì)。5. 在通過真空過濾抽吸剩余液體穿過所述膜之前，在室溫下讓靶蛋白 質(zhì)通過重力流動過濾穿過所述膜40分鐘。6. 在室溫下通過添加300jiL于TBS中的5。/。脫脂奶粉封閉孔l小時。7. 小心地從每個孔吸出所述5%封閉溶液。8. 通過添加lOOpL TBS清洗各孔一次。通過真空過濾將TBS經(jīng)所述 膜吸出。9. 向含有MEK1蛋白質(zhì)的一個孔和含有MEK2蛋白質(zhì)的一個孔添加 100nL 0.1ng/jiL各種MEK抑制劑溶解產(chǎn)物的待測溶液，以使最后的測定 量為每孔10ng抑制劑。在通過真空過濾抽吸剩余溶解產(chǎn)物穿過所述膜之 前，使抑制劑溶解產(chǎn)物與MEKl/2靶蛋白質(zhì)在室溫下孵育40分鐘。10. 通過添加lOO)iL于TBS中的1% SDS清洗各孔。通過真空過濾將 于TBS中的1。/oSDS經(jīng)所述膜吸出。重復此清洗步驟另外兩次，共清洗三 次。11. 施加真空，并用鋼筆或鉛筆標記所述膜(以使所述膜能在從所述設 備取出后重新對齊)。12. 關(guān)閉真空，并將所述膜從所述設備中取出。13. 將所述膜置于培養(yǎng)皿(或同等容器)中，并在輕輕搖動下用于TBS 中的1。/。SDS清洗5分鐘(添加足夠的于TBS中的1%SDS以覆蓋整個膜)。 重復此清洗步驟另外四次，共清洗五次。14. 在TBS中清洗所述膜一次(如步驟13中所述)，以除去所述膜中過 量的SDS去污劑。15. 按步驟2的描述將膜放回斑點印跡設備。16. 向各孔中添加lOO)iL (3-Glo P-半乳糖苷酶底物，并在室溫下孵育 30分鐘。17. 真空過濾p-Glo底物穿過所述膜，從設備中取出所述膜，在 FluorChem成像儀中使所述膜曝光15分鐘以進行化學發(fā)光檢測。此測定中使用的材料為1. 斑點印跡設備(Bio-Rad或同等的)2. Tris (Sigma， #252859或同等的)3. SDS (ICN #811034或同等的)
4. NaCl (EMD #7647-14-5或同等的)
5. p-Glo測定試劑盒(Promega #E4740)
6. Mekl (Cell Signaling #M02-10G-10或同等的)
7. Mek2 (Cell Signaling #M03-10G-10或同等的)
8. FluorChem成像儀(Alpha Innotech或同等的) 然后使用下列方案定量圖像數(shù)據(jù)
1. 在軟件應用程序ImageJ中打開斑點印跡圖像。
2. 使用矩形選擇工具括出第一組。
3. 在Special (專用)菜單中選擇Mark First Lane (標記第一泳道)。
4. 移動矩形選擇(通過在其內(nèi)單擊并拖動)并連續(xù)括出(使用Mark Next Lane (標記下一泳道))其他各個泳道。
5. 使用Plot Lanes (繪制泳道)以產(chǎn)生泳道4&廓圖。
6. 使用畫線工具畫出基線和下降線(dr叩line),以使各個峰定義如上 所示的閉合區(qū)域。
7. 通過用棒(wand)工具連續(xù)在各個峰內(nèi)部單擊而測量峰的面積。
8. 然后可將峰測量(斑點強度值)的數(shù)據(jù)文件另存為Microsoft excel文 件，并進行歸一化和用圖表示。
圖26代表蛋白質(zhì)斑點印跡結(jié)合測定的圖像分析結(jié)果，其顯示多個融 合蛋白展示出對MEK1和/或MEK2的結(jié)合活性。
公開了調(diào)節(jié)MEK活性的配體和多聚配體以及制備和使用這些配體的 方法。所述配體和多聚配體通過化學或重組方法合成，并用作研究工具或 治療劑。本發(fā)明包括將所述配體和多聚配體連接至細胞定位信號以獲得亞 細胞治療劑。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其包含與SEQ ID NO1或SEQ ID NO5或SEQ IDNO9或SEQ ID NO13或SEQ ID NO17或SEQ ID NO21或SEQ ID NO25或SEQ ID NO29或SEQ ID NO33具有至少約80％同一性的氨基酸序列。
2. —種分離的嵌合多肽同型多聚配體，其單體選自包含與SEQ ID NO:41-51的任一個具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽組成的組，其 中Xaa是任一氨基酸。
3. —種分離的嵌合多肽異型多聚配體，其單體選自包含與SEQ ID NO:41-51的4壬一個具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽組成的組，其 中Xaa是任一氨基酸。
4. 一種分離的嵌合多肽，其包含選自SEQIDNO:41-51的任一個的兩 種或多種多肽，其中指定為Xaa的至少一個氨基酸是不同于絲氨酸、酪氨 酸或蘇氨酸的氨基酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的分離的嵌合多肽，其中所述兩種或多種多肽選 自SEQIDNO:41-48。
6. 如權(quán)利要求4所述的分離的嵌合多肽，其中所述兩種或多種多肽選 自SEQIDNO:49畫51。
7. —種分離的嵌合多肽同型多聚配體，其中所述同型多聚配體調(diào)節(jié) MEK活性。
8. —種分離的嵌合多肽異型多聚配體，其中所述異型多聚配體調(diào)節(jié) MEK活性。
9. 一種MEK的多肽抑制劑，其包含選自由以下組成的組的肽的至少 一個拷貝a)與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基213-225的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ 1D NO:37的氨基酸殘基 218和/或222的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；b) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基211-227的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基 218和/或222的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；c) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基208-229的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基 218和/或222的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；和d) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基210-231的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基 218和/或222的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基。
10. —種MEK的多肽抑制劑，其包含選自由以下組成的組的肽的至少 一個拷貝a) 與包含對應于SEQ 1D NO:37的氨基酸殘基293-305的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氣基酸殘基 298和/或300的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；b) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基291-308的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ 1D NO:37的氨基酸殘基 298和/或300的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；c) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基290-309的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基 298和/或300的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；和d) 與包含對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基289-310的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:37的氨基酸殘基298和/或300的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘基。
11. 一種MEK的多肽抑制劑，其包含選自由以下組成的組的肽的至少 一個拷貝a) 與包含對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基199-210的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基 202和/或204的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；b) 與包含對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基198-217的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基 202和/或204的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；c) 與包含對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基187-211的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ TD NO:38的氨基酸殘基 202和/或204的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；和d) 與包含對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基191-211的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:38的氨基酸殘基 202和/或204的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基。
12. —種MEK的多肽抑制劑，其包含選自由以下組成的組的肽的至少 一個拷貝a) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基170-194的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；b) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基174-198的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基185和/或187的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；c) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基176-197的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基；和d) 與包含對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基179-193的氨基酸殘基 的肽具有至少80%同一性的肽，其中對應于SEQ ID NO:39的氨基酸殘基 185和/或187的氨基酸殘基已被突變?yōu)椴煌诮z氨酸、酪氨酸或蘇氨酸的 氨基酸殘基。
13. 如權(quán)利要求1-12的每一項所述的多肽，其連接于亞細胞定位信號、 報道分子和/或表位標簽。
14. 一種組合物，其包含至少兩個單體性配體，其中每個所述配體的 至少一部分能夠被MEK識別，并且其中所述配體的至少一個不含有可被 MEK磷酸化的氨基酸。
15. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述組合物是同型多聚配體。
16. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其還包含介于至少兩個所述單體性 配體之間的間隔子氨基酸。
17. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其還包含定位信號、報道分子和/ 或表^立標簽。
18. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述組合物是異型多聚體配體。
19. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其還包含介于至少兩個所述單體性 配體之間的間隔子氨基酸。
20. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其還包含定位信號、報道分子和/ 或表位標簽。
21. —種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1 -20中任一項所述的多肽。
22. —種載體，其包含權(quán)利要求21所述的核酸分子。
23. —種重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求22所述的載體。
24. —種抑制細胞中的MEK的方法，其包括將權(quán)利要求22所述的載 體轉(zhuǎn)染入宿主細胞，并在適于產(chǎn)生所述多肽的至少一個拷貝的條件下培養(yǎng) 所述轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
25. —種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求24所述的各種多肽，其中 所述多核苷酸一個末端的側(cè)翼為可被第 一限制性核酸內(nèi)切酶切割的序列， 并且其中所述多核苷酸的另一末端的側(cè)翼為可被第二限制性核酸內(nèi)切酶 切割的序列，并且其中所述第 一和第二限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生不相容的黏 性末端。
26. —種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求24所述的各種多肽，其中 所述多核香酸一個末端的側(cè)翼為可被NgoM IV切割的序列，并且其中所述 多核苷酸的另 一末端的側(cè)翼為可被Xma I和Cla I切割的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及激酶配體和多聚配體。特別地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)MEK活性的配體、同型多聚配體和異型多聚配體。所述配體和多聚配體用作研究工具或用作治療劑。本發(fā)明包括將配體、同型多聚配體和異型多聚配體連接于細胞定位信號、表位標簽和/或報道分子。本發(fā)明還包括編碼所述配體和多聚配體的多核苷酸。
文檔編號C12N9/12GK101679956SQ200880017643
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日
發(fā)明者喬納森·卡森, 大衛(wèi)·巴欽斯基, 托馬斯·里德, 艾米·艾特澤爾 申請人:英特拉克森公司